專利名稱：一種水稻細胞色素p450基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及基因和利用這種基因產(chǎn)生可以用除草劑選擇性控制的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物目前已經(jīng)在世界許多國家大量推廣種植。例如轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗除草劑玉米已經(jīng)在北美大量推廣，轉(zhuǎn)基因棉花也已經(jīng)在中國大量種植。進一步，利用轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白質(zhì)，工業(yè)用酶等也正在廣泛研究和開發(fā)。轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物應(yīng)用的重要工作之一是控制它們的傳播、防止它們混入到非轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物之中。特別是防止作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白質(zhì)、工業(yè)酶和其他可能對人和動物有不良作用的轉(zhuǎn)基因品種混入糧食和飼料用品種是非常重要的。發(fā)明一種簡便的方法控制轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物方法具有重大價值。
本達松和磺酰脲類除草劑是常用的農(nóng)業(yè)除草劑。它們對許多寬葉雜草具有良好的殺草能力。但是禾本科農(nóng)作物中具有這些除草劑的解毒酶，對這些除草劑具有良好的抗性。因此在轉(zhuǎn)基因植物中如果同時抑制了抗本達松和磺酰脲類除草劑的解毒酶的表達，轉(zhuǎn)基因植物必要時就能夠被本達松和磺酰脲類除草劑選擇性地消滅。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種基因和利用這種基因產(chǎn)生可以用除草劑選擇性控制的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的方法。
本發(fā)明是通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn)的提供一種水稻細胞色素P450基因，它的核苷酸序列是SEQ ID NO.1。
一種DNA質(zhì)粒，含有利用上述的細胞色素P450基因或者其中的基因片斷構(gòu)建得到的反義RNA或RNAi的抑制表達框，并且還含有一種或者多中在農(nóng)作物中表達有價值的功能基因(目的基因)。
一種細胞，含有上述質(zhì)粒。
一種轉(zhuǎn)基因水稻得制備方法，該方法包含有上述的反義RNA或RNAi的抑制表達框。
細胞色素P450基因及其基因片斷，在利用除草劑選擇性控制轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點目的基因表達框與本達松、磺酰脲類除草劑的解毒酶基因抑制表達框連接在同一個DNA導(dǎo)入片斷上，從而達到在轉(zhuǎn)基因水稻中目的基因與本達松、磺酰脲類除草劑的解毒酶基因的抑制表達基因緊密連鎖。
在轉(zhuǎn)基因水稻中表達目的基因的同時，利用反義RNA或者RNAi的方法抑制水稻中這種細胞色素P450基因的表達，從而使轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物對本達松和磺酰脲類除草劑敏感，進而可以被選擇性地殺滅。因此必要時可以通過使用常用的本達松和磺酰脲類除草劑防止轉(zhuǎn)基因水稻的傳播、消滅混入非轉(zhuǎn)基因或其他轉(zhuǎn)基因水稻中的本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因水稻。
具體實施例方式
本發(fā)明中的水稻細胞色素P450基因zcb(SEQ ID NO.1)是根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫的序列，通過PCR而獲得。利用RNAi的方法抑制水稻中這種細胞色素P450基因的表達，發(fā)現(xiàn)zcb與水稻的抗本達松、磺酰脲類除草劑能力相關(guān)。水稻中導(dǎo)入zcb的RNAi抑制表達框后，其抗本達松、磺酰脲類除草劑的能力大幅度降低。因此，在轉(zhuǎn)基因水稻中表達目的基因的同時，利用反義RNA或者RNAi，或者其他的方法抑制水稻中這種細胞色素P450基因的表達，可以使轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物對本達松和磺酰脲類除草劑敏感。利用反義RNA或者RNAi的方法抑制基因表達的技術(shù)是已經(jīng)有的技術(shù)(Kusaba 2004 RNA Interference in crop plants，Current Opinionin Biotechnology，15139-143)。
在本發(fā)明中，目的基因表達框與本達松、磺酰脲類除草劑的解毒酶基因抑制表達框連接在同一個DNA導(dǎo)入片斷上，從而達到在轉(zhuǎn)基因水稻中目的基因與本達松、磺酰脲類除草劑的解毒酶基因的抑制表達基因緊密連鎖。特別是上述目的基因包括一種抗草甘膦基因，從而使獲得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物對草甘膦除草劑具有高抗性而對本達松和磺酰脲類除草劑敏感。上述目的基因還包括抗蟲等抗逆基因，工業(yè)酶基因，藥物蛋白質(zhì)基因以及其他有價值的適宜在植物中表達的基因。本發(fā)明中的目的基因可以是抗蟲基因、抗除草劑基因，藥物蛋白質(zhì)基因、工業(yè)酶基因，或者其他有價值的基因，可以是其中的一個、二個或者多個。
本發(fā)明使轉(zhuǎn)基因水稻對本達松和磺酰脲類除草劑敏感，并且這種對除草劑敏感性狀與目的基因緊密連鎖。而這種連鎖是通過插入DNA的構(gòu)建來實現(xiàn)即本發(fā)明將目的基因表達框和本達松和磺酰脲類的解毒基因抑制表達框連接在同一個載體上的同一個DNA插入片斷中。在利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時，則是在連接在同一個T-DNA片斷中。
本達松和磺酰脲類的解毒基因抑制表達框可以由二個部分組成一個是啟動子，它可以是水稻或者玉米泛素(Ubiqutin)啟動子，或者水稻Actin啟動子，或者是花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)，或者是其他在禾本科農(nóng)作物中有活性的啟動子。另一個部分與啟動子功能性相聯(lián)的是本發(fā)明的細胞色素P450基因(SEQ ID NO1)的反義RNA或者RNAi。利用反義RNA和RNAi抑制表達的機理和技術(shù)已經(jīng)有完整的描述，是已經(jīng)有的技術(shù)(Kusaba 2004 RNAInterference in crop plants，Current Opinion in Biotechnology，15139-143)。產(chǎn)生反義RNA的DNA模板可以是全長基因，或者僅僅是其中的一個或幾個片斷。產(chǎn)生RNA干擾的序列(RNAi)可以根據(jù)SEQ ID NO1設(shè)計。
同時具有目的基因表達框和本達松和磺酰脲類的解毒基因抑制表達框的載體可以通過轉(zhuǎn)基因的方法穩(wěn)定導(dǎo)入水稻。這個方法包括基因槍方法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，這二種方法都是成熟的已知的方法(Hiei et al.1994 Effieienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant J.6271-282)。
一種轉(zhuǎn)基因植物可以通過花粉擴散或者直接通過種子傳播到計劃種植以外的地方。本發(fā)明通過使轉(zhuǎn)基因植物對本達松和磺酰脲類產(chǎn)生敏感性而選擇性地殺滅，從而保證了目的基因能夠被控制。在種植非轉(zhuǎn)基因品種的大田中，只要使用本達松和磺酰脲類除草劑防治雜草就可以消滅可能混入的轉(zhuǎn)基因品種。
本發(fā)明的又一個方面是提供一種利用不同的除草劑對轉(zhuǎn)基因植物可以進行正選擇和負選擇的技術(shù)。一種抗草甘膦基因，與抑制水稻細胞色素P450基因的DNA片斷構(gòu)建在同一個質(zhì)粒上。這樣，對草甘膦的抗性和對本達松和磺酰脲類的敏感性在轉(zhuǎn)基因禾本科農(nóng)作物中高度連鎖。這種方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物可以利用草甘膦進行篩選和雜草防治，同時也可以利用本達松和磺酰脲類除草劑控制和消滅轉(zhuǎn)基因禾本科農(nóng)作物。
利用本發(fā)明的方法獲得的植物細胞，再將其分化培育成相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。所獲得的植株能夠表達目的基因，但是失去對抗本達松和磺酰脲類除草劑的能力。
以下通過實例進一步對本發(fā)明進行描述實施例1、水稻細胞色素P450基因zcb的克隆根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫的序列，通過對基因組DNA進行PCR擴增而獲得。PCR的引物分別為C450Bfggatccaatgaagtac tccacttctg taacca(SEQ ID NO5)和C450Brctcgag caa catgtgtatg ctcacaagaa gcttattgc(SEQ ID NO6)。PCR擴增的條件是95℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，進行30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物水稻細胞色素P450基因zcb。水稻細胞色素P450基因zcb被克隆到T載體(上海生工)中，測序說明克隆正確。
實施例2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T-DNA載體的構(gòu)建水稻轉(zhuǎn)化T-DNA載體pCAMB1300Rice-G6-450B的構(gòu)建水稻RNAi片斷是從水稻基因組通過PCR的方法擴增獲得。一個片斷是Rice450B1，PCR引物分別為Rice450bF15’gtca ctcgag aatgaagtactccacttctgtaaccat(SEQ ID NO7)和Rice450bR4605’gatc ggatcc gacatgaggccgacgcggcgc gcg(SEQ ID NO8)；另一片斷是Rice450B2，PCR引物分別為Rice450bF1和Rice450bR3505’catg agatcttgc gac tcg aac ctg ggc cgg ttc g(SEQ ID NO9)。這二個片斷分別被克隆到T載體(上海生工)中。片斷是Rice450B1用XhoI和BamHI從T載體中酶切獲得；Rice450B2用XhoI和BglII從T載體中酶切獲得。然后，Rice450B1和Rice450B2被連接到用XhoI預(yù)先酶切切除去抗潮霉素(hyg)基因的pCambia1300載體，獲得pCamb1300-450B.載體pCamb1300-450Bi包含有一個CaMVS35啟動子控制下的能夠產(chǎn)生RNAi的抑制表達框(核苷酸序列是SEQ ID NO.2)。載體pCamb1300-450Bi進一步用EcoRI和HindIII酶切，然后用含有抗草甘膦基因G6的DNA片斷連接(EQ ID NO.3)，獲得載體pCAMB1300-G6-450Bi，其核苷酸序列是SEQ ID NO.4。
實施例2、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌 龔祖塤 1998生命科學(xué)10125-131；劉凡等，2003分子植物育種1108-115)。選取成熟飽滿種子去殼，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。取含目的基因的農(nóng)桿菌劃板，挑單菌落接種準備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入適當濃度的農(nóng)桿菌液中(含乙酰丁香酮)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)2～3天。用無菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含1-4mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)兩個月(中間繼代一次)。把篩選后，生長活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織移到分化培養(yǎng)基，14小時光照分化發(fā)芽。2-3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，作為鑒定材料。獲得LG-Rice-GlyR-450i再生水稻植株。
T-DNA的插入及其基因的表達可以通過PCR和western印跡分析檢測?；蚪MDNA可以根據(jù)現(xiàn)有的方法從轉(zhuǎn)化再生植株和非轉(zhuǎn)化禾本科農(nóng)作物中提取。
實施例3、對轉(zhuǎn)基因禾本科農(nóng)作物的正選擇和負選擇獲得的轉(zhuǎn)化LG-Rice-GlyR-450i再生水稻植株和沒有轉(zhuǎn)化的水稻植株在溫室中培養(yǎng)溶液中單株培養(yǎng)。這些再生植株分為3個處理，每個處理包括LG-Rice-GlyR-450i和非轉(zhuǎn)化植株各30株。處理1噴20mM草甘膦；處理2噴1500mg/L本達松；處理34mg/L芐嘧磺??；處理4噴水。處理后10天記錄植株的成活率。結(jié)果如下(表1)。
表1

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
序列表SEQ ID NO 11 aatgaagtac tccacttctg taaccatgga taaggcctac attgccgtct tctccatcgt61catcctcttc ttgctcgtcg actaccttcg tcgtcttcgt ggcggcggca cgagcaatgg121 caagaacaag gggatgcggc tgccgccggg tctaccggcc gtcccgatca tcggccacct181 ccacctcgtc aagaagccga tgcacgcgac gctgtcccgc ctcgccgcgc ggcacgggcc241 ggtgttctcg ctgcgcctcg gctcgcggcg cgccgtggtg gtgtcgtcgc cggggtgcgc301 cagggagtgc ttcaccgagc acgacgtggc cttcgcgaac cggcccaggt tcgagtcgca361 gctgctcatg tcgttcgacg gcaccgcgct ggccatggcg agctacggcc cgcactggcg421 caacctccgc cgggtcgccg cggtgcagct gctctccgcg cgccgcgtcg gcctcatgtc481 ggggctcatc gccggcgagg tgcgcgccat ggtgcggagc ttgtgccgcc gcccagccgc541 cgccgcgcca gtccagctga agcggaggct gttcgagctc tccctgagcg tgctcatgga601 gaccatcgcc cagagcaagg cgacccgacc cgagacgacg gacacggaca cggacatgtc661 catggaagcc caggagtaca agcaggtcgt cgaggagatc ctcgagcgca tcggcacggg721 caacctgtgc gactacctgc cggcgctccg gtggttcgac gtgttcggcg tgaggaacag781 gatcctcgcc gcggtgagcc ggagggacgc gttcctccgt cgactgatct acgcggcgcg841 gtggaggatg gacgacggcg agaagaagag catgatcgcc gtgctgctca ctctgcagaa901 gacacagccg gaggtgtaca ctgacaacat gatcacggct ctttgctcga acttgttagg961 agcaggaaca gagacaacct cgacgacgat agaatgggca atgtcgctgt tgctgaacca1021 cccagaaacg ctcaagaaag cacaagccga gatcgacgcg tccgtcggca actcccgcct1081 gatcaccgcc gacgacgtgc cccgcatcac ctatctccag tgcatcgtca gggagacgct1141 ccgcctctac cccgcggcgc cgatgctcat cccgcacgag tcctccgccg actgcgaggt1201 cggcggctac agcgtcccgc gcgggacgat gctgctcgtg aacgcgtacg ccatccaccg1261 tgacccggcg gcgtgggagg agccggagag gttcgtgccg gagaggttcg agggcggcgg1321 gtgcgacggc aacctctcga tgccgttcgg gatggggagg cggaggtgcc ccggcgagac1381 gctggctctg cacacggtgg ggctggtgct gggcacgctg atccagtgct tcgactggga1441 gagggtcgat ggcgtggagg tcgacatggc tgagggtggc gggctcacca tgcccaaggt1501 cgtgccgttg gaggccgtgt gcaggccgcg cgacgccatg ggtggtgttc ttcgcgagct1561 ctgaacattt tggcgtcgtt tgcatctcca gggcaaactc atgtatactg atgaagtacc1621 aaaagtaagt agcaataagc ttcttgtgag catacacatg ttg
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SEQ ID NO935catgagatct tgcgactcga acctgggccg gttcg
權(quán)利要求
1.一種水稻細胞色素P450基因，其特征在于該基因的核苷酸序列為SEQ IDNO1。
2.一種DNA質(zhì)粒，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的細胞色素P450基因或者其中的基因片斷構(gòu)建得到的反義RNA或RNAi的抑制表達框，還含有一種或者多中在農(nóng)作物中表達有價值的功能基因。
3.一種細胞，其特征在于含有權(quán)利要求2所述質(zhì)粒。
4.一種轉(zhuǎn)基因水稻得制備方法，其特征在于，該方法包含有權(quán)利要求2所述的反義RNA或RNAi的抑制表達框。
5.權(quán)利要求1或2或3，任選一項中所述的涉及有關(guān)細胞色素P450基因及其基因片斷，在利用除草劑選擇性控制轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻細胞色素P450基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO1；還公開了一種DNA質(zhì)粒、細胞和水稻；細胞色素P450基因及其基因片斷，在利用除草劑選擇性控制轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中的應(yīng)用。利用本發(fā)明，可以通過使用常用的本達松和磺酰脲類除草劑防止轉(zhuǎn)基因水稻的傳播、消滅混入非轉(zhuǎn)基因水稻中的轉(zhuǎn)基因水稻。
文檔編號C12N15/82GK101063134SQ20071006832
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者沈志成 申請人:浙江大學(xué)