專利名稱：一株植物乳桿菌及其高密度培養(yǎng)和凍干菌粉制備的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株植物乳桿菌及其高密度培養(yǎng)和凍干菌粉制備的方法。
背景技術(shù)：
植物乳桿菌與人類的生活關(guān)系密切，是一種常見(jiàn)于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌，能通過(guò)胃并定植于腸道發(fā)揮有益作用。它對(duì)腸道微生物有重要影響，無(wú)論在食品發(fā)酵，還是在工業(yè)乳酸發(fā)酵以及醫(yī)療保健等領(lǐng)域，都有著廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明使用的植物乳桿菌P8是分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌,經(jīng)16S rDNA同源性分析與Gene Bank中標(biāo)準(zhǔn)菌株植物乳桿菌ATCC14917的同源性為100%。植物乳桿菌P8作為一種益生菌，具備優(yōu)良的益生特性，經(jīng)研究表明該菌株具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、在腸道 有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常見(jiàn)腸道致病菌生長(zhǎng)特性(Yan Bao,Heping Zhang等人，《Annals of Microbiology》)。含有益生菌植物乳桿菌P8的發(fā)酵乳可改善機(jī)體內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境、預(yù)防和治療高脂血癥。植物乳桿菌P8作為一種益生菌，在食品發(fā)酵、動(dòng)物飼料及醫(yī)療保健等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景和巨大經(jīng)濟(jì)效益。高密度培養(yǎng)技術(shù)(High Cell Density Culture)，也就是高密度發(fā)酵技術(shù)。由于各個(gè)菌種所能達(dá)到的最高菌體濃度相差較大，目前的文獻(xiàn)中并沒(méi)有對(duì)高密度培養(yǎng)有確切的定義。一般來(lái)說(shuō)，高密度培養(yǎng)是指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)或裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較傳統(tǒng)培養(yǎng)方式有顯著的提高，從而達(dá)到減少培養(yǎng)體積，還可以縮短生產(chǎn)周期，最終提高特定產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率，減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，提高在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。隨著發(fā)酵劑的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的迅速增加，工業(yè)發(fā)酵的基本目標(biāo)自然轉(zhuǎn)向了以最小的代價(jià)獲得最大的產(chǎn)值和利潤(rùn)，而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的工程手段是針對(duì)每個(gè)特定過(guò)程建立相應(yīng)的高效發(fā)酵模式。因此，進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，大規(guī)模培養(yǎng)非遺傳修飾菌和工程菌的技術(shù)和工藝就顯得日趨重要。乳酸菌濃縮發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵是要實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行高活性、高密度的培養(yǎng)。植物乳桿菌可添加到食品基料中，制成能夠改善人體腸道健康的功能性食品，像瑞典 Skanemejerier 公司生產(chǎn)的含有 L. plantarum 299v 的 ProVivarosehip 飲料；也可制成調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、提升免疫力的益生菌制劑，如加拿大生產(chǎn)的含L. planta rumR0202的益生菌制劑Jarrow Formulas ;還可用作豬飼料的益生素添加劑，如用能夠耐受豬胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的L. plantarum 4. I。本發(fā)明針對(duì)一株從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品-酸牛奶中分離，并經(jīng)過(guò)體外耐酸性試驗(yàn)、耐膽酸鹽試驗(yàn)、降膽固醇試驗(yàn)等一系列試驗(yàn)篩選得到的具有潛在益生作用的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8),通過(guò)優(yōu)化液體培養(yǎng)基以及對(duì)培養(yǎng)條件的控制等方法實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體、添加保護(hù)劑后冷凍干燥得到凍干菌粉，可以應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑和益生菌制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株植物乳桿菌及其高密度培養(yǎng)和凍干菌粉制備的方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一株植物乳桿菌,其特征在于所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)是分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、腸道凝集作用及抑制常見(jiàn)腸道致病菌等特性；該菌菌株已于2011年11月18日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，分類命名植物乳桿菌Lactobacillus plantarum,保藏號(hào)為 CGMCC No. 5468。一種如上所述的植物乳桿菌的高菌體密度培養(yǎng)的方法，包括以下步驟
a.菌種的活化將冷凍保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18 24小時(shí)，如此傳代培養(yǎng)I 2次得到活化菌種；b.優(yōu)化培養(yǎng)基的配制將優(yōu)化培養(yǎng)基各成份按比例配制，混合均勻后調(diào)pH值為6. 5，121 °C下滅菌15min ；優(yōu)化培養(yǎng)基各成分的含量比例如下鹿糖50 80kg,酵母粉20 40kg,大豆蛋白胨8 20kg,朽1檬酸I I. 5kg,朽1檬酸鈉 20 25kg, MgSO4. 7H20 I. 5 2. 0kg, MnSO4. 5H20 0. 08 0. 12kg,吐溫-80 0· 8 I. 0kg,蒸懼水 IOOOLoc.種子發(fā)酵液的制備取步驟a中活化好的菌種接種于b中配制的培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)8 10小時(shí)；d.接種與培養(yǎng)將步驟c的種子發(fā)酵液，接種于b中配制的培養(yǎng)基中，在控制的發(fā)酵條件下發(fā)酵8 15h ；發(fā)酵條件控制為33 37°C恒溫培養(yǎng)，通過(guò)流加中和劑的方法控制發(fā)酵過(guò)程pH保持5. 6 6. 2，保持微通氧或厭氧發(fā)酵。其中中和劑可以是NaOH、KOH、Na2C03等無(wú)機(jī)堿水溶液或氨水溶液。其中微通氧條件通過(guò)通空氣O. 02 O. 05vvm,或每?jī)蓚€(gè)小時(shí)通空氣一次的方法實(shí)現(xiàn)；厭氧條件通過(guò)通氮?dú)釵. 02 O. 05vvm,或每?jī)蓚€(gè)小時(shí)通氮?dú)庖淮蔚姆椒▽?shí)現(xiàn)。e.終止發(fā)酵當(dāng)菌體產(chǎn)酸停止時(shí)終止發(fā)酵，得到植物乳桿菌的高密度發(fā)酵液，發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá) 1010cfu/ml 以上。其中可根據(jù)pH不再降低，中和劑流加停止來(lái)判斷產(chǎn)酸是否停止。一種如上所述的植物乳桿菌凍干菌粉的制備方法包括如下步驟a.菌體濃縮高密度發(fā)酵液經(jīng)5000 12000g離心濃縮菌體；b.添加保護(hù)劑菌體濃縮液添加5 10倍的保護(hù)劑溶液；保護(hù)劑溶液的成分配方比例如下脫脂乳30 35kg,脫鹽乳清粉15 20kg,工業(yè)海藻糖15 20kg,維生素C3 4kg,卵憐脂0. 05 O. 08kg,蒸懼水IOOOLoc.干燥將上述添加保護(hù)劑后的菌懸液經(jīng)冷凍干燥得到凍干菌粉。菌粉活菌總數(shù)可以達(dá)到4X 10ncfu/g以上，可以應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑或益生菌制劑。本發(fā)明的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)對(duì)酸和膽鹽耐受能力強(qiáng),并且具有降膽固醇，降血脂，改善腸道菌群等多種益生功能，經(jīng)高密度發(fā)酵后冷凍干燥后可得到高活力的凍干菌粉，滿足了對(duì)于益生菌發(fā)揮益生功效所需的高活力的要求，可直接應(yīng)用于益生菌制劑或益生菌發(fā)酵劑。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明；以下實(shí)施例僅為說(shuō)明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例I :一株植物乳桿菌,所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)是分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、腸道凝集作用及抑制常見(jiàn)腸道致病菌等特性；該菌菌株已于2011年11月18日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5468。植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)的高密度培養(yǎng)方法a.菌種的活化將_80°C冷凍保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)接種于5ml MRS液體培養(yǎng)基中(MRS培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g,磷酸氫二鉀2g,乙酸鈉5g,朽1檬酸三鈉2g,吐溫-801g,硫酸鎂200mg,硫酸猛54mg,蒸餾水lOOOmL，pH6. 5 121°C 15min滅菌備用)，37°C培養(yǎng)18小時(shí)，如此傳代培養(yǎng)2次得到活化的菌種。b.配制優(yōu)化培養(yǎng)基,將鹿糖50 80kg,酵母粉20 40kg,大豆蛋白胨8 20kg,檸檬酸 I I. 5kg,檸檬酸鈉 20 25kg, MgSO4. 7H20 I. 5 2. 0kg, MnSO4. 5H20 0. 08
0.12kg，吐溫-80 0· 8 I. 0kg,水 1000L,充分溶解。c.制備種子培養(yǎng)液將上述活化好的菌種2%接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10小時(shí)。d.接種發(fā)酵將種子培養(yǎng)液7%接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，37°C恒溫，每2小時(shí)通空氣2分鐘保持微通氧條件發(fā)酵，自動(dòng)控制流加氨水保持PH5. 9發(fā)酵至產(chǎn)酸停止，氨水不再流加時(shí)終止發(fā)酵，得到植物乳桿菌高密度培養(yǎng)液。植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)凍干菌粉的制備方法將植物乳桿菌高密度發(fā)酵液經(jīng)IOOOOg離心得到濃縮菌體，按濃縮菌體與保護(hù)劑溶液比例I : 8加入保護(hù)劑溶液(脫脂乳30 35kg，脫鹽乳清粉15 20kg，工業(yè)海藻糖15 20kg,維生素C 3 4kg,卵磷脂0. 05 0. 08kg,蒸懼水1000L),混合均勻后入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥36小時(shí),得到植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)凍干菌粉。菌粉的活菌數(shù)可達(dá)4X10ncfU/g以上，可直接應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑或益生菌制劑。實(shí)施例2
一株植物乳桿菌,所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)是分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、腸道凝集作用及抑制常見(jiàn)腸道致病菌等特性；該菌菌株已于2011年11月18日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5468。植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)的高密度發(fā)酵a.菌種的活化將_80°C冷凍保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)接種于MRS液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)18小時(shí)，如此傳代培養(yǎng)2次得到活化的菌種。b.配制優(yōu)化培養(yǎng)基,將鹿糖50 80kg,酵母粉20 40kg,大豆蛋白胨8 20kg,檸檬酸 I I. 5kg,檸檬酸鈉 20 25kg, MgSO4. 7H20 I. 5 2. 0kg, MnSO4. 5H20 0. 08
0.12kg，吐溫-80 0· 8 I. 0kg,水 1000L,充分溶解。C.制備種子培養(yǎng)液將上述活化好的菌種2%接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10小時(shí)。d.接種發(fā)酵將種子培養(yǎng)液9%接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，37°C恒溫,每2小時(shí)通氮?dú)?分鐘保持厭氧發(fā)酵，自動(dòng)控制流加10M KOH溶液保持pH6. 2發(fā)酵至產(chǎn)酸停止，氨水不再流加時(shí)終止發(fā)酵，得到植物乳桿菌高密度培養(yǎng)液。植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)凍干菌粉的制備方法，同實(shí)施例I。
權(quán)利要求
1.一株植物乳桿菌，其特征在于所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)是分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、腸道凝集作用及抑制常見(jiàn)腸道致病菌等特性；該菌菌株已于2011年11月18日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5468。
2.一種如權(quán)利要求I所述的植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于依次包括下述步驟 a.菌種的活化 將冷凍保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18 24小時(shí)，如此傳代培養(yǎng)I 2次得到活化菌種； b.培養(yǎng)基的配制 將優(yōu)化培養(yǎng)基各成份按比例配制，混合均勻后，然后調(diào)PH值為6. 5，121 °C下滅菌15min ； c.種子發(fā)酵液的制備 取步驟a中活化好的菌種接種于b中配制的培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)8 10小時(shí)； d.接種與培養(yǎng) 將步驟c的種子發(fā)酵液，接種于b中配制的培養(yǎng)基中，在控制的發(fā)酵條件下發(fā)酵8 15h ； e.終止發(fā)酵 當(dāng)菌體產(chǎn)酸停止時(shí)終止發(fā)酵，得到植物乳桿菌的高密度發(fā)酵液。
3.—種如權(quán)利要求I所述的植物乳桿菌的凍干菌粉的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟 a.菌體濃縮高密度發(fā)酵液經(jīng)5000 12000g離心濃縮菌體； b.添加保護(hù)劑菌體濃縮液添加5 10倍的保護(hù)劑溶液； c.干燥將上述添加保護(hù)劑后的菌懸液經(jīng)冷凍干燥得到凍干菌粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于b步驟和e步驟中優(yōu)化培養(yǎng)基各成分的含量比例如下 鹿糖50 80kg,酵母粉20 40kg,大豆蛋白胨8 20kg,朽1檬酸I I. 5kg,朽1檬酸鈉20 25kg, MgSO4. 7H20 I. 5 2. 0kg, MnSO4. 5H20 0. 08 0. 12kg,吐溫-80 0· 8 I. 0kg,蒸餾水1000L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于d步驟中控制的發(fā)酵條件為35 37°C恒溫培養(yǎng)，通過(guò)流加中和劑的方法控制發(fā)酵過(guò)程pH保持恒定，保持微通氧或厭氧發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于e步驟中可根據(jù)PH不再降低，中和劑流加停止來(lái)判斷是否到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)。
7.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于b步驟中保護(hù)劑的各成分的含量比例如下脫脂乳30 35kg,脫鹽乳清粉15 20kg,工業(yè)海藻糖15 20kg,維生素C 3 4kg,卵磷脂0. 05 0. 08kg,蒸餾水IOOOL0
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于中和劑可以選擇NaOH> KOH> Na2C03等無(wú)機(jī)堿水溶液或氨水溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于pH保持微酸性，.5.6-6. 2 之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法，其特征在于微通氧條件通過(guò)通空氣O. 02 O. 05vvm或每?jī)蓚€(gè)小時(shí)通空氣一次的方法實(shí)現(xiàn)；厭氧條件通過(guò)通氮?dú)?O. 02 O. 05vvm或每?jī)蓚€(gè)小時(shí)通氮?dú)庖淮蔚姆椒▽?shí)現(xiàn)。
全文摘要
一株植物乳桿菌及其高密度培養(yǎng)和凍干菌粉制備的方法。技術(shù)方案是其特征在于所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P8)是分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、腸道凝集作用及抑制常見(jiàn)腸道致病菌等特性；該菌菌株已于2011年11月18日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.5468。
文檔編號(hào)C12N1/04GK102864096SQ20121011545
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者高鵬飛, 姚國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:北京和美科盛生物技術(shù)有限公司