專利名稱：一種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻領(lǐng)域，確切地說是指一種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)β -胡蘿卜素的方法。
背景技術(shù)：
胡蘿卜素是由碳、氫兩種元素組成的萜類化合物，它是類胡蘿卜素的一種，廣泛存在于植物細(xì)胞中，參與光能的捕獲和傳遞，同時(shí)保護(hù)植物細(xì)胞免受強(qiáng)光輻射損傷，動(dòng)物細(xì)胞不能合成β_胡蘿卜素，只能從外界環(huán)境攝入。β_胡蘿卜素是一種極具營養(yǎng)和藥用價(jià)值的生物活性物質(zhì)，其生理功能主要有1)維生素A合成的前體物質(zhì)；2)光保護(hù)作用；3) 預(yù)防腫瘤發(fā)生和抗癌功效；4)對白內(nèi)障及心血管疾病有一定的防治作用。人們最初是由天然物中提取獲得β_胡蘿卜素，所使用的原料主要是胡蘿卜，這一生產(chǎn)方式收率低且提取工藝復(fù)雜，制約了 β_胡蘿卜素的應(yīng)用。于是人們將注意力轉(zhuǎn)向有機(jī)合成法生產(chǎn)β_胡蘿卜素，如利用β_紫羅蘭酮合成β_胡蘿卜素，但有機(jī)合成 β -胡蘿卜素工藝更加復(fù)雜，而且合成色素的毒性問題，限制了其在食品、藥品、化妝品等范圍內(nèi)的應(yīng)用。近些年，科研工作者再次將研究方向轉(zhuǎn)向由天然物中提取β-胡蘿卜素1) 研究發(fā)現(xiàn)一些真菌及酵母菌可以合成β-胡蘿卜素，如改良的三胞布拉霉菌(Blakeslea tripora)，它的最高β -胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá)3. 0-3. 5g/L，許多嗜鹽海洋細(xì)菌也含有較高含量的β_胡蘿卜素；2)采用植物細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)β_胡蘿卜素，但植物細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻、反應(yīng)器要求高，與工業(yè)化生產(chǎn)尚有一定差距；3)培養(yǎng)單細(xì)胞藻類生產(chǎn)β-胡蘿卜素， 如Dunaliella. bardwill和Dunaliella. Salinade的β_胡蘿卜素含量可占細(xì)胞干重的 13%，并且微藻具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單、光合效率高、生長速率快、可進(jìn)行戶外養(yǎng)殖等優(yōu)勢，因而受到科學(xué)家和企業(yè)家的廣泛關(guān)注。目前，培養(yǎng)微藻生產(chǎn)β -胡蘿卜素的研究主要集中在杜氏藻(Dunaliela)，杜氏藻屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、杜氏藻科、杜氏藻屬，其細(xì)胞微小，通常情況下，藻體細(xì)胞長約 7-22 μ m、寬約3-14 μ m，杜氏藻細(xì)胞的形態(tài)多樣，有卵圓形、球形、梨形、長頸形等，杜氏藻是目前已知的最耐鹽的生物之一。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的杜氏藻有兩個(gè)種=Dunaliela. salina(鹽藻)、Dunaliela. bardawill (巴氏藻)，它們的β -胡蘿卜素含量均超過干重的10%。國際上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)利用杜氏藻生產(chǎn)胡蘿卜素的公司有澳大利亞的貝它亭公司 (Betatene Ltd.)和西部生物工程公司(Western Biotechnology Ltd.)、美國的微生物資源公司(Microbio Resources Inc.)、以色列的庫爾食品公司(Koor Foods Ltd.)以及日本的天然 β 技術(shù)公司(Natural Beta-Biotechology Ltd.)等。國內(nèi)已公開β_胡蘿卜素相關(guān)發(fā)明專利較多，主要包括β_胡蘿卜素新商品的開發(fā)、胡蘿卜素的提取方法、胡蘿卜素的化學(xué)合成方法、富含胡蘿卜素的生物材料的保護(hù)等。專利中提到的富含β-胡蘿卜素的天然物主要有三類1)高等植物，如一種從綠茶中制備高純度β-胡蘿卜素的方法(200710164487. 7)，一種從胡蘿卜中提取天然β_胡蘿卜素的方法(200610094872. 4)，一種從沙棘果皮中提取β-胡蘿卜素的方法(200910263590. 6)，從枸杞皮渣中提取β -胡蘿卜素、玉米黃素的方法(201010573774. 5) 等；2)厭氧微生物，一種粗壯脈紋胞菌發(fā)酵生產(chǎn)胡蘿卜素的方法(200910115555. X)，從三孢布拉霉菌發(fā)酵液中制備胡蘿卜素的方法(200910135676. O)，一種生產(chǎn) β-胡蘿卜素的粘性紅圓酵母、胡蘿卜素及其生產(chǎn)方法(200610008485. 4)，一種好食脈菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胡蘿卜素的方法(200710071831.8)等；3)目前專利中僅有杜氏鹽藻一個(gè)微藻種類，可用于β_胡蘿卜素的生產(chǎn)，一種從杜氏鹽藻中提取類胡蘿卜素和食用甘油的方法(200710120704. 2)，從杜氏鹽藻中提取類胡蘿卜素和液化制生物燃油的方法(200910238784.0)，基于杜氏鹽藻代謝途徑的β-胡蘿卜素工程菌及構(gòu)建方法 (201110008946. 9)，養(yǎng)殖鹽藻生產(chǎn)β -胡蘿卜素模式的建立(93106062. I)，鹽藻的收集與 β -胡蘿卜素的提取方法(92107782. 3)等。培養(yǎng)杜氏鹽藻進(jìn)行β -胡蘿卜素的商業(yè)化生產(chǎn)始于上世紀(jì)八十年代中期，至今已有20多年的歷史，其在藻種的選育、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、提取工藝的改進(jìn)和產(chǎn)品的創(chuàng)新等方面已經(jīng)取得了巨大的突破，但杜氏鹽藻自身的生物學(xué)缺陷始終無法克服，影響生產(chǎn)效率。培養(yǎng)杜氏鹽藻生產(chǎn)胡蘿卜素，雖然已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，但仍然存在下列諸多缺點(diǎn)。
I、杜氏鹽藻個(gè)體微小，其培養(yǎng)介質(zhì)的鹽度高，藻體比重與培養(yǎng)液比重接近，增加了藻體采收難度。離心分離是杜氏鹽藻常用的分離方法，但其成本較高，另外，鹽藻培養(yǎng)液的鹽度較高，容易腐蝕離心機(jī)，特別注意的是，鹽藻無細(xì)胞壁，離心分離易產(chǎn)生藻細(xì)胞破裂，降低產(chǎn)物的提取率；2、β -胡蘿卜素的單位面積產(chǎn)率最高僅為400mg/m2d(日本的天然β技術(shù)公司)， 難以滿足市場的需要；3、杜氏鹽藻作為一種高附加值的生物材料，目前對它的利用僅限于β -胡蘿卜素的提取，杜氏鹽藻雖然可以合成占總脂肪酸2.0%的ΕΡΑ，但在實(shí)際生產(chǎn)中，難以進(jìn)行有效提取，造成資源浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述缺陷，本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn) β-胡蘿卜素的方法，可以實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素的高效生產(chǎn)。為了解決以上的技術(shù)問題，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法，其中類波氏真眼點(diǎn)藻的培養(yǎng)環(huán)境條件適宜生長溫度為15_30°C，光照強(qiáng)度為 30-600 μ E/m2s, pH 為 6-8 ；類波氏真眼點(diǎn)藻的營養(yǎng)條件a).NaNO3 300_1500mg/L 或 Urea 150_750mg/L ; b) · K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ；c) · MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ；d) · CaCl2 · 2H2030_50mg/L ； e). NaC0310-30mg/L ；f). FeCl3· 6H20 2-6mg/L ；g).Citric acid 4_8mg/L ;h)·EDTANa2 2-5mg/L ；i). H3BO3 2_4mg/L ；j). MnCl2 · 4H201_2mg/L ；k). ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ； I) · Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ；m) · Co (NO3) 2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ；n) · CuSO4 · 5H20 0.06-0. 09mg/L ；生產(chǎn)β-胡蘿卜素的流程為藻種逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，待藻液光密度OD75tl達(dá)到2. 5時(shí)，進(jìn)行戶外規(guī)?；囵B(yǎng)。規(guī)?；B(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為100-600 μ E/m2s，培養(yǎng)周期8-12天，藻體收獲后可進(jìn)行β -胡蘿卜素的提取。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)β_胡蘿卜素的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)I)類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞體積較大(細(xì)胞直徑最大可達(dá)35 μ m)，易于采收；2)類波氏真眼點(diǎn)藻在正常培養(yǎng)條件下的生物量可達(dá)8. Og/L以上，遠(yuǎn)超過杜氏鹽藻的生物量，并且類波氏真眼點(diǎn)藻的胡蘿卜素可占細(xì)胞干重的8%，與其他生物相比， 也具有明顯的優(yōu)勢；3)類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞還含有超過干重5%的ΕΡΑ，企業(yè)可同時(shí)進(jìn)行β-胡蘿卜素和EPA的生產(chǎn)，提高藻體的利用效率；4)通過氮濃度調(diào)控的方式，可以實(shí)現(xiàn)胡蘿卜素的一步法生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性。


圖I類波氏真眼點(diǎn)藻隨著培養(yǎng)液中營養(yǎng)的不斷消耗，細(xì)胞中大量積累油體和類胡蘿卜素Α.對數(shù)前期的細(xì)胞；Β.對數(shù)中期細(xì)胞；C.對數(shù)末期細(xì)胞(油體明顯形成)；D.平臺(tái)期細(xì)胞(細(xì)胞中較大的富含類胡蘿卜素的油體)；圖2為不同硝酸鈉濃度條件下，類波氏真眼點(diǎn)培養(yǎng)物顏色的變化，其中A.培養(yǎng)初期，B.平臺(tái)期；圖3為類波氏真眼點(diǎn)藻對數(shù)生長階段細(xì)胞的色素組成；圖4為類波氏真眼點(diǎn)藻平臺(tái)期細(xì)胞的色素組成。
具體實(shí)施例方式為了本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行闡述。本發(fā)明專利提供了一種富含β -胡蘿卜素的微藻及其培養(yǎng)方法，該微藻拉丁名稱為類波氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatos cf. polyphem),已于2011年9月13日在“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”保藏成功；地址中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心；菌種保藏號(hào)CGMCCNo. 5247。類波氏真眼點(diǎn)藻屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)、真眼點(diǎn)藻目 (Eustigmatales)、真眼點(diǎn)藻科(Eustigmataceae)、真眼點(diǎn)藻屬(Eustigmatos),細(xì)胞為球形或近球形，大小通常在10-11 μ m,培養(yǎng)過程中一些細(xì)胞會(huì)達(dá)到20-35 μ m,細(xì)胞中具有一個(gè)相對較大的、近球形的液泡，其中含有能振動(dòng)的顆粒物和一個(gè)直徑在3-5 μ m的色素體， 它的顏色從灰黃、褐色到紅褐色變化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長會(huì)變大變暗；細(xì)胞中有一周生深裂狀葉綠體；通常形成2個(gè)D形或4個(gè)四方體的似親孢子，或形成8到16個(gè)球形細(xì)胞。類波氏真眼點(diǎn)藻在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的顏色會(huì)發(fā)生明顯變化，如圖1A-1D所示，培養(yǎng)初期(圖1A)，類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞的顏色為綠色，細(xì)胞內(nèi)存在明顯的周生深裂狀葉綠體，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)(圖IB和1C)，藻細(xì)胞的葉綠體逐漸片段化，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色的油體，并逐漸增大，平臺(tái)期(圖1D)，油體體積達(dá)到最大，大量β -胡蘿卜素溶解在油體中，使油體顯現(xiàn)黃色。為了提高類波氏真眼點(diǎn)藻胡蘿卜素的產(chǎn)量，本發(fā)明專利從氮源形式、氮濃度和光強(qiáng)出發(fā)，對類波氏真眼點(diǎn)藻高產(chǎn)β_胡蘿卜素的條件進(jìn)行了優(yōu)化。圖2Α和2Β為類波氏真眼點(diǎn)藻液在不同硝酸鈉濃度條件下，藻液顏色的變化(圖2Α培養(yǎng)初期，圖2Β平臺(tái)期)， 其中I號(hào)培養(yǎng)管為高濃度硝酸鈉處理組，2號(hào)培養(yǎng)管為中濃度硝酸鈉處理組，3號(hào)培養(yǎng)管為低濃度硝酸鈉處理組，由圖可知，在培養(yǎng)過程中，類波氏真眼點(diǎn)藻培養(yǎng)物的顏色由綠色變?yōu)辄S色，但不同硝酸鈉處理組藻液的顏色變化有明顯差異，低濃度硝酸鈉處理組藻液顏色明顯黃于其他兩個(gè)處理組，說明低濃度硝酸鈉有利于胡蘿卜素的積累。圖3和圖4分別為類波氏真眼點(diǎn)藻在對數(shù)生長階段和平臺(tái)期，藻細(xì)胞的色素組成， 由圖看出，在培養(yǎng)初期，藻細(xì)胞的色素主要以堇菜黃素、無隔藻黃素、β_胡蘿卜素、玉米黃素和葉綠素a為主，此時(shí)β-胡蘿卜素含量不高。平臺(tái)期，藻細(xì)胞β_胡蘿卜素含量明顯增加，胡蘿卜素含量最高可占到細(xì)胞干重的6%。本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)胡蘿卜素的方法，其中類波氏真眼點(diǎn)藻的培養(yǎng)環(huán)境條件適宜生長溫度為15_30°C，光照強(qiáng)度為 30-600 μ E/m2s, pH 為 6-8 ；類波氏真眼點(diǎn)藻的營養(yǎng)條件a).NaNO3300_1500mg/L 或 Urea 150_750mg/L ; b) · K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ；c) · MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ；d) · CaCl2 · 2H2030_50mg/L ； e). NaC0310-30mg/L ；f). FeCl3· 6H20 2-6mg/L ；g).Citric acid 4_8mg/L ;h)·EDTANa2 2-5mg/L ；i). H3BO3 2_4mg/L ；j). MnCl2 · 4H201_2mg/L ；k). ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ； I) · Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ；m) · Co (NO3) 2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ；n) · CuSO4 · 5H20 0.06-0. 09mg/L ；生產(chǎn)β-胡蘿卜素的流程為藻種逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，待藻液光密度OD75tl達(dá)到2. 5時(shí)， 進(jìn)行戶外規(guī)?；囵B(yǎng)。規(guī)?；B(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為100-600 μ E/m2s，培養(yǎng)周期8-12天，藻體收獲后可進(jìn)行β -胡蘿卜素的提取。通過對類波氏真眼點(diǎn)藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化，本發(fā)明選擇合適的氮源，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始氮濃度至適宜范圍，無需增設(shè)脅迫培養(yǎng)裝置，即可以實(shí)現(xiàn)β_胡蘿卜素的高效生產(chǎn)。 通過研究，本發(fā)明提出胡蘿卜素高產(chǎn)的氮源為尿素和硝酸鹽，氮元素濃度為2-6mM，控制光照強(qiáng)度為100-600 μ E/m2S0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)β -胡蘿卜素的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)I)類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞體積較大(細(xì)胞直徑最大可達(dá)35 μ m)，易于采收；2)類波氏真眼點(diǎn)藻在正常培養(yǎng)條件下的生物量可達(dá)8. Og/L以上，遠(yuǎn)超過杜氏鹽藻的生物量，并且類波氏真眼點(diǎn)藻的胡蘿卜素可占細(xì)胞干重的8%，與其他生物相比， 也具有明顯的優(yōu)勢；3)類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞還含有超過干重5%的ΕΡΑ，企業(yè)可同時(shí)進(jìn)行β-胡蘿卜素和EPA的生產(chǎn)，提高藻體的利用效率；4)通過氮濃度調(diào)控的方式，可以實(shí)現(xiàn)胡蘿卜素的一步法生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性。對所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實(shí)施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種利用類波氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatoscf. polyphem)生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法，其特征在于，其中類波氏真眼點(diǎn)藻的培養(yǎng)環(huán)境條件適宜生長溫度為15-30°C，光照強(qiáng)度為30-600μΕ/ m2s, pH 為 6-8 ；類波氏真眼點(diǎn)藻的營養(yǎng)條件a). NaNO3 300-1500mg/L或Urea 150-750mg/L ； b) · K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ；c) · MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ；d) · CaCl2 · 2H2030_50mg/L ； e). NaC0310-30mg/L ；f). FeCl3· 6H20 2-6mg/L ；g).Citric acid 4_8mg/L ;h)·EDTANa2 2-5mg/L ；i). H3BO3 2_4mg/L ；j). MnCl2 · 4H201_2mg/L ；k). ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ； I) · Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ；m) · Co (NO3) 2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ；n) · CuSO4 · 5H20 0.06-0. 09mg/L ；生產(chǎn)胡蘿卜素的流程為藻種逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，待藻液光密度OD75tl達(dá)到2. 5時(shí)，進(jìn)行戶外規(guī)?；囵B(yǎng)，規(guī)?；B(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為100-600 μ E/m2s，培養(yǎng)周期8-12天，藻體收獲后可進(jìn)行β -胡蘿卜素的提取。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用類波氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatoscf.polyphem)生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法，生產(chǎn)β-胡蘿卜素的流程為藻種逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，待藻液光密度OD750達(dá)到2.5時(shí)，進(jìn)行戶外規(guī)模化培養(yǎng)，規(guī)模化養(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為100-600μE/m2s，培養(yǎng)周期8-12天，藻體收獲后可進(jìn)行β-胡蘿卜素的提取。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法，可以實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素的高效生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P23/00GK102605032SQ20121010977
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者萬凌琳, 吳洪, 張成武, 李濤, 李愛芬 申請人:暨南大學(xué)