專利名稱：檢測維生素c生產(chǎn)菌株傳代培養(yǎng)過程中營養(yǎng)環(huán)境變化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種檢測維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境變化的方法。
背景技術(shù)：
目前，我國生產(chǎn)維生素C的方法為“二步發(fā)酵法”，第一步發(fā)酵使用黑醋桿菌將山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，第二步發(fā)酵為巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌混合發(fā)酵，將山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸。其中，第二步發(fā)酵中前者為伴生菌，后者為產(chǎn)酸菌。兩菌在混合發(fā)酵的過程中，通過相互作用促進產(chǎn)酸菌的生長和產(chǎn)酸。通過混菌傳代培養(yǎng)，混菌發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的能力得到提高，但其作用機理尚不明確。隨著高通量的現(xiàn)代儀器分析技術(shù)和化學計量學方法的發(fā)展，過程分析技術(shù)(PAT)可以有效地應(yīng)用于生物發(fā)酵過程中營養(yǎng)環(huán)境變化的研究。在兩菌長期的混合培養(yǎng)中，它們之間的交流使得培養(yǎng)液的營養(yǎng)環(huán)境不斷的發(fā)生變化，進而傳遞到胞內(nèi)，產(chǎn)生一系列不同的生長及發(fā)酵行為。如果采用PAT技術(shù)研究兩菌傳代培養(yǎng)，特別是在不斷強化相互作用的過程中，檢測出培養(yǎng)基中營養(yǎng)環(huán)境的變化情況，將為揭示傳代培養(yǎng)強化兩菌相互作用促進產(chǎn)酸的作用機制提供有利信息，并為進一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝等提供支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境變化的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下—種檢測維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境變化的方法，包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取存于液氮的10-500 μ L保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和10-500 μ L保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上,28_35°C,培養(yǎng)24-48h ；②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28-35°C，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到一個新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2X107-2X101(lCFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2X 108_2X 10nCFU/mL，在28-35°C，200-280r/min搖床振蕩混菌培養(yǎng)，以24_48h為傳代周期，以體積比為1% -10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天得到混菌細胞，在傳代0-100天或0-150天中選定3-4個時間取樣,取3-4個樣；
③分純將步驟(I)②獲得的3-4個樣的混菌細胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35°C培養(yǎng)24-48h ;再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在28-35 °C，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中；④發(fā)酵將步驟(I)③獲得的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2X 107-2X 101(lCFU/mL，氧化葡糖桿菌的密度為2X 108-2X 10nCFU/mL，在28-35 °C，200_280r/min搖床振蕩培養(yǎng)10-15h ；(2)營養(yǎng)環(huán)境中物質(zhì)的測定①培養(yǎng)液的收集分別取步驟(I)④獲得的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)液、氧化葡糖桿菌培養(yǎng)液和混菌體系培養(yǎng)液l_2mL，以5000-10000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集上清，并用O. 22 μ m纖維素微孔濾膜過濾，得濾液；②樣品制備取步驟⑵①獲得的濾液10-50 μ L置于離心管中，加入50-200 μ L的O. 04-0. 14mg/ml氘標記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標物，冷凍干燥；加入40-100 μ L濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C _40°C水浴中肟化反應(yīng)60_120min ;再加入50-100 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35°C _40°C水浴進行硅烷化反應(yīng)30_60min ；③GC-TOFMS 檢測將IyL步驟⑵②獲得的樣品進到氣相色譜儀中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30mX0. 25mm i.d.，進樣口溫度為250 °C _280°C，載氣為高純氦氣，流速O. 6-0. 8ml/min，分流比3 1-20 1，柱溫箱升溫程序為初始50°C _80°C，保持2min_5min,以 4°C /min_8°C /min 的速度升到 260°C -300°C,保持 3min_8min,使用 EI 電離源，源溫 230°C -260°C，檢測器電壓 2300V-2700V，電離電壓 60eV_80eV，電流 30 μ Α-50 μ A ；質(zhì)譜檢測范圍50-800m/z ;營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的鑒定使用NIST 2005數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)相對含量的測定使用Masslynx 4. I軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內(nèi)標物的峰面積對照，得到營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的相對含量；(3)主成分分析①將步驟⑵獲得的營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的相對含量的數(shù)據(jù)進行Pareto預處理；②用Metlab 7. O (Mathworks. Inc.)軟件對步驟(3)①預處理后的數(shù)據(jù)進行主成分分析，得到差異營養(yǎng)環(huán)境標志物；(4)過程分析將差異營養(yǎng)環(huán)境標志物的相對含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析這些物質(zhì)變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境的變化。利用本發(fā)明的方法可以從揭示混菌傳代培養(yǎng)對巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌以及混菌體系產(chǎn)生的影響，找到影響傳代培養(yǎng)營養(yǎng)環(huán)境中的重要物質(zhì)，這些物質(zhì)含量的變化規(guī)律為了解傳代培養(yǎng)促進氧化葡糖桿菌生長及2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)的作用機理提供依據(jù)，從而為進一步優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。


圖I為不同傳代時間的氧化葡糖桿菌營養(yǎng)環(huán)境的主成分分析得分圖(圖1-1)和載荷圖(圖1-2)；圖2為不同傳代時間的氧化葡糖桿菌傳代培養(yǎng)過程中營養(yǎng)環(huán)境標志物的變化圖；圖3為不同傳代時間的巨大芽孢桿菌營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的主成分分析得分圖(圖3-1)和載荷圖(圖3-2)；圖4為不同傳代時間的巨大芽孢桿菌傳代培養(yǎng)過程中營養(yǎng)環(huán)境標志物的變化圖；圖5為不同傳代時間的混菌營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的主成分分析得分圖(圖5-1)和載荷圖(圖5-2)；圖6為不同傳代時間的混菌傳代培養(yǎng)過程中營養(yǎng)環(huán)境中差異物質(zhì)的變化具體實施例方式下面的實施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例I一種檢測維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境變化的方法，包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取存于液氮的500 μ L保藏于體積濃度為15 %的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和500 μ L保藏于體積濃度為15 %的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上,28°C,培養(yǎng)24h ;②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28°C,200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h，得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2 X 107CFU/mL,使氧化葡糖桿菌的密度為2 X 108CFU/mL,在28°C，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)，以24h為傳代周期，以體積比為1%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代150天得到混菌細胞，在傳代0-150天中選定4個取樣時間分別為O天、50天、100天、150天取4個樣；③分純將步驟(I)②獲得的4個樣的混菌細胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h ;再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在28°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)24h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15%的甘油水溶液中；
④發(fā)酵將步驟(I)③獲得的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2X107CFU/mL，氧化葡糖桿菌的密度為2X 108CFU/mL，在28°C，200r/min搖床振蕩培養(yǎng)IOh ；(2)營養(yǎng)環(huán)境中物質(zhì)的測定①培養(yǎng)液的收集分別取步驟(I)④⑤獲得的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)液、氧化葡糖桿菌培養(yǎng)液和混菌體系培養(yǎng)液ImL,以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心,收集 上清,并用O. 22 μ m纖維素微孔濾膜過濾；②樣品制備取步驟(2)①獲得的濾液10 μ L置于離心管中，加入50 μ L的O. 04mg/ml氣標記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標物，冷凍干燥；加入40 μ L濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C水浴中肟化反應(yīng)60min ;再加入50 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35 °C水浴進行硅烷化反應(yīng)30min ；③GC-TOFMS 檢測將IyL步驟(2)③獲得樣品進到氣相色譜中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30mX0. 25mm i. d.，進樣口溫度250°C，載氣為高純氦氣，流速O. 6ml/min，分流比3 1，柱溫箱升溫程序為初始50°C，保持2min，以4°C /min的速度升到260°C，保持3min，使用EI電離源，源溫230°C，檢測器電壓2300V，電離電壓60eV，電流30 μ A ;質(zhì)譜檢測范圍50-800m/z ;營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的鑒定使用NIST 2005數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)相對含量的測定使用Masslynx 4. I軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內(nèi)標物的峰面積對照，得到營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的相對含量；(3)主成分分析①將步驟⑵獲得的營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的相對含量的數(shù)據(jù)進行Pareto預處理；②用Metlab 7. O (Mathworks. Inc.)軟件對步驟(3)①預處理后的數(shù)據(jù)進行主成分分析，得到差異營養(yǎng)環(huán)境標志物；得到用于表達樣本相似性和差異性的得分圖和載荷圖；在得分圖中，樣品點相互之間距離越近，說明樣本的相似度越大，距離越遠，說明樣本差異越大，用來比較不同代數(shù)巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌和混菌體系傳代培養(yǎng)過程中營養(yǎng)環(huán)境的相似和差異；在載荷圖中，每個點表示各營養(yǎng)成分，距離中心點距離越遠的物質(zhì)，其在傳代培養(yǎng)的過程中的差異就越大，便可作為傳代培養(yǎng)營養(yǎng)環(huán)境變化的標志物；見圖I、圖3和圖5。(4)過程分析將差異營養(yǎng)環(huán)境標志物的相對含量按照不同傳代時間制成圖表圖2、圖4和圖6,觀察并分析這些物質(zhì)變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境的變化，進而發(fā)現(xiàn)在混菌傳代培養(yǎng)過程中起關(guān)鍵作用的營養(yǎng)環(huán)境成分，從而為揭示混菌傳代培養(yǎng)過程中兩菌的相互作用機制和培養(yǎng)條件優(yōu)化提供了方向。表I氧化葡糖桿菌傳代培養(yǎng)過程中營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)鑒定表
權(quán)利要求
1.一種檢測維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境變化的方法，包括如下步驟 (1)混菌傳代培養(yǎng) ①固體培養(yǎng) 取保藏于體積濃度為15-30 %的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)和保藏于體積濃度為15-30 %的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(BaciIIusmegaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28_35°C，培養(yǎng)24_48h ； ②種子培養(yǎng) 將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28-35°C，200-280r/min搖床振蕩培養(yǎng)24_48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液； 將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到ー個新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為 2X 107-2X 101QCFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為 2 X 108_2 X 10nCFU/mL，在 28_35°C，200-280r/min搖床振蕩混菌培養(yǎng)，以24_48h為傳代周期，以體積比為1% -10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天得到混菌細胞，在傳代0-100天或0-150天中選定3-4個時間取樣,取3-4個樣； ③分純 將步驟(I)②獲得的3-4個樣的混菌細胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35 V培養(yǎng)24-48h ;再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在28-35 V，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中； ④發(fā)酵 將步驟(I)③獲得的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2X107-2X101(lCFU/mL，氧化葡糖桿菌的密度為2X 108-2X 10nCFU/mL，在28-35 °C，200_280r/min搖床振蕩培養(yǎng)10-15h ； (2)營養(yǎng)環(huán)境中物質(zhì)的測定 ①培養(yǎng)液的收集 分別取步驟(I)④獲得的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)液、氧化葡糖桿菌培養(yǎng)液和混菌體系培養(yǎng)液l_2mL，以5000-10000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集上清，并用O. 22 μ m纖維素微孔濾膜過濾，得濾液； ②樣品制備 取步驟(2)①獲得的濾液10-50yL置于離心管中，加入50-200yL的O. 04-0. 14mg/ml氘標記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標物，冷凍干燥；加入40-100 μ L濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C -40°C水浴中肟化反應(yīng)60-120min ;再加入50-100 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟こ酰胺于35°C _40°C水浴進行硅烷化反應(yīng)30-60min ； ③GC-TOFMS檢測 將IyL步驟(2)②獲得的樣品進到氣相色譜儀中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30m X O. 25mm i. d.，進樣ロ溫度為250°C _280°C，載氣為高純氦氣，流速O. 6-0. 8ml/min，分流比3 1-20 1，柱溫箱升溫程序為初始50°C _80°C，保持2min_5min，以.4 V /min-8 V /min的速度升到260 V -300 V，保持3min_8min，使用EI電離源，源溫.230°C-260°C，檢測器電壓2300V-2700V，電離電壓60eV_80eV，電流30 μ Α-50 μ A ;質(zhì)譜檢測范圍50-800m/z ;營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的鑒定使用NIST 2005數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)相對含量的測定使用Masslynx 4. I軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內(nèi)標物的峰面積對照，得到營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的相對含量； (3)主成分分析 ①將步驟(2)獲得的營養(yǎng)環(huán)境物質(zhì)的相對含量的數(shù)據(jù)進行Pareto預處理； ②用Metlab7. O (Mathworks. Inc.)軟件對步驟(3)①預處理后的數(shù)據(jù)進行主成分分 析，得到差異營養(yǎng)環(huán)境標志物； (4)過程分析 將差異營養(yǎng)環(huán)境標志物的相對含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析這些物質(zhì)變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境的變化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中營養(yǎng)環(huán)境變化的方法，包括如下步驟(1)混菌傳代培養(yǎng)；(2)營養(yǎng)環(huán)境中物質(zhì)的測定；(3)主成分分析；(4)過程分析。利用本發(fā)明的方法可以從揭示混菌傳代培養(yǎng)對巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌以及混菌體系產(chǎn)生的影響，找到影響傳代培養(yǎng)營養(yǎng)環(huán)境中的重要物質(zhì)，這些物質(zhì)含量的變化規(guī)律為了解傳代培養(yǎng)促進氧化葡糖桿菌生長及2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)的作用機理提供依據(jù)，從而為進一步優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/11GK102634562SQ201210109628
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者任恒千, 元英進, 胡夢龍, 鄒旸, 高赟 申請人:天津大學