專利名稱：一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于篩選藥物領(lǐng)域，特別涉及一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤基質(zhì)的前提，也是瘤細(xì)胞與基質(zhì)黏附以后發(fā)生的重大變化。金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡最重要的酶系。所以MMP是治療癌癥及腫瘤的重要靶點(diǎn)。但是現(xiàn)有體外的金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的篩選方法不能模擬MMP在體內(nèi)的作用方式，很多研究證明可溶性的MMP (比如-1.-13，-2，-9)不能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。1992年Gossen等成功地利用原核基因調(diào)控元件構(gòu)建了四環(huán)素(tetracycline,Tet)真核細(xì)胞基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，它利用Tet及其衍生物對所感興趣的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。隨著人們對該系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，使這種誘導(dǎo)表達(dá)具有嚴(yán)密、高效、可控性強(qiáng)、表達(dá)泄露小等優(yōu)點(diǎn)。目前真核細(xì)胞可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究及基因治療研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，該方法建立了一個(gè)基于Retro-X Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)的篩選MMP抑制劑的方法，該方法在體外最大程度模擬了 MMP的作用環(huán)境，從而對候選藥物對MMP的作用做出更準(zhǔn)確的評(píng)估。本發(fā)明的一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，包括(I)設(shè)計(jì)引物，PCR完成擴(kuò)增金屬基質(zhì)蛋白酶的全長cDNA ；(2)將上述擴(kuò)增的cDNA插入pRetroX-Tight-Pur的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建以Retro-XTet-Off為載體的表達(dá)體系；(3)將上述構(gòu)建完成的載體對細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并篩選陽性克隆，當(dāng)細(xì)胞鋪滿皿底后，將培養(yǎng)基換成不含DOX的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)MMP的表達(dá)；(4)設(shè)空白對照組、陽性對照組、陰性對照組和不同藥物濃度處理組，用細(xì)胞膜探針對細(xì)胞膜進(jìn)行染色觀察，利用對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的分析評(píng)估候選待評(píng)價(jià)藥物對MMP的作用。所述步驟(I)中的引物為上游引物TGAGGATCCATGCATCCAGGGTCCTGGC ;下游引物AGCTCGCGACTTAACACCACAAAATGG。所述步驟(3)中的細(xì)胞系為PCS-100-011細(xì)胞系，人的大動(dòng)脈原代細(xì)胞，體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，可以形成一個(gè)類似與體內(nèi)細(xì)胞及基質(zhì)的環(huán)境。所述步驟(4)中的細(xì)胞膜探針為DiI細(xì)胞膜探針，在熒光顯微鏡下可更方便的觀 察分析。本發(fā)明利用Retro-X Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)在細(xì)胞表達(dá)，并發(fā)生作用，從而引起細(xì)胞形態(tài)變化，以細(xì)胞形態(tài)的變化作為篩選金屬基質(zhì)蛋白酶的標(biāo)志，培養(yǎng)過程中加入四環(huán)素抑制金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)，使細(xì)胞正常貼壁生長，呈正常的細(xì)胞形態(tài)。等細(xì)胞貼壁后，換成不含四環(huán)素的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化。細(xì)胞水平篩選抑制齊U，細(xì)胞表達(dá)的蛋白酶的作用方式更加接近體內(nèi)。有益.效果本發(fā)明建立了一個(gè)基于Retro-X Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)的，能最大程度模擬MMP在體內(nèi)的作用的方法，可用于MMP抑制劑的篩選，能對蛋白酶抑制劑有更準(zhǔn)確的判斷，細(xì)胞形態(tài)作為篩選標(biāo)志更為直觀和靈敏，利用細(xì)胞膜熒光探針，使檢測更為方便快速，具有良好的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I實(shí)施例以MMP-13為例，但是本專利不僅限于MMP-13，也可用于其他金屬基質(zhì)蛋白酶。本實(shí)施例米用 Clontech 公司 Retro-X Tet-Off Advanced InducibleExpression System,包含pRetroX Tet-Off 質(zhì)粒，pRetroX-Tight-Pur 質(zhì)粒以及pRetroX-Tight-Pur-luc對照質(zhì)粒。采用GP293細(xì)胞為包裝細(xì)胞。采用PCS-100-011作為靶細(xì)胞。(1)MMP-13表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建①總RNA提取從經(jīng)TNF- α處理的UT-SCC-7細(xì)胞，用Trizol抽提總RNA。然后利用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，oligo(dT)作為引物。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈。②MMP-13 全長 cDNA 的擴(kuò)增上游引物 TGAGGATCCATGCATCCAGGGTCCTGGC ;下游引物 AGCTCGCGACTTAACACCACAAAATGG。退火溫度為 65°C -55°C 降落 PCR，72 攝氏度延伸 2min，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物長度為I. 4kb。將PCR產(chǎn)物用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物。(2)將上述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物及pRetroX-Tight-Pur經(jīng)BamH I和Nurl均雙酶切過夜，回收。插將酶切過的PCR產(chǎn)物和酶切過pRetroX-Tight-Pur用T4DNA連接酶，16攝氏度連接過夜，轉(zhuǎn)化到DH5a菌種,用100ug/ml的氨節(jié)青霉素篩選陽性質(zhì)?？寺?抽提質(zhì)粒,命名為 pRetroX-MMP ；(3)穩(wěn)轉(zhuǎn) RetroX-Tet-Of f advanced 細(xì)胞系的建立采用商品化的Retro X universal Packing System(clontech)。按照說明進(jìn)行操作建立RetroX-Tet-Offadvanced穩(wěn)定細(xì)胞系。簡要的步驟如下包裝質(zhì)粒和pRetroXTet-Off質(zhì)?；旌虾?，共轉(zhuǎn)染GP293細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)候，收獲病毒。利用qRT-PCR檢測滴度。將病毒感染PCS-100-011細(xì)胞。用500μ g/ml的G418篩選穩(wěn)定的細(xì)胞系。TetR單抗(購自clontech)選擇出高表達(dá)的細(xì)胞系,從而獲得pRetroX Tet-Off穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系。該細(xì)胞系命名為Tet-Off-PCS細(xì)胞系。(3) pRetroX-MMP 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。①將上述構(gòu)建完成的載體pRetroX-MMP同樣利用Retro X universal PackingSystem包裝，收獲病毒后對細(xì)胞系Tet-Off-PCS進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并用5 μ g/ml的Puromycin篩選陽性克隆。再利用RT-PCR的方法篩選(引物及PCR條件同MMP cDNA的擴(kuò)增)出含四環(huán)素時(shí)MMP低表達(dá)，不含四環(huán)素時(shí)高表達(dá)的克隆。從而獲得雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，命名為pRetro-MMP 細(xì)胞系。②將pRetroX-Tight-Pur-luc以同(3)步驟中①的方法轉(zhuǎn)染Tet-Off-PCS細(xì)胞系，篩選陽性克隆。將獲得的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系命名為pRetr0-C0n。 (4)將篩選得到的陽性細(xì)胞種入培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基為DMEM(含10%小牛血清及I μ g/ml的四環(huán)素)。當(dāng)細(xì)胞生長直到鋪滿70%的皿底后，大約48h-72h，將培養(yǎng)基換為不含四環(huán)素的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)MMP的表達(dá)；(5)各處理組的設(shè)置下面所有處理組都需要在pRetro-MMP細(xì)胞系和pRetro-con細(xì)胞系中平行進(jìn)行。各處理組設(shè)置方法空白對照I :用候選藥物的溶劑作為對照，比如所用藥物溶于乙醇，則用乙醇作為對照。將溶劑按照候選藥物組使用的濃度溶解于培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為DMEM，不含四環(huán)素，不含小牛血清?？瞻讓φ? :用含I μ g/ml的四環(huán)素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。陰性對照組用不含四環(huán)素和血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。陽性對照組因該方法為首創(chuàng)方法，尚未有合適的陽性對照，所以采用四環(huán)素作為抑制劑，抑制MMP的表達(dá)，作為陽性對照。使用濃度推薦為50ng/ml。即用含50ng/ml的四環(huán)素，不含血清的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞。不同藥物濃度組將候選藥物稀釋成各梯度濃度，可以按I : 10作倍比稀釋。即用不含四環(huán)素及血清的DMEM培養(yǎng)液將候選待評(píng)價(jià)藥物稀釋到特定濃度。設(shè)立各處理組的目的空白對照I :確定候選藥物的溶劑的對實(shí)驗(yàn)的影響?？瞻讓φ? :確定MMP基本不表達(dá)時(shí)的對細(xì)胞狀態(tài)的影響。陰性對照MMP高表達(dá)對細(xì)胞狀態(tài)的影響。 陽性對照MMP活性或表達(dá)被抑制時(shí)對細(xì)胞狀態(tài)的影響。不同藥物濃度組不同濃度篩選藥物的對細(xì)胞狀態(tài)的影響。(6) pRetro-con細(xì)胞系報(bào)告基因檢測采用商品化的Iuciferase檢測試劑盒進(jìn)行。簡要步驟為去除培養(yǎng)基,加入試劑盒提供的裂解液，3000rpm離心5分鐘收集上清液，加入熒光素酶底物，用化學(xué)發(fā)光儀檢測熒光RLU。(7)細(xì)胞形態(tài)的觀察在顯微鏡下觀察到細(xì)胞空白對照2和陰性對照有較為明顯的差異時(shí)，向各個(gè)樣品中加入用PBS配制的4%多聚甲醛固定細(xì)胞。然后加入含IOmM DiI的無血清的DMEM培養(yǎng)基，37 °C孵育20分鐘，然后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。本實(shí)施例最大程度模擬了腫瘤細(xì)胞的MMP開始異常表達(dá)的情況，同時(shí)細(xì)胞外的基質(zhì)也非常類似正常的基質(zhì)，當(dāng)MMP開始異常表達(dá)之后，過表達(dá)的MMP開始降解細(xì)胞外基質(zhì)，這一過程模擬了腫瘤細(xì)胞如何降解細(xì)胞外基質(zhì)。MMP異常表達(dá)的細(xì)胞通常會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的伸展能力，其在形態(tài)學(xué)上更加不規(guī)則。在此過程中可加入藥物，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，從而判斷藥物對MMP有沒有抑制作用。如果經(jīng)處理后細(xì)胞的形態(tài)相對規(guī)則，則認(rèn)為該藥物對MMP有一定抑制作用。
MMP異常表達(dá)還可能出現(xiàn)另一種情況即MMP作用相對較強(qiáng)，會(huì)使細(xì)胞部分脫離培養(yǎng)基質(zhì)，從而出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變的圓潤，而且細(xì)胞周邊變得光亮。也有些MMP可能對細(xì)胞不能引起比較明顯的形態(tài)變化。需要對細(xì)胞進(jìn)行報(bào)告基因檢測，確定候選藥物對表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)效率的影響，排除藥物是抑制了 MMP的表達(dá)而不是作用于MMP本身起抑制作用。利用pRetroX-Tight-Pur-luc對照質(zhì)粒可以檢測候選藥物對pRetroX-MMP表達(dá)效率的影響。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，包括 (1)設(shè)計(jì)引物，PCR完成擴(kuò)增金屬基質(zhì)蛋白酶的全長CDNA； (2)將上述擴(kuò)增的cDNA插入pRetroX-Tight-Pur的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建以Retro-XTet-Off為載體的表達(dá)體系； (3)將上述構(gòu)建完成的載體對細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并篩選陽性克隆，當(dāng)細(xì)胞鋪滿皿底后，將培養(yǎng)基換成不含DOX的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)MMP的表達(dá)； (4)設(shè)空白對照組、陽性對照組、陰性對照組和不同藥物濃度處理組，用細(xì)胞膜探針對細(xì)胞膜進(jìn)行染色觀察，利用對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的分析評(píng)估候選待評(píng)價(jià)藥物對MMP的作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟(I)中的引物為上游引物TGAGGATCCATGCATCCAGGGTCCTGGC ;下游引物AGCTCGCGACTTAACACCACAAAATGG。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟(3)中的細(xì)胞系為PCS-100-011細(xì)胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所述步驟(4)中的細(xì)胞膜探針為DiI細(xì)胞膜探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，包括(1)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增金屬基質(zhì)蛋白酶的全長cDNA；(2)構(gòu)建以Retro-X Tet-Off為載體的表達(dá)體系；(3)將上述構(gòu)建完成的載體對細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并篩選陽性克隆，當(dāng)細(xì)胞鋪滿皿底后，將培養(yǎng)基換為不含DOX的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)；(4)篩選出金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑。本發(fā)明建立了一個(gè)基于Tet-off表達(dá)系統(tǒng)的，能最大程度模擬MMP的作用環(huán)境的方法，用于MMP抑制劑的篩選，相對一般金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑體外篩選更準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102618620SQ201210103880
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者史小娟, 魯曉鋒 申請人:上海云澤生物科技有限公司, 上海健耕醫(yī)藥科技有限公司