專利名稱：肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌的方法及pna探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PNA-FISH法鑒定沙門氏菌屬的方法，尤其涉及用于鑒定主要食源致病性沙門氏菌(Salmonella)的方法和PNA探針。
背景技術(shù)：
沙門氏菌屬是一群形態(tài)和培養(yǎng)特性都類似的腸桿菌科中的一個(gè)大屬，也是腸桿菌科中最重要的一個(gè)屬。沙門氏菌是革蘭氏陰性致病菌，在自然界分布極廣，且株型繁多，目前全世界已分離出2，523個(gè)血清型。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，我國每年發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件占食物中毒事件總數(shù)的30% 90%，人數(shù)占食物中毒總?cè)藬?shù)的60% 90% (陳建林等， 1996)，而在細(xì)菌性食物中毒的病原菌中，約40%為沙門氏菌。而在引起沙門氏菌中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等動(dòng)物性食品，這些食品中含有多種豐富的營養(yǎng)成分，沙門氏菌會(huì)非常迅速地繁殖。人們一旦攝入含有大量沙門氏菌(IO5 106cfu/g)的食品，就會(huì)引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而在毒素的作用下發(fā)生食物中毒。沙門氏菌等微生物污染已對我們的食品安全構(gòu)成了主要的威脅。不過與人類疾病有關(guān)的血清型主要集中于A E群，其中以鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)、腸炎沙門氏菌(S. Enteritidis)及豬霍亂沙門氏菌 (S. Choleraesuis)最為常見。肽核酸是1991年由丹麥科學(xué)家Nielsen等人設(shè)計(jì)的一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA模擬物，其骨架結(jié)構(gòu)單元為(2-氨乙基)甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接與主骨架的氨基N上，可以序列特異地與DNA、RNA結(jié)合。其骨架為電中性，與DNA-DNA或 RNA-DNA互補(bǔ)鏈相比，PNA-DNA和PNA-RNA互補(bǔ)不存在靜電排斥作用，因此具有很高的DNA 或RNA親和性，在無錯(cuò)配的情況下其結(jié)合具有高穩(wěn)定性，且雜交速度快，具有良好的細(xì)胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。同時(shí)PNA探針結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)(FISH)，與傳統(tǒng)生化鑒定比較，PNA-FISH法可節(jié)約大量時(shí)間，若不計(jì)增菌時(shí)間，一般耗時(shí)不超過4個(gè)小時(shí)。與PCR 等方法比較，PNA-FISH法的結(jié)果判斷基于熒光檢測和形態(tài)檢測兩部分，較PCR法等假陽性較低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是設(shè)計(jì)了具主要食源致病性沙門氏菌特異性的PNA探針，本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌的方法，實(shí)現(xiàn)對主要食源致病性沙門氏菌的快速檢測。為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌用PNA探針Sal-invA-Ι，所述的PNA探針的序列為 TCTGGATGGTATGCC。為了驗(yàn)證探針的敏感度和特異性，用BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)對探針進(jìn)行了驗(yàn)證。BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，所設(shè)計(jì)的探針Sal-invA-1對主要食源性沙門氏菌具有較高的特異性，包括鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)、丙型副傷寒沙門氏菌(S. Paratyphi)、腸炎沙門氏菌(S. Enteritidis)、雞傷寒沙門氏菌(S. Gallinarum)、 阿哥納沙門氏菌(S. Agona)、海德堡沙門氏菌(S. Heidelberg)、紐波特沙門氏菌 (S. Newport)、雞白痢沙門氏菌(S. Pullorum)、都柏林沙門氏菌(S. Dublin)、豬霍亂沙門氏菌(S. Choleraesuis)等常見沙門氏菌。但也有一些非目標(biāo)細(xì)菌如喜溫硫桿菌 (Acidithiobacillus caldus)、硫酸鹽還原菌(Desulfobulbus propionicus)、解木聚糖擬桿菌(Bacteroides xylanisolvens)、不透明紅球菌(Rhodococcus opacus)等與探針 Sal-invA-Ι有重合區(qū)域，但上述菌株均與沙門氏菌關(guān)系較為疏遠(yuǎn)，也并非常見食品中的致病菌。因此，從理論角度分析，Sal-invA-Ι探針有較好的靈敏度和特異性，可用于沙門氏菌 PNA檢測分析方法的建立。為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌的方法，該方法包括以下的步驟I)離心收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，PBS調(diào)整細(xì)菌濃度至0D600 = O. 5-2. 0，取10 μ I 菌液于98 %酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80 %的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干;2)將25μ I含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液滴加于玻片上，所述的PNA探針的序列為TCTGGATGGTATGCC，55°C作用I. 5小時(shí)，雜交后玻片于55°C預(yù)熱的洗滌緩沖液中洗滌2 次，每次10分鐘，取2 5μ I菌液涂片，風(fēng)干后熒光顯微鏡觀察熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。作為優(yōu)選，所述的雜交緩沖液ρΗ7. 5，包括10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl, 30% (v/v)甲酰胺,0. 1% (w/v)焦磷酸鈉,0.2% (w/v)聚乙烯卩比咯燒酮,O. 2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA,0. 2% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl。作為優(yōu)選，所述的洗滌緩沖液pHIO，包括15mM Tris, 15mM NaCl和O. I % (v/v) TritonX-IOOo本發(fā)明由于采用上述的技術(shù)方案，PNA具有與DNA和RNA特異性結(jié)合的高穩(wěn)定性、 雜交快速性、及其良好的細(xì)胞穿透性，使本發(fā)明的檢測方法具有快速，準(zhǔn)確、靈敏的特性。同時(shí)結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)使檢測具有分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重保證，更加提高了鑒定的準(zhǔn)確率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I PNA-FISH敏感度驗(yàn)證肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌用PNA探針Sal-invA-Ι，所述的PNA探針的序列如表I。表I PNA探針序列
探針序列(5’ -3’ )探針位置突光標(biāo)記喊基序列；GenBank號(hào)BacUinaCTGCCTCCCGTAGGA-FAM—Sal-invA-1TCTGGATGGTATGCC3040012-3040026； AE006468. IaBacUin 為陽性對照探針;引用自 Perry-O，Keefe, H.，Stender, H.，Broomer, A.，Oliveira, K.，CoulI, J.，Hyldig-Nielsen，J. J.，2001. Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection， identification and enumeration of specificmicro-organisms. J Appl Microbiol 90(2) :180-189。探針合成和標(biāo)記由韓國Panagene完成。我們選取了包括沙門氏菌兩個(gè)種(Salmonellaentrica 和 Salmonella bongori) 的19個(gè)血清型，共計(jì)25株沙門氏菌進(jìn)行了探針的靈敏度實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)方法如下所述離心(2000g，5min)收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至OD6tltl = 0. 5-2.0，取10 μ I菌液于98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；25μ I含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液(pH7. 5，10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmMNaCl, 30% (v/v)甲酰胺，0. 1% (w/v)焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5mMNa2EDTA，0. 2% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl) 滴加于玻片上，55°C作用I. 5小時(shí)，雜交后玻片于55°C預(yù)熱的洗滌緩沖液(pH10，5mM Tris, 15mMNaCl,0. 1% (v/v) TritonX-100)中洗滌2次，每次10分鐘，取2 5 μ I菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。每次試驗(yàn)(包括以下實(shí)例2和3)都同步進(jìn)行陽性對照和陰性對照試驗(yàn)，陽性對照試驗(yàn)，用探針BacUin替代其他探針，而陰性對照試驗(yàn)中，用空白替代其他探針。如表2所示，除了鴨沙門沙門氏菌(S. Anatum)、斯坦利沙門氏菌(S. Stanley)、康德沙門氏菌(S. Kande)、諾拉沙門氏菌(S. Nola)、巴基斯坦沙門氏菌(S. Pakistan)、吉偉沙門氏菌(S. Give)、維肖沙門氏菌(S. Virchow) 8株菌株之外，其余17株沙門氏菌全部與 Sal-invA-Ι探針呈雜交陽性。此外，所有的菌株都能和陽性對照探針BacUin結(jié)合。上述結(jié)果和預(yù)設(shè)結(jié)果基本一致，探針Sal-invA-Ι能檢測到自己的目標(biāo)菌株，有較高的敏感度。表2沙門氏菌PNA探針靈敏度驗(yàn)證
權(quán)利要求
1.肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌用PNA探針，其特征在于PNA探針的序列為 TCTGGATGGTATGCC。
2.肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)離心收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，PBS調(diào)整細(xì)菌濃度至0D_=0.5-2. 0，取10μ1菌液于 98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；2)將25μ1含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液滴加于玻片上，所述的PNA探針的序列為 TCTGGATGGTATGCC, 55°C作用I. 5小時(shí)，雜交后玻片于55°C預(yù)熱的洗滌緩沖液中洗滌2次，每次10分鐘，取2 5μ1菌液涂片，風(fēng)干后熒光顯微鏡觀察熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌的方法，其特征在于雜交緩沖液ρΗ7· 5,包括10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (v/v)甲酰胺,0.1% (w/ V)焦磷酸鈉，O. 2% (w/v)聚乙烯卩比咯燒酮,O. 2% (w/v)聚鹿糖，5 mM Na2EDTA, O. 2% (v/v) TritonX-100,50 mM Tris/HCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌的方法，其特征在于洗滌緩沖液 pHIO，包括15 mM Tris，15mM NaCl 和 O. 1% (v/v) TritonX-IOO0
全文摘要
本發(fā)明涉及PNA-FISH法鑒定沙門氏菌屬的方法，尤其涉及用于鑒定主要食源致病性沙門氏菌(Salmonella)的方法和PNA探針。肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測沙門氏菌用PNA探針Sal-invA-1，所述的PNA探針的序列為TCTGGATGGTATGCC。本發(fā)明的PNA具有與DNA和RNA特異性結(jié)合的高穩(wěn)定性、雜交快速性、及其良好的細(xì)胞穿透性，使本發(fā)明的檢測方法具有快速，準(zhǔn)確、靈敏的特性。同時(shí)結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)使檢測具有分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重保證，更加提高了鑒定的準(zhǔn)確率。
文檔編號(hào)C12Q1/10GK102586466SQ20121007906
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者何永強(qiáng), 吳珊, 帥江冰, 張曉峰, 李可 申請人:浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院