專利名稱：肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌的方法及pna探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用PNA-FISH法鑒定弧菌屬的方法，尤其涉及用于鑒定重要致病性弧菌(Vibrio )的方法和PNA探針。
背景技術(shù)：
我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物的病害種類達(dá)200余種，常年養(yǎng)殖病害發(fā)病率達(dá)50%以上，損失率 20%左右，估計(jì)每年因水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問(wèn)題而造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)百億元之巨，并且還有上升的趨勢(shì)。從近年來(lái)我國(guó)海水養(yǎng)殖病害監(jiān)測(cè)報(bào)告來(lái)看，病害以生物源性疾病為主，其中又以弧菌(Vj·briο )疾病為重,霍亂弧菌(K cholerae )、副溶血弧菌(K parahaemolyticus )、 哈維氏弧菌(K harveyi )、創(chuàng)傷弧菌(K vulnificus )、溶藻弧菌(K alginolyticus )、鰻弧菌(K 梅氏弧菌(K等都是重要的細(xì)菌病原。因此,發(fā)展對(duì)弧菌病原菌的快速檢測(cè)和鑒定技術(shù)對(duì)于食品安全、水產(chǎn)養(yǎng)殖等均具有十分重要的意義。肽核酸是1991年由丹麥科學(xué)家Nielsen等人設(shè)計(jì)的一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA模擬物，其骨架結(jié)構(gòu)單元為(2-氨乙基)甘氨酸，堿基部分通過(guò)亞甲基羰基連接與主骨架的氨基N上，可以序列特異地與DNA、RNA結(jié)合。其骨架為電中性，與DNA-DNA或 RNA-DNA互補(bǔ)鏈相比，PNA-DNA和PNA-RNA互補(bǔ)不存在靜電排斥作用，因此具有很高的DNA 或RNA親和性，在無(wú)錯(cuò)配的情況下其結(jié)合具有高穩(wěn)定性，且雜交速度快，具有良好的細(xì)胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。同時(shí)PNA探針結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)(FISH)，與傳統(tǒng)生化鑒定比較，PNA-FISH法可節(jié)約大量時(shí)間，若不計(jì)增菌時(shí)間，一般耗時(shí)不超過(guò)4個(gè)小時(shí)。與PCR 等方法比較，PNA-FISH法的結(jié)果判斷基于熒光檢測(cè)和形態(tài)檢測(cè)兩部分，較PCR法等假陽(yáng)性較低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是設(shè)計(jì)了具弧菌特異性的PNA探針，本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)弧菌屬的快速檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌用PNA探針，PNA探針的序列為TAC CCC CCT CTA
CAG。為了驗(yàn)證探針的靈敏度和特異性，用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/)和 ProbeCheck (http://www. microbial-ecology. net/probecheck)對(duì)探針進(jìn)行了 驗(yàn)證。BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，所設(shè)計(jì)的探針具有較高的特異性。但也有一些的非目標(biāo)細(xì)菌與探針 Vib_16S_l 有重合區(qū)域，如wodanis, Pantoea agglomerans, Listonella pelagia，Allomonas enterica，Listonella angui11 arum, Exiguobacteri um aurantiacum, Thorsellia anophelis，Antarctic bacterium，Rhodobacter■，但以上非目標(biāo)細(xì)菌與弧菌關(guān)系都較疏遠(yuǎn)，也并非常見(jiàn)食品中的致病菌，因此一般不會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。ProbeCheck驗(yàn)證結(jié)果顯示，探針Vib_16S_l能檢測(cè)到ProbeCheck中小亞基(16S/18S)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的2000株弧菌，但同時(shí)也能檢測(cè)到635株非目標(biāo)菌，其中包括 352個(gè)非培養(yǎng)細(xì)菌，對(duì)弧菌屬的特異性為99. 86%，靈敏度為100%。又將PNA探針與大亞基 (23S/28S)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅有一株i/i辦 a與之匹配，也不會(huì)與我們的目標(biāo)菌混淆。為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌的方法，該方法包括以下的步驟
1)離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至 0D600=0. 5-2. O,取10μ1菌液于98%酒精清洗過(guò)的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；
2)25μ1含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液滴加于玻片上，PNA探針的序列為TAC CCC CCT CTA CAG，55°C作用1_1. 5小時(shí)，雜交后玻片于55°C預(yù)熱的洗滌緩沖液中洗滌2次，每次 10分鐘，取2 5μ1菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。作為優(yōu)選，上述的雜交緩沖液ρΗ7· 5，包括10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (v/v)甲酰胺,0.1% (w/v)焦磷酸鈉,O. 2% (w/v)聚乙烯卩比咯燒酮,O. 2% (w/v)聚鹿糖, 5 mM Na2EDTA,O. 2% (v/v) TritonX-100,50 mM Tris/HCl。作為優(yōu)選，上述的洗滌緩沖液pHIO，包括5 mM Tris, 15mM NaCl,O. 1% (v/v) TritonX-IOOo2.固相PNA熒光原位雜交
本發(fā)明由于采用上述的技術(shù)方案，PNA具有與DNA和RNA特異性結(jié)合的高穩(wěn)定性、雜交快速性、及其良好的細(xì)胞穿透性，使本發(fā)明的檢測(cè)方法具有快速，準(zhǔn)確、靈敏的特性。同時(shí)結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)使檢測(cè)具有分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重保證，更加提高了鑒定的準(zhǔn)確率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I PNA-FISH敏感度驗(yàn)證
肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌用PNA探針，PNA探針的序列為TAC CCC CCT CTA
CAG。經(jīng)過(guò)BLAST和ProbeCheck驗(yàn)證，所設(shè)計(jì)的探針Vib_16S_l理論上具有很高的靈敏度和特異性。與陽(yáng)性對(duì)照探針BacUin —起被用于后續(xù)檢測(cè)。表I PNA探針序列
探針序列(5’ -3’ )熒光標(biāo)記探針位置堿基序列；GenBank號(hào)BacllinaCTGCCTCCCGTAGGA-FAM—Vib-16S-ITACCCCCCTCTACAG106-120;HM590221.I
a BacUin 為陽(yáng)性對(duì)照探針；引用自 Perry-0’Keefe, H. , Stender, H. , Broomer, A., Oliveira, Κ. , Coull, J. , Hyldig-Nielsen, J. J. , 2001. Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection, identification and enumeration of specific micro-organisms. J Appl Microbiol 90(2): 180-189.
探針合成和標(biāo)記由韓國(guó)Panagene完成。 本發(fā)明選取了 7種弧菌共12株細(xì)菌進(jìn)行了靈敏度驗(yàn)證試驗(yàn)方法如下所述離心(2000g，5min)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至0D_=0. 5-2. O,取10μ1菌液于98%酒精清洗過(guò)的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80% 的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；25μ1含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液(pH7. 5，10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (v/v)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸鈉，O. 2% (w/v)聚乙烯卩比咯烷酮，O. 2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA, O. 2% (v/v) TritonX-100, 50 mM Tris/HCl)滴加于玻片上，55°C作用1_1.5小時(shí)，雜交后玻片于551預(yù)熱的洗滌緩沖液(？!110，5 mM Tris, 15mM NaCl,O. 1% (v/v) TritonX-100)中洗滌2次，每次10分鐘，取2 5μ1菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。每次試驗(yàn)(包括以下實(shí)例2和3)都同步進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照試驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，用探針BacUin替代其他探針，而陰性對(duì)照試驗(yàn)中，用空白替代其他探針。結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)的弧菌菌株都與陽(yáng)性對(duì)照探針BacUin和探針Vib-16S-l呈雜交陽(yáng)性(見(jiàn)表2)。上述結(jié)果和預(yù)設(shè)結(jié)果一致，探針Vib-16S-l能檢測(cè)到自己的目標(biāo)菌株，有較高的敏感度。雜交條件被優(yōu)化確立后，我們進(jìn)一步研究了 Vib-16S_l探針的靈敏度和特異性。 我們選取了 7種弧菌共12株細(xì)菌進(jìn)行了靈敏度驗(yàn)證。如表2所示，
表2 弧菌PNA探針靈敏度驗(yàn)證
權(quán)利要求
1.肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌用PNA探針，其特征在于PNA探針的序列為TAC CCC CCT CTA CAG。
2.肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至 OD600=O. 5-2. O,取10μ1菌液于98%酒精清洗過(guò)的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；2)25μ1含500pmole/mlPNA的雜交緩沖液滴加于玻片上，PNA探針的序列為TAC CCC CCT CTA CAG，55°C作用1_1. 5小時(shí)，雜交后玻片于55°C預(yù)熱的洗滌緩沖液中洗滌2次，每次 10分鐘，取2 5μ1菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌的方法，其特征在于雜交緩沖液ρΗ7. 5,包括10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (v/v)甲酰胺，0.1% (w/ V)焦磷酸鈉，O. 2% (w/v)聚乙烯卩比咯燒酮,O. 2% (w/v)聚鹿糖，5 mM Na2EDTA, O. 2% (v/v) TritonX-100,50 mM Tris/HCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌的方法，其特征在于洗滌緩沖液 pHIO，包括5 mM Tris，15mM NaCl,0. 1% (v/v) TritonX-IOO0
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用PNA-FISH法鑒定弧菌屬的方法，尤其涉及用于鑒定重要致病性弧菌(Vibrio)的方法和PNA探針。肽核酸原位熒光雜交技術(shù)檢測(cè)弧菌用PNA探針，PNA探針的序列為TACCCCCCTCTACAG。本發(fā)明的PNA具有與DNA和RNA特異性結(jié)合的高穩(wěn)定性、雜交快速性、及其良好的細(xì)胞穿透性，使本發(fā)明的檢測(cè)方法具有快速，準(zhǔn)確、靈敏的特性。同時(shí)結(jié)合原位熒光雜交技術(shù)使檢測(cè)具有分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重保證，更加提高了鑒定的準(zhǔn)確率。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102586465SQ20121007887
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者吳珊, 帥江冰, 張曉峰, 朱振江, 李可 申請(qǐng)人:浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院