專利名稱：地溝油快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于地溝油檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地溝油快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的各種地溝油檢測(cè)方法主要有常規(guī)油脂理化指標(biāo)法(參見(jiàn)潘劍宇，尹平河， 余漢豪.2003.潲水油、煎炸老油與合格食用植物油的鑒別研究.食品科學(xué)24 27-29以及張漩，余漢豪，單習(xí)章.2004.餐飲業(yè)廢油脂有害成分及特征指標(biāo)研究.廣州環(huán)境科學(xué)19: 29-31.)、膽固醇含量判定法(張蕊，祖麗亞，樊鐵.2006.測(cè)定膽固醇含量鑒別地溝油的研究.中國(guó)油脂31 :65-67)、薄層色譜檢測(cè)極性物法(尹平河，潘劍宇，趙玲.2004.薄層色譜法快速鑒別潲水油和煎炸老油的研究.食品科學(xué)29 47-49)、電導(dǎo)率法(朱銳，王睿，王小京.2008.電導(dǎo)率測(cè)定在鑒別食用植物油摻偽應(yīng)用研究.糧食與油脂11 :42-43)、頂空-氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜檢測(cè)油脂的揮發(fā)性成分(全常春，尹平河.2004.精煉餐飲業(yè)地溝油揮發(fā)性危害成分的GC/MS靜態(tài)頂空分析.食品科學(xué)25 =128-134)、脂肪酸相對(duì)不飽和度(蘭慶豐， 梁敏.2006.氣相色譜法鑒別摻假食用油的研究.刑事技術(shù)I :37-39)、測(cè)真菌毒素法(黃軍，熊華，李亮.2008.潲水油在精煉中衛(wèi)生指標(biāo)的檢測(cè)與分析.中國(guó)油脂33 :70-74)、表面活性劑殘留法(曹文明，薛斌，楊波濤，丁丹華，孫禧華.2011.地溝油檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展與研究.糧食科技與經(jīng)濟(jì)36 42-44以及張清，沈群.2010.我國(guó)食用植物油中地溝油檢測(cè)技術(shù)回顧.食品科技35 :311-314)等。方法考察的對(duì)象多為地溝油中的特征化學(xué)成分，涉及的技術(shù)手段也主要為分析化學(xué)方法如熒光光譜、氣相色譜、原子吸收光譜等。現(xiàn)有的各種檢測(cè)方法都存在或特征指標(biāo)專一性不強(qiáng)，或檢測(cè)靈敏度不高，或檢測(cè)準(zhǔn)確性不高，僅能在一定范圍內(nèi)適用特定類型的地溝油的檢測(cè)判定的特點(diǎn)。由于地溝油不是一種化學(xué)組分固定不變的物質(zhì)，因來(lái)源不同、精煉加工程度不同，其內(nèi)在物質(zhì)組成會(huì)呈現(xiàn)或多或少的差異。因此，包括以上列舉的現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)，都未能針對(duì)地溝油獨(dú)有的特征指標(biāo)及其量值來(lái)進(jìn)行檢測(cè)判斷，檢測(cè)結(jié)果的判定不能適用所有類型的地溝油(曹文明，薛斌，楊波濤，丁丹華，孫禧華.2011.地溝油檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展與研究.糧食科技與經(jīng)濟(jì)36 :42-44)。 用分析化學(xué)的方法去測(cè)定地溝油中有害殘留的成分，容易出現(xiàn)漏檢和對(duì)不同有害成分檢測(cè)靈敏度不夠的情況。地溝油成分的復(fù)雜性，又導(dǎo)致了無(wú)法根據(jù)分析化學(xué)所測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)而制定一個(gè)統(tǒng)一的，切實(shí)可行的地溝油檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。換句話說(shuō)，要根據(jù)有害物質(zhì)殘留量來(lái)制定地溝油標(biāo)準(zhǔn)是極其困難的，甚至是不可能的。因此，要解決地溝油檢測(cè)這一技術(shù)問(wèn)題，必須另辟蹊徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種地溝油快速檢測(cè)方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中地溝油檢測(cè)方法中以特定的化學(xué)組分為目標(biāo)化合物為檢測(cè)目標(biāo)導(dǎo)致檢測(cè)方法只能在一定范圍內(nèi)適用特定類型的地溝油的缺陷。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是
一種地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(I)按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在培養(yǎng)基中進(jìn)行正常細(xì)胞的培養(yǎng)，當(dāng)正常細(xì)胞達(dá)到預(yù)定數(shù)量時(shí)加入待測(cè)地溝油樣品繼續(xù)培養(yǎng)；(2)對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞死亡或存活情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)或?qū)?xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)培養(yǎng)后的細(xì)胞毒性或細(xì)胞死亡或存活情況判斷待測(cè)地溝油樣品是否為地溝油。優(yōu)選的，所述方法步驟(I)待測(cè)地溝油樣品在加入培養(yǎng)基前進(jìn)行過(guò)濾處理。優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)正常細(xì)胞的時(shí)間控制在I 36小時(shí)。優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中加入的待測(cè)地溝油樣品的體積為O. lmL。優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中加入待測(cè)地溝油樣品繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間控制在24 48 小時(shí)。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中細(xì)胞死亡情況統(tǒng)計(jì)是采用考馬斯亮藍(lán)染色、活/死細(xì)胞染色方法處理繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)藍(lán)染的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行死亡細(xì)胞統(tǒng)計(jì)。優(yōu)選的，所述方法還包括在步驟(I)進(jìn)行正常細(xì)胞的培養(yǎng)后加入常用食用油進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，以常用食用油為對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)常用食用油與待測(cè)地溝油樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中判斷待測(cè)地溝油樣品是否為地溝油是通過(guò)先分別采用地溝油與常用食用油處理細(xì)胞培養(yǎng)后的細(xì)胞存活或死亡情況進(jìn)行對(duì)比統(tǒng)計(jì)，獲得常用食用油與地溝油間的閾值；根據(jù)待測(cè)地溝油樣品處理細(xì)胞培養(yǎng)后的細(xì)胞存活或死亡情況與閾值的比較判斷待測(cè)地溝油樣品是否為地溝油。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中設(shè)置若干個(gè)閾值將地溝油分為低度毒性地溝油、中度毒性地溝油和高度毒性地溝油。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞死亡或存活情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)是通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的。眾所周知，地溝油問(wèn)題的關(guān)鍵是它對(duì)人體健康的潛在危害。凡對(duì)人體健康有毒害的物質(zhì)，必然對(duì)細(xì)胞有毒害作用，因?yàn)榧?xì)胞對(duì)環(huán)境有毒物質(zhì)的敏感度要大大高于人體。因此，本發(fā)明提出了一個(gè)生物方法來(lái)鑒定地溝油，即用人的細(xì)胞(肝臟細(xì)胞和腎臟細(xì)胞等) 來(lái)鑒定地溝油是否具有毒性。實(shí)際上，用細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)化合物進(jìn)行毒理鑒定，已在國(guó)外藥物公司新藥開(kāi)發(fā)中應(yīng)用 20 多年之久(Fang, J. F.，Y. Kitagawa, S. Ishikawa. 1986. Toxicity assessments of chemical substances using primary culture of rat hepatocytes. Sangyo igaku 28:438-444)。本發(fā)明提出的地溝油生物細(xì)胞檢測(cè)體系，正是基于細(xì)胞對(duì)有毒物質(zhì)敏感這一特性，將檢測(cè)的重點(diǎn)放在是否對(duì)細(xì)胞有毒這一關(guān)鍵問(wèn)題，而對(duì)地溝油可能含有的有毒物質(zhì)的種類和濃度則予以忽略。這是一個(gè)地溝油檢測(cè)的新思路。本方法的主要思路為在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入地溝油，若地溝油中含有有毒物質(zhì)，細(xì)胞的生理和代謝會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。例如，細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)繁殖的速度、細(xì)胞炎癥分子的表達(dá)、細(xì)胞代謝物質(zhì)的分泌等都會(huì)發(fā)生顯著的變化。這種顯著的變化，可以用相應(yīng)的儀器設(shè)備加以檢測(cè)和記錄。利用計(jì)算機(jī)技術(shù)，快速、準(zhǔn)確地處理生理生化數(shù)據(jù)，代謝數(shù)據(jù)和顯微圖像數(shù)據(jù)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的閾值區(qū)分地溝油與健康無(wú)害的食用油。本發(fā)明中待測(cè)地溝油樣品優(yōu)選進(jìn)行過(guò)濾處理，一般可以待測(cè)油樣均經(jīng)O. 22 μ m無(wú)菌針頭過(guò)濾器于超凈臺(tái)內(nèi)濾過(guò)，室溫暗處保存。如待測(cè)地溝油樣品為有明顯白色沉淀的樣品油液，如粗提的地溝油樣品，于4000轉(zhuǎn)離心I小時(shí)，取上清油液，用O. 22 μ m無(wú)菌針頭過(guò)濾器依次于開(kāi)放環(huán)境及超凈臺(tái)內(nèi)濾過(guò)，室溫暗處保存。本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)方法采用常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。檢測(cè)方法有考馬斯亮藍(lán)染色、活/死細(xì)胞染色。其中考馬斯亮藍(lán)染色方法原理為考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，細(xì)胞染色后顯微成像呈藍(lán)色。地溝油含有的有毒物質(zhì)對(duì)貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)產(chǎn)生影響，主要表現(xiàn)在貼壁程度以及細(xì)胞形態(tài)上。染色過(guò)程中死細(xì)胞或者活力不佳、貼壁不牢的細(xì)胞被移出，顯微成像后藍(lán)色區(qū)域的面積與殘存的活細(xì)胞的個(gè)數(shù)及狀態(tài)有關(guān)，待測(cè)油樣毒性越大其殘存細(xì)胞數(shù)量越少。該方法可以通過(guò)紫外分光光度法進(jìn)行驗(yàn)證。其原理是待測(cè)油樣處理后活細(xì)胞仍貼附于培養(yǎng)板壁，考馬斯亮藍(lán)染色后細(xì)胞呈藍(lán)色。5% SDS溶液可以提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)提取液因染色而呈藍(lán)色，并且于 614nm附近有最大吸收峰。通過(guò)測(cè)量蛋白提取液的光度值，與預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)， 得出殘存細(xì)胞的數(shù)量。本發(fā)明以CHO與NIH3T3細(xì)胞株的培養(yǎng)為例進(jìn)行說(shuō)明的。CHO與NIH3T3細(xì)胞株的正常培養(yǎng)方法如下(I)培養(yǎng)基成分高糖DMEM, 10%新生小牛血清，100units/mL青霉素和100 μ g/mL 鏈霉素。(2)細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)條件正常細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種于5mL培養(yǎng)基，25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)， 置于37°C，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2-3天更換一次。至細(xì)胞鋪滿長(zhǎng)滿后， 胰酶消化進(jìn)行下一步的細(xì)胞瓶接種以及12孔板接種。(3) 12孔板內(nèi)培養(yǎng)條件細(xì)胞以每孔IO5個(gè)的濃度種板，培養(yǎng)基體積為2mL，置于 37°C,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。注培養(yǎng)基成分和種板濃度需根據(jù)細(xì)胞株具體特性進(jìn)行調(diào)整，表現(xiàn)在血清的品種、 用量以及細(xì)胞濃度的選擇上。預(yù)實(shí)驗(yàn)證明上述條件下CHO和NIH3T3細(xì)胞株均能保持正常生長(zhǎng)狀態(tài)。本地溝油檢測(cè)方法適用于貼壁細(xì)胞，但值得注意的是，正常細(xì)胞的培養(yǎng)方法需根據(jù)不同的細(xì)胞株進(jìn)行調(diào)整。正常條件下培養(yǎng)細(xì)胞2小時(shí)或者24小時(shí)，接著加入待測(cè)油樣繼續(xù)培養(yǎng)。油作24 小時(shí)和48小時(shí)后，用倒置顯微鏡拍照。細(xì)胞于正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)的處理組，油作用時(shí)長(zhǎng)為48小時(shí)，正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)的處理組，油作用時(shí)長(zhǎng)為24小時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)后加入油樣后進(jìn)行48h處理,為正常培養(yǎng)2小時(shí)后向培養(yǎng)基加入一定體積的待測(cè)油樣,于37°C, 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，即油樣作用(即處理)時(shí)間為48小時(shí)。食用油對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，因而不會(huì)影響細(xì)胞的活性。而地溝油含有有毒物質(zhì)，從而使得培養(yǎng)的細(xì)胞部分或大部分死亡。通過(guò)細(xì)胞死亡的量，可以判斷地溝油的毒性。區(qū)分地溝油與商品食用油的閾值設(shè)置方法如下(I)考馬斯亮藍(lán)染色成像后，利用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)，分析藍(lán)染細(xì)胞區(qū)域的面積大小。(2)分析空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)組)、陰性對(duì)照組(商品食用油組)、濃度梯度稀釋的陽(yáng)性對(duì)照組(證實(shí)有細(xì)胞毒性物質(zhì)，非地溝油)的藍(lán)染面積大小，并以空白對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，得各組校正值。(例，假設(shè)空白對(duì)照組面積大小為100pixel2，陰性對(duì)照組為95pixel2，校正后空白對(duì)照組結(jié)果為1，陰性對(duì)照組為O. 95)。利用統(tǒng)計(jì)軟件，設(shè)置置信區(qū)間大小，分析組間差異，選擇與商品食用油組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的陽(yáng)性對(duì)照組的校正值作為低毒、中毒、高毒的閾值，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的為安全的閾值。(3)得到閾值后，將地溝油組的校正值與各閾值進(jìn)行比較，判斷待測(cè)油樣的是否有毒性，以及毒性等級(jí)。活/死細(xì)胞染色、細(xì)胞炎癥因子表達(dá)檢測(cè)與考馬斯亮藍(lán)染色法類似，均需借助顯微鏡成像及圖像處理技術(shù)?；?死細(xì)胞染色是利用活細(xì)胞/死細(xì)胞特異的熒光染料，如 PI (碘化丙啶，一種不能透過(guò)細(xì)胞膜的紅色熒光染料)特異性地染色死細(xì)胞，而染色活細(xì)胞的染料因發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)不同，兩種熒光信號(hào)利用不同的濾光片分離，從而在成像上區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是I.本發(fā)明的檢測(cè)方法具有很高的靈敏度?，F(xiàn)有的分析化學(xué)方法測(cè)定地溝油有毒成份的含量，可能出現(xiàn)漏檢或檢測(cè)不出來(lái)等問(wèn)題。由于本發(fā)明的原理是基于細(xì)胞對(duì)于有毒物質(zhì)的反應(yīng)，只要食用油含有有毒物質(zhì)，無(wú)論有毒物質(zhì)的種類是什么，本發(fā)明均可以測(cè)定出來(lái)。2.本發(fā)明的檢測(cè)方法可靠性強(qiáng)。不管地溝油在加工過(guò)程中使用什么方法，只要其中含有有毒成份，細(xì)胞都能檢測(cè)出來(lái)。3.本發(fā)明的檢測(cè)方法適應(yīng)面廣。無(wú)論哪種地溝油，只要對(duì)細(xì)胞有毒性，本方法均可以檢測(cè)出來(lái)。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖I為采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)待測(cè)地溝油樣品的方法流程圖；圖2為應(yīng)用紫外分光光度法驗(yàn)證考馬斯亮藍(lán)染色法的方法流程圖；圖3為細(xì)胞數(shù)與紫外光度值的線性關(guān)系及對(duì)應(yīng)的回歸方程(η = 3)。a為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)，b為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。圖4為以商品茶籽油、醫(yī)用硅膠片、毒性培養(yǎng)基處理CHO細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖5為以商品茶籽油、醫(yī)用硅膠片、毒性培養(yǎng)基處理CHO細(xì)胞株24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖6為以商品茶籽油、醫(yī)用硅膠片、毒性培養(yǎng)基處理NIH3T3細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖7為以商品茶籽油、醫(yī)用硅膠片、毒性培養(yǎng)基處理NIH3T3細(xì)胞株24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖8為以商品茶籽油和食堂廢油處理CHO細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以
及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖9為以商品茶籽油和食堂廢油處理NIH3T3細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖10為以商品茶籽油和粗提地溝油處理CHO細(xì)胞株24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖11為以3種商品食用油處理CHO細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考
馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖12為3種商品食用油處理48小時(shí)后殘余細(xì)胞數(shù)對(duì)比。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例I商品茶籽油與醫(yī)用硅膠對(duì)比實(shí)驗(yàn)I、樣品前處理醫(yī)用硅膠為預(yù)實(shí)驗(yàn)證明有細(xì)胞毒性，在此試驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照組。毒性培養(yǎng)基為取適量醫(yī)用娃膠浸泡于15毫升培養(yǎng)基中，浸泡時(shí)間不少于24小時(shí),4度保存。待測(cè)油樣前處理方法如下I. I待測(cè)油樣均經(jīng)O. 22 μ m無(wú)菌針頭過(guò)濾器于超凈臺(tái)內(nèi)濾過(guò)，室溫暗處保存。除特別說(shuō)明外，只過(guò)濾一次。I. 2有明顯白色沉淀的樣品油液，如粗提的地溝油樣品，于4000轉(zhuǎn)離心I小時(shí)，取上清油液，用O. 22 μ m無(wú)菌針頭過(guò)濾器依次于開(kāi)放環(huán)境及超凈臺(tái)內(nèi)濾過(guò)，室溫暗處保存。2、樣品檢測(cè)方法如圖I所示，樣品檢測(cè)方法步驟如下(I)正常條件下培養(yǎng)細(xì)胞2小時(shí)或者24小時(shí)；(2)加入O. ImL的待測(cè)油樣；(3)油處理24小時(shí)和48小時(shí)后，用倒置顯微鏡拍照。細(xì)胞于正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)的處理組，油作用總時(shí)長(zhǎng)為48小時(shí)，正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)的處理組，油作用總時(shí)長(zhǎng)為 24小時(shí)；(4)按照考馬斯亮藍(lán)染色、live/dead細(xì)胞染色、細(xì)胞炎癥因子表達(dá)檢測(cè)等方法的要求處理細(xì)胞后，用倒置顯微鏡/倒置熒光顯微鏡拍照；(5)每組處理平行操作3次。如圖2所示，樣品檢測(cè)方法的驗(yàn)證采用紫外分光光度法驗(yàn)證(以考馬斯亮藍(lán)染色法為例)，具體操作步驟如下(I)細(xì)胞培養(yǎng)至考馬斯亮藍(lán)染色的步驟同前面所述的樣品檢測(cè)方法步驟(I) ⑷。(2)將染色液轉(zhuǎn)移至15mL離心管；(3)用IX PBS潤(rùn)洗12孔板，回收PBS至⑵步離心管中，重復(fù)3次至PBS洗液基本無(wú)色，4000rpm離心5分鐘,棄上清；(4)每孔加入ImL 5% SDS，振搖10分鐘，將SDS提取液回收至(3)步離心管中，重復(fù)操作3次，至孔內(nèi)無(wú)可見(jiàn)藍(lán)色斑塊；(5) 4000rpm離心10分鐘或者用O. 22 μ m針頭過(guò)濾器過(guò)濾。取上清液或?yàn)V液，于 614nm處測(cè)其紫外吸收光度值。
2. I中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)CHO與NIH3T3細(xì)胞株的正常培養(yǎng)方法如下(I)培養(yǎng)基成分高糖DMEM, 10%新生小牛血清，100units/mL青霉素和100 μ g/mL 鏈霉素。(2)細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)條件正常細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種于5mL培養(yǎng)基，25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)， 置于37°C，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2-3天更換一次。至細(xì)胞鋪滿長(zhǎng)滿后， 胰酶消化進(jìn)行下一步的細(xì)胞瓶接種以及12孔板接種。(3)12孔板內(nèi)培養(yǎng)條件細(xì)胞以每孔IO5個(gè)的濃度種板，培養(yǎng)基體積為2mL，置于 37°C,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。注培養(yǎng)基成分和種板濃度需根據(jù)細(xì)胞株具體特性進(jìn)行調(diào)整，表現(xiàn)在血清的品種、 用量以及細(xì)胞濃度的選擇上。預(yù)實(shí)驗(yàn)證明上述條件下CHO和NIH3T3細(xì)胞株均能保持正常生長(zhǎng)狀態(tài)。2. 11正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)處理組結(jié)果處24小時(shí)后，醫(yī)用硅膠組內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，毒性培養(yǎng)基組與商品茶籽油組的細(xì)胞形態(tài)與陰性對(duì)照組無(wú)可見(jiàn)區(qū)別。繼續(xù)處24小時(shí)后，醫(yī)用硅膠組培養(yǎng)基內(nèi)有大量死細(xì)胞團(tuán)塊漂浮，毒性培養(yǎng)基組與商品茶籽油組均有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的現(xiàn)象。結(jié)果如圖4所示。圖4為以商品茶籽油、醫(yī)用硅膠片、毒性培養(yǎng)基處理CHO細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。處理前細(xì)胞于正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)。每組處理平行操作3份，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。a :4倍鏡下處24小時(shí)后結(jié)果； b 4倍鏡下處理48小時(shí)后結(jié)果；c 4倍鏡下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。2. 12正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)處理組結(jié)果與正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)處理組相比，醫(yī)用硅膠組處理24小時(shí)后僅有輕微毒性。 當(dāng)細(xì)胞密度高時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)可見(jiàn)死細(xì)胞團(tuán)塊漂浮。毒性培養(yǎng)基組和商品茶籽油組與正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)處理組結(jié)果類似，有輕微細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果如圖5所示。圖5為以商品茶籽油、醫(yī)用硅膠片、毒性培養(yǎng)基處理CHO細(xì)胞株24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。處理前細(xì)胞于正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)。每組處理平行操作3份，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。a :4倍鏡下處理24小時(shí)后結(jié)果； b 4倍鏡下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。2. 2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)2. 21正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)處理組結(jié)果與2. ICHO細(xì)胞組相比，處理24小時(shí)后，醫(yī)用硅膠組有較弱細(xì)胞毒性，但繼續(xù)處理 24小時(shí)后，大部分細(xì)胞死亡。陰性對(duì)照組、商品茶籽油組以及毒性培養(yǎng)基組，處理24小時(shí)和 48小時(shí)后，無(wú)顯著差異。結(jié)果如圖6所示。圖6為以商品茶籽油、醫(yī)用硅膠片、毒性培養(yǎng)基處理NIH3T3細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。處理前細(xì)胞于正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)。每組處理平行操作3份，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。a :4倍鏡下處理24小時(shí)后結(jié)果；b 4倍鏡下處理48小時(shí)后結(jié)果；c 4倍鏡下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。2. 22正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)處理組結(jié)果結(jié)果與正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)處理組類似，但所有處理組對(duì)細(xì)胞均有輕微毒性。醫(yī)用硅膠組對(duì)細(xì)胞的毒性大于正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)處理組。值得指出的是，實(shí)驗(yàn)中正常的NIH3T3細(xì)胞株貼壁不牢，因此染色過(guò)程中潤(rùn)洗細(xì)胞的操作對(duì)考馬斯亮藍(lán)染色成像有較大的影響。結(jié)果如圖7所示。圖7為以商品茶籽油、醫(yī)用硅膠片、毒性培養(yǎng)基處理NIH3T3細(xì)胞株24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。處理前細(xì)胞于正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)。每組處理平行操作3份，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。a :4倍鏡下處理24小時(shí)后結(jié)果山4倍鏡下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖3為健康中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)的細(xì)胞數(shù)與紫外光度值的線性關(guān)系及對(duì)應(yīng)的回歸方程(η = 3)。a為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)， b為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。實(shí)施例2商品茶籽油與食堂廢棄油對(duì)比試驗(yàn)樣品預(yù)處理、檢測(cè)方法類似實(shí)施例1，可以采用實(shí)施例I相同的條件。樣品來(lái)源 食堂廢棄油收集于獨(dú)墅湖高教區(qū)文星廣場(chǎng)餐館。實(shí)驗(yàn)結(jié)果I. I中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)與商品茶籽油相比，處理24小時(shí)以及48小時(shí)后，食堂廢油對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)毒性。結(jié)果顯示，CHO細(xì)胞株在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后對(duì)食堂廢油的靈敏度不及2小時(shí)組。結(jié)果如圖8所示。圖8為以商品茶籽油和食堂廢油處理CHO細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。除食堂廢油24小時(shí)組外，其他處理組細(xì)胞在加樣前均于正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)。每組處理平行操作3份。a :4倍鏡下處理 24小時(shí)后結(jié)果；b 4倍鏡下處理48小時(shí)后結(jié)果；c 4倍鏡下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。I. 2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)結(jié)果與中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)細(xì)胞株相似(圖9)，食堂廢油對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)毒性。 正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞對(duì)食堂廢油的靈敏度不及2小時(shí)組。圖9為以商品茶籽油和食堂廢油處理NIH3T3細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。除食堂廢油24小時(shí)組外，其他處理組細(xì)胞在加樣前均于正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)。每組處理平行操作3份。a:4倍鏡下處理24小時(shí)后結(jié)果；b 4倍鏡下處理48小時(shí)后結(jié)果；c 4倍鏡下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。實(shí)施例3商品茶籽油與粗提地溝油對(duì)比實(shí)驗(yàn)(CH0細(xì)胞株)樣品預(yù)處理、檢測(cè)方法類似實(shí)施例1，可以采用實(shí)施例I相同的條件。樣品來(lái)源采用粗提地溝油由蘇州市公安局蘇州獨(dú)墅湖高等教育區(qū)分局取樣，為未經(jīng)深加工的地溝油， 有異臭。結(jié)果顯示(如圖10所示)，細(xì)胞經(jīng)粗提地溝油處理24小時(shí)后，培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)大量漂浮的死細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞死亡。圖10為以商品茶籽油和粗提地溝油處理CHO細(xì)胞株24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。細(xì)胞在處理前于正常條件下培養(yǎng)2 小時(shí)。每組處理平行操作3份。a :10倍鏡下處理24小時(shí)后結(jié)果；b:4倍鏡下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。
實(shí)施例43種商品食用油對(duì)比實(shí)驗(yàn)(CH0細(xì)胞株)樣品預(yù)處理、檢測(cè)方法類似實(shí)施例1，可以采用實(shí)施例I相同的條件。樣品來(lái)源采用3種商品食用油為茶籽油、葵花橄欖油以及葵花籽油，均為市場(chǎng)流通品種。顯微成像結(jié)果顯示(圖11)，陰性對(duì)照組、葵花橄欖油、以及葵花籽油組無(wú)可見(jiàn)差異。處理48小時(shí)后，茶籽油顯示輕微抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用。應(yīng)用紫外分光光度法驗(yàn)證考馬斯亮藍(lán)染色方法(圖12)，用One-way ANOVA(SNK)法比較四組結(jié)果后，顯示在99%置信區(qū)間內(nèi)(P = O. 01)，各處理組間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖11為以3種商品食用油處理CHO細(xì)胞株24和48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)變化以及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。細(xì)胞在處理前于正常條件下培養(yǎng)2小時(shí)。每組處理平行操作3份。a :4倍鏡下處理24小時(shí)后結(jié)果；b:4倍鏡下處理48小時(shí)后結(jié)果；c :4倍鏡下考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖12為3種商品食用油處理48小時(shí)后殘余細(xì)胞數(shù)對(duì)比。上述實(shí)例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在培養(yǎng)基中進(jìn)行正常細(xì)胞的培養(yǎng)，當(dāng)正常細(xì)胞達(dá)到預(yù)定數(shù)量時(shí)加入待測(cè)地溝油樣品繼續(xù)培養(yǎng)；(2)對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞死亡或存活情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)或?qū)?xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)培養(yǎng)后的細(xì)胞毒性或細(xì)胞死亡或存活情況判斷待測(cè)地溝油樣品是否為地溝油。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法步驟(I)待測(cè)地溝油樣品在加入培養(yǎng)基前進(jìn)行過(guò)濾處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法步驟(I)中常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)正常細(xì)胞的時(shí)間控制在廣36小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法步驟(I)中加入的待測(cè)地溝油樣品的體積為O. I mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法步驟(I)中加入待測(cè)地溝油樣品繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間控制在2Γ48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法步驟(2)中細(xì)胞死亡情況統(tǒng)計(jì)是采用考馬斯亮藍(lán)染色、活/死細(xì)胞染色方法處理繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)藍(lán)染的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行死亡細(xì)胞統(tǒng)計(jì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法還包括在步驟(I)進(jìn)行正常細(xì)胞的培養(yǎng)后加入常用食用油進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，以常用食用油為對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)常用食用油與待測(cè)地溝油樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法步驟(2)中判斷待測(cè)地溝油樣品是否為地溝油是通過(guò)先分別采用地溝油與常用食用油處理細(xì)胞培養(yǎng)后的細(xì)胞存活或死亡情況進(jìn)行對(duì)比統(tǒng)計(jì)，獲得常用食用油與地溝油間的閾值；根據(jù)待測(cè)地溝油樣品處理細(xì)胞培養(yǎng)后的細(xì)胞存活或死亡情況與閾值的比較判斷待測(cè)地溝油樣品是否為地溝油。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法步驟(2)中設(shè)置若干個(gè)閾值將地溝油分為低度毒性地溝油、中度毒性地溝油和高度毒性地溝油。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法步驟(2)中對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞死亡或存活情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)是通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種地溝油快速檢測(cè)方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在培養(yǎng)基中進(jìn)行正常細(xì)胞的培養(yǎng)，待正常細(xì)胞達(dá)到預(yù)定數(shù)量時(shí)加入待測(cè)地溝油樣品繼續(xù)培養(yǎng)；(2)對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)或?qū)?xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)培養(yǎng)后的細(xì)胞毒性或細(xì)胞死亡情況判斷待測(cè)地溝油樣品是否為地溝油。該方法解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)方法只能在一定范圍內(nèi)適用特定類型的地溝油的缺陷。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102605035SQ20121006467
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者呂文進(jìn), 孫濤, 張俊龍, 張百靈, 熊伊韋 申請(qǐng)人:西交利物浦大學(xué)