專(zhuān)利名稱(chēng)：增強(qiáng)植物中脅迫耐受的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明部分涉及新的植物法尼基轉(zhuǎn)移酶α和β亞基聚核苷酸和多肽。同時(shí)包括在內(nèi)的是表達(dá)新的聚核苷酸和多肽的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也包括具有從有意義或反義方向表達(dá)這些聚核苷酸得到的新的表現(xiàn)型的植物細(xì)胞，組織和植物。
背景技術(shù)：
大多數(shù)較高等的植物在它們的生命循環(huán)的一些時(shí)期會(huì)遇到相對(duì)水含量至少暫時(shí)的降低，結(jié)果是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了許多脫水保護(hù)機(jī)制。但是，如果水缺乏的變化延長(zhǎng)，對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的影響可能是長(zhǎng)遠(yuǎn)的。由于干燥，寒冷或鹽脅迫水含量降低可能無(wú)可挽回地?fù)p壞植物細(xì)胞，依次限制農(nóng)業(yè)上植物的生長(zhǎng)和作物的生產(chǎn)率。
植物能應(yīng)答干燥，鹽度和寒冷的不利條件，帶來(lái)各種形態(tài)和生理的變化。雖然我們對(duì)這些脅迫的植物耐受機(jī)制的理解是不完全的，植物激素抗壞血酸(ABA)是環(huán)境刺激和植物應(yīng)答之間的基本介導(dǎo)物。ABA水平應(yīng)答水缺陷而上升，外源應(yīng)用ABA模擬了水脅迫誘導(dǎo)的許多應(yīng)答。一旦ABA合成，就引起了葉子氣孔的關(guān)閉，從而降低蒸騰作用導(dǎo)致的水損失。
將ABA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞應(yīng)答的基因的鑒定打開(kāi)開(kāi)發(fā)這些調(diào)節(jié)物增強(qiáng)作物種類(lèi)中的脫水耐受性的可能性。原則上，這些ABA發(fā)信號(hào)基因可以與適當(dāng)?shù)目刂圃亟Y(jié)合，允許最佳的植物生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)。所以，不僅這些基因允許作物的遺傳剪切抵抗暫時(shí)的環(huán)境脅迫，而且它們也應(yīng)該拓寬了傳統(tǒng)作物可以生長(zhǎng)的環(huán)境。
擬南芥突變體的最新的分離對(duì)ABA是超敏感的，已經(jīng)顯示也是對(duì)水饑渴條件可耐受的。ERA1已經(jīng)鑒定為法尼基轉(zhuǎn)移酶的β亞基。法尼基轉(zhuǎn)移酶是雜二體酶，可以在底物靶序列上特異地添加法尼基磷酸成分。靶序列確定為存在于蛋白質(zhì)的羧基末端的四個(gè)氨基酸序列，稱(chēng)為CaaX基序，其中“C”是半胱氨酸，“a”是任何脂肪族氨基酸，和“X”是任何氨基酸。α亞單位通常是兩個(gè)異戊烯化酶，香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶，具有不同的β亞基，在靶序列上加上了香葉基香葉基異戊烯基磷酸成分。
異戊烯化是多步驟途徑，包括CaaX位點(diǎn)的半胱氨酸的異戊烯化，-aaX三肽的裂解和異戊烯基半胱氨酸殘基的甲基化。這些步驟中的每一個(gè)都可以代表異戊烯化過(guò)程的遺傳操作的靶，產(chǎn)生需要的表現(xiàn)型如脅迫耐受。
在植物中，異戊烯化已經(jīng)與細(xì)胞循環(huán)控制，分生組織發(fā)育，和光激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)連接，但是，異戊烯化，底物蛋白質(zhì)或植物系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物和酵母系統(tǒng)類(lèi)似的程度的細(xì)節(jié)只有少數(shù)是已知的。CaaX修飾的最大特征的底物是酵母的Ras和a因子蛋白質(zhì)。雖然，雖然完成蛋白質(zhì)的成熟有三步，但任何一步的去除或修改不一定導(dǎo)致靶生物活性的終止。如果-aaX三肽不裂解，但也不去除，一些蛋白質(zhì)在法尼基化后保留了-aaX三肽那么Ras功能減弱了。這些觀察可以是底物特異的，相反，有例子表明，一些蛋白質(zhì)只有在適當(dāng)異戊烯化后如調(diào)節(jié)過(guò)程，如哺乳動(dòng)物中的分裂原應(yīng)答，和酵母中的匹配信息素后才能完全發(fā)揮功能。
在擬南芥菜中，不只600個(gè)蛋白質(zhì)含有CaaX基序，表明了在許多細(xì)胞過(guò)程中通過(guò)異戊烯化的翻譯后的修飾的作用。在擬南芥菜中，已經(jīng)證明，法尼基轉(zhuǎn)移酶的β亞基將導(dǎo)致ABA超敏感表現(xiàn)型。雖然仍然不清楚為什么沒(méi)有法尼基轉(zhuǎn)移酶的功能性β亞基的植物變得對(duì)ABA更敏感，但很明顯，蛋白質(zhì)異戊烯化參與了ABA敏感性的穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。ABA細(xì)胞應(yīng)答的平衡，是否對(duì)ABA更敏感或更不敏感可能是受異戊烯化蛋白質(zhì)的相對(duì)活性的調(diào)節(jié)的。
本發(fā)明涉及法尼基轉(zhuǎn)移酶(FT)亞基，α或β(FTA，F(xiàn)TB)改變法尼基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)和活性的操作。法尼基轉(zhuǎn)移酶催化了法尼基化的第一步，其中在靶序列CaaX的半胱氨酸殘基中加入15碳法尼基成分。包括在本發(fā)明中的是含有在適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下的FTA或FTB序列的載體構(gòu)建體，產(chǎn)生表現(xiàn)型如但不限于水脅迫耐受，增強(qiáng)的生物量積累，提高的產(chǎn)量或推遲的衰老。FTA亞基的操作也可以影響葉香基葉香基轉(zhuǎn)移酶的活性并且，與這一操作相關(guān)的表現(xiàn)型是包括在本發(fā)明中的。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于來(lái)自擬南芥(Arabidospsis thaliana)，歐洲油菜(Brassica napus)，大豆(Glycine max)和玉米(Zea maize)的新法尼基轉(zhuǎn)移酶核酸序列的發(fā)現(xiàn)。本文所述的核酸，聚核苷酸，蛋白質(zhì)和多肽或其片段總稱(chēng)為FT核酸和多肽。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括SEQ ID NO1，SEQID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37或其片段，同源物，類(lèi)似物或衍生物的序列的分離核酸。核酸可以包括例如，編碼至少與包括氨基酸序列SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO37的多肽有99％的同一性的多肽的核酸序列，編碼與包括氨基酸序列SEQ ID NO5，SEQID NO7或SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽有85％的同一性的多肽的核酸序列，或編碼與包括氨基酸序列SEQ ID NO33，SEQ ID NO36，或SEQ ID NO39的氨基酸序列的多肽有至少99％的同一性的核酸序列，該核酸序列可以是例如基因組DNA片段，或cDNA分子。
本發(fā)明也包括SEQ ID NO2，3，4，29，30，32，35，38，40-57或58的核酸序列。同時(shí)包括在本發(fā)明中的是含有本文所述的一個(gè)或以上的核酸的載體，含有該載體的細(xì)胞或本文所述的核酸。在一些方面，F(xiàn)T核酸可操作地與啟動(dòng)子連接。啟動(dòng)子的例子包括構(gòu)成性啟動(dòng)子(例如，35ScaMV，MuA)，ABA可誘導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，RD29A)，組織特異啟動(dòng)子(例如，CUT1)，或保衛(wèi)細(xì)胞特異啟動(dòng)子(例如，35S，MuA，和RD29A)。
本發(fā)明也涉及用含有本文所述的任意核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及用FT核酸或含有FT核酸的載體轉(zhuǎn)化的植物和細(xì)胞。同時(shí)包括在本發(fā)明中的是種子，轉(zhuǎn)化植物或細(xì)胞的子代。
本發(fā)明也進(jìn)一步涉及在突變體文庫(kù)和基因篩選方案的產(chǎn)生中用FT核酸或含有FT核酸的載體額植物和細(xì)胞的利用。
在其他方面，本發(fā)明包括基本純化的FT多肽，例如，F(xiàn)T核酸和其片段，同源物，類(lèi)似物和衍生物編碼的任意FT多肽。
仍然在其他方面，本發(fā)明提供了特異地結(jié)合FT多肽的抗體?？贵w可以例如是單克隆或多克隆抗體，和其片段，同源物，類(lèi)似物和衍生物。本發(fā)明也涉及結(jié)合本文所述的任意核酸分子編碼的多肽上的表位的分離的抗體。
本發(fā)明也包括生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該轉(zhuǎn)基因植物具有增強(qiáng)的脅迫抗性，如但不限于水缺乏，或生物量增大，產(chǎn)量增大；衰老推遲或在植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中導(dǎo)入改變植物中的FT表達(dá)或活性的化合物。在一個(gè)方面，化合物是FT核酸。核酸可以例如是法尼基化或戊二烯化的抑制劑。或者，化合物是FT雙鏈RNA抑制發(fā)夾核酸或FT反義核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)提供含有FT核酸的細(xì)胞，例如，包括FT核酸的載體，并且在足以表達(dá)核酸編碼的FT多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)FT多肽的方法。然后，從細(xì)胞中回收表達(dá)的FT多肽。優(yōu)選地，細(xì)胞產(chǎn)生了小的或非內(nèi)源的FT多肽。細(xì)胞可以是例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及通過(guò)將樣品與特異地結(jié)合多肽或核酸的化合物接觸，和檢測(cè)復(fù)合物的形成來(lái)鑒定樣品中的FT多肽或核酸的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)將FT多肽與化合物接觸，測(cè)定是否FT多肽活性修飾了來(lái)調(diào)節(jié)FT多肽的活性的鑒定化合物的方法。
本發(fā)明也涉及調(diào)節(jié)通過(guò)將FT多肽與化合物接觸和測(cè)定是否化合物修飾了FT多肽的活性，結(jié)合FT多肽，或結(jié)合編碼FT多肽的核酸分子來(lái)鑒定額FT多肽活性的化合物。
除非特別定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明屬于的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般理解的相同意義雖然與本文所述相似或相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)和方法可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或?qū)嶒?yàn)中，適當(dāng)?shù)姆椒ê臀镔|(zhì)如下所述。所有的公開(kāi)物，專(zhuān)利申請(qǐng)，專(zhuān)利和其他本文提到的參考文獻(xiàn)都通過(guò)在此引述而合并于本文。在有爭(zhēng)議的情況下，本說(shuō)明書(shū)，包括定義將為依據(jù)。另外，材料，方法和實(shí)施例只用于說(shuō)明，不打算用于限制。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將能從下面詳細(xì)的敘述和權(quán)利要求中明了。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是描述pBI121反義FTA載體構(gòu)建體的說(shuō)明。
圖2是抗FTA轉(zhuǎn)基因擬南芥菜的基因組Southern雜交分析的說(shuō)明。
圖3是5個(gè)35S-抗-FTA擬南芥菜系(T3植物)的Northern分析的說(shuō)明。
圖4顯示了利用抗FTA抗體檢測(cè)FTA多肽的Western表達(dá)分析。
圖5是顯示了ABA對(duì)種子生長(zhǎng)和發(fā)育的效果的圖系列。FTA反義轉(zhuǎn)基因秧苗展示了具有增強(qiáng)的ABA敏感性。
圖6顯示了ABA對(duì)秧苗生長(zhǎng)和發(fā)育的影響。
圖7顯示了在不澆水8天后，擬南芥菜的野生型Columbia(A)和4個(gè)反義FTA轉(zhuǎn)基因系(B，C，D，E)的圖。
圖8是根據(jù)Clustal W anaysis(給出了各物種的百分?jǐn)?shù))來(lái)自各種植物種類(lèi)的FTA核酸(A)和氨基酸(B)序列的同源性的說(shuō)明。
圖9是根據(jù)Clustal W anaysis(給出了各物種的百分?jǐn)?shù))來(lái)自各種植物種類(lèi)的FTB核酸和氨基酸序列之間的同源性的說(shuō)明。
圖10是水脅迫過(guò)程中轉(zhuǎn)基因效率的說(shuō)明。
圖11是在水脅迫處理6天和6天恢復(fù)期后莖的新鮮重，或生物量積累的說(shuō)明。
圖12是在最佳條件下，或在6天水脅迫處理后得到的種子產(chǎn)量(g)的說(shuō)明。
圖13是最佳條件下的植物生長(zhǎng)的說(shuō)明，顯示的是在第一次開(kāi)花后6天的莖的新鮮重。
圖14是生物脅迫與干旱脅迫處理對(duì)種子產(chǎn)量的效果的說(shuō)明。
圖15是在實(shí)驗(yàn)中的PCR凝膠電泳分析檢測(cè)歐洲油菜的轉(zhuǎn)基因系的代表性說(shuō)明。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供了從歐洲油菜(Bn)，擬南芥菜(At)，大豆(Gm)和玉米(Zm)分離的新的法尼基轉(zhuǎn)移酶(FT)的核酸序列(SEQ IDNO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ IDNO34，或SEQ ID NO37)和他們的編碼多肽(SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39)。序列總稱(chēng)為“FT核酸”或FT聚核苷酸，對(duì)應(yīng)的編碼多肽稱(chēng)為“FT多肽”或“FT蛋白質(zhì)”。法尼基轉(zhuǎn)移酶亞基，Alpha(α)和Beta(β)稱(chēng)為FTA和FTB。大豆在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中也稱(chēng)為大豆。玉米也稱(chēng)為在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中也稱(chēng)為玉米。這些術(shù)語(yǔ)是可以交換使用的。除非特別說(shuō)明，“FT”是指本文公開(kāi)的任意新的序列。
表A提供了FT核酸和它們的編碼多肽的概括。
同時(shí)包括在本發(fā)明中的是與公開(kāi)的FT核酸序列互補(bǔ)的核酸。例如，SEQ ID NO2，3，29，30，32，35或38。另外本發(fā)明提供的是如SEQ ID NO4，40-58中公開(kāi)的包括FT反義核酸的分子的構(gòu)建體。
根據(jù)與已知的法尼基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，F(xiàn)T蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)的法尼基轉(zhuǎn)移酶家族的新成員。(參見(jiàn)實(shí)施例3)本發(fā)明的FT核酸，和它們的編碼多肽可用于各種申請(qǐng)書(shū)或文獻(xiàn)中。例如，核酸可以用于生產(chǎn)對(duì)生物和非生物脅迫，例如寒冷脅迫，鹽脅迫，熱脅迫，水脅迫，傷口，致病原攻擊或除草劑抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明包括在轉(zhuǎn)基因植物，細(xì)胞和組織培養(yǎng)物中利用過(guò)度表達(dá)的載體構(gòu)建體上調(diào)FT酶活性的方法，和在轉(zhuǎn)基因植物，細(xì)胞和組織培養(yǎng)物中利用雙鏈RNA抑制，發(fā)夾載體構(gòu)建體下調(diào)FT酶活性。這些方法是利用實(shí)施例生產(chǎn)上調(diào)或下調(diào)的效果，并不意味著局限于達(dá)到這一結(jié)果的方法。
另外，本發(fā)明的核酸和多肽可以用作調(diào)節(jié)或抑制FT活性的小分子的鑒定的靶。或者，F(xiàn)T核酸和多肽可以用于鑒定是相關(guān)蛋白質(zhì)的法尼基轉(zhuǎn)移酶家族的成員的蛋白質(zhì)。
另外，通過(guò)化學(xué)誘變或輻射的作用來(lái)修飾FTA或FTB的核酸序列可以達(dá)到FT活性的調(diào)節(jié)或抑制。酶學(xué)編碼非功能性FT多肽的FT核酸的表達(dá)可以用于引起FT活性的陰性?xún)?yōu)勢(shì)的抑制效果。
本發(fā)明的FT核酸和多肽額其他用途也在本文中公開(kāi)了。
FT核酸本發(fā)明的核酸包括編碼FT多肽或蛋白質(zhì)的那些。如本文所用術(shù)語(yǔ)多肽和蛋白質(zhì)是可交換使用的。
在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)T核酸編碼了天然FT多肽。如本文所用，本文所述的多肽的“成熟”形式涉及天然存在額多肽或前體形式或前蛋白質(zhì)的產(chǎn)物。天然存在的多肽，前體或前蛋白質(zhì)包括非限制的例子對(duì)應(yīng)基因編碼的全長(zhǎng)基因產(chǎn)物?；蛘?，它可以確定為本文所述的開(kāi)放讀碼框架編碼的多肽，前體或前蛋白質(zhì)。再次非限制地，產(chǎn)物“成熟”形式產(chǎn)生作為可以在產(chǎn)生基因產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一個(gè)或多個(gè)天然存在的加工步驟的結(jié)果。產(chǎn)生多肽或蛋白質(zhì)的“成熟”形式的這樣額加工步驟的例子包括開(kāi)放讀碼框架的起始密碼編碼的N末端甲硫氨酸殘基的裂解，或信號(hào)肽或前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)水解的裂解。所以，從前體多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)生的成熟形式具有1到N的殘基，其中殘基1是N末端甲硫氨酸，在N末端甲硫氨酸除去后將具有2到N的其余部分?；蛘撸瑲埢?到殘基M的N末端信號(hào)序列裂解的從具有1到N的前體多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)生的成熟形式具有殘基M+1到殘基N的其余部分的殘基。另外，如本文所用，多肽或蛋白質(zhì)的“成熟”形式可以從翻譯后修飾而不是蛋白質(zhì)水解事件中產(chǎn)生。這樣的其他過(guò)程非限制地包括糖基化，豆蔻?；蛄姿峄Ｍǔ?，成熟多肽或蛋白質(zhì)可以從這些步驟中的一個(gè)或它們中的任意結(jié)合的操作步驟產(chǎn)生。
在FT核酸中的是SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37或它們的片段中提供序列的核酸。另外，本發(fā)明包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，SEQ ID NO37或其片段的突變或變異核酸。其中的任意堿基可以從SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的對(duì)應(yīng)堿基中改變，仍然編碼至少維持它的FT類(lèi)似活性和生理功能中的一個(gè)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明另外包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的核酸序列的補(bǔ)體，包括其片段，衍生物，類(lèi)似物和同源物。本發(fā)明另外包括其結(jié)構(gòu)包括化學(xué)修飾的核酸，或核酸片段，或其補(bǔ)體。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分的分離的核酸分子。同時(shí)包括足以用作鑒定FT編碼核酸的核酸片段(例如，F(xiàn)TmRNA)和用作FT核酸分子的擴(kuò)增或突變的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)因?yàn)榈钠?。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”打算包括利用核苷酸類(lèi)似物，和衍生物，片段和其同源物產(chǎn)生的DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，該DNA或RNA的類(lèi)似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選地是雙鏈DNA。
根據(jù)用途，“探針”指可變長(zhǎng)度的核酸序列，優(yōu)選地在至少約10個(gè)核苷酸，100個(gè)核苷酸，或多至例如6,000個(gè)核苷酸。探針可用于檢測(cè)相同，相似，或互補(bǔ)的核酸序列。更長(zhǎng)長(zhǎng)度的探針通常是從天然或重組來(lái)源得到的，是高度特異和比寡聚物更慢地雜交的。探針可以是單鏈或雙鏈的，設(shè)計(jì)成在PCR，膜基礎(chǔ)的雜交技術(shù)或ELISA類(lèi)似技術(shù)中有特異性的。
“分離”的核酸分子是從存在于核酸的天然來(lái)源的其他核酸分子中分離的一個(gè)。分離的核酸分子的例子不限于載體中含有的重組DNA分子，在異源寄主細(xì)胞中維持的重組DNA分子，部分或基本純化的核酸分子，和合成DNA或RNA分子。優(yōu)選地，“分離”的核酸是沒(méi)有核酸從中派生的有機(jī)體的基因組DNA中的核酸(即，定位于核酸的5’和3’末端的序列)天然側(cè)接的序列。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的FT核酸分子可以含有少于核酸派生的細(xì)胞的基因組DNA中的核酸分子天然側(cè)接的核苷酸序列的約50kb，25kb，5kb，4kb，3kb，3kb，1kb，0.5kb或0.1kb。另外，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，“分離”的核酸分子，如cDNA分子可以基本無(wú)其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，當(dāng)化學(xué)合成時(shí)可以基本無(wú)化學(xué)前體或其他化學(xué)物。
本發(fā)明的核酸分子例如，具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，SEQ ID NO37的核苷酸序列的核酸分子或核苷酸序列的任意一個(gè)的補(bǔ)體可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)或本文提供的序列信息來(lái)分離。利用SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的核酸序列的全部或一部分作為雜交探針，F(xiàn)T核酸序列可以利用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)來(lái)分離(例如，如Sambrook等人，eds.，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，NY，1989；和Ausubel，等人，eds.，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，NY，1993)。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，利用cDNA，mRNA或者基因組DNA作為模板和適當(dāng)?shù)墓丫酆塑账嵋锟梢詳U(kuò)增本發(fā)明的核酸。這樣擴(kuò)增的核酸可以克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)妮d體并且通過(guò)DNA序列分析來(lái)鑒定。另外，對(duì)應(yīng)于FT核苷酸序列的寡聚核苷酸可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)，例如利用自動(dòng)DNA合成儀來(lái)制備。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸”指一系列連接的核苷酸殘基，寡聚核苷酸具有足夠數(shù)目的核苷酸堿基待用于PCR反應(yīng)中。短的寡聚核苷酸序列可以根據(jù)或從基因組或cDNA序列中設(shè)計(jì)，并且用于擴(kuò)增，證明或發(fā)現(xiàn)特定細(xì)胞或組織中的相同，相似或互補(bǔ)DNA或RNA的存在。寡聚核苷酸包括具有長(zhǎng)度約10nt，50nt，或100nt，優(yōu)選地15nt到30nt的核酸序列的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚核苷酸包括長(zhǎng)度小于100nt的核酸分子，將另外包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37或其補(bǔ)體的至少6個(gè)鄰接的核苷酸。寡聚核苷酸可以化學(xué)地合成并且可以用作探針。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包括是SEQID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸序列的補(bǔ)體的核酸分子。例如，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO35或SEQID NO38的互補(bǔ)核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包括是SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37或這一核苷酸序列部分所示的核苷酸序列的補(bǔ)體的核酸分子。與SEQ IDNO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸序列足以互補(bǔ)的一個(gè)，它可以與SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸小小地或沒(méi)有錯(cuò)配而氫鍵合，從而形成穩(wěn)定的雙倍體。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指在核酸分子的核苷酸單位之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對(duì)，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”指兩個(gè)多肽或化合物或相關(guān)的多肽或其化合物或結(jié)合之間的物理或化學(xué)相互作用。結(jié)合包括離子的，非離子的，Von der Waals，疏水相互作用等等。物理相互作用可以是直接的或間接的。間接的相互作用可以是完全的或由于另一個(gè)多肽或化合物的效果。直接的結(jié)合是指不通過(guò)或由于另一個(gè)多肽或化合物的效果發(fā)生的相互反應(yīng)，而且是沒(méi)有其他基本化學(xué)中間產(chǎn)物的。
另外，本發(fā)明的核酸分子可以?xún)H僅包括SEQ ID NO1，SEQID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的核酸序列，例如，可以用作探針或引物的片段，或編碼FT生物活性部分的片段。本文提供的片段確定是作為至少6(鄰接)核酸或至少4個(gè)(鄰接)氨基酸，長(zhǎng)度足以允許核酸情況中的特異雜交，或允許氨基酸情況中的表位的特異識(shí)別，大多數(shù)一些部分小于全長(zhǎng)序列。片段可以從選擇的核酸或氨基酸序列的任意的鄰接部分派生。衍生物是直接從天然化合物或通過(guò)修改或部分取代形成的核酸序列或氨基酸序列。類(lèi)似物是具有與天然化合物相似但不是相同，在一些成分或側(cè)鏈上有結(jié)構(gòu)的不同的核酸序列或氨基酸序列。類(lèi)似物可以是合成的或來(lái)自不同的進(jìn)化起源，可以具有與野生型比較，相似或相反的代謝活性。
如果衍生物或類(lèi)似物含有修飾的核酸或氨基酸，衍生物和類(lèi)似物可以是全長(zhǎng)或不是全長(zhǎng)。本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)的衍生物或類(lèi)似物包括，但不限于包括與本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)基本同源的區(qū)域的分子，在各種實(shí)施方案中，與相同大小的核酸或氨基酸序列或當(dāng)與排列是通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源程序進(jìn)行，或編碼核酸能夠在嚴(yán)格，中度嚴(yán)格或低嚴(yán)格條件下與編碼前面提到的蛋白質(zhì)的序列的補(bǔ)體雜交的排列序列比較時(shí)同源性至少約70％，80％，85％，90％，95％，98％或甚至99％的同一性(優(yōu)選地同一性80-99％)。參見(jiàn)例如，Ausubel，等人，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1993，和如下。程序的一個(gè)例子是Gap程序(Wisconsin程序分析包，第8版，UNIX，Genetics Computer Group，帕克研究大學(xué)，Madison，WI)，其中利用了出廠設(shè)定，利用了Smith and Waterman算式(Adv.Appl.Math，1981，2482-489，其通過(guò)在此引述而合并于本文)。
“同源核酸序列”或“同源氨基酸序列”或其變異體指如上討論的核苷酸水平或氨基酸水平的同源性鑒定的序列。同源核苷酸序列編碼了編碼FT多肽的同工型的那些序列。同工型可以在相同的有機(jī)體的不同組織中作為RNA的兩可性拼接表達(dá)。或者，同工型可以由不同的基因編碼。同源核苷酸序列也可以包括，但不限于天然存在的等位基因變體或本文所述的核苷酸序列的突變。同源核酸序列包括編碼SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39中的保守氨基酸取代(參見(jiàn)如下)的那些核酸序列，以及具有FT活性的多肽，例如底物結(jié)合。
從克隆擬南芥菜FT基因的克隆確定的核苷酸序列允許產(chǎn)生設(shè)計(jì)用于在例如，來(lái)自其他組織的其他細(xì)胞類(lèi)型中鑒定和/或克隆FT同源物，以及來(lái)自其他植物的FT同源物。探針/引物通常包括基本純化的寡聚核苷酸。寡聚核苷酸通常包括在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的至少約12，25，50，100，150，200，250，300，或400或更多的連續(xù)的有意義鏈核苷酸序列，或SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的反義鏈核苷酸序列，或SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的天然存在的突變體雜交的核苷酸序列的一個(gè)區(qū)域。
根據(jù)擬南芥菜FT核苷酸序列的探針可以用于檢測(cè)編碼相同或同源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物或基因組序列。在各種實(shí)施方案中，探針進(jìn)一步包括附著于它的標(biāo)記基團(tuán)，例如標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素，熒光化合物，酶，或酶協(xié)同因子。這樣的探針可以用作鑒定mis表達(dá)FT的細(xì)胞或組織的診斷實(shí)驗(yàn)試劑盒的一部分，方法如通過(guò)測(cè)量來(lái)自受試者的細(xì)胞的樣品中的FT編碼核酸的水平，例如檢測(cè)FT mRNA水平或確定是否基因組FT基因已經(jīng)突變或缺失。
如在特定的生物實(shí)驗(yàn)中，有或沒(méi)有劑量依賴(lài)時(shí)測(cè)定的，“具有FT生物活性部分額多肽”指具有與包括成熟形式的本發(fā)明的多肽的活性相似但不一定相同的活性的多肽。編碼“FT的生物活性部分”的核酸片段可以通過(guò)分離編碼具有FT生物活性(FT蛋白質(zhì)的生物活性如下所述)，表達(dá)FT生物活性(例如通過(guò)體外重組表達(dá))的多肽的SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO“31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37來(lái)制備，和評(píng)估FT的編碼部分的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼FT的生物活性部分的核酸片段包括一個(gè)或多個(gè)區(qū)域。
FT變異體本發(fā)明另外包括由于遺傳密碼的間并性而與SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37不同的核酸分子。這樣，這些核酸編碼了相同的FT蛋白質(zhì)，如SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ IDNO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸序列編碼的，例如SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸具有編碼具有SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
除了SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的擬南芥菜FT核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，導(dǎo)致FT的氨基酸序列中的變化的DNA序列多態(tài)性可能存在于群體中(例如，植物中)。在FT基因中的這樣的遺傳多態(tài)性可能存在于天然等位基因變化的群體內(nèi)的個(gè)體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”和“重組基因”指包括編碼FT蛋白質(zhì)優(yōu)選地植物FT蛋白質(zhì)的開(kāi)放讀碼框架的核酸分子。這樣的天然等位基因的變化通常可以導(dǎo)致FT基因的核苷酸序列的1-5％的變化。這樣的天然等位基因的變化通?？梢詫?dǎo)致FT基因的核苷酸序列中1-5％的變化。天然等位基因的變化的結(jié)果和不改變FT的功能活性的任意的和所有的這樣的核苷酸變化和得到的FT的氨基酸多態(tài)性是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。
另外，編碼來(lái)自其他種類(lèi)的FT蛋白質(zhì)的核酸分子和所以具有與SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的序列不同的核苷酸序列的核酸分子是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。根據(jù)嚴(yán)格雜交條件下的標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，利用cDNA，或其一部分作為雜交探針可以根據(jù)它們與本文公開(kāi)的擬南芥菜FT核酸的同源性來(lái)分離對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的FTcDNA的天然等位基因和同源物的核酸分子。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子在長(zhǎng)度上至少有6個(gè)核苷酸，并且在嚴(yán)格條件下與包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的核苷酸序列的核酸分子雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸至少有10，25，50，100，250，500或750個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核苷酸分子與編碼區(qū)雜交。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交”打算用于敘述雜交的條件并且在核苷酸序列相互至少60％的同源性并且通常保留相互雜交下洗滌。
利用本領(lǐng)域已知的方法，利用特定的序列的全部或部分作為探針，在低，中度或高嚴(yán)格雜交下得到同源物(即，從不是擬南芥菜的種類(lèi)派生的編碼FT蛋白質(zhì)的核酸)用于核酸雜交和克隆。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”指探針，引物或寡聚核苷酸將與它的靶序列但不是其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是依賴(lài)序列的，將是在不同情況下不同的。較長(zhǎng)的序列在比更短的序列更高的溫度下雜交。通常，選擇嚴(yán)格條件是在確定的離子強(qiáng)度和pH下特定的序列得到熱熔化點(diǎn)(Tm)低約5℃。Tm是與靶序列互補(bǔ)的探針的50％與靶序列在平衡時(shí)雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度，pH和核酸濃度)。因?yàn)榘行蛄型ǔ＿^(guò)量存在，在Tm時(shí)，平衡時(shí)占有50％的探針。通常，嚴(yán)格條件是這樣的，其中鹽濃度至少約1.0M鈉離子，在pH7.0到8.3通常約0.01到1.0M鈉離子(或其他鹽)和對(duì)于短探針，引物或寡聚核苷酸(例如，10nt到50nt)時(shí)溫度約30℃，和對(duì)于較長(zhǎng)的探針，引物和寡聚核苷酸至少約60℃。在加入脫穩(wěn)定劑如甲醛下可以得到嚴(yán)格條件。
嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域已知的，并且可以在CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6找到。優(yōu)選地，條件是使至少約65％，70％，75％，85％，90％，95％，98％或99％同源性的序列通常保持相互雜交。嚴(yán)格雜交條件的非限制例子是在高鹽緩沖液中雜交，緩沖液中含6XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA，和500mg/ml變性鮭精DNA，65℃。這一雜交是在0.2XSSC，0.01％BSA和50℃下一次或多次洗滌后的。在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的序列雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。如本文所用，“天然存在”的核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然的蛋白質(zhì))。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，提供了在中度嚴(yán)格條件下，與包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37或其片段，類(lèi)似物或衍生物的核苷酸序列的核酸分子雜交的核酸序列。中度嚴(yán)格雜交條件的非限制例子是在55℃下6XSSC，5Xdenhardt’溶液，0.5％SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中雜交?？梢岳玫钠渌卸葒?yán)格條件是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如，Ausubel等人(eds)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley&Sons，NY，and Kriegler，1990，GENE TRANSFER ANDEXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，提供了在低嚴(yán)格條件下與包括SEQ IDNO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQID NO34或SEQ ID NO37或其片段，類(lèi)似物或衍生物的核苷酸序列的核酸分子可雜交的核酸。低嚴(yán)格雜交條件的非限制例子是在35％的甲醛，5XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，5mMEDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100mg/ml變性鮭精DNA，10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，在40℃下雜交，接著在2XSSC，25mMTris-HCl(pH7.4)，5mMEDTA，和0.1％SDS中，在50℃下一次或多次洗滌。可以利用的低嚴(yán)格度的其他條件是本領(lǐng)域已知的(例如，交叉種類(lèi)雜交中利用的)。參見(jiàn)例如，Ausubel等人(eds)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，NY，and Kriegler，1990，GENE TRANSFERAND EXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY；Shilo and Weinberg，1981，Proc Natl Acad Sci USA786789-6792。
保守性突變除了可以在群體中存在的FT序列的天然存在的等位基因變異體，本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步理解的是，通過(guò)突變可以在SEQID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的核苷酸序列中導(dǎo)入突變，從而導(dǎo)致編碼的FT蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有變化，而且不改變FT蛋白質(zhì)的功能。例如，導(dǎo)致“非基本”氨基酸殘基中氨基酸取代的核苷酸取代可以在SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的序列中進(jìn)行?！胺腔尽卑被釟埢强梢詮腇T的野生型序列改變，但不改變生物活性的殘基，而“基本”氨基酸殘基是生物活性需要的。在本發(fā)明的FT蛋白質(zhì)中保守的氨基酸殘基被推測(cè)為對(duì)變化是特別不可修改的。
本發(fā)明的另一方面涉及編碼含有對(duì)于活性非必須的氨基酸殘基的變化的FT蛋白質(zhì)的編碼核酸分子。這樣的FT蛋白質(zhì)在來(lái)自SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的氨基酸序列是不同的，但仍然保留了生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子包括編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中蛋白質(zhì)包括與SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的氨基酸序列至少約75％的同源的氨基酸序列。編碼核酸的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQID NO9，SEQ IDNO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39至少約80％同源，最優(yōu)選地與SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39至少約99％同源。
通過(guò)在SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQIDNO31，SEQ ID NO34或SEQ IDNO37的核苷酸序列中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代，添加或缺失可以產(chǎn)生編碼與SEQID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQID NO36或SEQ ID NO39的蛋白質(zhì)同源的FT蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，使一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，添加或缺失導(dǎo)入到編碼的蛋白質(zhì)中。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如位點(diǎn)特異的誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，可以在SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，SEQ ID NO37的核苷酸序列中導(dǎo)入突變。優(yōu)選地，在一個(gè)或多個(gè)推測(cè)的非必須氨基酸殘基中進(jìn)行保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔怯镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代的氨基酸殘基的一個(gè)。具有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中確定。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴(lài)氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸側(cè)鏈(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，beta支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。所以，在FT中推測(cè)的非必須氨基酸殘基是用來(lái)自相同的側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基來(lái)取代的?；蛘撸诹硪粋€(gè)實(shí)施方案中，可以沿著FT編碼序列的全部或部分，如通過(guò)飽和誘變?nèi)我鈱?dǎo)入突變，并且可以篩選其余的突變體的FT生物活性，鑒定保留活性的突變體。在SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的誘變后，通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意重組技術(shù)可以表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)，可以確定蛋白質(zhì)的活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以測(cè)試突變的FT蛋白質(zhì)的(1)形成與其他FT蛋白質(zhì)，其他細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，或其生物活性部分的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用的能力，(2)在突變的FT蛋白質(zhì)和FT受體之間復(fù)合物的形成；(3)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)或其生物活性部分(例如，抗生物素蛋白質(zhì))的突變的FT蛋白質(zhì)的能力；(4)結(jié)合FT蛋白質(zhì)額能力；或(5)特異地結(jié)合抗FT蛋白質(zhì)抗體的能力。
反義FT核酸本發(fā)明的另一方面涉及與包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO31，SEQ ID NO34或SEQ IDNO37或其片段，類(lèi)似物或衍生物的核苷酸序列的核苷酸分子雜交或互補(bǔ)的分離的反義核酸分子。“反義”核酸包括與編碼蛋白質(zhì)的“有意義”核酸互補(bǔ)，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)或與mRNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在特定的方面，提供了反義核酸分子，其中包括與至少約10，25，50，100，250，500個(gè)核苷酸，或整個(gè)FT編碼鏈，或只是其中的一部分互補(bǔ)的序列。另外提供的是編碼SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的FT蛋白質(zhì)的片段，同源物，衍生物和類(lèi)似物的核酸分子，或與SEQID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的FT核酸序列互補(bǔ)的反義核酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子是與編碼FT的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37)的核苷酸序列的編碼鏈的“編碼區(qū)”反義。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”指包括翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列的區(qū)域(例如，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39)的擬南芥菜FT的蛋白質(zhì)編碼區(qū))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子是與編碼FT的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37)的編碼鏈的“非編碼區(qū)”反義。術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”指與沒(méi)有翻譯成氨基酸的編碼區(qū)側(cè)接的5’和3’序列(即，也稱(chēng)為5’和3’未翻譯區(qū))。
在各個(gè)實(shí)施方案中，反義FT核酸分子包括SEQ ID NO2，3，29，30，32，35或38的序列。
給出編碼本文公開(kāi)的FT的編碼鏈序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37)，本發(fā)明的反義核酸可以根據(jù)Watson和Crick或Hoogsteen堿基配對(duì)規(guī)則來(lái)設(shè)計(jì)。反義核酸分子可以是與FT mRNA的整個(gè)編碼區(qū)互補(bǔ)的，但更優(yōu)選地是與FTmRNA的編碼或非編碼區(qū)的一部分反義的寡聚核苷酸。例如，反義寡聚核苷酸可以是與圍繞FTmRNA的翻譯起始位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)的。翻譯寡聚核苷酸可以是例如約5，10，15，20，25，30，35，40，45或50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的。本發(fā)明的一個(gè)反義核酸可以利用化學(xué)合成或利用本領(lǐng)域的已知方法通過(guò)酶連接反應(yīng)來(lái)構(gòu)建。例如，反義核酸(例如，反義寡聚核苷酸)可以利用設(shè)計(jì)成增強(qiáng)分子的生物穩(wěn)定性或增強(qiáng)反義和有意義核酸，之間形成的雙倍體的物理穩(wěn)定性來(lái)化學(xué)合成，例如可以利用磷酸硫代衍生物和丫啶取代的核苷酸。
可以用于生產(chǎn)反義核酸的修飾核苷酸的例子包括5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基2-硫尿苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，beta-D-半乳糖苷queosine，肌苷，N6-焦戊烯腺嘌呤，1-甲基鳥(niǎo)嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥(niǎo)嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥(niǎo)嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，beta-D-甘露糖基queosine，5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w；和2，6-二氨基嘌呤?；蛘?，利用核酸已經(jīng)在反義方向亞克隆的表達(dá)載體可以生物地生產(chǎn)反義核酸(即，從插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA將是與下面的部分中進(jìn)一步敘述的需要的靶核酸是反義方向的)。
原位產(chǎn)生本發(fā)明的反義核酸分子，使它們與編碼FT蛋白質(zhì)的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，從而例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。雜交可以是通過(guò)常規(guī)核苷酸互補(bǔ)性形成穩(wěn)定的雙倍體，或例如，在通過(guò)雙螺旋的大溝中的特異相互作用結(jié)合DNA雙倍體的反義核酸分子的情況中。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子是α-端基核酸分子。α-端基核酸分子與通常的β亞基相反，鏈相互平行的互補(bǔ)RNA的互補(bǔ)RNA形成特異的雙鏈雜合體(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids Res 156625-6641)。反義核酸分子也可以包括2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucleic Acids Res156131-6148)或嵌合RNA-DNA類(lèi)似物(Inoue等人(1987)FEBSLett215327-330)。
這樣的修飾包括但不限于修飾的堿基，和修飾或派生糖磷酸骨架的核酸。這些修飾至少部分地進(jìn)行了，用于增強(qiáng)修飾的核酸的化學(xué)穩(wěn)定性，使它們可以用作申請(qǐng)中的反義結(jié)合核酸。
發(fā)夾核酸的雙鏈RNA抑制(RNAi)本發(fā)明的另一方面涉及利用翻譯后的基因沉默(PTGS)阻遏基因表達(dá)。雙鏈RNA可以啟動(dòng)植物和動(dòng)物中的基因表達(dá)的序列特異阻遏。將雙鏈RNA加工成長(zhǎng)度21-23個(gè)核苷酸的短的雙倍體寡聚物。這些小的干擾RNA以序列特異的方式阻遏了內(nèi)源和外源基因的表達(dá)(Fire等人Nature 391806-811，Carthew，Curr.Opin.In Cell Biol.，13244-248，Elbashir 等人，Nature411494-498)。RNAi阻遏構(gòu)建體可以許多方法設(shè)計(jì)，例如可以形成長(zhǎng)發(fā)夾分子的顛倒重復(fù)的轉(zhuǎn)錄，可以是不相關(guān)序列如GUS或內(nèi)含子序列的間隔序列分開(kāi)的顛倒重復(fù)。有意義和反義鏈的轉(zhuǎn)錄是通過(guò)相反啟動(dòng)子或有意義和反義基因的共轉(zhuǎn)錄。
FT核糖酶和PNA成分仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸是核酶。核酶是具有核糖核酶活性的催化RNA分子，能夠裂解單鏈核酸，如具有互補(bǔ)區(qū)的mRNA。所以，核酶(例如，錘頭核酶(如Haselhoffand Gerlach(1988)Nature 334585-591中所述)可以用于催化裂解FTmRNA轉(zhuǎn)錄物，從而抑制FT mRNA的轉(zhuǎn)錄。具有FT編碼核酸特異性的核酶可以根據(jù)本文公開(kāi)的FT DNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)(即，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37)。例如，可以構(gòu)建Tetrahymena L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷酸序列是與FT編碼mRNA中待裂解的核苷酸序列互補(bǔ)的，參見(jiàn)例如，Cech等人U.S.Pat.No.4,987,071；and Cech等人U.S.Pat.No.5,116,742。或者，F(xiàn)T mRNA可以用于從RNA分子的庫(kù)中選擇具有特異的核糖核酶活性的催化RNA。參見(jiàn)例如，Bartel等人，(1993)Science 2611411-1418。
通過(guò)靶擊與FT的調(diào)節(jié)區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列可以抑制FT基因表達(dá)(例如，F(xiàn)T啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)，形成防止靶細(xì)胞中的FT基因的轉(zhuǎn)錄的三倍體螺旋結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)通常，Helene.(1991)AnticancerDrug Des.6569-84；Helene.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；and Maher(1992)Bioassays 14807-15。
在各種實(shí)施方案中，可以在堿基成分，糖成分或磷酸骨架修飾FT的核酸，提高例如分子的穩(wěn)定性，雜交或溶解性。例如，可以修飾核酸的脫氧核糖磷酸骨架產(chǎn)生肽核酸(參見(jiàn)Hyrup等人(1996)Bioorg Med Chem 45-23)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肽核酸”或“PNAs”指核酸模擬物，例如，DNA模擬物，其中脫氧磷酸骨架是被假肽骨架取代，并且只保留了四個(gè)天然的核堿基。PNA的中性骨架已經(jīng)顯示允許在低離子強(qiáng)度條件下DNA和RNA雜交。PNA寡聚物的合成可以利用標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成方案來(lái)進(jìn)行，如Hyrup等人(1996)；Perry-O’Keefe等人(1996)PNAS9314670-675所述。
FT的PNA可以用于治療和診斷。例如，PNA可以用作基因表達(dá)的序列特異調(diào)節(jié)的反義或反基因試劑，例如通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯的遏止或抑制復(fù)制。FT的PNA也可以在基因中的單堿基對(duì)突變的分析中，例如涉及PNA的PCR鉗中用作與其他酶例如S1核酶結(jié)合使用時(shí)的人工限制酶(Hyrup B.(1996))；或用作DNA序列和雜交的探針或引物；Perry-O’Keefe(1996)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T的PNA可以通過(guò)將親脂或其他輔助基團(tuán)附著于PNA，通過(guò)形成PNA-DNA嵌合體，或利用本領(lǐng)域已知的脂質(zhì)體或其他藥物遞送的技術(shù)來(lái)增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或細(xì)胞吸收。例如，可以產(chǎn)生FT的PNA-DNA嵌合體，它可以結(jié)合PNA和DNA的有利特征。這樣的嵌合體允許DNA識(shí)別酶例如Rnase H和DNA聚合酶與DNA部分相互作用，同時(shí)PNA部分將提供高的結(jié)合親和力和特異性。利用根據(jù)堿基垛疊，核堿基之間的許多鍵選擇的適當(dāng)長(zhǎng)度的接頭可以連接PNA-DNA嵌合體，并且定向(Hyrup(1996))。PNA-DNA嵌合體的合成可以如Hyrup(1996)如上和Finn等人(1996)Nucl Acids Res243357-63所述來(lái)進(jìn)行。例如，可以利用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸酰胺偶聯(lián)化學(xué)，在固相支持物上合成DNA鏈，可以在PNA和DNA的5’末端之間利用修飾的核苷酸類(lèi)似物，例如，5’-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5‘-脫氧胸腺嘧啶磷酸酰胺(Mag等人(1989)Nucl Acid Res 175973-88)。然后，以逐步的方式結(jié)合PNA單體，生產(chǎn)具有5’PNA區(qū)段和3’DNA區(qū)段的嵌合分子(Finn等人(1996))?；蛘撸逗戏肿涌梢杂?’DNA區(qū)段和3’PNA區(qū)段來(lái)合成。參見(jiàn)例如Petersen等人(1975)Bioorg Med Chem Lett 51119-11124。
FT多肽本發(fā)明的FT多肽包括序列在SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO9中提供的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括任意殘基可以從SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ IDNO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39中所示的對(duì)應(yīng)的殘基改變的突變或變異蛋白質(zhì)，這些序列仍然編碼了維持FT類(lèi)似活性和生理功能或其功能片段的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，在突變或變異體蛋白質(zhì)中可以如此改變達(dá)到20％或更多的殘基。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的FT多肽是成熟的多肽。
通常，保持FT類(lèi)似功能的FT類(lèi)似變異體包括在序列的特定位置的殘基已經(jīng)被其他氨基酸取代的任意變異體，另外包括了在親本蛋白質(zhì)的兩個(gè)殘基之間插入其他殘基的可能性以及從親本序列缺失一個(gè)或多個(gè)殘基的可能性。任何氨基酸取代，插入或缺失包括在本發(fā)明中。在有利的情況中，取代是如上所述的保守取代。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的蛋白質(zhì)，和其生物活性部分，或其衍生物，片段，類(lèi)似物或同源物。同時(shí)提供的是適于用作產(chǎn)生抗FT抗體額免疫原的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然FT蛋白質(zhì)可以從細(xì)胞或組織來(lái)源通過(guò)適當(dāng)?shù)募兓桨竵?lái)源標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)來(lái)分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T蛋白質(zhì)是通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的。取代重組表達(dá)，F(xiàn)T蛋白質(zhì)或多肽可以利用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)地合成。
當(dāng)化學(xué)合成時(shí)，“分離”或“純化”蛋白質(zhì)或其生物活性部分是基本無(wú)來(lái)自FT蛋白質(zhì)派生的細(xì)胞或組織來(lái)源的細(xì)胞物質(zhì)或其他污染蛋白質(zhì)，或者基本無(wú)化學(xué)前體或其他化學(xué)物的。術(shù)語(yǔ)“基本無(wú)細(xì)胞物質(zhì)”包括FT蛋白質(zhì)的制備，其中蛋白質(zhì)是從它分離或重組產(chǎn)生的細(xì)胞的細(xì)胞成分分離的。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“基本無(wú)細(xì)胞物質(zhì)”包括具有少于約30％(干重)非FT蛋白質(zhì)的FT蛋白質(zhì)的制備(本文也稱(chēng)為“污染蛋白質(zhì)”)，更優(yōu)選地少于約20％的非FT蛋白質(zhì)，更優(yōu)選地小于約10％的非FT蛋白質(zhì)，最優(yōu)選地少于約5％的非FT蛋白質(zhì)。當(dāng)FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分重組生產(chǎn)時(shí)，它同樣優(yōu)選地是基本無(wú)培養(yǎng)基的，即培養(yǎng)基出現(xiàn)少于約20％，更優(yōu)選地少于約10％，最優(yōu)選地少于約5％的蛋白質(zhì)制劑的體積。
術(shù)語(yǔ)“基本無(wú)化學(xué)前體或其他化學(xué)物”包括FT蛋白質(zhì)的制劑，其中蛋白質(zhì)是從參與蛋白質(zhì)的合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)物分離的。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“基本無(wú)化學(xué)前體或其他化學(xué)物”包括FT蛋白質(zhì)的制劑具有少于約30％(干重)的化學(xué)前體或非FT化學(xué)物，更優(yōu)選地少于約20％的化學(xué)前體或非FT化學(xué)物，更優(yōu)選地少于約20％化學(xué)前體或非FT化學(xué)物，更優(yōu)選地少于約10％化學(xué)前體或非FT化學(xué)物，最優(yōu)選地少于約5％的化學(xué)前體或非FT化學(xué)物。
FT蛋白質(zhì)的生物活性部分包括含有足以與FT蛋白質(zhì)的氨基酸序列同源或從中派生的氨基酸序列，例如SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39所示的氨基酸序列的肽，其中包括了比全長(zhǎng)FT蛋白質(zhì)更少的氨基酸至少具有一個(gè)FT蛋白質(zhì)活性，例如底物結(jié)合。通常，生物活性部分包括至少具有一個(gè)FT蛋白質(zhì)活性的區(qū)域或基序。FT蛋白質(zhì)的生物活性部分可以是例如10，25，50，100或更多長(zhǎng)度的多肽。
本發(fā)明的FT蛋白質(zhì)的生物活性部分可以至少含有一個(gè)上面鑒定的FT蛋白質(zhì)之間的保守的區(qū)域。另外，蛋白質(zhì)的其他區(qū)域缺失的其他生物活性部分可以通過(guò)重組技術(shù)制備，和評(píng)估天然FT蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)功能活性。
生物活性部分或FT蛋白質(zhì)可以是FT多肽的N末端區(qū)。或者生物活性部分或FT蛋白質(zhì)可以是FT多肽的C末端區(qū)。優(yōu)選地，生物活性部分至少包括C末端區(qū)的75個(gè)氨基酸。更優(yōu)選地，生物活性部分至少包括C末端區(qū)域的25個(gè)氨基酸。最優(yōu)選地，生物活性部分至少包括C末端的10個(gè)氨基酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO5，SEQ IDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的一個(gè)氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，F(xiàn)T蛋白質(zhì)是與SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39基本同源的，并且保留了SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的蛋白質(zhì)的功能活性，仍然由于天然等位基因變化或誘變氨基酸序列是不同的，如下文詳細(xì)所述。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T蛋白質(zhì)是包括至少與SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的氨基酸序列45％同源的氨基酸序列，并且保留了SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ IDNO39的FT蛋白質(zhì)的功能活性。
兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的同源性判斷為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的同源性百分?jǐn)?shù)，將序列按照最佳目的進(jìn)行序列排列(例如，在待比較序列之間的任一序列中導(dǎo)入缺口)。然后，比較對(duì)應(yīng)于氨基酸位置或核苷酸位置中的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)與第二個(gè)序列中的對(duì)應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)了第一個(gè)序列中的一個(gè)位置時(shí)，那么分子在該位置是同源的(即，本文利用的氨基酸或核酸“同源性”是與氨基酸或核酸“同一性”相當(dāng)?shù)?。
如兩個(gè)序列之間的同一性程度可以確定核酸序列的同源性。利用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序可以確定同源性，如GCG程序包提供的GAP軟件。參見(jiàn)例如，Needleman and Wunsch 1907 J MolBiol 48443-453。利用具有下面額核酸序列比較的設(shè)定值的GCGGAP軟件GAP產(chǎn)生罰分5.0，GAP擴(kuò)展罰分0.3，類(lèi)似核酸序列的編碼區(qū)指與SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的DNA序列的CDS(編碼)部分優(yōu)選地至少具有70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，或99％的同一性程度的上面的序列。
術(shù)語(yǔ)“序列同一性”指在比較的特定區(qū)域上根據(jù)殘基對(duì)殘基的原理兩個(gè)聚核苷酸或多肽相同的程度。術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分?jǐn)?shù)”是通過(guò)在比較的區(qū)域比較兩個(gè)最佳排列的序列，確定兩個(gè)序列中存在的相同核苷酸堿基(例如，核酸情況中的A，T，C，G，U或I)的位置的數(shù)目得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除比較的區(qū)域(即窗的大小)中的位置的總數(shù)目，將結(jié)果乘100得到序列同一性的百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算的。術(shù)語(yǔ)“基本同一性”如本文所用指聚核苷酸序列的特征，其中聚核苷酸包括與比較區(qū)域的參考序列比較具有至少80％序列同一性，優(yōu)選地至少85％的同一性，經(jīng)常是90到95％的序列同一性，更通常是至少99％的序列同一性的序列。術(shù)語(yǔ)“正殘基的百分?jǐn)?shù)”是通過(guò)比較在比較區(qū)域內(nèi)的兩個(gè)最佳排列的序列，確定在兩個(gè)序列中如上所述的相同和保守的氨基酸取代的位置的數(shù)目得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除比較的區(qū)域中(即，窗的大小)位置的總數(shù)目，將結(jié)果乘100得到正殘基的百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算的。
嵌合和融合蛋白質(zhì)本發(fā)明同時(shí)提供了FT嵌合或融合蛋白質(zhì)。如本文所述，F(xiàn)T“嵌合蛋白質(zhì)”或“融合蛋白質(zhì)”包括與非FT多肽可操作地連接的FT多肽?！癋T多肽”指具有對(duì)應(yīng)于FT的氨基酸序列，而“非FT多肽”指具有對(duì)應(yīng)于與FT蛋白質(zhì)，例如與FT蛋白質(zhì)不同和從相同或不同的有機(jī)體派生的蛋白質(zhì)基本非同源的蛋白質(zhì)的氨基酸的多肽。在FT融合蛋白質(zhì)內(nèi)，F(xiàn)T多肽可以對(duì)應(yīng)于FT蛋白質(zhì)的所有或部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T融合蛋白質(zhì)至少包括FT蛋白質(zhì)的一個(gè)生物活性部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T融合蛋白質(zhì)至少包括FT蛋白質(zhì)的兩個(gè)生物活性部分。在融合蛋白質(zhì)內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”打算指在框架內(nèi)相互融合的FT多肽和非FT多肽。非FT多肽可以與FT多肽的N末端或C末端融合。
本發(fā)明的FT嵌合或融合蛋白質(zhì)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)，例如通過(guò)利用末端鈍化或交錯(cuò)切口處理末端來(lái)連接，限制酶消化將編碼不同的多肽序列的DNA片段在框架內(nèi)連接，提供黏連末端的適當(dāng)末端化和填充作為適當(dāng)?shù)?，堿性磷酸處理，避免不需要的連接和酶連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)常規(guī)技術(shù)包括自動(dòng)DNA合成儀可以合成融合基因?；蛘?，利用錨引物可以進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生可以隨后退化和再擴(kuò)增的兩個(gè)連續(xù)的基因片段之間的互補(bǔ)突出，產(chǎn)生嵌合的基因序列(參見(jiàn)例如，Ausubel等人(eds)CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，1992)。另外，許多已經(jīng)編碼融合成分(例如，GST多肽，6Xhis-tag)的表達(dá)載體可以商業(yè)獲得。FT編碼核酸可以克隆進(jìn)這樣的表達(dá)載體使融合成分在框架內(nèi)與FT蛋白質(zhì)連接。
FT激動(dòng)劑和拮抗劑本發(fā)明也涉及作為FT激動(dòng)劑(模擬物)或作為FT拮抗劑起作用的FT蛋白質(zhì)的變異體。激動(dòng)劑可以例如是反義核酸分子。FT蛋白質(zhì)的變異體可以通過(guò)誘變，例如FT蛋白質(zhì)的不連續(xù)的點(diǎn)突變或截短來(lái)產(chǎn)生。FT蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑可以基本保持FT蛋白質(zhì)的天然存在形式的生物活性或其亞系。FT蛋白質(zhì)的拮抗劑可以通過(guò)例如與包括FT蛋白質(zhì)的細(xì)胞發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)的下游或上游成員競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制FT蛋白質(zhì)的天然存在形式的一個(gè)或多個(gè)活性。所以，特定的生物效果可以通過(guò)用限制性功能的變異體來(lái)處理而引發(fā)。
可以通過(guò)篩選突變體，例如FT.蛋白質(zhì)的截短的突變體的結(jié)合文庫(kù)的FT蛋白質(zhì)激動(dòng)劑或拮抗劑活性來(lái)鑒定作為FT激動(dòng)劑(模擬物)或作為FT拮抗劑起作用的FT蛋白質(zhì)的變異體。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T變異體的雜色文庫(kù)是通過(guò)在核酸水平的結(jié)合誘變來(lái)產(chǎn)生的，是通過(guò)雜色基因文庫(kù)來(lái)編碼的。FT變異體的雜色文庫(kù)可以通過(guò)例如將合成的寡聚核苷酸的混合物酶學(xué)連接進(jìn)基因序列使?jié)撛诘腇T序列作為個(gè)別多肽，或者作為其中含有FT序列的系列的更大的融合蛋白質(zhì)(例如，用于噬菌體展示)的一個(gè)系列來(lái)表達(dá)。存在可以用于從間并寡聚序列生產(chǎn)潛在的FT變異體的文庫(kù)的各種方法。間并基因序列的化學(xué)合成可以在自動(dòng)DNA合成儀中進(jìn)行，然后將合成的基因連接進(jìn)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體?；虻拈g并系列的利用允許在一個(gè)混合物中提供所有編碼潛在的FT序列的需要系列的序列。合成間并寡聚核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如，Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1984)Annu Rev Biochem 53323；Itakura等人(1984)Science 1981056；Ike等人(1983)Nucl Acid Res 11477。
多肽文庫(kù)另外，F(xiàn)T蛋白質(zhì)編碼序列的片段的文庫(kù)可以用于生產(chǎn)FT片段的雜色群體用于FT蛋白質(zhì)的變異體的篩選和隨后的選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼序列片段的文庫(kù)可以通過(guò)在每個(gè)分子只發(fā)生一次缺口，變性雙鏈DNA，再變性DNA的條件下用核酸酶處理FT編碼序列的雙鏈PCR片段可以生產(chǎn)編碼序列片段的文庫(kù)，形成可以包括來(lái)自不同缺口產(chǎn)物的有意義/反義對(duì)的雙鏈DNA，通過(guò)S1核酶處理從再形成的雙倍體除去單鏈部分，將得到的片段文庫(kù)連接進(jìn)表達(dá)載體。通過(guò)這一方法，可以派生編碼FT蛋白質(zhì)的各種大小的N末端和內(nèi)部片段的表達(dá)文庫(kù)。
幾個(gè)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，可用于篩選點(diǎn)突變或截短制成的結(jié)合文庫(kù)的基因產(chǎn)物，和用于篩選具有選擇特性的基因產(chǎn)物的cDNA文庫(kù)。這樣的技術(shù)適用于快速篩選FT蛋白質(zhì)的結(jié)合誘變產(chǎn)生的基因文庫(kù)。篩選大基因文庫(kù)額可修改成高通量分析的最廣泛利用的技術(shù)通常包括將基因文庫(kù)克隆進(jìn)可復(fù)制的表達(dá)載體，用得到的文庫(kù)轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞，在需要的活性的檢測(cè)簡(jiǎn)化編碼產(chǎn)物得到檢測(cè)的基因的載體的分離的條件下表達(dá)結(jié)合基因。反射系綜誘變(REM)，增強(qiáng)文庫(kù)中的功能突變的頻率的新技術(shù)可以結(jié)合篩選實(shí)驗(yàn)來(lái)使用，鑒定FT變異體(Arkin and Yourvan(1992)PNAS897811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering6327-331)。
FT抗體FT多肽，包括嵌合多肽，或其衍生物，片段，類(lèi)似物或同源物可以用作免疫原，產(chǎn)生免疫特異結(jié)合這些肽成分的抗體。這些抗體包括例如，多克隆，單克隆，嵌合，單鏈，F(xiàn)ab片段，和Fab表達(dá)文庫(kù)。在特定的實(shí)施方案中，F(xiàn)T多肽的片段可以用作抗體生產(chǎn)的免疫原。本領(lǐng)域已知的各種方法可以用于生產(chǎn)FT多肽的多克隆或單克隆抗體，或其衍生物，片段，類(lèi)似物或同源物的生產(chǎn)。
對(duì)于多克隆抗體的生產(chǎn)，可以用天然肽，或其合成變異體，或前面的衍生物注射來(lái)免疫各種寄主動(dòng)物。各種佐劑可以用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，并且包括但不限于弗氏(完全和不完全)，礦質(zhì)凝膠(例如，氫氧化鋁)，表面活性物質(zhì)(例如，卵磷脂，多聚醇，聚陰離子，肽，油乳液，二硝基酚等等)和人佐劑，如BacilleCalmette-Guerin and Corynebacterium parvum。
對(duì)于抗FT多肽的單克隆抗體，或其衍生物，片段，類(lèi)似物，或同源物的制備，可以利用通過(guò)連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)。這樣的技術(shù)包括，但不限于雜交瘤技術(shù)(參見(jiàn)，Kohlerand Milstein，1975.Nature 256495-497)；三體技術(shù)；人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參見(jiàn)，Kozbor，等人，1983.Immunol Today472)和EBV雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)人單克隆抗體(參見(jiàn)，Cole.，等人，1985.InMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。人單克隆抗體可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中，并且可以利用人雜交瘤來(lái)生產(chǎn)(參見(jiàn)，Cote，等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA802026-2030)或通過(guò)用Epstein Barr病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(參見(jiàn)，Cole，等人，1985.InMonoclonal Antibodies and CancerTherapy(Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)來(lái)生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，可以采用一些技術(shù)來(lái)生產(chǎn)特異于FT多肽的單鏈抗體(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)，4,946,778)。另外，可以采用一些方法來(lái)構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(參見(jiàn)例如，Huse，等人，1989.Science2461275-1281)允許快速而有效地鑒定具有FT多肽或其衍生物，片段，類(lèi)似物或同源物的需要的特異性的Fab片段。含有FT多肽的獨(dú)特型的抗體片段可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，其中包括例如(i)抗體分子的胰蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab)2’片段；(ii)還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段；和(iii)通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生Fab片段，(iv)Fv片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，篩選具有需要特異性的抗體的方法包括，但不限于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和其他本領(lǐng)域已知的免疫介導(dǎo)的技術(shù)。在特定的實(shí)施方案中，特異于FT多肽的特定區(qū)域的抗體的選擇是通過(guò)生產(chǎn)結(jié)合具有這樣的區(qū)域的FT多肽的片段的雜交瘤的生產(chǎn)來(lái)簡(jiǎn)化的。特異于FT多肽，其衍生物，片段，類(lèi)似物或同源物內(nèi)的區(qū)域的抗體也提供在內(nèi)。抗FT多肽抗體可以用于涉及FT多肽的定位和/或定量的本領(lǐng)域內(nèi)的已知的方法中(例如，用于測(cè)量適當(dāng)?shù)纳順悠穬?nèi)的肽的水平，用于診斷方法中，用于肽的成象中等等)。
FT重組表達(dá)載體和寄主細(xì)胞本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼FT蛋白質(zhì)的核酸，其衍生物，片段，類(lèi)似物或同源物的載體，優(yōu)選地表達(dá)載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠運(yùn)輸已經(jīng)連接另一個(gè)核酸的核酸分子。載體的一個(gè)類(lèi)型是“質(zhì)?！?，指可以連接其他DNA區(qū)段的循環(huán)雙鏈DNA環(huán)。載體的另一個(gè)類(lèi)型是病毒載體，其中其他DNA區(qū)段可以連接進(jìn)病毒基因組。一些載體能夠在導(dǎo)入的寄主細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)的細(xì)菌載體)。將其他載體在導(dǎo)入寄主細(xì)胞中后整合進(jìn)寄主細(xì)胞的基因組，從而沿著寄主基因組復(fù)制。另外，一些載體能夠指導(dǎo)可操作地連接的基因的表達(dá)。這樣的載體本文指“表達(dá)載體”。通常，在重組DNA技術(shù)中利用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒形式的。在本申請(qǐng)書(shū)中，“質(zhì)粒”和“載體”可以相互交換用作載體的最常用形式的質(zhì)粒。但是，本發(fā)明打算包括如下其他表達(dá)載體的形式，如病毒載體或植物轉(zhuǎn)化載體，雙元或起同等功能的載體。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括適于在寄主細(xì)胞中表達(dá)核酸的形式的本發(fā)明的核酸，指包括在帶用于表達(dá)的寄主細(xì)胞的基礎(chǔ)上選擇的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，是可操作地與待表達(dá)的核酸序列連接的。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“可操作地連接”指與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(dá)的方式連接的需要的核苷酸序列(例如，當(dāng)在寄主細(xì)胞中導(dǎo)入載體時(shí)，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或寄主細(xì)胞中)。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”打算包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子或其他表達(dá)控制元素(例如，聚腺苷酸化信號(hào))。這樣的調(diào)節(jié)序列如Goeddel，GENEEXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS IN ENZYMOLOGY185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中所述。調(diào)節(jié)序列包括在許多類(lèi)型的寄主細(xì)胞中指導(dǎo)構(gòu)成性表達(dá)核苷酸序列的那些和只在一些寄主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列(例如，組織特異調(diào)節(jié)序列)的表達(dá)的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以依據(jù)待轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，需要的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等選擇這樣的因子。本發(fā)明的表達(dá)載體可以導(dǎo)入寄主細(xì)胞中，從而產(chǎn)生包括如本文所述的核酸編碼的融合蛋白質(zhì)或肽的蛋白質(zhì)或肽(例如，F(xiàn)T蛋白質(zhì)，F(xiàn)T蛋白質(zhì)的突變形式，融合蛋白質(zhì)等等)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以設(shè)計(jì)成在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)FT蛋白質(zhì)的。例如，F(xiàn)T蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，昆蟲(chóng)細(xì)胞(利用，桿狀病毒表達(dá)載體)，酵母細(xì)胞，植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞進(jìn)一步在Goeddel，GENEEXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS IN ENZYMOLOGY185，Academic Press，San Die go，Calf.(1990)中討論?；蛘?，重組表達(dá)載體可以例如利用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。
原核生物中蛋白質(zhì)的表達(dá)最經(jīng)常是利用含有指導(dǎo)融合或非融合蛋白質(zhì)的構(gòu)成性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的載體，在大腸桿菌中進(jìn)行的。融合載體在其編碼的蛋白質(zhì)中加了許多氨基酸，通常是在重組蛋白質(zhì)的氨基末端，但羧基末端融合也是常見(jiàn)。這樣的融合載體通常有三個(gè)目的(i)增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；(ii)增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的溶解性；和(iii)通過(guò)作為親和純化的配體輔助重組蛋白質(zhì)的純化。經(jīng)常，在融合表達(dá)載體中，在融合成分和重組蛋白質(zhì)的結(jié)合處導(dǎo)入蛋白質(zhì)裂解的位點(diǎn)，使重組蛋白質(zhì)能夠從融合成分中分離，隨后純化融合蛋白質(zhì)。這樣的酶，和它們的相關(guān)識(shí)別序列包括Xa因子，凝血酶和腸肽酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith and Johnson，1988，Gene6731-40)，pMAL(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，Beverly，Mass)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，這些表達(dá)載體可以將谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，甘露糖E結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)A分別與靶重組蛋白質(zhì)融合。
適當(dāng)?shù)目烧T導(dǎo)非融合大腸桿菌表達(dá)載體的例子包括pTrc(Amrann等人，(1988)Gene 69301-315)和Pet 11 d(Studier等人，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS INENZYMOLOGY 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)60-89)。
在大腸桿菌中使重組蛋白質(zhì)的表達(dá)最小化的一個(gè)方法是在蛋白質(zhì)水解重組蛋白質(zhì)的能力受損傷的寄主細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)。參見(jiàn)例如，Gottesman，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS IN ENZYMOLOGY 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)119-128。另一個(gè)方法是改變待插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，使各個(gè)氨基酸的個(gè)別密碼子是那些優(yōu)先用于大腸桿菌中的(參見(jiàn)例如，Wada，等人，1992.Nucl.Acids Res.202111-2118)。本發(fā)明的這樣的核酸序列的改變可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。在啤酒酵母中用于表達(dá)的載體的例子包括pYepSecl(Baldari，等人，1987.EMBO J.6229-234)，pMEa(Kurjan and Herskowitz，1982.Cell30933-943)，pJRY88(Schultz等人，1987.Gene 54113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)，和picZ(InVitrogen Corp，San Diego.Calif.)。
或者，F(xiàn)T可以利用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)。在培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中(例如，SF9細(xì)胞)表達(dá)蛋白質(zhì)可得的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith，等人，1983.Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summers，1989.Virology17031-39)。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸是利用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的例子包括pCDM8(Seed，1987.Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman，等人，1987 EMBO J.6187-195)。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中利用時(shí)，表達(dá)載體控制功能經(jīng)常是通過(guò)病毒調(diào)節(jié)元素提供的。例如，通常利用的啟動(dòng)子是從多形瘤，腺病毒2，巨細(xì)胞病毒，和猿猴病毒40中派生的。對(duì)于其他原核和真核細(xì)胞的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)參見(jiàn)例如，Sambrook，等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL.第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，N.Y.，1989，第16和17章。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸是利用植物表達(dá)載體在植物細(xì)胞中表達(dá)的。植物表達(dá)載體系統(tǒng)的例子包括在農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；蚱湟徊糠?，椰菜花葉病毒(CAMV)DNA和載體如pBI121。
對(duì)于植物中的表達(dá)，重組表達(dá)盒將包含F(xiàn)T核酸和植物啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(如果待轉(zhuǎn)錄的編碼序列中沒(méi)有)，和轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化序列。終止/聚腺苷酸化區(qū)可以從與啟動(dòng)子序列相同的基因中得到，或者可以從不同的基因中得到。通常包括在盒子的5’和3’末端的獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)允許容易地插入預(yù)存在的載體。
適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的例子包括來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子如來(lái)自椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(CaMV)。Odell，等人，Nature，313810-812(1985)。來(lái)自這些基因的啟動(dòng)子如水稻激動(dòng)素(McElroy，等人，Plant Cell，163-171(1990))；泛素(Christensen，等人，Plant Mol.Biol.，12619-632(1992)；和Charistensen，等人，Plant Mol.Biol.，18675-689(1992))；pEMU(Last，等人，Theor.Appl.Genet.，81581-588(1991))；MAS(Velten，等人，EMBO J.，32723-2730(1984))；玉米H3組酮(Lepetit，等人，Mol.Gen.Genet.，231276-285(1992)；和Atanassvoa，等人Plant Journal，2(3)291-300(1992))，從根癌農(nóng)桿菌的T-DNA派生的5’-或3’-啟動(dòng)子，Smas啟動(dòng)子，肉桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(U.S.專(zhuān)利號(hào)，5,683,439)，Nos啟動(dòng)子，rubisco啟動(dòng)子，GRP1-8啟動(dòng)子，ALS啟動(dòng)子(WO 96/30530)，合成啟動(dòng)子，如Rsyn7，SCP和UCP啟動(dòng)子，核糖-1，3-二磷酸羧化酶，特異于果實(shí)的啟動(dòng)子，熱休克啟動(dòng)子，特異于種子的啟動(dòng)子和其他來(lái)自各種植物基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，例如包括各種冠癭堿起始區(qū)，如章魚(yú)堿，甘露堿，和胭脂堿。
可以與FT編碼核酸序列結(jié)合用于植物中表達(dá)的其他調(diào)節(jié)元素包括終止子，聚腺苷酸化序列，和編碼允許植物細(xì)胞中定位從細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的信號(hào)肽的核酸序列。用于添加或交換具有調(diào)節(jié)元素FT基因的這些元素的這樣的調(diào)節(jié)元素和方法是已知的，并且包括，但不限于3’終止和/或聚腺苷酸化區(qū)域如根癌農(nóng)桿菌合成酶9nos0基因(Bevan，等人，Nucl.Acids Res.，12369-385(1983))；土豆蛋白質(zhì)酶抑制劑II(PINII)基因(Keil，等人，Nucl.Acids Res.，145641-5650(1986)的那些，并且引入本文作為參考)；和An，等人，Plant Cell，1115-122(1989))；和CaMV 19S基因(Mogen，等人，Plant Cell，21261-1272(1990))。
本發(fā)明中利用了植物信號(hào)序列，包括但不限于編碼將蛋白質(zhì)靶擊到植物細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的DNA/RNA序列的信號(hào)肽(Dratewka-Kos，等人，J.Biol.Chem.，2644896-4900(1989))和Nicotiana plumbaginifolia擴(kuò)展基因(DeLoose，等人，Gene，9995-100(1991))，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶擊到液泡的信號(hào)肽，如甜土豆sporamin基因(Matsuka，等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)，88834(1991))和燕麥植物凝集素基因(Wilkins，等人，Plant Cell，2301-313(1990))，或?qū)е碌鞍踪|(zhì)分泌的信號(hào)，如PRIb的(Lind，等人，Plant Mol.Biol.，1847-53(1992))，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶擊到質(zhì)體的那些如葡萄種子烯酰-ACP還原酶的(Verwaert，等人，Plant Mol.Biol.，26189-202(1994))。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)選地在特定的細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)(例如，利用組織特異調(diào)節(jié)元素表達(dá)核酸)。組織特異調(diào)節(jié)元素是本領(lǐng)域已知的。特定地與本發(fā)明的核酸結(jié)合利用的是可在植物中操作的表達(dá)系統(tǒng)。這些包括在組織特異啟動(dòng)子的控制下的系統(tǒng)，以及包括在所有植物組織中可操作的啟動(dòng)子的那些。
器官特異啟動(dòng)子也是本領(lǐng)域已知的。例如，patatin類(lèi)I啟動(dòng)子只在土豆塊莖中轉(zhuǎn)錄激活，并且可用于靶擊塊莖中的基因表達(dá)(Bevan，M.，1986，Nucleic Acids Research 144625-4636)。另一個(gè)土豆特異啟動(dòng)子是顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSS)啟動(dòng)子(Visser，R.G.R.，等人，1991，Plant Molecular Biology 17691-699)。
利用已知的方法可以分離適用于需要的靶器官的其他器官特異啟動(dòng)子。這些控制序列通常是與在需要的器官中獨(dú)特表達(dá)的基因結(jié)合的。在典型的高等植物中，每個(gè)器官具有其他器官系統(tǒng)中沒(méi)有的幾千個(gè)mRNA(參見(jiàn)Goldberg，P.，1986，Trans.R.Soc.London B3 14343)。
為了原位生產(chǎn)GST的反義mRNA，將包括未翻譯區(qū)的轉(zhuǎn)錄成GST mRNA的GST基因的那些區(qū)域在反向的啟動(dòng)子系統(tǒng)的控制下插入表達(dá)載體。然后，得到的轉(zhuǎn)錄mRNA是與植物正常生產(chǎn)的互補(bǔ)的。
將得到的表達(dá)系統(tǒng)或盒子連接進(jìn)或構(gòu)建包括在適用于植物轉(zhuǎn)化的重組載體。該載體也可以含有可選擇的標(biāo)記基因，該標(biāo)記基因可用于在培養(yǎng)物中鑒定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。通常，標(biāo)記基因?qū)⒕幋a抗生素抗性。這些標(biāo)記包括對(duì)G418，潮霉素，博來(lái)霉素，卡那霉素，和慶大霉素的抗性。在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，具有該載體的那些細(xì)胞可以由它們?cè)诤刑囟ǖ目股氐呐囵B(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力來(lái)鑒定。細(xì)菌或病毒起源的重復(fù)序列通常也包括在內(nèi)，允許細(xì)菌或噬菌體寄主中克隆載體，優(yōu)選地包括一個(gè)大的寄主范圍的原核生物復(fù)制來(lái)源。細(xì)菌的可選擇標(biāo)記也應(yīng)該包括在內(nèi)，允許選擇含有需要的構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞。適當(dāng)?shù)脑松锟蛇x擇標(biāo)記也包括對(duì)抗生素如卡那霉素或四環(huán)素的抗性。
編碼其他功能的其他DNA序列也存在于本領(lǐng)域已知的載體中。例如，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的情況中，T-DNA序列也將包括在內(nèi)用于隨后轉(zhuǎn)化植物染色體。
本發(fā)明的另一方面涉及已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的寄主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“寄主細(xì)胞”和“重組寄主細(xì)胞”在本文中是可以交換使用的?？梢岳斫猓@樣的術(shù)語(yǔ)不僅指特定的主體細(xì)胞，而且是這樣的一個(gè)細(xì)胞的子代或潛在的子代。因?yàn)樵诤罄m(xù)的子代中由于突變或環(huán)境影響可能存在一些改變，事實(shí)上，這樣的子代可能與親本細(xì)胞不相同，但仍然包括在本文所用的術(shù)語(yǔ)的范圍中?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”用于指在寄主細(xì)胞中導(dǎo)入外源核酸(例如，DNA)的許多領(lǐng)域內(nèi)已認(rèn)識(shí)的技術(shù)。
本發(fā)明的寄主細(xì)胞，培養(yǎng)物中的原核生物或真核生物寄主細(xì)胞可以用于生產(chǎn)(即表達(dá))在本發(fā)明的聚核苷酸的開(kāi)放讀碼框架中編碼的本發(fā)明的多肽。因此，本發(fā)明另外提供了利用本發(fā)明的寄主細(xì)胞生產(chǎn)多肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在能生產(chǎn)該多肽額適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的寄主細(xì)胞(其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼本發(fā)明的多肽額重組表達(dá)載體)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法另外包括從培養(yǎng)基或寄主細(xì)胞分離多肽。
許多類(lèi)型的細(xì)胞可以作為本發(fā)明的聚核苷酸的開(kāi)放讀碼框架編碼的多肽的表達(dá)所適用的寄主細(xì)胞。植物寄主細(xì)胞包括例如，可以作為本發(fā)明的聚核苷酸的表達(dá)的適當(dāng)寄主起作用的植物細(xì)胞，包括來(lái)自各種植物種類(lèi)如擬南芥，煙草，苜蓿，玉米，和大豆的表皮細(xì)胞，葉肉和其他地下組織，和葉子，莖，花器官和根中的微管束組織。
或者，也可以生產(chǎn)低等真核生物如酵母或原核生物如細(xì)菌中的多肽。潛在的適當(dāng)?shù)慕湍妇臧ㄆ【平湍?，Schizosaccharomyces pombe，Kluyveromyces菌株，Candida，或能夠表達(dá)異源蛋白質(zhì)的任何酵母菌株。潛在的適當(dāng)?shù)募?xì)菌菌株包括大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌或能夠表達(dá)異源多肽的任何細(xì)菌菌株。如果多肽是在酵母或細(xì)菌中制造的，可能需要修飾其中產(chǎn)生的多肽，例如通過(guò)適當(dāng)位點(diǎn)的磷酸化或糖苷化，目的是得到足夠長(zhǎng)并且構(gòu)型具有活性的功能多肽。這樣的共價(jià)附著可以利用已知的化學(xué)或酶學(xué)方法來(lái)完成。
多肽可以通過(guò)在適于表達(dá)重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞來(lái)制備。然后，可以從這樣的培養(yǎng)物(例如，從培養(yǎng)基或細(xì)胞萃取物)中利用已知的純化方法，如凝膠過(guò)濾和離子交換層析純化得到的表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)。多肽或蛋白質(zhì)的純化也可以包括含有結(jié)合蛋白質(zhì)的試劑的親和柱；一個(gè)或多個(gè)柱步驟，這樣的親和樹(shù)脂如伴刀豆球蛋白A瓊脂糖，肝素富山珍珠或Cibacrom藍(lán)3GA瓊脂糖；包括利用這樣的樹(shù)脂，如苯乙醚，丁乙醚，或丙乙醚的疏水相互反應(yīng)層析；或免疫親和層析的一個(gè)或多個(gè)步驟。
或者，多肽或蛋白質(zhì)也可以表達(dá)成能簡(jiǎn)化純化過(guò)程的形式。例如，它可以表達(dá)成含有六殘基組氨酸末尾的融合蛋白質(zhì)。然后，組氨酸末尾的蛋白質(zhì)結(jié)合Ni-親和柱。在洗脫所有其他的蛋白質(zhì)后，可以洗脫組氨酸末尾的蛋白質(zhì)完成快速有效的純化?？梢岳檬杷甊P-HPLC介質(zhì)，例如具有懸垂甲基或其他雙親性基團(tuán)的硅膠的一個(gè)或多個(gè)逆相高效液體層析(RP-HPLC)步驟進(jìn)一步純化多肽。結(jié)合各不相同的一些或所有前面的純化步驟也可以用于提供基本同源分離的重組多肽。這樣純化的蛋白質(zhì)或多肽基本無(wú)其他植物蛋白質(zhì)或多肽，根據(jù)本發(fā)明定義為“已分離”。
已轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明包括原生質(zhì)體，植物細(xì)胞，植物組織和植物(例如，用FT核酸，含有FT核酸的載體或含有FT核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的單子葉和雙子葉植物，適于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物的核酸的例子包括SEQ ID NO4，40-57或58的那些核酸序列。如本文所用，“植物”指不僅包括整個(gè)植物，而且包括其一部分(即，細(xì)胞，和組織，包括例如，葉子，莖，苗，根，花，果實(shí)和種子)。
植物可以是任何植物類(lèi)型，包括例如，來(lái)自下列屬的種類(lèi)Cucurbita，Rosa，Vitis，Juglans，F(xiàn)ragaria，Lotus，Medicago，Onobrychis，Thifolium，Trigonella，Vigna，Citrus，Linum，Geranium，Manihot，Daucus，Arabidopsis，Brassica，Raphanus，Sinapis，Atropa，Capsicum，Datura，Hyoscyamus，Lycopersicon，Nicotiana，Solanum，Petunia，Digitalis，Majorana，Ciahorium，Helianthus，Lactuca，Bromus，Asparagus，Antirrhinum，Heterocallis，Nemesis，Pelargonium，Panieum，Pennisetum，Ranunculus，Senecio，Salpiglossis，Cucumis，Browaalia，Glycine，Pisum，Phaseolus，Lolium，Oryza，Zea，Avena，Hordeum，Secale，Triticum，Sorghum，Picea，Caco，和Populus。
在本發(fā)明的一些方面，轉(zhuǎn)化植物是抗抗生素和非生物脅迫的，例如，寒冷脅迫，鹽脅迫，熱脅迫，水脅迫，疾病，蟲(chóng)害，和傷口愈合。另外，本發(fā)明也包括抗致病原如真菌，細(xì)菌，線蟲(chóng)，病毒和寄生雜草有抗性的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘?，轉(zhuǎn)基因植物是抗除草劑的?？剐允侵钢参锬茉诿{迫條件(例如，高鹽，失水，低溫)或在正常地抑制未轉(zhuǎn)化的植物到一定程度的條件下生長(zhǎng)。確定植物生長(zhǎng)或?qū)γ{迫的應(yīng)答的方法包括例如，高度的測(cè)量，重量的測(cè)量，葉子面積，開(kāi)花，水利用，呼吸速度和生產(chǎn)的能力的測(cè)量。
本發(fā)明也包括細(xì)胞，組織，包括例如葉子，莖，苗，根，花，果實(shí)和種子和從轉(zhuǎn)化植物派生的子代。
在植物中導(dǎo)入外源基因的許多方法是已知的，并且可以用于在植物寄主中插入基因，包括生物和物理的植物轉(zhuǎn)化方案。參見(jiàn)例如，Miki等人，(1993)“在植物中導(dǎo)入外源DNA的方法”，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法，Glick and Thompson，eds.，CRCPress，Inc.，Boca Raton，67-88頁(yè)，和Andrew Bent，Clough SJ andBent AF，1998?；ń哼x擇的方法根據(jù)寄主植物改變，包括化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，如磷酸鈣，聚乙二醇(PEG)轉(zhuǎn)化，微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移如農(nóng)桿菌(Horsch，等人，Science，2271229-31(1985))，電穿孔，原生質(zhì)轉(zhuǎn)化，微注射，花蘸和顆粒或非顆粒生物炸彈。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在植物中導(dǎo)入表達(dá)載體的利用最廣泛的方法是基于農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的。根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)是在遺傳上轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物致病原土壤細(xì)菌。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶了負(fù)責(zé)植物的基因轉(zhuǎn)化的基因。參見(jiàn)例如，Kado，Crit.Rev.Plant Sci.，101-32(1991)。Gruber等人，出處同上；和Moloney，等人，Plant Cell Reports，8238-242(1989)提供了用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)的描述。
轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物可以容易地通過(guò)將開(kāi)花植物蘸入農(nóng)桿菌培養(yǎng)物中的方法來(lái)生產(chǎn)，方法是根據(jù)Andrew Bent in，Clough SJand Bent AF，1998。蘸花擬南芥的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的簡(jiǎn)化方法。野生型植物生長(zhǎng)直到植物具有在開(kāi)的花和已開(kāi)的花。植物回到攜帶適當(dāng)?shù)幕驑?gòu)建體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的溶液中1分鐘。然后，植物在一個(gè)淺盤(pán)中保持水平，保持覆蓋2天保持潮濕，然后，扶正，打包，繼續(xù)生長(zhǎng)，發(fā)育種子。大量收獲成熟的種子。
直接基因轉(zhuǎn)移植物轉(zhuǎn)化的一般可應(yīng)用的方法是位粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中在約1到4mu.m的微粒表面上攜帶了DNA。該表達(dá)載體是利用將微彈的速度加速到足以滲透到植物細(xì)胞壁和膜的300到600m/s的生物裝置來(lái)導(dǎo)入植物組織(Sanford，等人，Part.Sci.Technol.，527-37(1987)；Sanford，Trend Biotech，6299-302(1988)；Sanford，Physiol.Plant，79206-209(1990)；Klein，等人，Biotchnology，10286-291(1992))。
將DNA物理遞送到植物的另一個(gè)方法是將靶細(xì)胞超聲波處理，如Zang，等人，BioTechnology，9996-996(1991)?；蛘?，利用脂質(zhì)體或原生質(zhì)體融合在植物中導(dǎo)入表達(dá)載體。參見(jiàn)例如，Deshayes，等人，EMBO J.，42731-2737(1985)；and Christou，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，843962-3966(1987)。利用CaCl2沉淀，聚乙烯醇或聚-L-鳥(niǎo)氨酸也已經(jīng)敘述過(guò)。參見(jiàn)例如，Hain，等人，Mol.Gen.Genet.，199161(1985)；和Draper，等人，PlantCell Physiol.，23451-158(1982)。
原生質(zhì)體和整個(gè)細(xì)胞和組織的電穿孔也已經(jīng)敘述過(guò)。參見(jiàn)例如，Donn，等人，(1990)Abstracts ofthe VIIth Int；1.Congress onPlant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，53頁(yè)；D’Halluin等人，Plant Cell，41495-1505(1992)；and Spencer等人，Plant Mol.Biol.，2451-61(1994)。
植物也可以利用Held等人的方法來(lái)轉(zhuǎn)化(美國(guó)申請(qǐng)20010026941)。該方法利用了攜帶需要的分子，DNA進(jìn)入靶細(xì)胞的小滴的加速的氣霧束。這一方法產(chǎn)生的小滴的大小據(jù)報(bào)道足以小到轉(zhuǎn)化長(zhǎng)度1到2微粒的細(xì)菌細(xì)胞。
顆粒創(chuàng)傷/農(nóng)桿菌遞送另一個(gè)有用的基本轉(zhuǎn)化方法包括結(jié)合創(chuàng)傷和顆粒炸彈，接著利用農(nóng)桿菌遞送DNA，入Bidney，等人，Plant Mol.Biol.，18301-31(1992)所述。利用的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒包括Bin 19。參見(jiàn)Bevan，Nucleic Acids Research，128711-8721(1984)，該文通過(guò)在此引述而合并于本文。
通常，完整的分生組織轉(zhuǎn)化方法包括在暗中吸漲種子，除去子葉和根軸，接著培養(yǎng)分生組織外植體。24小時(shí)后，除去最初的葉子，暴露頂端的分生組織。將外植體圓頂立起來(lái)放置，例如用顆粒轟炸兩次，接著與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。為了與整個(gè)分生組織共培養(yǎng)，將農(nóng)桿菌放置于分生組織上。在約共培養(yǎng)了3天后，將分生組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，用頭胞噻肟加卡那霉素進(jìn)行NPTII選擇。
劈開(kāi)分生組織的方法包括，吸漲種子，斷裂子葉在胚軸的平臺(tái)上產(chǎn)生一個(gè)清潔的裂口，切掉根尖，然后在原始葉子之間縱向等分外植體。兩個(gè)閥放置在培養(yǎng)基上的切開(kāi)的表面，然后用顆粒轟炸兩次，接著與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。對(duì)于分開(kāi)的分生組織，在轟炸后，將分生組織放置于農(nóng)桿菌懸浮液中30分鐘。然后，從懸浮液中移到固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天。在這一時(shí)期后，將分生組織轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中，用頭胞塞肟加卡那霉素選擇。
通過(guò)植物育種轉(zhuǎn)移或者，當(dāng)通過(guò)前面的重組DNA方法得到一次轉(zhuǎn)化的植物后，利用常規(guī)的植物育種方法通過(guò)雜交和回交轉(zhuǎn)移基因和相關(guān)的調(diào)節(jié)序列。這樣的中間性方法包括其他步驟(1)將抗病植物與來(lái)自疾病敏感的類(lèi)群的植物有性雜交；(2)從雜交的子代回收可再生物質(zhì)；和(3)從可再生物質(zhì)生長(zhǎng)疾病抗性植物。需要或必須時(shí)，可以將這一方法延伸包括其他重復(fù)步驟可以基本保留敏感類(lèi)群的農(nóng)業(yè)特征(1)將抗病子代與來(lái)自敏感類(lèi)群的疾病敏感植物回交；和(2)在回交的子代中選擇過(guò)氧化氫生產(chǎn)酶活性的表達(dá)(或相關(guān)的標(biāo)記基因)，直到需要百分?jǐn)?shù)的敏感類(lèi)群的特征和給予草酸降解和/或過(guò)氧化氫酶活性的基因出現(xiàn)在子代中。
本文的術(shù)語(yǔ)“類(lèi)群”是指生物分類(lèi)的一個(gè)單位。它包括，屬，種，品種，變種，變異種和其他不一致命名的小類(lèi)群組。
轉(zhuǎn)化體的再生來(lái)自單個(gè)植物原生質(zhì)體或各種外植體的植物的發(fā)育或再生是本領(lǐng)域已知的(Weissbach and Weissbach，1988)。這一再生和生長(zhǎng)的過(guò)程通常包括步驟選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，培養(yǎng)那些單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胚發(fā)育的一般時(shí)期到長(zhǎng)根的小植株時(shí)期。同樣地再生轉(zhuǎn)基因的胚和種子。然后，在適當(dāng)?shù)闹参锷L(zhǎng)培養(yǎng)基入土壤中種植得到的轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)根的苗。
利用本領(lǐng)域已知的方法如(Horsch等人，1985)所述可以進(jìn)行含有編碼從葉子外植體通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入的需要的多肽的外源基因的植物的發(fā)育或再生。在這一方法中，在存在選擇試劑和在誘導(dǎo)待轉(zhuǎn)化的植物品系的苗的再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，如(Fraley等人，1983)所述。特別是，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,349,124(該文通過(guò)在此引述而合并于本文)詳細(xì)敘述了從中可以表達(dá)給予植物抗鱗翅目蛾類(lèi)的殺昆蟲(chóng)活性的雜合體結(jié)晶蛋白質(zhì)的遺傳轉(zhuǎn)化萵苣細(xì)胞和植物的生產(chǎn)。
這一方法通常在2到4個(gè)月產(chǎn)生了苗，然后將那些苗轉(zhuǎn)移到含有選擇因子和房細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素的適當(dāng)?shù)母T導(dǎo)培養(yǎng)基上。然后將存在選擇因子時(shí)長(zhǎng)根形成小植株的苗移植到土壤中或其他允許根生長(zhǎng)的介質(zhì)中。這些方法可以根據(jù)利用的特定的植物品系變化，這樣的變化是本領(lǐng)域已知的。
優(yōu)選地，將再生的植株自花授粉提供純合的轉(zhuǎn)基因植物，或?qū)脑偕仓甑玫降幕ǚ叟c農(nóng)業(yè)上重要的，優(yōu)選地自交系種子生長(zhǎng)植物雜交。相反地，還利用來(lái)自這些重要的品系的植物的花粉對(duì)再生植株授粉。利用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)含有需要的多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是獨(dú)立的分離子，可以將FT基因和它的活性傳遞到它的子代。更優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是該基因的純合子，在有性交配的基礎(chǔ)上可以將那個(gè)基因傳遞到它所有的子代。來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物的種子可以在田野或溫室中生長(zhǎng)，得到的性成熟轉(zhuǎn)基因植物自花授粉后產(chǎn)生純育植物。來(lái)自這些植物的子代變成FT轉(zhuǎn)基因的表達(dá)增強(qiáng)的純育系。
生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法包括在本發(fā)明中的是脅迫抗性提高，衰老延遲或?qū)BA的敏感性提高的轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法。改方法包括在一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中導(dǎo)入改變植物中法尼基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)(即，法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha或beta)或活性的化合物。該化合物可以是例如，(i)法尼基轉(zhuǎn)移酶多肽的抑制劑；(ii)編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶多肽抑制劑的核酸；(iii)降低編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸，和其衍生物，片段，類(lèi)似物和同源物的表達(dá)核酸；(iv)反義法尼基轉(zhuǎn)移酶核酸。降低編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸的表達(dá)的核酸包括例如，反義核酸或RNA抑制性核酸。該核酸可以是內(nèi)源的或外源的。優(yōu)選地，該化合物是法尼基轉(zhuǎn)移酶多肽，或編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸。例如，該化合物是SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ IDNO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的核酸序列。更優(yōu)選地，該化合物是與編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸互補(bǔ)的核酸。例如，一個(gè)反義核酸分子?？勺鳛槔拥幕衔锇⊿EQ ID NO1，3，4，29，30，32，35，38，40-57和58。
同樣包括在本發(fā)明中的是在編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶(即，alpha或beta)的基因中已經(jīng)導(dǎo)入了一個(gè)突變的植物，這樣導(dǎo)致植物與野生型植物比較法尼基轉(zhuǎn)移酶活性降低，對(duì)脅迫的耐性降低。該突變可以通過(guò)化學(xué)或機(jī)械的方法來(lái)導(dǎo)入。
脅迫的例子包括例如，寒冷脅迫，熱脅迫，鹽脅迫，水脅迫，營(yíng)養(yǎng)限制脅迫，疾病，食植害蟲(chóng)，創(chuàng)傷愈合，致病原如真菌，細(xì)菌，線蟲(chóng)，病毒或寄生雜草和殺蟲(chóng)劑。
脅迫抗性提高是指該轉(zhuǎn)基因植物可以在脅迫條件下(例如，高鹽，脫水，低溫)或在正常時(shí)抑制未轉(zhuǎn)化的植物的生長(zhǎng)的條件下可以生長(zhǎng)。確定植物的生長(zhǎng)或?qū)γ{迫的應(yīng)答的方法包括例如，測(cè)量高度，測(cè)量重量，葉子面積，開(kāi)花的能力，水的利用，蒸騰的速度和產(chǎn)量。
如實(shí)施例11所述，可以利用ABA的濃度曲線評(píng)估ABA的敏感性，并且在平板上萌發(fā)種子。評(píng)估萌發(fā)的頻率，用于確定敏感性。但是，敏感性也可以在除了簡(jiǎn)單萌發(fā)以外的許多發(fā)育時(shí)期觀察。例如，在子葉擴(kuò)展，第一片真葉的擴(kuò)展，或苗期的發(fā)育停滯時(shí)期也可以觀察到敏感性的提高。
能觀察到敏感性的ABA濃度是根據(jù)品種不同而變化的。例如，轉(zhuǎn)基因擬南芥中的敏感濃度比苜?；虼蠖怪杏^察到的更低。
通過(guò)提高ABA敏感性，可以看到，轉(zhuǎn)基因植物展示與野生型植物相同的表現(xiàn)型需要的ABA濃度更低。確定ABA敏感性的方法包括例如，植物萌發(fā)，生長(zhǎng)或發(fā)育。
植物可以是如下的任何植物類(lèi)型，包括Cucurbita，Rosa，Vitis，Juglans，F(xiàn)ragaria，Lotus，Medicago，Onobrychis，Trifolium，Trigonella，Vigna，Citrus，Linum，Geranium，Manihot，Daucus，Arabidopsis，Brassica，Raphanus，Sinapis，Atropa，Capsicum，Datura，Hyoscyamus，Lycopersicon，Nicotiana，Solanum，Petunia，Digitalis，Majorana，Ciahorium，Helianthus，Lactuca，Bromus，Asparagus，Antirrhinum，Heterocallis，Nemesis，Pelargonium，Panieum，Pennisetum，Ranunculus，Senecio，Salpiglossis，Cucumis，Browaalia，Glycine Pisum，Phaseolus，Lolium，Oryza，Zea，Avena，Hordeum，Secale，Triticum，Sorghum，Picea，Caco，和Populus.
篩選方法本發(fā)明的分離的核酸分子(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37)可用于表達(dá)FT蛋白質(zhì)(例如，通過(guò)寄主中的重組表達(dá)載體)，檢測(cè)FTmRNA(例如，在生物樣品中)，或FT基因中的遺傳損傷，和調(diào)節(jié)FT活性，如下面進(jìn)一步敘述。另外，F(xiàn)T蛋白質(zhì)可以用于篩選調(diào)節(jié)FT蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)的化合物。另外，本發(fā)明的抗FT抗體可以用于檢測(cè)和分離FT蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)FT活性。
本發(fā)明提供了用于鑒定結(jié)合FT蛋白質(zhì)或?qū)鏔T蛋白質(zhì)的表達(dá)或FT蛋白質(zhì)的活性具有刺激或抑制效果的調(diào)節(jié)物，即候選或測(cè)試化合物或試劑(例如，肽，肽模擬物，小分子，或其他藥物)的方法(本文也稱(chēng)為“篩選實(shí)驗(yàn))。本發(fā)明也包括在本文所述的篩選實(shí)驗(yàn)中鑒定的化合物。本發(fā)明也包括利用誘變，基因標(biāo)記，插入性基因標(biāo)記，激活標(biāo)記，或其他這樣的基因或表現(xiàn)型鑒定方法在篩選方案中利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物鑒定相關(guān)基因的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選結(jié)合FT蛋白質(zhì)或多肽其生物活性部分的候選或?qū)嶒?yàn)化合物的測(cè)試方法。本發(fā)明的測(cè)試化合物可以利用本領(lǐng)域已知的結(jié)合文庫(kù)方法中的許多途徑來(lái)得到，包括生物文庫(kù)；空間可知的平行固相或液相文庫(kù)；需要解旋的合成文庫(kù)方法；“一珠一化合物”文庫(kù)方法；和利用親和層析選擇的合成文庫(kù)方法。生物文庫(kù)途徑僅限于肽文庫(kù)，而其他四個(gè)途徑可應(yīng)用于肽，非肽寡聚物或化合物的小分子文庫(kù)。參見(jiàn)例如，Lam，1997，Anticancer Drug Design 12145。
如本文所用，“小分子”是指分子量小于約5Kd，更優(yōu)選地小于約4kD的組合物。小分子可以例如是核酸，肽，多肽，肽模擬物，碳水化合物，脂或其他有機(jī)或無(wú)機(jī)分子?；瘜W(xué)和/或生物混合物，如真菌，細(xì)菌，或藻類(lèi)萃取物的文庫(kù)是本領(lǐng)域已知的，并且可以利用本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)篩選。
合成分子文庫(kù)的方法的例子可以在本領(lǐng)域中找到，例如，在Dewitt，等人，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb，等人，1994。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9111422；Zuckermann，等人，1994.J.Med.Chem.372678；Cho，等人，1993.Science2611303；Carrell，等人，1994.J.Med.Chem.372678；Cho，等人，1993.Science 2611303；Carrell，等人，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell，等人，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；and Gallop，等人，1994.J.Med.Chem.371233。
化合物的文庫(kù)可以存在于溶液中(例如，Houghten，1992.Biotechniques 13412-421)，或在小珠上(Lam，1991.Nature35482-84)，在條上(Fodor，1993.Nature 364555-556)，細(xì)菌(Landner，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,223,409)，芽胞(Landner，美國(guó)專(zhuān)利5,233,409)，質(zhì)粒(Cull，等人.，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA891865-1869)或在嗜菌體上(Scott and Smith，1990 Science249386-390；Devlin，1990.Science 249404-406；Cwirla，等人，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A876378-6382；Felici，1991.J.Mol.Biol.222301-310；Landner.美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,233,409)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試是基于細(xì)胞的測(cè)試，其中表達(dá)FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，并且確定了測(cè)試化合物結(jié)合FT蛋白質(zhì)的能力。該細(xì)胞例如可以是哺乳動(dòng)物起源，植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。確定測(cè)試化合物結(jié)合FT蛋白質(zhì)的能力可以例如將測(cè)試化合物與放射性同位素或酶標(biāo)記結(jié)合來(lái)完成，使測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分的結(jié)合可以通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物中的標(biāo)記化合物來(lái)確定。例如，測(cè)試化合物可以是用125I，35S，14C，3H，直接或間接地標(biāo)記，通過(guò)直接計(jì)數(shù)輻射發(fā)散或通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)放射性同位素。或者，可以用例如，辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，或熒光酶來(lái)酶標(biāo)記，并且通過(guò)確定適當(dāng)?shù)牡孜锱c產(chǎn)物的交換檢測(cè)酶標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試包括將表達(dá)FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分額細(xì)胞與結(jié)合FT的已知化合物接觸形成測(cè)試混合物，將測(cè)試混合物與測(cè)試化合物接觸，確定測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)的相互作用的能力，其中確定測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)的相互作用的能力包括確定測(cè)試化合物優(yōu)先結(jié)合FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分的能力，并且與已知化合物比較。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試是基于細(xì)胞的測(cè)試，包括將表達(dá)FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸和確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(例如，刺激或抑制)FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分的活性的能力。確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)FT或其生物活性部分的活性的能力可以例如通過(guò)確定FT蛋白質(zhì)結(jié)合或與FT靶分子相互作用的能力來(lái)完成。如本文所用，“靶分子”是FT蛋白質(zhì)自然情況下結(jié)合或相互反應(yīng)的分子，例如在表達(dá)FT相互作用蛋白質(zhì)的細(xì)胞表面上的分子，在第二個(gè)細(xì)胞的表面上的分子，在細(xì)胞外環(huán)境中的一個(gè)分子，與細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)分子的內(nèi)部表面結(jié)合的分子。FT靶分子可以是本發(fā)明的一個(gè)非FT分子或FT蛋白質(zhì)或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)T靶分子是簡(jiǎn)化細(xì)胞外信號(hào)(例如，化合物與膜結(jié)合分子結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào))傳導(dǎo)通過(guò)細(xì)胞膜和進(jìn)入細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成分。靶例如可以是具有催化活性的第二個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，或簡(jiǎn)化下游信號(hào)分子與FT的結(jié)合的蛋白質(zhì)。
FT蛋白質(zhì)結(jié)合或與FT靶分子相互作用的能力的確定可以通過(guò)如上所述的確定直接結(jié)合的方法中的一個(gè)來(lái)完成。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定FT蛋白質(zhì)與FT靶分子結(jié)合或相互作用的能力可以通過(guò)確定靶分子的活性的來(lái)完成。例如，靶分子的活性可以通過(guò)確定靶的細(xì)胞第二信使(即，細(xì)胞內(nèi)Ca2+，二乙酰甘油，IP3，等等)的誘導(dǎo)，檢測(cè)靶對(duì)適當(dāng)?shù)牡孜锏拇呋?酶活性，檢測(cè)報(bào)道基因(包括與編碼可檢測(cè)標(biāo)記，例如熒光酶的核酸可操作地連接的FT應(yīng)答調(diào)節(jié)元素)的誘導(dǎo)；或檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)答，例如細(xì)胞的生存，細(xì)胞分化，或細(xì)胞增殖來(lái)確定。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的測(cè)試是無(wú)細(xì)胞測(cè)試，包括將FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸，和確定測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分結(jié)合的能力。測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)的結(jié)合可以如上所述直接或間接測(cè)定。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，測(cè)試包括將FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分與結(jié)合FT的已知化合物接觸形成測(cè)試化合物，將測(cè)試混合物與測(cè)試化合物接觸，確定測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)相互作用的能力的測(cè)定包括確定測(cè)試化合物與FT或其生物活性部分優(yōu)選結(jié)合的能力，并且與已知的化合物比較。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試是無(wú)細(xì)胞測(cè)試，包括將FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸，確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(例如，刺激或抑制)FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分的活性的能力。測(cè)試化合物調(diào)節(jié)FT的活性的能力的確定可以例如通過(guò)如上所述的確定直接結(jié)合的一個(gè)方法確定FT蛋白質(zhì)結(jié)合FT靶分子的能力來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)或選的實(shí)施方案中，測(cè)試化合物調(diào)節(jié)FT蛋白質(zhì)的活性的能力的確定可以通過(guò)確定FT蛋白質(zhì)進(jìn)一步調(diào)節(jié)FT靶分子的能力來(lái)完成。例如，可以如上所述確定適當(dāng)?shù)牡孜锷习蟹肿拥拇呋?酶活性。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)細(xì)胞測(cè)試包括，將FT蛋白質(zhì)或其生物活性部分與結(jié)合FT蛋白質(zhì)的已知化合物接觸形成測(cè)試混合物，將測(cè)試混合物與測(cè)試化合物接觸，確定測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)相互作用的能力的確定包括確定FT蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合或調(diào)節(jié)FT靶分子的活性的能力。
本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞測(cè)試方法可以修改成利用FT蛋白質(zhì)的可溶形式或膜結(jié)合形式。在包括FT蛋白質(zhì)的膜結(jié)合形式的無(wú)細(xì)胞測(cè)試的情況中，需要利用溶解試劑使FT蛋白質(zhì)的膜結(jié)合形式保留在溶液中。這樣的溶解試劑的例子包括非離子去垢劑如n-辛基葡糖苷，n-十二烷基葡糖苷，n-十二烷基甘露糖苷，辛?；?N-甲基葡糖酰胺，葵?；?N-甲基葡糖酰胺，曲通X-100，曲通X-114，Thesit，異三葵基聚(乙二醇醚)n，N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸，3-(3-氯酰丙基)二甲基氨基-1-丙烷磺酸(CHAPS)，或3-(3-氯酰丙基)二甲基氨基-2-羥基-1-丙烷磺酸(CHAPSO)。
在本發(fā)明的上面的測(cè)試方法的不止一個(gè)實(shí)施方案中，需要將FT蛋白質(zhì)或它的靶分子固定，簡(jiǎn)化一個(gè)或兩個(gè)蛋白質(zhì)的復(fù)合形式從非復(fù)合形式中的分離，以及需要使測(cè)試方法自動(dòng)化。在存在和沒(méi)有候選化合物時(shí)，測(cè)試化合物與FT蛋白質(zhì)的結(jié)合，或FT蛋白質(zhì)與靶分子的相互作用可以在任何適于裝載反應(yīng)劑的容器中進(jìn)行。這樣的容器的例子包括微滴平板，試管，和微量離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供了加入允許一個(gè)或兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合基質(zhì)的區(qū)域的融合蛋白質(zhì)。例如，GST-FT融合蛋白質(zhì)或GST靶融合蛋白質(zhì)可以吸收到谷光甘肽瓊脂糖珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷光甘肽派生微滴平板，然后結(jié)合測(cè)試化合物或測(cè)試化合物和非吸收靶蛋白質(zhì)或FT蛋白質(zhì)，在指導(dǎo)復(fù)合物形成的條件下(例如，在生理鹽和pH)條件下溫育混合物。在溫育后，洗滌小珠或微滴平板的孔除去未結(jié)合的成分，在小珠的情況中除去固定的基質(zhì)，如上所述直接或間接測(cè)定復(fù)合物。或者，可以從基質(zhì)離解復(fù)合物，利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)測(cè)定FT蛋白質(zhì)結(jié)合或活性水平。
在基質(zhì)上固定蛋白質(zhì)的其他技術(shù)也可以用于本發(fā)明的篩選實(shí)驗(yàn)中。例如，F(xiàn)T蛋白質(zhì)或它的靶分子可以利用生物素和鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合來(lái)固定。生物素化FT蛋白質(zhì)或靶分子可以從生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰)，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如，生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)來(lái)制備，并且在鏈霉抗生物素蛋白包衣的96孔平板(Pierce Chemical)的孔中固定。或者，可以將與FT蛋白質(zhì)或靶分子反應(yīng)但不干擾FT蛋白質(zhì)與它的靶分子結(jié)合的抗體通過(guò)抗體結(jié)合派生到平板的孔中，和未結(jié)合的靶或陷入孔中的FT蛋白質(zhì)上。檢測(cè)這樣的復(fù)合物的方法，除了如上所述固定GST復(fù)合物的那些還包括利用與FT蛋白質(zhì)或靶分子反應(yīng)的抗體免疫檢測(cè)復(fù)合物，以及依賴(lài)檢測(cè)與FT蛋白質(zhì)或靶分子相關(guān)的酶活性的酶聯(lián)測(cè)試方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞與候選化合物接觸，測(cè)定細(xì)胞中的FTmRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法中鑒定了FT蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)物。將存在候選化合物時(shí)FTmRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與沒(méi)有候選化合物時(shí)FTmRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平比較。然后，根據(jù)這一比較可以確定候選化合物是FTmRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)物。例如，當(dāng)存在候選化合物時(shí)FTmRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)比沒(méi)有候選化合物時(shí)更大(即，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上更大)，則候選化合物可以鑒定為FTmRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的刺激物?；蛘撸?dāng)存在候選化合物時(shí)FTmRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)比沒(méi)有候選化合物時(shí)更低(統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上更低)，則候選化合物可以鑒定為FTmRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制劑。細(xì)胞中的FTmRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可以用本文所述的檢測(cè)FTmRNA或蛋白質(zhì)的方法來(lái)測(cè)定。
仍然在本發(fā)明的另一個(gè)方面，F(xiàn)T蛋白質(zhì)可以用作雙雜合體實(shí)驗(yàn)或三雜合體實(shí)驗(yàn)中的“餌蛋白質(zhì)”(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)，5,283,317；Zervos，等人，1993.Cell 72223-232；Madura，等人，1993.J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel，等人，1993.Biotechniques 14920-924；Iwabuchi，等人，1993.Oncogene 81693-1696；and Brrent WO94/1-3000)，鑒定與FT結(jié)合或相互作用的其他蛋白質(zhì)(“FT結(jié)合蛋白質(zhì)”或“FT-bp”)和調(diào)節(jié)FT活性。這樣的FT結(jié)合蛋白質(zhì)也可以類(lèi)似地參與通過(guò)例如FT途徑的上游或下游元素的FT蛋白質(zhì)的來(lái)傳播信號(hào)。
雙雜合體系統(tǒng)是基于包括可分離的DNA結(jié)合和激活區(qū)的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)特性的。簡(jiǎn)要地所，該實(shí)驗(yàn)利用了兩個(gè)不同的DNA構(gòu)建體。在一個(gè)構(gòu)建體中，編碼FT的基因與編碼已知轉(zhuǎn)錄因子(例如，GAL-4)的DNA結(jié)合區(qū)的基因融合。在另一個(gè)構(gòu)建體中，編碼未鑒定的蛋白質(zhì)(“捕獲物”或“樣品”)的來(lái)自DNA序列的文庫(kù)的DNA序列與編碼已知轉(zhuǎn)錄因子的激活區(qū)域的基因融合。如果“餌”和“捕獲物”蛋白質(zhì)能夠在體內(nèi)相互作用，形成依賴(lài)FT的復(fù)合物，那么轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合和激活區(qū)就接近了。這一接近允許與對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點(diǎn)可操作連接的報(bào)道基因(例如，LacZ)的轉(zhuǎn)錄?？梢詸z測(cè)報(bào)道基因的表達(dá)，可以分離含有功能性轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞克隆，用于得到編碼與FT相互作用的蛋白質(zhì)的已克隆基因。
仍然在本發(fā)明的另一方面的是通過(guò)遺傳篩選方案，利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物鑒定FT相互作用成分。這些成分例如可以是修飾FT基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元素，直接改變FT活性的相互作用蛋白質(zhì)或改變相同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成分，從而對(duì)FT的表達(dá)或活性產(chǎn)生效果的的相互作用的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，遺傳篩選方案可以用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，并且這樣來(lái)鑒定野生型篩選背景不能鑒定的相關(guān)基因。例如，利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物作為遺傳背景可以產(chǎn)生激活標(biāo)記文庫(kù)(Weigel，等人，2000.Plant Physiol.1221003-1013)。然后，篩選植物中與親本植物具有的相比有變化的表現(xiàn)型?？梢岳脧谋景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)文庫(kù)的方法，例如化學(xué)或輻射誘導(dǎo)的突變，插入失活或激活方法。
本發(fā)明另外涉及通過(guò)前面提到的篩選實(shí)驗(yàn)鑒定的新試劑和它們的用途。
本發(fā)明不打算局限于本文所述的特定實(shí)施方案的范圍。確實(shí)，除了本文所述的那些，本發(fā)明的各種修改都是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從前面的敘述和附圖中得到理解的。這樣的修改是在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)的。
本發(fā)明將進(jìn)一步在下面的實(shí)施例中敘述，這些實(shí)施例并不限制權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1克隆擬南芥FTA和構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體利用對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的引物，從葉子組織分離的總RNA通過(guò)RT-PCR得到擬南芥FTA序列。用BamHI和SmaI消化得到的片段，并且克隆進(jìn)質(zhì)粒pCR2.1。利用Clonetech載體pBI121作為反義構(gòu)建體的骨架。通過(guò)BamHI和EcolCRI消化除去GUS基因，用SmaI和BamHI從pCR2.1-FTA切出的FTA插入片段替代，連接進(jìn)載體SEQ ID NO4。
表1SEQ ID NO115’-AAAGGATCCTCAAATTGCTGCCACTGTAAT-3’SEQ ID NO125’-AAACCCGGGATGAATTTCGACGAGAACGTG-3’實(shí)施例2克隆非全長(zhǎng)苜蓿FTA和FTB核酸序列利用Qiagen Rneasy試劑盒，從葉子和根組織分離RNA。利用表2所示的引物，通過(guò)已知技術(shù)進(jìn)行RT-PCR。利用引物對(duì)SEQ ID NO19和SEQ ID NO20得到FTA序列。利用引物對(duì)SEQ ID NO21和SEQ ID NO22得到FTB序列。
表2SEQ ID NO195’-GGATCCATGGATTACTTCCGTGCGATTTACTTCTCC-3’SEQ ID NO205’-AAAAAGCTTCCATGCCCAATAGTTAGCTCTTATTGGATC-3’SEQ ID NO215’-AAAAAGCTTTGGCTTTGTTACTGGATTCTTCATTCAAT-3’SEQ ID NO225’-AAATCTAGAAGCTTCATAATACCGATCCAAGACAATGTT-3’利用Qiagen PCR柱旋轉(zhuǎn)試劑盒從RT-PCR反應(yīng)混合物分離PCR產(chǎn)物，連接進(jìn)克隆載體pBluescript KS+。用EcoRV消化載體，在存在dTTP時(shí)用Taq聚合酶處理產(chǎn)生3’突出，用于PCR產(chǎn)物的連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，選擇陽(yáng)性克隆，將得到的插入片段測(cè)序。
實(shí)施例3克隆來(lái)自大豆和玉米的非全長(zhǎng)FTA和FTB核酸序列利用Qiagen Rneasy試劑盒，從葉子和根組織分離RNA。利用表3所示的引物通過(guò)已知技術(shù)進(jìn)行RT-PCR。利用引物對(duì)SEQID NO23和SEQ ID NO24得到大豆FTA序列。利用引物對(duì)SEQ ID NO25和SEQ ID NO26得到大豆FTB序列。利用引物對(duì)SEQ ID NO27和SEQ ID NO28得到玉米FTB序列。
表3SEQ ID NO235’-AAAGGATCCATGGAATCTGGGTCTAGCGA-3’SEQ ID NO245’-AAATCTAGAAGGAAGTCTGCTCTTGCGC-3’SEQ ID NO255’-AAATCTAGAGCCACCATTCCTCGCAACG-3’SEQ ID NO265’-AAAGAGCTCGTGGTGGAGAATCTGGGTGC-3’SEQ ID NO27 5’-GGCGGATCCCGACCTACCGAGG-3’SEQ ID NO285’-AAAGAGCTCGTGGATGGATTGGCTCCAGC-3’利用Qiagen PCR柱旋轉(zhuǎn)試劑盒，從RT-PCR反應(yīng)混合物分離PCR產(chǎn)物，連接進(jìn)克隆載體pBluescript KS+。用EcoRV消化載體，在存在dTTP時(shí)用Taq聚合酶處理，產(chǎn)生一個(gè)用于連接PCR產(chǎn)物的3’突出。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，選擇陽(yáng)性克隆，將得到的插入片段測(cè)序。
實(shí)施例4序列分析擬南芥FTA在表4A中顯示了999核苷酸(也稱(chēng)為FT1)的公開(kāi)的核酸。用于PCR的引物是黑體。
SEQ ID NO1編碼的公開(kāi)的FT1多肽(SEQ ID NO5)具有326個(gè)氨基酸殘基，在表4B中表示成單字母氨基酸密碼。
由于克隆方案的特性，表示的序列不含有任何5’或3’非翻譯序列。利用本文公開(kāi)的序列作為雜交探針，可以從cDNA或基因組文庫(kù)篩選和分離全長(zhǎng)序列，或利用cDNA末端(RACE)技術(shù)的快速擴(kuò)增或其他PCR技術(shù)。擬南芥核苷酸序列和它的編碼氨基酸與公開(kāi)的序列的同一性百分?jǐn)?shù)表示在圖8。
本發(fā)明也包括了與SEQ ID NO1的擬南芥法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha亞單位互補(bǔ)的核酸序列。公開(kāi)的互補(bǔ)序列表示為SEQ IDNO2。SEQ ID NO3的核苷酸序列顯示，已經(jīng)制備的SEQ IDNO2的核酸序列可用于連接進(jìn)表達(dá)載體。
SEQ ID NO2aaaggatcctcaaattgctgccactgtaatcttgctcttcctccatgcccaatagttagctcttataggatctacacgaccaagaatagtacacaccaaattggccaagttagtctctggttcttcattagctagagctctcactgagtctttatgctcgttggttggtctcagtccatcacatagaagatccaaaagggtgctcagagcgaatccatggaagcaatctgtgcgggatagaacattcaaacagactgaggaaacacttggatcactaatccaggattctttgtcgtctttgtaaagcgcttttaggtatcgccatgagctctcgtttgcaggattggttaaaatggctttgattgtgtagcttacttcagattctctcatggcttctaggcctcccaacaaaggagattgggtgatgacataatacctctgattccaggcggaattgttaaagacgtcagcttcaaggagctcgtgacagtaatcgagctcatcttcccatcctcctaatgcccgtagtgtccactgcctatgtgaccaagcatgataatgtttggcatcaagtgaaagtactctacgggtaaattcaagttctctccctgcaacatcaggacccagtttctctgcaacccatcgccgatgatgccacagttggtagttcttagagttatcctcagcaatgcgttcgatgaactcgagttcttcaaacaagtcgtgattaagggcctcgagtactaggcgcctgaaatgccacactgtgtagttgccggagtttaagaggagggtttcttccgtgagtcgtagtgcgcgaggagatcgctcgtcggaaaagtaaatcgcacggaagtaatccatagtctcgcggaactcttccttgtaggcaattggcaccactggattcggaccatcgtcctgagtcaatgggaccacgtctgaccactccaatcgttggctcagtggcacggtctcgtcgaaattcatcccgggtttSEQ ID NO3gatcctcaaattgctgccactgtaatcttgctcttcctccatgcccaatagttagctcttataggatctacacgaccaagaatagtacacaccaaattggccaagttagtctctggttcttcattagctagagctctcactgagtctttatgctcgttggttggtctcagtccatcacatagaagatccaaaagggtgctcagagcgaatccatggaagcaatctgtgcgggatagaacattcaaacagactgaggaaacacttggatcactaatccaggattctttgtcgtctttgtaaagcgcttttaggtatcgccatgagctctcgtttgcaggattggttaaaatggctttgattgtgtagcttacttcagattctctcatggcttctaggcctcccaacaaaggagattgggtgatgacataatacctctgattccaggcggaattgttaaagacgtcagcttcaaggagctcgtgacagtaatcgagctcatcttcccatcctcctaatgcccgtagtgtccactgcctatgtgaccaagcatgataatgtttggcatcaagtgaaagtactctacgggtaaattcaagttctctccctgcaacatcaggacccagtttctctgcaacccatcgccgatgatgccacagttggtagttcttagagttatcctcagcaatgcgttcgatgaactcgagttcttcaaacaagtcgtgattaagggcctcgagtactaggcgcctgaaatgccacactgtgtagttgccggagtttaagaggagggtttcttccgtgagtcgtagtgcgcgaggagatcgctcgtcggaaaagtaaatcgcacggaagtaatccatagtctcgcggaactcttccttgtaggcaattggcaccactggattcggaccatcgtcctgagtcaatgggaccacgtctgaccactccaatcgttggctcagtggcacggtctcgtcgaaattcatccc苜蓿FTA
表5表示了822核苷酸(也稱(chēng)為FT2)的公開(kāi)的核酸序列。
SEQ ID NO6編碼的公開(kāi)的FT多肽(SEQ ID NO7)具有274個(gè)氨基酸殘基，并且在表5B中表示成單字母氨基酸密碼。
由于克隆方案的特性，與擬南芥序列比較，表示的序列不是全長(zhǎng)的。其中有氨基末端丟失了42個(gè)氨基酸，羧基末端丟失了10個(gè)氨基酸。圖8表示了苜蓿核苷酸序列和它的編碼氨基酸序列與公開(kāi)的序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。
利用本文公開(kāi)的序列作為雜交探針，可以從cDNA或基因組文庫(kù)篩選和分離全長(zhǎng)序列，或使用cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)或其他PCR技術(shù)。
本發(fā)明也包括與SEQ ID NO6的苜蓿法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha亞基互補(bǔ)的核酸序列。公開(kāi)的互補(bǔ)序列表示為SEQ ID NO29。
SEQ ID NO29CCATGCCCAATAGTTAGCTCTTATTGGATCAACACGACACAGAATGGTACACACCAAATTGGCCAAGTTAGTCTCTGGTTCTTCATTAGCTAGAGCTTTCACCGAGTCTCTATGCTCGTTGGTTGGTCTCAACCCATCGCACAGAAGATCCAAAAGGGTGCTCAGAGCGAATCCATGGAAGCAGTCCGCGCGTGAGAGAACTTTCAAACAGACTGAGGAAACACTTGGATCACTAATCCAAGACTCTGTGTCGTCTTTGTAAAGGGCTTTCAGGTACCTCCAAGAGCTCTCGTTCCCGGGATTTGCTAAAATGGCTTTGACTGTGTAGCTTACTTCAGATTCTCTCATGGCTTCTAGGCCTCCCAACGAAGGTGATCTAGTTATAACGTAATACCTCTGATTCCATGCAGAGTTGTTAAAGACGTCAGCTTCAAGGAGCTCGTGGCAGTAGTTAAGCTCATTTTCCCATCCTCCTAATGCTTGTAGCGCCCACTGCCTATGTGACCAAGCATGATAATGCTTGGCATCAAGTGATAGTACCCTCCGAGTAAACTCAAGTTCCTTTCCTGCAACATCAGGACCCAGTTTCTCTGCGACCCATCGTCGATGATGCCACAACTGGTAGTTCTTAGAGTTATCCTCAGCAATGCTTTCGATGAACTTGAGCTCTTCATACAAGTCGTTATTAAGCTCCTCGAGTACTAAGCGCCCGAAGTGCCACACGGTGTAGTTGCCCGAGTTTAAGCGGAGAGCTTCTTCCGTGAGTCGCAGCGCGCGAGCAGAACGCTCGTCGGAGAAGTAAATCGCACGGAAGTAATCCAT苜蓿FTB1110核苷酸(也稱(chēng)為FT3)的公開(kāi)的核酸表示在表6A。
SEQ ID NO7編碼的公開(kāi)的FT3多肽(SEQ ID NO9)具有370個(gè)氨基酸殘基，以單字母氨基酸密碼表示在表6B。
由于克隆方案的特性，表示的序列不是全長(zhǎng)的。與擬南芥比較，在氨基末端丟失了31個(gè)氨基酸，在羧基末端丟失了5個(gè)氨基酸。歐洲歐洲油菜核苷酸序列和它的編碼氨基酸序列與公開(kāi)的序列的同一性百分?jǐn)?shù)表示在圖9。
利用本文公開(kāi)的序列作為雜交探針，可以從cDNA或基因組文庫(kù)篩選和分離全長(zhǎng)序列，或使用cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)或其他的PCR技術(shù)。序列比較已經(jīng)進(jìn)行，圖8和圖9表示了同一性百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明也包括了與SEQ ID NO8的苜蓿法尼基轉(zhuǎn)移酶beta亞基互補(bǔ)的核酸序列。公開(kāi)的互補(bǔ)序列表示為SEQ ID NO30。
SEQ ID NO30AAATCTAGAAGCTTCATAATACCGATCCAAGACAATGTTGTGGAGGAGGTGAACAGGTTCAAGGTGGTTTGCGTAGCCACCCAAAATGTCACGAGTCAAAGGAGGAGTGTCCTCGTCTTTTGACCAAGCGTGTTGAGCCACGGAAAGACCGCTTAGGCAGTAACATGTGTGGTAGAAGTCACGGGGTTTCCTCAGCTTGTCTCTGAATCCACCATCAGCAACCTGAGAGCACAAGAGCACATATCTTTGCAAGCCGAGGCTATCAAAAACAGGTTGAATTCTCCTGTCAATGTAGGTAGACGTATGATGAACTTGGTGACCATTCCCTGAATCTTCATCGCTATCCTCATCAGAATCATCTTCATCACTGTCTTCAGGATCATCTTCATCATGACCATGTTCCTCGTGATCTTCATCTGTCCCTTGTGACATATGTGATGATGATCCATGAGGTGCCATATCCTGGGATGAAAAAAATCGCTGTAGTAGAACACAGGGGGCTGCCTGCCAAAACGTGTAGCAACCGTCGACCAATTTGTTCGTCCTACCTTGGAATCCCATTTCTACTCCTTGTCGATGTACAACCCAATTCATTAACGAATCCAAATTCAAGCGGTCGACTTCATTGATTAAAATCATAGTAGCCAACCCACAGTACGTGTACCCACCATGAGCTTCGGAGCCAGGTTCCCCTCCAATGCCACCTTCATAAGTTTGGCAACTCAAAATGTAATCTCCTAAGCCGCGGGTGAGTTCATCATCCACAATGTTCAGGATGCTTGCAATCAAAATCGCAGTGTAGCACGCTCGCACATCTATTTCTCCCATATTATGCATCCTGAAACCTCCATTTGTATCCTTCATTCGTCTTAAGAAACAAGCCATTTGTTCTCTGTTAATTGAAGAGAAGGCTTTCTCACCTCCTAAAGTAACAAGTGTATTCACTGCAGCATAACTTGTTGCAAGATGTGGAAGTTGGCCAGGACCACCACCATATCCACCATCAGAACCCTGGCAACGTCCAAGAAAATCGATTGCATTGTTTTCTAAGTCATCATCCACAGACTCCCCAAGCAAAGCAATTGAATGAAGAATCCAGTAACAAAGCCA大豆FTA表7A中表示了1041核苷酸(也稱(chēng)為FT4)的公開(kāi)的核酸。
SEQ ID NO31編碼的公開(kāi)的FT多肽(SEQ ID NO33)具有347個(gè)氨基酸殘基，以單字母氨基酸密碼表示在表7B中。
由于克隆方案的特性，表示的序列不是全長(zhǎng)的。大豆核苷酸序列和它的編碼的氨基酸序列與其他序列的同一性百分?jǐn)?shù)表示在圖8。
利用本文公開(kāi)的序列作為雜交探針，可以從cDNA或基因組文庫(kù)篩選和分離全長(zhǎng)序列，或使用cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)或其他的PCR技術(shù)。
本發(fā)明也包括與SEQ ID NO31的大豆alpha亞基互補(bǔ)的核酸序列。公開(kāi)的互補(bǔ)序列表示為SEQ ID NO32。
SEQ ID NO32AGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTCATTGTTTCTAGCTTCAGGACCTAACTTCTCGGCAACCCATCGTCTAGGATGCCTACAGAACATNCACATCTGATAATTTTTAGAATTTCCAGCGGCCATACGCTCCACAAACTCCAGTTCATCGTTCAAGTCGACTTTTAGCGACTCAAGTAACAACCGTCGGAAATGCCACACAGTGTAGTTGCCGGAGTTGAATTGAACGGCTTCGGCTGTGAGAGCGAGGGCGCGAGGGGAGCGTTCATCGGTGAGGTAAACGGCGCGAAAGTAATCCATAACTTCGGAAAACTCTTCAGTGTACTGGATCGGAACGACAGGGTTAGGGCCGTCGTTTTGAGGAACCGGAGTAACATCTGACCACTCCACTCTCTCCCTCAACGGCACGCGTTGCTGCACCTCTTCTCCTTCGCTAGACCCAGATTCCAT大豆FTB
表8A中表示了也稱(chēng)為FT5的1035核苷酸的公開(kāi)核酸。
SEQ ID NO34編碼的公開(kāi)的FT5多肽(SEQ ID NO36)具有378個(gè)氨基酸殘基，以單字母氨基酸密碼表示在表8B。
由于克隆方案的特性，表示的序列不是全長(zhǎng)。大豆核苷酸序列和它的編碼氨基酸序列與其他序列的同一性百分?jǐn)?shù)表示在圖8。
利用本文公開(kāi)的序列作為雜交探針，可以從cDNA或基因組文庫(kù)篩選和分離全長(zhǎng)序列，或使用cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)或其他這樣的PCR技術(shù)。
本發(fā)明也包括與SEQ ID NO34的大豆beta亞基互補(bǔ)的核酸序列。公開(kāi)的互補(bǔ)序列表示為SEQ ID NO35。
SEQ ID NO35GTGGTGGAGAATCTGGGTGCTTTGACCAACTATACTGGCACAATGAGAGTCCACTTAAACAGTAACATGTGTGATAATGATCTCTACGTTTACCCGGTTTGTCTCTCAGTCCACCCTCTTGCTCCTGTGCACATAAGAGAATATATTGCTGTAAAGCAATACTGTGAAAAAGTGGTTCTTGTGCTCTCCACTCATTAATAAATTTATAGGCAATATTTTTAAAATCAGATGAACTGGATTCACTGGTGCCTTCATGCTCACCACGGCATGTTGCATGACTAGAGGTTCCATCCAAACTTTCTTTTGCTTCAGATACATAAGATACCGCAAAAATCTGTGATGTCTCTTCCATCTGTTTGTTGATAATAGAAGATAATCTTTGCAATAGAGCAACAGCACCTCCCTGCCAAAAGGAATAGCATCCATCCACCAGTTTATTTGTTCTCCCCTGGAATCCACATTCCTTACCTTGTCGGAATACCACCCAGTCAACTAATCGAGGCAGATCCAAGTGATTAACCTCACCAATCAGAATCATTGTAGCTAATCCACAAAAGGTGTACCCACCATGAGCCTCAGAACCAGGCTCACCAGCAATGCCACCCTCATATGTTTGACAGCTTATAATGTAGTCTCCAACATTCTGGATCAGCTCATCATCCAAAATGTTCAAAACACTTGCAACAGAAATGGCAGTGTAGCAAGCTCGAACATCAATTTCACCTTCATCATGCATCCTGAATCCACCATTTGGTTGCTTCATCCGCCGCAGAAACCCATACAGTTTATCTCTATTAATTGATGCCAGGGATTTCTCACCACCCAAAGTAATAAGTGAATTAACAGCAGCATAAGTTGTGGCAATATGAGGCATCTGGCCTGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCAGGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGC玉米FTB公開(kāi)的1235核苷酸的核酸(也稱(chēng)為FT6)表示在表9A。
SEQ ID NO37編碼的公開(kāi)的FT6多肽(SEQ ID NO39)具有414個(gè)氨基酸殘基，以單字母氨基酸密碼表示在表9B中。
由于克隆方案的特性，表示的序列不是全長(zhǎng)的。大豆核苷酸序列和它的編碼氨基酸序列與其他序列的同一性百分?jǐn)?shù)表示在圖8。
利用本文公開(kāi)的序列作為雜交探針，可以從cDNA或基因組文庫(kù)篩選和分離全長(zhǎng)序列，或使用cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)或其他PCR技術(shù)。
本發(fā)明也包括與SEQ ID NO37的玉米beta亞基互補(bǔ)的核酸序列。公開(kāi)的互補(bǔ)序列表示為SEQ ID NO38。
SEQ ID NO38GGATGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGCTAACTGCGAGGCCACTGAGGCAGTAGCATGAATGATAGTGATCTCTGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTCCACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCAGCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGTTTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACATCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGTGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCATCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAGAGGGAGCGGTAGATGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCC本文公開(kāi)的FTA和FTB核酸和氨基酸與FT蛋白質(zhì)的家族的其他成員(GenBank ID N0sU63298，U83707，和U73203；WO00/14207；Cutler等人，Science 273(5279)1239-41，1996；Ziegelhoffer等人，Proc Natl Acad Sci USA 97(13)7633-8，2000)。這些和那些序列的同源性在Clustal W分析中如圖表示在表10A-10D。在Clustal W排列中，黑輪廓的氨基酸殘基表示了保守序列的區(qū)域(即，保存結(jié)構(gòu)或功能特性需要的區(qū)域)，而非重點(diǎn)氨基酸殘基更不保守，并且可以潛在地改變到更大的程度，但不改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能。
表10A.FT Alpha亞基的ClustalW核酸分析1)BNA-12；FT2(SEQ ID NO6)2)At-FTA；FT1(SEQ ID NO1)3)PPI-大豆-FTA；FT4(SEQ ID NO31)4)桃-FTA(SEQ ID NO59)5)西紅柿-FTA(SEQ ID NO60)6)水稻-FT-A(SEQ ID NO61)7)玉米-FT-A(SEQ ID NO62)8)大豆1-FT-A(SEQ ID NO63)9)大豆2-FT-A(SEQ ID NO64)10)氚-FT-A(SEQ ID NO65)



1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|BNA-12 ----------------------------------------------------------------------At-FT-A ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTA----------------------------------------------------------------------桃-FT-A AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--------------------------------------------------西紅柿-FTA CTGCTATGTTTTGTAAGTTTTGGATATGGATGCATAGCTTATTGATACTTTTGGTGACTTAAAATACTCT水稻-FT-A ----------------------------------------------------------------------玉米-FT-A CAGGTGTGTTTGTTAATGTATTACACTT--G-CCATGGGAGCCTAAATGAGACCCATAATCACTTCCACT大豆1-FT-A AAAA------------------------------------------------------------------大豆2-FT-A AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--------------------------------------------------氚-FT-A AAACTCCAACGAGCAGATTGTTACAGTAACGGCCACTGGTGGTGTGAAAATCCTGAAATCTGCTTCAGTC1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|A-12----------------------------------------------------------------------At-FT-A ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTA----------------------------------------------------------------------桃-FT-A ----------------------------------------------------------------------西紅柿-FTA GGAAGGCAGGTAGCATGTGTATAATTCACTGTTACTTCCCATGTCGAGTTAGATGCTTGAAAATTTTAGT水稻-FT-A ----------------------------------------------------------------------玉米-FT-A AGAGTCGGAAGACCGT-GTCGAGCAGTTCACTCATATGGTCACTTAAAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-大豆1-FT-A ----------------------------------------------------------------------大豆2-FT-A ----------------------------------------------------------------------氚-FACTTTGCCTTGTTTACAGTTGAGTCTGTTGTTGTGATCTGTACCTAATGCATGTACACAATCATCAAATT1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|BNA-12 ----------------------------------------------------------------------At-FT-A ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTA----------------------------------------------------------------------桃-FT-A ----------------------------------------------------------------------西紅柿-FTA AGGTGTTCTTTTATGAAGCACACATTAATGTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA水稻-FT-A ----------------------------------------------------------------------玉米-FT-A ----------------------------------------------------------------------大豆1-FT-A ----------------------------------------------------------------------大豆2-FT-A ----------------------------------------------------------------------氚-FT-A ATTAGTTTTTGTACCAATGAGTATTCGATGAAAAAAAAAAAAAAAAA-----------------------
BnA-12 -At-FT-A -PPI-大豆-FTA-桃-FT-A -西紅柿-FTA A水稻-FT-A -玉米-FT-A -大豆1-FT-A -大豆2-FT-A -氚-FT-A -表10B.FT Alpha亞基的ClustalW氨基酸分析1)BNA-12；FT2(SEQ ID NO7)2)At-FT-A；FT1(SEQ ID NO5)3)PPI-大豆-FTA；FT4(SEQ ID NO33)4)桃-FT-A(SEQ ID NO66)5)西紅柿-FTA(SEQ ID NO67)6)水稻-FT-A(SEQ ID NO68)7)玉米-FT-A(SEQ ID NO69)8)大豆1-FT-A(SEQ ID NO70)9)大豆2-FT-A(SEQ ID NO71)10)氚-FT-A(SEQ ID NO72)

表10C.FT Beta亞基的ClustalW核酸分析1)PPI-BnFTb；FT3(SEQ ID NO8)2)Eral(SEQ ID NO73)3)Wiggum(SEQ ID NO74)4)PPI-大豆-FTB；FT5(SEQ ID NO34)5)DuP-大豆-FTB(SEQ ID NO75)6)PPI-玉米-FTB；FT6(SEQ ID NO37)7)DuP-玉米-FTB(SEQ ID NO76)8)豌豆-FT-B(SEQ ID NO77)9)西紅柿(SEQ ID NO78)10)煙葉(SEQ ID NO79)
10203040506070....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------Wiggum ATGCCAGTAGTAACCCGCTTGATTCGTTTGAAGTGTGTAGGGCTCAGACTTGACCGGAGTGGACTCAATCPPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B ----------------------------------------------------------------------西紅柿 ----------------------------------------------------GTAAACGAGCGTTGATTT煙葉---------------------------------------------------------------------- 150 160 170 180 190 200 210....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------



1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eralAGTTTCGGTAGTGTTGTAACTTGTAAGATTTCAAAAG---------------------------------Wiggum AGTTTTCGTAGTGTTGTAACTTGTAAGATTTCAAAAGAAGTTTCACTAATTTAACCTTAAAACCTGTTACPPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B AATGTAAAATGTAAACTAAAATATGAAATATGAAATACCAAAAAGATATTATTGGATGAAATTCACGTGG西紅柿 AAACTTAGTTGCAATCCAGAAGTTAAAAGTGTCATTGGGTTCAAAAGAGTTGTGATCGTTTATGTACATA煙葉---TCTAGTTG---TTCAGAATCAGAGACTAATCTATTATTTTGAGGGATTGGATTCAAAAAAAAAAAAA 1690 1700 1710 1720 173017401750....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------Wiggum ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B TCTTATTCATACATTTGTTAAGAGCTTAAGGCTTAATGGTTAAGCCAATGATATAAATATTTATGCAGAA西紅柿 GTAAATTCGTCTCTGGTTTAGTGAGGTCTGTAAACATCAATGTGAAATTGCGAGATATGCATGTAATAGT煙葉----------------------------------------------------------------------1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------Wiggum ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B AGCTGTTGCTTATCACCAACGGTAATATTAATAAGCAAACAAGTATTCTGTGAT----------------西紅柿 GGCTAAGATTTACAAATCTGGATACCGGTTATTAGTGATCAGAAATTTCATTCAATTTCCCAAACGGTCA煙葉----------------------------------------------------------------------1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------
Wiggum ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B ----------------------------------------------------------------------西紅柿 CCTAAGTTTAGGATATTGCTTTAAAATATTATTTATTTTTCATTTAAGAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAA煙葉----------------------------------------------------------------------....|....
PPI-BnFTberal---------Wiggum ---------PPI-大豆-FTB---------DuP-大豆-FTB---------PPI-玉米-FTB---------DuP-玉米-FTB---------豌豆-FT-B ---------西紅柿 AAAAAAAAA煙葉---------表10D.FTBeta亞基的ClustalW氨基酸分析1)PPI-BnFTb；FT3(SEQ ID NO9)2)Eral(SEQ ID NO80)3)Wiggum(SEQ ID NO81)4)PPI-大豆-FTB；FT5(SEQ ID NO36)5)DuP-大豆-FTB(SEQ ID NO82)6)PPI-玉米-FTB；FT6(SEQ ID NO39)7)DuP-玉米-FTB(SEQ ID NO83)8)豌豆-FT-B(SEQ ID NO84)9)西紅柿(SEQ ID NO85)10)煙葉(SEQ ID NO86)
10203040506070....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------Wiggum MPVVTRLIRLKCVGLRLDRSGLNRRICHGGHGESTRRRVMEELSSLTVSQREQFLVENDVFGIYNYFDASPPI-大豆-FTB-------------------------------------------------------------------ATIDuP-大豆-FTB-------------------------------------------------------------------ATIPPI-玉米-FTB--------------------------------------ADPDLPRLTVTQVEQMKVEARVGDIYRSLFGADuP-玉米-FTB--------------------------------------ADPDLPRLTVTQVEQMKVEARVGDIYRSLFGA豌豆-FT-B -------------------------------------------------------------------MEA西紅柿 ----------------------------------------MESRKVTKTLEDQWVVERRVREIYDYFYSI煙葉------------------------------------------GTSGTRTLEDQWMVERQVREIYNFFYSI

同時(shí)包括在本發(fā)明中的是SEQ ID NO87的法尼基轉(zhuǎn)移酶Alpha同感序列和SEQ ID NO88的法尼基轉(zhuǎn)移酶beta同感序列。為了產(chǎn)生同感序列，將本發(fā)明的法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha和法尼基轉(zhuǎn)移酶beta序列利用程序BioEdit排列。在本發(fā)明的法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha(FTA)多肽序列之間的同源性如圖表示在表10E中的ClustalW分析中。在本發(fā)明的法尼基轉(zhuǎn)移酶beta(FTB)多肽序列之間的同源性如圖表示在表10F的ClustalW的分析中。
表10E FT Alpha的Clustal W氨基酸分析..
BnA-12 --(SEQ ID NO7)At-FT-A AI(SEQ ID NO2)PPI-大豆-FTA --(SEQ ID NO33)同源性 --(SEQ ID NO87)
表10F FT Beta的ClustalW氨基酸分析
同時(shí)包括在本發(fā)明中的是SEQ ID NO89的法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha同感序列和SEQ ID NO90的法尼基轉(zhuǎn)移酶beta同感序列。為了產(chǎn)生同感序列，利用程序BioEdit，排列本發(fā)明的法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha和法尼基轉(zhuǎn)移酶beta序列。本發(fā)明的法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha(FTA)核酸序列之間的同源性如圖表示在表1OG所示的ClustalW分析中。在本發(fā)明的法尼基轉(zhuǎn)移酶beta(FTB)核酸序列之間的同源性如圖表示在表1OH的Clustal分析中。
表10G FT Alpha的ClustalW核酸分析

1090 1100 1110 1120 1130 1140....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|BnA-12 ------------------------------------------------------------ 822At-FT-A AACTGCTTATTTATGAATCACATGTTCATGTTAACATGTATCAAACAATMCTTGATTTCT 1112PPI-大豆-FTA------------------------------------------------------------ 1041同源性 ------------------------------------------------------------ 9001150 1160 1170....|....|....|....|....|....|.
BnA-12 ------------------------------- 822 (SEQ ID NO6)At-FT-A CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1143 (SEQ ID NO1)PPI-大豆-FTA------------------------------- 1041 (SEQ ID NO31)同源性 ------------------------------- 900 (SEQ ID NO89)表10H FT Beta的ClustalW核酸分析 708090 100 110 120....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ------------------------------------------------------------ 1eral------------------------------------------------------------ 1PPI-大豆-FTB---------------------------GCCACCATTCCTCGCAACGCCCAAAACCCTCAT 32PPI-玉米-FTBCAGGGTTGGCGACATCTACCGCTCCCTCTTCGGGGCCGCGCCCAACACGAAATCCATCAT 120同源性 ---------------------- 1

1330 1340 1350 1360 1370 1380....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb CTAGATTT---------------------------------------------------- 1110eralTCGAGTTCTTCTTTAAAGCAGCATGACCCGTTGTTGCTAATGTATGGGAAACCCCAAACA 1249PPI-大豆-FTB------------------------------------------------------------ 1135PPI-玉米-FTB------------------------------------------------------------ 1245同源性 ------------------------------------------------------- 7971390 1400 1410 1420....|....|....|....|....|....|....|....|.
PPI-BnFTb ----------------------------------------- 1110 (SEQ ID NO8)eralTAAGAGTTTCCGTAGTGTTGTAACTTGTAAGATTTCAAAAG 1290 (SEQ ID NO73)PPI-大豆-FTB----------------------------------------- 1135 (SEQ ID NO34)PPI-玉米-FTB----------------------------------------- 1245 (SEQ ID NO37)同源性 ----------------------------------------- 797 (SEQ ID NO90)
實(shí)施例5轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建體FTA或FTB序列已經(jīng)用于適于在植物中轉(zhuǎn)化和在適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列的控制下的構(gòu)建體。基因序列是在有意義方向過(guò)度表達(dá)或反義方向下調(diào)。這些序列的部分已經(jīng)用于構(gòu)建雙鏈RNA抑制(dsRNAi)構(gòu)建體。優(yōu)選地不超過(guò)21nt的序列作為倒轉(zhuǎn)重復(fù)克隆，被接頭分開(kāi)，當(dāng)表達(dá)時(shí)導(dǎo)致靶基因的下調(diào)。雙反義(DA)載體已經(jīng)產(chǎn)生，其中反義序列的直接重復(fù)被間隔序列如GUS分開(kāi)。啟動(dòng)子已經(jīng)用于構(gòu)成性表達(dá)，如35S CaMV啟動(dòng)子，MuA玉米啟動(dòng)子或者是特定的環(huán)境或細(xì)胞cues如誘導(dǎo)RD29A啟動(dòng)子的表達(dá)的ABA水平或干燥條件可誘導(dǎo)的?；蛘?，可以利用組織或細(xì)胞器特異啟動(dòng)子如HIC或CUT1啟動(dòng)子。這樣的構(gòu)建體已經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)擬南芥，苜蓿，玉米，大豆。其他種類(lèi)可以如要求轉(zhuǎn)化。正如對(duì)那些特別的種類(lèi)適當(dāng)?shù)?，各個(gè)待轉(zhuǎn)化的種類(lèi)可以利用特定的調(diào)節(jié)序列。已轉(zhuǎn)化的植物已經(jīng)選擇，它們的表現(xiàn)型特性已經(jīng)分析。評(píng)估了轉(zhuǎn)基因植物的特性，如對(duì)干燥的耐性提高，生物量累積改變，產(chǎn)量，營(yíng)養(yǎng)要求，如礦質(zhì)或微營(yíng)養(yǎng)，生物脅迫，如真菌，細(xì)菌，或其他這樣的致病原感染或攻擊，或任何其他這樣的物理或生物化學(xué)特征。
實(shí)施例6植物轉(zhuǎn)化通過(guò)花蘸方法，將擬南芥菜轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行農(nóng)桿菌培養(yǎng)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)野生型植物直到它們開(kāi)花。將植物在農(nóng)桿菌溶液中倒轉(zhuǎn)2分鐘。然后，包裹植物2天，維持濕度，然后解開(kāi)繼續(xù)生長(zhǎng)，長(zhǎng)成種子。大量收獲成熟的種子。
通過(guò)在含有50ug/ml卡那霉素的MS平板上萌發(fā)和生長(zhǎng)來(lái)選擇已轉(zhuǎn)化的T1植物。在2星期的生長(zhǎng)后鑒定綠色的，卡那霉素抗性的秧苗，移植到土壤。包裹植物保證自花育種，獨(dú)立地收獲各個(gè)植物的T2種子。在T1植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，收獲葉子樣品。萃取DNA和進(jìn)行Southern分析。
分析T2種子進(jìn)行KanR分離。種植那些顯示3∶1抗性表現(xiàn)型的那些系中的存活的T2植物，在種子生長(zhǎng)過(guò)程中包裹，從每個(gè)系收獲T3種子。再次將T3種子用于KanR分離分析，并且選擇那些顯示100％KanR表現(xiàn)型的系作為純合系。利用T3種子進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉葉柄組織的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因苜蓿植物。如下滅菌種子。用95％的乙醇濕潤(rùn)種子一個(gè)短的時(shí)期15秒。加入約30毫升的滅菌溶液(70％Javex，100ul Tween 20)，保留約15分鐘。除去溶液I，用30ml的溶液II(0.25％氯化汞，100ul Tween20)，溫育約10分鐘。用至少500ml雙蒸餾無(wú)菌水漂洗種子，儲(chǔ)存在滅菌的盤(pán)中。在用1％蔗糖和0.7瓊脂補(bǔ)充的1/2 MS培養(yǎng)基，pH5.8的平板上萌發(fā)種子。收獲完全擴(kuò)展的子葉，放置于培養(yǎng)基I上(Murashige minimal organics(MMO)，3％蔗糖，4.5mg/L芐基腺嘌呤(BA)，0.7％phytoagar，pH5.8)。在AB基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)含有需要的核酸構(gòu)建體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物2天。蘸子葉外植體，只使葉柄的切出部分接觸農(nóng)桿菌溶液。然后，在培養(yǎng)基I中保埋外植體，在24℃維持5天，其中光暗循環(huán)是16，8小時(shí)。將外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基II(培養(yǎng)基I，300mg/Ltimentin)中，保留7天，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基III(培養(yǎng)基II，20mg/L卡那霉素)。將這時(shí)已經(jīng)發(fā)育的根或苗組織解離。在14-21天后轉(zhuǎn)移外植體到新鮮的培養(yǎng)基III的平板中。當(dāng)再生的苗組織發(fā)育時(shí)，將再生的組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基IV(MMO，3％蔗糖，1.0％植物瓊脂，300mg/L timentin，20mg/L卡那霉素)。一旦健康的苗組織發(fā)育，在10X IBA中蘸從任何愈傷組織分離的苗組織，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基V(Murashige and Skooge(MS)，3％蔗糖，0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)，0.7％瓊脂，300mg/L timentin，20mg/L卡那霉素)，長(zhǎng)根。將健康的小植體轉(zhuǎn)移到土壤。
利用本領(lǐng)域已知的農(nóng)桿菌方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大豆，玉米和棉花?；蛘撸梢岳妙w?；蚍穷w粒生物炸彈轉(zhuǎn)化方法。在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20010026941中給出了非顆粒生物轉(zhuǎn)化例子。繁殖存活的植物，產(chǎn)生純合系。測(cè)試植物中干旱耐性，生理和生物化學(xué)表現(xiàn)型。
下面的表格鑒定了已經(jīng)轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體和種類(lèi)。
表II
適于植物轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建體的非限制例子是SEQ ID NO4，40-58中給出的。
SEQ ID NO4gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaact
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aacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattugttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgccaSEQ ID NO4是用于轉(zhuǎn)化擬南芥植物的pB1121-反義-FTA載體構(gòu)建體的核酸序列。斜體的序列在右和左更寬的重復(fù)(1-24，5226-5230)。下劃線的序列是35S啟動(dòng)子(2515-3318)。黑體的序列是反義法尼基轉(zhuǎn)移酶alpha序列(3334-4317)。
SEQ ID NO40gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcagcccacagatggttagagaggcttacgcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagcaataatctccaggaaatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaactgcatcaagaacacagagaaagatatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttcacaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcccactgaatcaaaggccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagc
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SEQ ID NO46GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCAGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTTAAAGGTGAAACTACTTCATGGGTAAATGATCCTCAAGTTTCTTCAGTATGCTTAAAGATTTTGAGAACTAAGAGCAACTACGTGTTTGCTCTTAGCACTATTTTAGATCTTATATGCTTTGGTTATCAACCAAATGAAGACATTAGAGATGCCATTGACGCCTTAAAGACCGCAGATATGGATAAACAAGATTTAGAYGATGATGAGAAAGGGGAACAACAAAATTTAAATATAGCACGAAATATTTGTTCTATCCTAAAACAAGTTGATCCAATTAGAACCAACTATTGGATTTGGCGCAAGAGCAGACTTCCTgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatt
tatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(下面劃線的是大豆FTA反義部分；黑體MuA啟動(dòng)子；斜體大豆FTA有意義部分；較低的情況NOS終止子序列)SEQ ID NO47ggagccatagatgcaattcaatcaaactgaaatttctgcaagaatctcaaacacggagatctcaaagtttgaaagaaaatttatttcttcgactcaaaacaaacttacgaaatttaggtagaacttatatacattatattgtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaatagaaaaggtgaattaagaggagagaggaggtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattgtaaaagtttacaagatttccatttgactagtgtaaatgaggaatattctctagtaagatcattatttcatctacttcttttatcttctaccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaattaattttccttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaacagccacacgacgtaaacgtaaaatgaccccatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgaccagacacgcgtagagagcaaaatgaactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcatacgtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgcaaactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattggaaagAGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTTAAAGGTGAAACTACTTCATGGGGTAAATGTCAAGTTTCTTCAGTATGCTTAAAGATTTTGAGAACTAAGAGCAACTACGTGTTTGCTCTTAGCACTATTTTAGATCTTATATGCTTTGGTTATCAACCAAATGAAGACATTAGAGATGCCATTGACGCCTTAAAGACCGCAGATATGGATAAACAAGATTTAGATGATGATGAGAAAGGGGAACAACAAAATTTAAATATAGCACGAAATATTTGTTCTATCCTAAAACAAGTTGATCCAATTAGAACCAACTATTGGATTTGGCGCAAGAGCAGACTTCCTgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(黑體的下面的部分RD29A啟動(dòng)子；下面劃線的，上面的部分反義GmFTA；上面的部分有意義的GmFTA；下面的部分NOS終止子)SEQ ID NO48gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgata
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TATGAGGCATCTGGCCTGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCAGGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGCGGTGAGGTTAATCACTTGGATCTGCCTCGATTAGTTGACTGGGTGGTATTCCGACAAGGTAAGGAATGTGGATTCCCAGGGAGAACAAATAAACTGGTGGATGGATGCTATTCCTTTTGGCAGGGAGGTGCTGTTGCTCTATTGCAAAGATTATCTTCTATTATCAACAAACAGATGGAAGAGACATCACAGATTTTTGCGGTATCTTATGTATTTGAAGCAAAAGAAAGTTTGGATGGAACCTCTAGTCATGCAACATGCCGTGGTGAGCATGAAGCACCCAGTGAATCCAGTTCATCTGATTTTAAAAATATTGCCTATAAATTTATTAATGAGTGGAGAGCACAAGAACCACTTTTTCACAGTATTGCTTTACAGCAATATATTCTCTTATGTGCACAGGAGCAAGAGGGTGGACTGAGAGACAAACCGGGTAAACGTAGAGATCATTATCACACATGTTACTGTTTAAGTGGACTCTCATTGTGCCAGTATAGTTGGTCAAAGCACCCAGATTCTCCACCACgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(上面部分MuA啟動(dòng)子；下面劃線反義GmFTB；黑體有意義GmFTB；下面部分NOS終止子)SEQ ID NO56GGAGCCATAGATGCAATTCAATCAAACTGAAATTTCTGCAAGAATCTCAAACACGGAGATCTCAAAGTTTGAAAGAAAATTTATTTCTTCGACTCAAAACAAACTTACGAAATTTAGGTAGAACTTATATACATTATATTGTAATTTTTTGTAACAAAATGTTTTTATTATTATTATAGAATTTTACTGGTTAAATTAAAAATGAATAGAAAAGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGGTAAACATTTTCTTCTATTTTTTCATATTTTCAGGATAAATTATTGTAAAAGTTTACAAGATTTCCATTTGACTAGTGTAAATGAGGAATATTCTCTAGTAAGATCATTATTTCATCTACTTCTTTTATCTTCTACCAGTAGAGGAATAAACAATATTTAGCTCCTTTGTAAATACAAATTAATTTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTAATTTTACGTATAAAATAAATGATCATACCTATTAGAACGATTAAGGAGAAATACAATTCGAATGAGAAGGATGTGCCGTTTGTTATAATAAACAGCCACACGACGTAAACGTAAAATGACCACATGATGGGCCAATAGACATGGACCGACTACTAATAATAGTAAGTTACATTTTAGGATGGAATAAATATCATAGCGACATCAGTTTTGAAAGAAAAGGGAAAAAAAGAAAAAATAAATAAAAGATATACTACCGACATGAGTTCCAAAAAGCAAAAAAAAAGATGAAGCCGACACAGACACGCGTAGAGAGCAAAATGACTTTGACGTCACACCACGAAAACAGACGGTTCATACGTGTCCCTTTATCTCTCTCAGTCTCTCTATAAACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTTTTAGTCACAAATATGCAAAAGTAGAAACAATCATCAGGAATAAAGGGTTTGATTACTTCTATTGGAAAGGTGGTGGAGAATCTGGGTGCTTTGACCAACTATACTGGCACAATGAGAGTCCACTTAAACAGTAACATGTGTGATAATGATCTCTACGTTTACCCGGTTTGTCTCTCAGTCCACCCTCTTGCTCCTGTGCACATAAGAGAATATATTGCTGTAAAGCAATACTGTGAAAAAGTGGTTCTTGTGCTCTCCACTCATTAATAAATTTATAGGCAATATTTTTAAAATCAGATGAACTGGATTCACTGGTGCCTTCATGCTCACCACGGCATGTTGCATGACTAGAGGTTCCATCCAAACTTTCTTTTGCTTCAGATACATAAGATACCGCAAAAATCTGTGATGTCTCTTCCATCTGTTTGTTGATAATAGAAGATAATCTTTGCAATAGAGCAACAGCACCTCCCTGCCAAAAGGAATAGCATCCATCCACCAGTTTATTTGTTCTCCCCTGGAATCCACATTCCTTACCTTGTCGGAATACCACCCAGTCAACTAATCGAGGCAGATCCAAGTGATTAACCTCACCAATCAGAATCATTGTAGCTAATCCACAAAAGGTGTACCCACCATGAGCCTCAGAACCAGGCTCACCAGCAATGCCACCCTCATATGTTTGACAGCTTATAATGTAGTCTCCAACATTCTGGATCAGCTCATCATCCAAAATGTTCAAAACACTTGCAACAGAAATGGCAGTGTAGCAAGCTCGAACATCAATTTCACCTTCATCATGCATCCTGAATCCACCATTTGGTTGCTTCATCCGCCGCAGAAACCCATACAGTTTATCTCTATTAATTGATGCCAGGGATTTCTCACCACCCAAAGTAATAAGTGAATTAACAGCAGCATAAGTTGTGGCAATATGAGGCATCTGGCCTGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCAGGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGCGGTGAGGTTAATCACTTGGATCTGCCTCGATTAGTTGACTGGGTGGTATTCCGACAAGGTAAGGAATGTGGATTCCAGGGGAGAACAAATAAACTGGTGGATGGATCCTATTCCTTTTGGCAGGGAGGTGCTGTTGCTCTATTGCAAAGATTATCTTCTATTATCAACAAACACATGGAAGAGACATCACAGATTTTTGCGGTATCTTATGTATCTGAAGCAAAAGAAAGTTTGGATGGAACCTCTAGTCATCCAACATGCCGTGGTGAGCATGAAGGCACCAGTGAATCCAGTTCATCTTGATTTAAAAATATTGCCTATAAATTTATTAATGAGTGGAGAGCACAAGAACCACTTTTTCACAGTATTGCTTTACAGCAATATATTCTCTTATGTGCACAGGAGCAAGAGGGTGGACTGAGAGACAAACCGGGTAAACGTAGAGATCATTATCACACATGTTACTGTTTAAGTGGACTCTCATTGTGCCAGTATAGTTGGTCAAAGCACCCAGATTCTCCACCACgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(上面的部分RD29A啟動(dòng)子；下面劃線反義GmFTB；黑體部分有意義GmFTB；下面部分NOS終止子)
SEQ ID NO57GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCGGATGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGCTAACTGCGAGGCCACTGAGGCAGTAGCATGAATGATAGTGATCTCTGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTCCACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCAGCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGYYTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACATCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGHGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCATCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAHAGGGAGCGGTAGATGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCCgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(上面部分MuA啟動(dòng)子；下面劃線反義玉米FTB；下面部分NOS終止子)SEQ ID NO58GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCGGATGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGCTAACTGCGAGGCCACTGAGGCAGTAGCATGAATGATAGTGATCTCTGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTCCACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCAGCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGTTTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACATCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGTGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCATCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAGAGGGAGCGGTAGATGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCCggatccGCTGGGGAGCCTTATGCTGAAGCACATGGTGGGTATACATTCTGTGGATTGGCTGCTTTGATCCTGCTTAATGAGGCAGAGAAAGTTGACTTGCCTAGTTTGATTGGCTGGGTGGCTTTTCGTCAAGGAGTGGAATGCGGATTTCAAGGACGAACTAATAAATTGGTTGATGGTTGCTACTCCTTTTGGCAGGGAGCTGCCATTGCTTTCACACAAAACTTAATTACGATTGTTGATAAGCAATTGAGGTCCTCGTATTCCTGCAAAAGGCCATCAGGAGAGGATGCCTGCAGCACCAGTTCATATGGGTGCACCGCGAATAAGTCTTCCTCTGCTGTGGACTATGCGAAGTTTGGATTTGATTTTATACAACAGAGCAACCAAATTGGCCCACTCTTCCATAAC
ATTGCCCTGCAACAATACATCCTACTTTGTTCTCAGGTACTAGAGGGAFGGCTGAGGGATAAGCCTGGAAAGAACAGAGATCACTATCATTCATGCTAGTGCCTCAGTGGCCTCGCAGTTAGCCAGTACAGTGCCATGACTGATACTGGTTCGTGCCCATTACCTCAGCATGTGCTTGGACCGTACTCTAATTTGCTGGAGCCAATCCATCCaagcttgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcggaagctt(上面部分MuA啟動(dòng)子；下面劃線反義玉米-FTB；黑體有意義玉米FTB；下面部分NOS終止子)實(shí)施例7推斷的轉(zhuǎn)基因植物的PCR分析為了證實(shí)推斷的轉(zhuǎn)基因植物攜帶了需要的PCR的基因，進(jìn)行了分析。分離基因組DNA，根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方案和條件進(jìn)行PCR。在25ul的體積中進(jìn)行典型的反應(yīng)，利用的引物對(duì)是依據(jù)特定的構(gòu)建體中的基因和啟動(dòng)子的結(jié)合的(表12)。
利用下面的表中詳述的引物的結(jié)合篩選推斷的轉(zhuǎn)基因苜蓿。顯示PCR分析結(jié)果的代表性凝膠表示在圖15，代表了攜帶pRD29A抗FTA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物。以類(lèi)似的方式證實(shí)，對(duì)各個(gè)種類(lèi)證實(shí)轉(zhuǎn)化體，并且進(jìn)行構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化。
表12.
實(shí)施例8Southern分析抗FTA轉(zhuǎn)基因擬南芥的轉(zhuǎn)基因Southern析。編號(hào)表示了系的號(hào)。用HindIII(T-DNA質(zhì)粒的獨(dú)特的位點(diǎn))消化5微克的T1植物的基因組DNA，并且在0.8％的凝膠中分離。將NPTII編碼區(qū)用作放射標(biāo)記的探針。圖2顯示了來(lái)自Southern分析的典型的結(jié)果，表明了存在轉(zhuǎn)基因。
實(shí)施例9反義FTA系的Northern印跡從5個(gè)35S-抗FTA擬南芥系(T3植物)的發(fā)育的葉子組織分離RNA。用P32標(biāo)記，單鏈有意義FTA轉(zhuǎn)錄物(圖3組A)首先探測(cè)印跡，檢測(cè)反義轉(zhuǎn)錄物，然后做條帶，和用單鏈FTA的反義轉(zhuǎn)錄物再探測(cè)(圖3組B)，檢測(cè)有意義轉(zhuǎn)錄物。圖3組C顯示了溴化乙錠染色的凝膠，用于印跡。在各個(gè)條帶中加載約5ug的總RNA。圖3表示了轉(zhuǎn)基因反義轉(zhuǎn)錄物的積累，和轉(zhuǎn)基因植物中有意義的轉(zhuǎn)錄物的減少。
實(shí)施例10具有抗FTα抗體的Western印跡反義FTA系利用實(shí)施例19的方法產(chǎn)生的抗體分析Western印跡上來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)萃取物。圖4的道1是分子量標(biāo)準(zhǔn)，道2純化FTA蛋白質(zhì)，道3-10是來(lái)自轉(zhuǎn)基因擬南芥的ERA1突變，野生型，和4系的蛋白質(zhì)萃取物。圖4說(shuō)明了轉(zhuǎn)基因系中的可檢測(cè)FTA蛋白質(zhì)的減少。
實(shí)施例11轉(zhuǎn)基因秧苗的ABA敏感性在沒(méi)有ABA(A)，0.3uM(B)，0.5uM(C)或1.0uM ABA(D)的基本培養(yǎng)基(1/2MS)上鋪35S-反義-FTA的兩個(gè)反義，干旱耐受系的野生型Columbia，era1-2和T3純合種子的種子。將平板在4℃，在暗中冷卻3天，在22℃溫育11天，連續(xù)光照24小時(shí)。在萌發(fā)中抑制轉(zhuǎn)基因系比野生型更甚。結(jié)果顯示在圖5。
在沒(méi)有(A)或有(B)1uM ABA的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)野生型Columbia，era1-2和兩個(gè)干旱耐受35S反義FTA系(9.9&21.2)的12天大的秧苗表現(xiàn)型。圖6顯示了與野生型植物相關(guān)的era1和轉(zhuǎn)基因系的根生長(zhǎng)和發(fā)育降低。35S反義FTA系顯示了根生長(zhǎng)降低，在對(duì)ABA的應(yīng)答中與era1突變體相似。
評(píng)估了攜帶35S-反義-FTA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因苜蓿系的ABA敏感性。在約10uM時(shí)，觀察到了效果，顯示在子葉和第一個(gè)葉時(shí)期秧苗的發(fā)育和活方降低，從而表明對(duì)ABA的敏感性提高。
在工程化的所有轉(zhuǎn)基因植物中評(píng)估ABA敏感性，通過(guò)上面的方法，F(xiàn)TA或FTB表達(dá)或活性降低或提高。利用的ABA濃度根據(jù)種類(lèi)的不同，在檢測(cè)下是不同的。
實(shí)施例12干旱實(shí)驗(yàn)為了評(píng)估水脅迫或干旱條件下對(duì)植物的應(yīng)答，可以將植物暴露在各種情況下。例如，可以從土壤或培養(yǎng)基中除去植物，放置于紙巾上一個(gè)時(shí)期，如4小時(shí)，然后，回到平板上繼續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育?？梢栽u(píng)估生存和活力。
或者，可以停水一個(gè)時(shí)期，如6天來(lái)更緊密地裝備田間狀態(tài)，以這樣的方式來(lái)施加水脅迫。在重復(fù)的水脅迫實(shí)驗(yàn)中，每4英寸一個(gè)點(diǎn)種植5個(gè)植株。用同等量的均一的預(yù)混合和濕潤(rùn)的土壤填充所有的點(diǎn)。生長(zhǎng)條件是在22℃和70％的相對(duì)濕度下，16小時(shí)光照(150-200umol/m2/s)。在第一朵花開(kāi)的那天，通過(guò)在重量基礎(chǔ)上平衡每個(gè)點(diǎn)的土壤水含量開(kāi)始進(jìn)行干旱處理，然后終止供水。在水脅迫處理結(jié)束時(shí)，通常收獲植物的生物量數(shù)據(jù)，或再灌水完成生命循環(huán)，確定生物量和產(chǎn)量數(shù)據(jù)。已經(jīng)在脅迫和光條件下評(píng)估生理參數(shù)，例如，秧苗和根生物量積累，土壤水含量，水損失，或作為參數(shù)如生物量，種子產(chǎn)量，和葉子數(shù)目和葉子面積的功能。圖7顯示了8天水脅迫處理后野生型Columbia(A)和4個(gè)35S-反義FTA轉(zhuǎn)基因擬南芥系(B，C，D，E)的照片。對(duì)照植物明顯地受脅迫，不太健康。已經(jīng)對(duì)含有SEQ ID NO4，40-58所述的載體的轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。
在所有工程化的轉(zhuǎn)基因植物中評(píng)估干旱或水脅迫耐受，使通過(guò)如上所述的方法降低或提高FTA或FTB的表達(dá)或活性。
實(shí)施例13在干旱脅迫過(guò)程中，在擬南芥pRD29A-DA-FTA系中分析水損失每4英寸5個(gè)植株和每個(gè)系6個(gè)點(diǎn)種植植株。當(dāng)植物生長(zhǎng)到第一個(gè)開(kāi)花時(shí)期，如實(shí)施例12所述開(kāi)始干旱處理。每天稱(chēng)重這些點(diǎn)，在7天干旱處理結(jié)束時(shí)，收獲所有植物，稱(chēng)重秧苗的鮮重和干重。圖10顯示了，在水脅迫處理4天時(shí)，每個(gè)秧苗干重基礎(chǔ)上水的損失。在這一實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的31個(gè)系中，25個(gè)顯示了與Columbia野生型比較，水損失較低，其中22個(gè)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是明顯的。如實(shí)施例6所述，評(píng)估了所有系的ABA敏感性，ABA敏感性(ABAS)的提高也與干旱處理過(guò)程中水損失下降有關(guān)。確定具有野生型ABA敏感性(ABAWT)的那些系是與野生型相比不表現(xiàn)出水損失降低的相同的6個(gè)系(系2，36，69，29，24，21)。
利用兩個(gè)ABAS系，一個(gè)ABAWT和Columbia對(duì)照重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)。在水脅迫處理2，4和6天后收獲植物，確定秧苗的干重。當(dāng)與ABAWT或Columbia對(duì)照比較時(shí)，ABAS轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)秧苗的干重中具有更大的葉子和秧苗的生物量，更大的土壤水含量和更低的水損失。結(jié)果在所有三個(gè)收獲時(shí)期是一致的。
利用攜帶pRD29A-DA-FTA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物得到這一實(shí)施例顯示的數(shù)據(jù)。在攜帶這一構(gòu)建體的變體，如35S-DA-FTA，pRD29A-反義FTA或35S-反義-FTA的系同時(shí)進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)，觀察到了相同的水脅迫耐受趨勢(shì)。在所有工程化的轉(zhuǎn)基因植物中評(píng)估土壤水損失，通過(guò)所示的方法，F(xiàn)TA或FTB的表達(dá)或活性降低或提高。
實(shí)施例14在干旱脅迫過(guò)程中，擬南芥pRD29A-DA-FTA系中秧苗鮮重的分析每4英寸點(diǎn)5個(gè)植物和每系8個(gè)點(diǎn)種植植物。當(dāng)植物生長(zhǎng)到第一個(gè)開(kāi)花時(shí)期時(shí)，如實(shí)施例12所述開(kāi)始干旱處理。在6天干旱處理后再澆水植物，允許恢復(fù)后再保留6天。收獲植物，確定秧苗鮮重。圖11顯示了秧苗鮮重。這一實(shí)驗(yàn)包括了25個(gè)轉(zhuǎn)基因系，其中的2個(gè)是ABAWT(系2和69)和Columbia野生型對(duì)照。所有23個(gè)ABAS轉(zhuǎn)基因系具有統(tǒng)計(jì)上更大的秧苗鮮重，平均重了44％。
利用攜帶pRD29A-DA-FTA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物得到這一實(shí)施例顯示的數(shù)據(jù)。對(duì)攜帶這一構(gòu)建體的變體如35S-DA-FTA，pRD29A-反義-FTA或35S-反義-FTA的系已經(jīng)進(jìn)行了這一實(shí)驗(yàn)，觀察到了相同的趨勢(shì)。
實(shí)施例15在干旱脅迫過(guò)程中，和在光條件下，擬南芥pRD29A-DA-FTA系中種子產(chǎn)量的分析每4英寸的點(diǎn)種植1個(gè)植株。當(dāng)植物生長(zhǎng)到第一個(gè)開(kāi)花時(shí)期時(shí)，如實(shí)施例12所述開(kāi)始干旱處理。在6天干旱處理后灌溉植株，允許生長(zhǎng)到成熟。照光組不進(jìn)行干旱處理。
產(chǎn)量分析表明，雖然干旱處理導(dǎo)致了產(chǎn)量降低，但對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的影響不如對(duì)照嚴(yán)重，維持了如實(shí)驗(yàn)14中前面所示的生產(chǎn)力的優(yōu)勢(shì)。比較ABAS轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照植物產(chǎn)生的產(chǎn)量的比較，顯示在照光條件下得到了15％更大的產(chǎn)量，和在干旱條件下20％的提高。在干旱處理組，9個(gè)轉(zhuǎn)基因系中有8個(gè)顯示了比對(duì)照更大的產(chǎn)量。在光照條件下作為它的性能的百分?jǐn)?shù)在干旱處理下得到的各個(gè)系的產(chǎn)量的表達(dá)表明9個(gè)ABAS系中的8個(gè)超過(guò)了對(duì)照系，而9個(gè)中的4個(gè)超過(guò)了ABAWT對(duì)照。
利用攜帶pRD29A-DA-FTA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物得到了這一實(shí)施例中所示的數(shù)據(jù)。對(duì)攜帶這一構(gòu)建體的變體的系如35S-DA-FTA，pRD29A-反義-FTA或35S-反義-FTA，已經(jīng)進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)，觀察到了相同的趨勢(shì)。
實(shí)施例16在最佳生長(zhǎng)條件下，擬南芥菜pRD29A-DA-FTA系中蔬菜生長(zhǎng)的分析每3英寸和每個(gè)系8個(gè)點(diǎn)生長(zhǎng)1個(gè)植株。在3個(gè)時(shí)期收獲植株，確定鮮重。蔬菜時(shí)期確定為14天大的秧苗，抽苔時(shí)期為第一朵花出現(xiàn)(19-21天秧苗)，中間的開(kāi)花時(shí)期為第一朵花后的6天。在上面的各個(gè)時(shí)期的每一個(gè)中，測(cè)試的10個(gè)ABAS中的轉(zhuǎn)基因系的7，8和10在統(tǒng)計(jì)上顯示了比對(duì)照植物更大的秧苗鮮重生物量(圖13)。一個(gè)Columbia系和ABAWT(系2)系用作對(duì)照組。另外，轉(zhuǎn)基因系有統(tǒng)計(jì)上明顯的玫瑰花形骨針葉子的數(shù)目提高的趨勢(shì)。
利用攜帶pRD29A-DA-FTA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，得到了這一實(shí)施例中所示的數(shù)據(jù)。對(duì)攜帶這一構(gòu)建體的變體如35S-DA-FTA，pRD29A-反義FTA或35S-反義-FTA的系已經(jīng)進(jìn)行了這一實(shí)驗(yàn)，同時(shí)觀察到了相同的趨勢(shì)。
實(shí)施例17在干旱處理和biotic脅迫條件下對(duì)擬南芥pRD29A-DA-FTA株系進(jìn)行分析將植株以每個(gè)4英寸缽種植1株的方式種植8個(gè)缽。當(dāng)植株生長(zhǎng)到第一個(gè)花期時(shí)開(kāi)始進(jìn)行干旱處理，如實(shí)施例12所示。在7天干旱處理之后再給植株澆水，使之生長(zhǎng)到成熟。對(duì)一個(gè)哥倫比亞對(duì)照系(col)和一個(gè)轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)種子產(chǎn)量進(jìn)行分析顯示低于正常產(chǎn)量，約為預(yù)期的最大產(chǎn)量的12％。對(duì)所使用的土壤含有的真菌污染物進(jìn)行測(cè)定，所述的真菌污染物導(dǎo)致了產(chǎn)量降低，因?yàn)橥ㄟ^(guò)在使用之前將土壤滅菌可以去除生命脅迫。與具有轉(zhuǎn)基因株系22％產(chǎn)量的對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系的生命脅迫較不嚴(yán)重。但是在干旱處理的植株組，生命脅迫降低，轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照組幾乎降低了4.5倍(附圖14)。
利用攜帶pRD29A-DA-FTA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植株獲得了本實(shí)施例中顯示的數(shù)據(jù)。在攜帶所述構(gòu)建體的變化形式如35S-DA-FTA，pRD29A-反義-FTA或35S-反義-FTA的株系中進(jìn)行該試驗(yàn)，觀察到類(lèi)似的動(dòng)向。
實(shí)施例18對(duì)擬南芥pRD29A-DA-FTA株系的氣孔數(shù)進(jìn)行分析對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系和野生型哥倫比亞對(duì)照的葉子的上表面和下表面的氣孔數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在15個(gè)葉子的上表面和下表面用指甲擦出印跡，植株處于早開(kāi)花期。沒(méi)有觀察到氣孔密度的不同。
利用攜帶pRD29A-DA-FTA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植株獲得了本實(shí)施例中顯示的數(shù)據(jù)。在攜帶所述構(gòu)建體的變化形式如35S-DA-FTA，pRD29A-反義-FTA或35S-反義-FTA的株系中進(jìn)行該試驗(yàn)，觀察到類(lèi)似的動(dòng)向。
實(shí)施例19抗FT-A和FT-B的多克隆抗體的生產(chǎn)將分離的擬南芥FT序列克隆到來(lái)源于pET11D的大腸桿菌表達(dá)載體。為了產(chǎn)生帶組氨酸標(biāo)記的FT-B構(gòu)建體，用BamHI消化擬南芥FT-B克隆和pET載體，將其連接在一起。進(jìn)行限制性消化以驗(yàn)證插入物的定向。為了產(chǎn)生FT-A構(gòu)建體，用BamHI和EcoRI消化擬南芥FT-A克隆和pET載體，將其連接在一起。獲得的質(zhì)粒指導(dǎo)在其AtFTA和AtFTB的N-末端含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基的融合蛋白的表達(dá)。在細(xì)菌宿主BL21(DE3)中表達(dá)所述的融合蛋白，利用Hi-Trap絡(luò)合色相方法，根據(jù)制造商的描述(Parmacia)進(jìn)行純化。將含有組氨酸-FT融合蛋白的細(xì)菌粗提取物的可溶性組分上樣到Hi-Trap柱(1.5cm×2.0cm)，用溶于柱緩沖液(25mM This-HCL，pH 7.5，1mM DTT)的200毫升0.0-0.3M線性梯度的咪唑洗脫所述的蛋白。將含有純化的組氨酸-FT蛋白質(zhì)的組分合并，脫鹽和用Centripep-30濃縮器(Amicon)將其濃縮。將所有的純化步驟在4℃進(jìn)行。為了產(chǎn)生抗體，進(jìn)一步通過(guò)SDS/PAGE分離純化的融合蛋白，切下對(duì)應(yīng)于融合蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色譜帶。通過(guò)電洗脫從凝膠切片上洗脫蛋白質(zhì)，然后在Ribi佐劑(Ribi Immunochem)中乳化到最終體積1毫升。1天后將組氨酸-AtFTA或組氨酸-AtFTB(250微克)注射到3千克的新西蘭兔，在21天和35天以200微克的蛋白質(zhì)加強(qiáng)注射。在最后注射之后一星期獲得了高效價(jià)的抗血清。這些抗體用于實(shí)施例10，附圖4的Western印跡分析。
實(shí)施例20相關(guān)基因的篩選將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株用于識(shí)別與本發(fā)明的基因相互作用的基因?？梢詫⒈景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物用于篩選相關(guān)的基因，例如基因表達(dá)的阻遏子，加強(qiáng)子或調(diào)節(jié)子或可以通過(guò)遺傳篩選方法識(shí)別的活性。例如，利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物作為遺傳背景制備突變文庫(kù)?？梢岳酶鞣N方法，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可以將化學(xué)誘變劑如EMS用于誘導(dǎo)基因組的點(diǎn)突變，種子的快速中子衍射導(dǎo)致缺失突變，由于插入作用可以產(chǎn)生使基因失活的T-DNA文庫(kù)，或者將活化標(biāo)簽的方法用于產(chǎn)生具有上調(diào)基因的文庫(kù)。分析這些類(lèi)型的文庫(kù)可以識(shí)別挽救或調(diào)節(jié)在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物中觀察到的表現(xiàn)型的基因。
權(quán)利要求
1.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中與野生型織物相比，所述的植物對(duì)脅迫的忍受性增強(qiáng)或老化延遲，該方法包括將抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶α表達(dá)或活性的核酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，從所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的核酸包括編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶α的反義核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的反義核酸包括與SEQ ID NO1，6或31互補(bǔ)的20或以上連續(xù)的核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的反義核酸包括SEQ ID NO2，3，29或32。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的核酸選自于由SEQ ID NO4，40-46或47組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的反義核酸可操作的連接到一個(gè)啟動(dòng)子上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的啟動(dòng)子選自于由組成性啟動(dòng)子，ABA誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，組織特異性啟動(dòng)子或守衛(wèi)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中核酸是法尼基化或geranylgeranyl化的抑制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的核酸序列編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶α。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的核酸報(bào)哦看SEQID NO1，6或31。
11.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述的植物對(duì)脅迫的忍受性增強(qiáng)或老化延遲，該方法包括將抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶α表達(dá)或活性的核酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述的核酸是法尼基轉(zhuǎn)移酶α的反義核酸；從所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
12.由權(quán)利要求1或11之一所述的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
13.權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中所述的種子產(chǎn)生對(duì)脅迫的忍受性增強(qiáng)或老化延遲的植物。
14.一種分離的多肽，包括具有選自于下列組SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的氨基酸序列成熟形式。
15.一種分離的多肽，包括選自于下列組SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的氨基酸序列。
16.一種分離的多肽，包括與選自于下列組SEQ ID NO5，7或9的氨基酸序列至少85％等同的氨基酸序列。
17.一種分離的多肽，包括與選自于下列組SEQ ID NO5，7或9的氨基酸序列至少99％等同的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的多肽，其中所述的多肽具有法尼基轉(zhuǎn)移酶活性。
19.一種分離的多肽，其中所述的多肽包括一個(gè)氨基酸序列，該序列在選自于下列組SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的氨基酸序列中包括一個(gè)或多個(gè)保守的替代。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多肽，其中所述的多肽是天然存在的。
21.一種分離的核酸分子，包括選自于下列組SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的核酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的核酸分子，其中核酸分子是天然存在的。
23.一種分離的核酸分子，編碼具有選自于下列組SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的氨基酸序列的多肽的成熟形式。
24.一種分離的核酸分子，其中所述的核酸分子在嚴(yán)格條件下與選自于下列組SEQ ID NO1，6，8，31，34或37的核苷酸序列雜交。
25.一種分離的核酸分子，包括與選自于下列組SEQ IDNO1，6或8的氨基酸序列至少90％等同的核苷酸序列。
26.一種分離的核酸分子，包括與選自于下列組SEQ IDNO31，34或37的核苷酸序列至少99％等同的核苷酸序列。
27.一種分離的核酸分子，包括選自于下列組SEQ ID NO2，3，29，30，32，35或38的核酸序列。
28.一種分離的核酸分子，包括與選自于下列組SEQ IDNO2，3，29或30的核苷酸序列至少90％等同的核苷酸序列。
29.一種分離的核酸分子，包括與選自于下列組SEQ IDNO32，35或38的核苷酸序列至少99％等同的核苷酸序列。
30.一種分離的核酸分子，包括選自于下列組SEQ ID NO4，40-58的核酸序列。
31.一種載體，包括權(quán)利要求21所述的核酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的載體，進(jìn)一步包括可操作連接到所述的核酸分子的啟動(dòng)子。
33.包括權(quán)利要求32所述的載體的細(xì)胞。
34.包括權(quán)利要求27所述的核酸分子的載體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的載體，進(jìn)一步包括可操作連接到所述的核酸分子的啟動(dòng)子。
36.包括權(quán)利要求34所述的載體的細(xì)胞。
37.免疫特異性地結(jié)合到權(quán)利要求14所述的多肽的抗體。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的抗體，其中該抗體是單克隆抗體。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的抗體，其中抗體是多克隆抗體。
40.識(shí)別結(jié)合到權(quán)利要求14所述的多肽的試劑的方法，該方法包括(a)將所述的多肽導(dǎo)入到所屬的試劑；和(b)決定所述的試劑是否與所述的多肽結(jié)合。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中該試劑是法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
42.一種識(shí)別法尼基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括(a)提供表達(dá)權(quán)利要求14所述的多肽的細(xì)胞；(b)將細(xì)胞與候選物質(zhì)接觸；(c)測(cè)定該物質(zhì)是否改變了法尼基轉(zhuǎn)移酶活性；如果在該物質(zhì)存在下觀察到改變，則當(dāng)在沒(méi)有該物質(zhì)時(shí)將細(xì)胞與一種組合物接觸時(shí)，沒(méi)有觀察到改變，則將該物質(zhì)識(shí)別為法尼基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)劑。
43.用于識(shí)別法尼基轉(zhuǎn)移酶的相互作用的基因的方法，該方法包括(a)提供其路由器12所述的轉(zhuǎn)基因植物；(b)從(a)制造被誘變的植物的文庫(kù)；(c)測(cè)定是否誘變的植物含有改變的表現(xiàn)型；因此當(dāng)誘變的植物已經(jīng)改變了法尼基轉(zhuǎn)移酶的相互作用基因的功能，導(dǎo)致表現(xiàn)型從(a)的轉(zhuǎn)基因植物改變?yōu)橐吧头寝D(zhuǎn)基因植物的表現(xiàn)型。
44.一種植物，其中在編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶的基因中已經(jīng)導(dǎo)入了一個(gè)突變，導(dǎo)致與野生型植物相比所述的植物顯示法尼基轉(zhuǎn)移酶活性降低，對(duì)脅迫的忍受性增強(qiáng)。
45.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中與野生型植物相比，所述的植物對(duì)脅迫的忍受性增強(qiáng)或老化延遲，包括將含有SEQID NO30，35，38，48-57或58的核酸序列的一個(gè)核酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；從所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。
46.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述的植物與野生型植物相比，對(duì)abscisic a酸的敏感性增強(qiáng)，包括將含有SEQ ID NO30，35，38，48-57或58的核酸序列的一個(gè)核酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；從所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了FT聚核苷酸編碼的新分離的FT聚核苷酸和多肽。同時(shí)提供了與FT多肽或FT多肽，聚核苷酸或抗體的任何衍生物，變異體，突變體或片段免疫特異結(jié)合的抗體。本發(fā)明另外提供了構(gòu)建FT聚核苷酸和多肽水平改變的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1535315SQ02814781
公開(kāi)日2004年10月6日 申請(qǐng)日期2002年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月31日
發(fā)明者黃亞帆, 瑪麗茜·查利?？怂? 王洋, 蒙妮卡·D·庫(kù)澤馬, 安吉拉·P·吉爾伊, D 庫(kù)澤馬, P 吉爾伊, 查利?？怂?申請(qǐng)人:波夫曼斯種植公司