專利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增禽呼腸孤病毒的引物、禽呼腸孤病毒的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽呼腸孤病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增禽呼腸孤病毒的引物，還涉及一種禽呼腸孤病毒的檢測(cè)試劑盒，還涉及所述禽呼腸孤病毒的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
禽呼腸孤病毒(Avian reoviruses, ARV)屬呼腸病毒科正呼腸孤病毒屬，主要感染雞、 火雞、鴨、鵝等多種禽類。禽呼腸孤病毒主要引起禽類關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎，同時(shí)也會(huì)引發(fā)生長(zhǎng)遲緩、心包炎、心肌炎、肝炎、骨質(zhì)疏松以及急性和慢性呼吸道疾病等。此外，禽呼腸孤病毒與其他免疫抑制性疾病的混合感染在雞群中普遍存在，導(dǎo)致雞生長(zhǎng)緩慢、飼料報(bào)酬率低， 影響免疫效果，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，禽呼腸孤病毒診斷方法有很多，主要有免疫瓊脂擴(kuò)散(AGP)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗(yàn)、免疫印跡(IBT)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以及實(shí)時(shí)熒光定量 (real-time PCR)等。但上述方法存在試驗(yàn)周期較長(zhǎng)、操作繁瑣、受檢測(cè)材料限制、對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器及檢測(cè)人員的技術(shù)要求高等不同缺點(diǎn)，因此不適合在基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。董嘉文、孫敏華等在《中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2011年7月第31卷第7期中發(fā)表的文章《禽呼腸孤病毒RT-LAMP快速檢測(cè)方法的建立》中提到根據(jù)禽呼腸孤病毒基因序列設(shè)計(jì)了特異對(duì)應(yīng)靶序列的6個(gè)基因區(qū)段的4條引物，并對(duì)此方法的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。但此文章中公開的檢測(cè)方法靈敏度低，最低檢出量為4ELD50，且使用SYBR Green I為熒光染料，極易造成交叉污染。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上LAMP方法檢測(cè)中存在的靈敏度低和容易污染的問題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)靈敏度高的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增禽呼腸孤病毒的引物。本發(fā)明還提供了一種能夠有效避免交叉污染禽呼腸孤病毒的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了禽呼腸孤病毒的檢測(cè)方法。本發(fā)明是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的
一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)禽呼腸孤病毒的引物，共包括外側(cè)引物對(duì)、內(nèi)側(cè)引物對(duì)和環(huán)形引物對(duì)三對(duì)特異性引物，序列如下
一對(duì)引物是能與禽呼腸孤病毒S1133株(GeneBank Accession Number AF330703)中 PlO基因(序列表中序列I)結(jié)合的外側(cè)引物對(duì)
上游引物F3 :5’ - ATGCTGCGTATGCCTCCC-3’，見序列表中序列2，
下游引物B3 5’ - CCAGCTCACGATGGAAGAC-3’，見序列表中序列3，
一對(duì)引物是能與禽呼腸孤病毒S1133株(GeneBank Accession Number AF3307030中 PlO基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)
上游引物FIP
5’ - ACGTAGCTTGCAAATCACCACCTTTTGTGTAACGGTGCGACTGCT-3’，見序列表中序列 4，下游引物BIP
5’ - CATAATTGCATATTGGCCTTATCTTTTTTACGTGCAGCGTCCGCCTT-3’，見序列表中序列 5， 一對(duì)引物是能與禽呼腸孤病毒 S1133 株(9GeneBank Accession Number AF3307030) 中PlO基因結(jié)合的環(huán)形引物對(duì)
上游引物L(fēng)F :5’ - GCCTGACAATGAACGTTACC-3’，見序列表中序列6，
下游引物L(fēng)B : 5’ - AGCGGCGGGTGGTGGTTTC-3’，見序列表中序列7，
夕卜側(cè)引物對(duì)、內(nèi)側(cè)引物對(duì)、環(huán)形引物對(duì)的摩爾比為1:8:4。引物識(shí)別的八個(gè)區(qū)域是匹配近年所有禽類呼腸孤病毒PlO基因的保守區(qū)，所以引物能夠識(shí)別所有的禽類呼腸孤病毒Pio基因，所述的外側(cè)引物對(duì)、內(nèi)側(cè)引物對(duì)和環(huán)形引物對(duì)作為一個(gè)整體使用，使用時(shí)應(yīng)盡量避免引物二聚體的形成。一種禽傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中含有上述三對(duì)特異性引物。所述的檢測(cè)試劑盒，每24 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中含有外側(cè)引物對(duì)上游引物和下游引物各5pmol，內(nèi)側(cè)引物對(duì)上游引物和下游引物各40pmol，環(huán)形引物對(duì)上游引物和下游引物各20pmol。所述的檢測(cè)試劑盒，每24 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中還含有Tris-HCl 20mM、 KCl IOmM, (NH4)2SO4 IOmM, MgSO4 4_16mM、Tween20 O. 1%、鈣黃綠素 O. 05 mM、MnCl2 O. 6mM、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶O. 2U、甜菜堿O. 8M、脫氧核苷酸dNTPs I. 4mM、Bst聚合酶8U。所述的檢測(cè)試劑盒，每24 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中還含有Tris-HCl 20mM、 KCl IOmM, (NH4)2SO4 IOmM, MgSO4 8mM、Tween20 O. 1%、鈣黃綠素 O. 05 mM、MnCl2 O. 6mM、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶O. 2U、甜菜堿O. 8M、脫氧核苷酸dNTPs I. 4mM、Bst聚合酶8U。所述的檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒中還包括熒光顯色劑。所述的檢測(cè)試劑盒，熒光顯色劑為鈣黃綠素和MnCl2。一種禽傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)方法，使用所述的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為:59-65 0C >30-75 分鐘。所述的檢測(cè)方法，將進(jìn)行完環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本在80°C條件下反應(yīng)2分鐘。應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)禽呼腸孤病毒，可以通過直接檢視判斷樣本是否含有禽呼腸孤病毒。直接檢視方法為
裝有陽性對(duì)照的反應(yīng)管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為棕黃色無熒光液體。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管有亮綠色可見熒光，則說明待檢樣品中禽呼腸孤病毒檢測(cè)結(jié)果為陽性。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管仍為棕黃色無熒光液體，則說明待檢樣品中禽呼腸孤病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。本發(fā)明提供的禽呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理如下
所述的引物組與所述的禽呼腸孤病毒AF330703序列plO基因8個(gè)特定結(jié)合區(qū)域結(jié)合， 見表I。表I引物組與所述的禽呼腸孤病毒AF330703序列plO基因結(jié)合區(qū)域I Ι-τ^.Ι-βΤτ'5>鳩位置_遞F 3I13I Β3225244Fle85107FWF22443Blc111134BWΒ2205I LF48€9I LE1 35153
上述引物組在AMV反轉(zhuǎn)錄酶和Bst DNA聚合酶的作用下可完成對(duì)模板RNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增過程分為三個(gè)階段，具體如下
(I)反轉(zhuǎn)錄階段
在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，樣本RNA被反轉(zhuǎn)錄成cDNA。(2)循環(huán)起始階段
一端內(nèi)側(cè)引物先于模板結(jié)合并啟動(dòng)DNA合成。相同一端的外側(cè)引物隨后與模板結(jié)合啟動(dòng)DNA合成，并發(fā)生鏈置換釋放出含有內(nèi)側(cè)引物序列的DNA單鏈。該單鏈DNA作為模板先后與另一端的內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物結(jié)合，啟動(dòng)DNA合成合并發(fā)生鏈置換，最后形成一個(gè)初始的莖環(huán)DNA。(3)反應(yīng)循環(huán)階段
內(nèi)側(cè)引物與初始莖環(huán)DNA結(jié)合，啟動(dòng)鏈置換DNA合成，可產(chǎn)生另一個(gè)初始莖環(huán)DNA和一個(gè)新的兩倍長(zhǎng)度的莖環(huán)DNA。這些莖環(huán)DNA可作為模板繼續(xù)與內(nèi)側(cè)引物結(jié)合啟動(dòng)鏈置換DNA 合成,并且每次合成均可使莖環(huán)DNA的莖長(zhǎng)度成倍增長(zhǎng)。進(jìn)入循環(huán)階段后，會(huì)產(chǎn)生許多分子大小不同的莖環(huán)DNA，這些莖環(huán)DNA還可以作為模板與環(huán)形引物結(jié)合，啟動(dòng)更多的DNA合成并發(fā)生鏈置換。最后經(jīng)過一個(gè)小時(shí)的等溫?cái)U(kuò)增， 目的基因可累計(jì)IO9拷貝。本發(fā)明的有益效果應(yīng)用本發(fā)明提供的禽呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，特異性和敏感性高，可檢測(cè)出100個(gè)拷貝的RNA。與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法相比，應(yīng)用本發(fā)明提供的禽呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，不需要昂貴的儀器，只需普通水浴鍋即可，且檢測(cè)結(jié)果可通過肉眼觀察熒光，操作簡(jiǎn)單，觀察方便。本試劑盒可應(yīng)用于基層現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的臨床獸醫(yī)學(xué)和食品中攜帶禽呼腸孤病毒的檢測(cè)。


圖I為實(shí)施例I擴(kuò)增結(jié)果的凝膠電泳譜圖，
其中M: Marker III, I: OmM Mg2+, 2: 4mM Mg2+, 3: 8mM Mg2+, 4: 12mM Mg2+, 5:
516mM Mg2+。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明有關(guān)內(nèi)容。下列實(shí)例中未注明的具體試驗(yàn)方法，通常按照分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所述的條件，或按照制造廠商提供的條件。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法包括如下步驟
(I)RNA的提取
本發(fā)明提供的試劑盒可用于檢測(cè)各種臟器、分泌物中的禽呼腸孤病毒，如鼻咽分泌物、 肺臟、腎臟、糞便等。不同來源的總RNA提取可參考相應(yīng)資料，或使用相應(yīng)RNA提取試劑盒。(2)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增
①在裝有24μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入I μ L模板RNA ；
②于水浴鍋或金屬恒溫加熱器上59_65°C放置30-75分鐘,取出。在步驟②完成后，取出前，還可以再調(diào)水浴鍋溫度到80°C反應(yīng)2分鐘，目的是能夠終止反應(yīng)，以便長(zhǎng)期保存反應(yīng)結(jié)果。(3)結(jié)果判定
可以通過直接檢視判斷樣本是否含有禽呼腸孤病毒。裝有陽性對(duì)照的反應(yīng)管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為棕黃色無熒光液體。如果裝有待檢測(cè)樣品的反應(yīng)管仍為棕黃色無熒光液體，則說明待檢樣品中禽呼腸孤病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果裝有待檢測(cè)樣品的檢樣管有亮綠色可見熒光，則說明樣品中禽呼腸孤病毒檢測(cè)結(jié)果為陽性。實(shí)施例I、禽呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒的制備
一、引物的合成
人工合成以下3對(duì)引物，外側(cè)引物對(duì)
上游引物 F3 :5’ - ATGCTGCGTATGCCTCCC-3’，
下游引物 B3 : 5’ - CCAGCTCACGATGGAAGAC-3’，
內(nèi)側(cè)引物對(duì)
上游引物FIP
5’ - ACGTAGCTTGCAAATCACCACCTTTTGTGTAACGGTGCGACTGCT-3’ ，
下游引物BIP
5’ - CATAATTGCATATTGGCCTTATCTTTTTTACGTGCAGCGTCCGCCTT-3’ ，
環(huán)形引物對(duì)
上游引物 LF :5’ - GCCTGACAATGAACGTTACC-3’，
下游引物 LB : 5’ - AGCGGCGGGTGGTGGTTTC-3’，
二、配制LAMP反應(yīng)液
每 24 μ L LAMP 反應(yīng)液，含有以下組分20mM Tris-HClUOmM KClUOmM (NH4)2SO4, 4-16mM MgS04、0. 1% Tween20、0. 05 mM 鈣黃綠素、0. 6mM MnCl2、0. 2U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、0. 8M 甜菜堿、I. 4mM脫氧核苷酸dNTPs、8U Bst聚合酶、5pmol上游外側(cè)引物(F3)、5pmol下游外側(cè)引物(B3)、40pmol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、40pmol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、20pmol上游環(huán)形引物、 20pmol下游環(huán)形引物。三、試劑盒的組裝
該試劑盒由以下物質(zhì)組成步驟二配制的LAMP反應(yīng)液、禽呼腸孤病毒RNA (陽性對(duì)照)(ARV/S1133株)、滅菌雙蒸水(陰性對(duì)照)、反應(yīng)管。反應(yīng)中Mg2+濃度是影響擴(kuò)增效率的重要因素。Mg2+濃度越低，反應(yīng)特異性越強(qiáng)，但擴(kuò)增效率降低；Mg2+濃度越高，反應(yīng)的效率增高，但特異性減弱。為了確定MgSO4的最佳添加濃度，分別配制MgSO4濃度分別為4mM、8 mM、12 mM和16 mM的LAMP反應(yīng)液，于水浴鍋或金屬恒溫加熱器上60°C放置60分鐘，取出，進(jìn)行凝膠電泳測(cè)試，結(jié)果見圖I，實(shí)施例結(jié)果表明， LAMP反應(yīng)體系中MgSO4為8mM時(shí)最為合適，所以試劑盒MgSO4濃度優(yōu)選8mM。以下實(shí)施例及靈敏度、特異性檢測(cè)中使用的LAMP反應(yīng)液中MgSO4濃度均為8mM。實(shí)施例2
取兩只雞，I只確診為禽呼腸孤病毒感染的病雞，I只健康雞。用泄殖腔棉拭子分別對(duì) 2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例I制備的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、提取 RNA
分別收集泄殖腔棉拭子，用O. 2mol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液在離心管中反復(fù)沖洗棉拭子，取出棉簽后，5000rpm離心lmin，取上清，得到2只雞的檢測(cè)液。提取RNA的操作是現(xiàn)有的技術(shù)，現(xiàn)只列舉其中一種具體操作，如下，但并不僅僅限于此種操作
在離心管中加入250 μ L檢測(cè)液和750 μ L TRIzol Reagent，劇烈振蕩，冰浴5min ;加氯仿200 μ L，冰浴5min ;12000rpm，4°C條件下離心lOmin，取水相，于另一離心管中；加入異丙醇500μ L(-20°C預(yù)冷)，_20°C下孵育IOmin ; 12000rpm，4°C條件下離心lOmin，棄上清；向沉淀中加入ImL 75%乙醇(O. 1% DEPC水配制)進(jìn)行洗滌；12000rpm，4°C條件下離心5min， 再重復(fù)洗滌后，棄上清；將沉淀室溫晾干lOmin，用O. 1%DEPC水將沉淀溶解，并在55_60°C下孵育lOmin，所制備RNA應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè)或貯存于_80°C備檢。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L步驟一得到病雞的RNA樣品， 作為檢測(cè)組I ;在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2 ;在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L陽性對(duì)照，作為陽性對(duì)照組；在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上59°C放置75分鐘，取出。三、檢視
裝有陽性對(duì)照的反應(yīng)管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為棕黃色無熒光液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。實(shí)施例3
取兩只雞，I只確診為禽呼腸孤病毒感染的病雞，I只健康雞。用泄殖腔棉拭子分別對(duì) 2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例I制備的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、提取 RNA
同實(shí)施例2的步驟一。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L步驟一得到病雞的RNA樣品，作為檢測(cè)組I ;在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2 ;在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L 陽性對(duì)照，作為陽性對(duì)照組；在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65°C放置60分鐘，取出。三、檢視
裝有陽性對(duì)照的反應(yīng)管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為棕黃色無熒光液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。實(shí)施例4
取兩只雞，I只確診為禽呼腸孤病毒感染的病雞，I只健康雞。用泄殖腔棉拭子分別對(duì) 2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例I制備的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。二、提取 RNA
同實(shí)施例2的步驟一。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L步驟一得到病雞的RNA樣品，作為檢測(cè)組I ;在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2 ;在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L 陽性對(duì)照，作為陽性對(duì)照組；在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上63°C放置45分鐘，取出。三、檢視
裝有陽性對(duì)照的反應(yīng)管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為棕黃色無熒光液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。實(shí)施例5
取兩只雞，I只確診為禽呼腸孤病毒感染的病雞，I只健康雞。用泄殖腔棉拭子分別對(duì) 2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例I制備的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、提取 RNA
同實(shí)施例2的步驟一。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L步驟一得到病雞的RNA樣品，作為檢測(cè)組I ;在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2 ;在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L 陽性對(duì)照，作為陽性對(duì)照組；在3支裝有24 μ L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入I μ L滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65°C放置30分鐘，取出。三、檢視
裝有陽性對(duì)照的反應(yīng)管有亮綠色可見熒光，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為棕黃色無熒光液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光。檢測(cè)靈敏度及特異性評(píng)價(jià)
一、靈敏度
制備101°拷貝/ μ L、IO9拷貝/ μ L、IO8拷貝/ μ L、IO7拷貝/ μ L、IO6拷貝/ μ L、IO5拷貝/ μ L、IO4拷貝/ μ L、IO3拷貝/ μ L、IO2拷貝/ μ L、IO1拷貝/ μ L含禽呼腸孤病毒plO基因的質(zhì)粒樣本。采用實(shí)施例I制備的檢測(cè)試劑盒對(duì)質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測(cè)。I、質(zhì)粒的制備
提取禽呼腸孤病毒SI 133株的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到DNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增得到此毒株的PlO基因片段。再與T載體連接后即得到含plO基因的質(zhì)粒，一個(gè)質(zhì)粒分子對(duì)應(yīng)一個(gè)拷貝的PlO基因。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒可隨著感受態(tài)細(xì)胞的繁殖而復(fù)制。最后從感受:態(tài)細(xì)胞中提取純化pio基因質(zhì)粒。得到的質(zhì)?？赏ㄟ^分光光度計(jì)法測(cè)定并計(jì)算拷貝數(shù)濃度。用雙蒸水將質(zhì)粒稀釋到所需要的濃度，即101°拷貝/μ L、IO9拷貝/μ L、IO8拷貝/μ L、IO7拷貝/μ L、IO6拷貝/ μ L、IO5拷貝/ μ L、IO4拷貝/ μ L、IO3拷貝/ μ L、IO2拷貝/ μ UlO1拷貝/ μ L。檢測(cè)時(shí)加入各濃度質(zhì)粒I μ L。(可參考《分子克隆試驗(yàn)指南》第三版，所需要的試劑和儀器均為市面可購(gòu)買的。)
2、分別對(duì)上述各濃度的質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下
(I)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
取步驟一得到101°拷貝/ μ L、IO9拷貝/ μ L、IO8拷貝/ μ L、IO7拷貝/ μ L、IO6拷貝/ μ L、IO5拷貝/ μ L、IO4拷貝/ μ L、IO3拷貝/ μ L、IO2拷貝/ μ L、IO1拷貝/ μ L的質(zhì)粒樣本各 I μ L，分別加至3支檢樣管中，每管再加入24μ L的LAMP反應(yīng)液，分別作為檢測(cè)組1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10。用相同體積的滅菌雙蒸水代替質(zhì)粒樣本同法制備陰性對(duì)照，另取3支陽性對(duì)照，加入24 μ L的LAMP反應(yīng)液。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上63°C放置60分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到80°C反應(yīng)2min，取出。(2)直接檢視
結(jié)果表明，陽性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體。檢測(cè)組I的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組2的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組3的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組4的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組5的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組6的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組7的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組8的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組9的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組10的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體?？梢姡景l(fā)明的禽呼腸孤病毒的檢測(cè)試劑盒可以檢測(cè)出IO2拷貝/ μ L的RNA，檢測(cè)靈敏度很高，可以對(duì)禽呼腸孤病毒進(jìn)行精確的檢測(cè)。二、特異性
提取禽呼腸孤病毒RNA樣本，并以新城疫病毒La Sota株{Newcastle Disease Virus, ND V)、H9N2 亞型禽流感病毒vian Influenza Virus, AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒(Jfl/eciioiAs Bronchitis Virus , IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(Jflfeciiow1S laryngotracheitis Virus, ILTV)、減蛋綜合癥病毒(萬從價(jià)0/7K/zyas, EDS)、大
腸埃希菌疋· coli )為對(duì)照病原，采用實(shí)施例6制備的試劑盒對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒RNA 樣本和對(duì)照病原核酸進(jìn)行特異性檢測(cè)。I、核酸的提取 (I)提取RNA
提取禽呼腸孤病毒、新城疫病毒、H9N2亞型禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒的 RNA，步驟同實(shí)施例5的步驟一。(2)提取 DNA
提取傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒和大腸埃希菌的DNA。取3種病原液體培養(yǎng)物進(jìn)行核酸DNA的提取，步驟如下
取500 μ L培養(yǎng)液加入25 μ LlO%的SDS和IOyL 20mg/mL的蛋白酶K，震蕩均勻；56°C 條件下水浴2小時(shí)；加入200 μ L Tris飽和酚，混勻后12000rpm離心IOmin ;取上層水相， 加入IOOyL Tris飽和酚和IOOyL氯仿，混勻，12000rpm離心IOmin ;將上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入200μ L氯仿，振蕩，12000rpm離心IOmin ;轉(zhuǎn)移上層水相到一新的離心管，加入等體積的異丙醇，_20°C冰凍10分鐘后12000rpm離心IOmin ;棄上清，加入500 μ L 70%乙醇，12000rpm離心2min ;棄上清，室溫放置30min后加入50 μ L水溶解DNA。2、分別對(duì)上述病原樣本核酸進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下
(I)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
取步驟一得到的Η9Ν2亞型禽流感病毒、新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性支氣管炎病毒的RNA和傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒、大腸埃希菌的DNA各I μ L，分別加至3支檢樣管中，每管再加入24μ L的LAMP反應(yīng)液(傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒、大腸埃希菌DNA的檢測(cè)管則用水代替其中的AMV)，分別作為檢測(cè)組1、2、3、4、5、6、7。用相同體積的滅菌雙蒸水代替核酸樣本同法制備陰性對(duì)照，另取3支陽性對(duì)照，加入24 μ L的 LAMP反應(yīng)液。上述檢樣管同時(shí)在水浴鍋上65°C放置60分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到80°C反應(yīng)2min，取出。(2)直接檢視
結(jié)果表明，陽性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體。檢測(cè)組I的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體，檢測(cè)組2的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體，檢測(cè)組3的三個(gè)反應(yīng)管均有亮綠色可見熒光，檢測(cè)組4的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體，檢測(cè)組5的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體，檢測(cè)組6 的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體，檢測(cè)組7的三個(gè)反應(yīng)管均為棕黃色無熒光液體?？梢?，本發(fā)明的禽呼腸孤病毒的檢測(cè)試劑盒對(duì)新城疫病毒La Sota株(Afefrca1Sih Disease Virus, NDV)、H9N2 亞型禽流感病毒Influenza Virus, AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒SroflcAiii1S Virus , IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(Jflfeciiow1S laryngotrachei tis Virus, ILTV)、減蛋綜合癥病毒(萬從價(jià)0/7K/zyas, EDS)、大腸埃希菌{E.coli )均無擴(kuò)增，具有很好的特異性，可以對(duì)禽呼腸孤病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增禽呼腸孤病毒的引物，其特征在于共包括外側(cè)引物對(duì)、內(nèi)側(cè)引物對(duì)和環(huán)形引物對(duì)三對(duì)特異性引物，序列如下外側(cè)引物對(duì)上游引物 F3 :5’ - ATGCTGCGTATGCCTCCC-3’，下游引物 B3 : 5’ - CCAGCTCACGATGGAAGAC-3’，內(nèi)側(cè)引物對(duì)上游引物FIP 5’ - ACGTAGCTTGCAAATCACCACCTTTTGTGTAACGGTGCGACTGCT-3’ ，下游引物BIP 5’ - CATAATTGCATATTGGCCTTATCTTTTTTACGTGCAGCGTCCGCCTT-3’ ，環(huán)形引物對(duì)上游引物 LF :5’ - GCCTGACAATGAACGTTACC-3’，下游引物 LB : 5’ - AGCGGCGGGTGGTGGTTTC-3’，夕卜側(cè)引物對(duì)、內(nèi)側(cè)引物對(duì)、環(huán)形引物對(duì)的摩爾比為1:8:4。
2.一種禽傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中含有權(quán)利要求I中的三對(duì)特異性引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于每24μL環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中含有外側(cè)引物對(duì)上游引物和下游引物各5pmol，內(nèi)側(cè)引物對(duì)上游引物和下游引物各 40pmoI,環(huán)形引物對(duì)上游引物和下游引物各20pmoI。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于每24μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中還含有 Tris-HCl 20mM、KCl IOmM、(NH4) 2SO4 IOmM、MgSO4 4_16mM、Tween20 O. 1%、鈣黃綠素O. 05 mM、MnCl2 O. 6mM、AMV反轉(zhuǎn)錄酶O. 2U、甜菜堿O. 8M、脫氧核苷酸dNTPs I. 4mM、 Bst聚合酶8U。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)試劑盒，特征在于每24μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中還含有 Tris-HCl 20mM、KCl IOmM, (NH4)2SO4 IOmM, MgSO4 8mM、Tween20 O. 1%、鈣黃綠素O.05 mM, MnCl2 O. 6mM、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 O. 2U、甜菜堿 O. 8M、脫氧核苷酸 dNTPs 1.4mM、Bst 聚合酶8U。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)試劑盒，特征在于所述的檢測(cè)試劑盒中還包括熒光顯色劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑盒，特征在于熒光顯色劑為鈣黃綠素和MnCl2。
8.一種禽傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)方法，其特征是使用權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為59-65°C、30-75分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于將進(jìn)行完環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本在80°C條件下反應(yīng)2分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及禽呼腸孤病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增禽呼腸孤病毒的引物，包括三對(duì)特異性引物，序列如序列表所示。一種禽呼腸孤病毒的檢測(cè)試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中含有上述三對(duì)特異性引物。一種禽呼腸孤病毒的檢測(cè)方法，使用所述的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為59-65℃、30-75分鐘。本發(fā)明的禽呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒，特異性和敏感性高，可檢測(cè)出100個(gè)拷貝的RNA，操作簡(jiǎn)單，觀察方便。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102586479SQ20121004049
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月22日
發(fā)明者張琳, 張秀美, 楊少華, 胡北俠, 許傳田, 顏世敢 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所