專利名稱：兼性厭氧微生物復合菌劑及其制備方法和其在降解秸稈中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種兼性厭氧微生物復合菌劑，本發(fā)明還涉及該復合菌劑的制備方法和其在降解秸桿中的應用。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物秸桿的有機成分主要為纖維素、半纖維素，其次為木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、氨基酸、 樹脂、單寧等。因為秸桿組分結(jié)構(gòu)特殊，秸桿中的木質(zhì)素很難被酸與酶降解。木質(zhì)素與半纖維素以共價鍵方式結(jié)合，將纖維素分子包埋在其中，形成一種天然屏障，使酶不易與纖維素分子接觸；另一方面，木質(zhì)素的非水溶性、化學結(jié)構(gòu)的復雜性，導致了秸桿的難降解性。近年來，秸桿的利用方式在我國主要包括作為能源、還田、飼料、用于工業(yè)原料 (造紙)等。目前主要的秸桿能源化利用技術(shù)主要有秸桿直燃供熱技術(shù)、秸桿氣化集中供氣技術(shù)、秸桿發(fā)酵制沼氣技術(shù)等。然而沼氣發(fā)酵過程中纖維素的降解是通過多種厭氧或兼性厭氧的水解或發(fā)酵性微生物合成的纖維素酶進行的。在厭氧條件下，纖維素多數(shù)處于結(jié)晶態(tài)，葡萄糖單體以β-1，4苷鍵聯(lián)結(jié)，與半纖維素、木質(zhì)素相聯(lián)結(jié)等結(jié)構(gòu)特性而難以被降解。纖維素的好氧或厭氧降解過程實質(zhì)上就是微生物所產(chǎn)生的纖維素酶類分解纖維素的過程。利用秸桿發(fā)酵生產(chǎn)沼氣，水解階段中起主要作用的是利用纖維素的微生物，自然界中能夠降解和利用纖維素的微生物種類很多，目前有很多針對纖維素酶菌株的篩選的科技成果和應用，但多為好氧性微生物，而沼氣發(fā)酵是在厭氧環(huán)境中進行，因此兼性厭氧高活性纖維素酶細菌成為利用秸桿發(fā)酵生產(chǎn)沼氣的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。瘤胃中含有大量能夠通過纖維素酶降解纖維素的厭氧微生物，利用微生物厭氧發(fā)酵秸桿生產(chǎn)生物沼氣不僅能使生物質(zhì)資源循環(huán)利用和得到深度開發(fā)，而且還能緩解能源危機，改善生態(tài)環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供一種兼性厭氧微生物復合菌劑，這種復合菌劑能使農(nóng)作物秸桿更好的分解，提高厭氧發(fā)酵沼氣產(chǎn)氣率；為此，本發(fā)明還提供該兼性厭氧微生物復合菌劑的制備方法和其在降解秸桿中的應用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種兼性厭氧微生物復合菌劑，所述復合菌劑由纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌組成；所述纖維單胞菌是從牛瘤胃液中篩選分離得到的。進一步地，所述復合菌劑中各組分的體積比如下纖維單胞菌黃孢原毛平革菌: 白腐真菌枯草芽孢桿菌=20-30:15-25:15-30:20-30。進一步地，所述復合菌劑中各組分的接種量如下纖維單胞菌30%，黃孢原毛平革菌20%,白腐真菌25%,枯草芽孢桿菌25%。本發(fā)明的第二個目的是提供該兼性厭氧微生物復合菌劑的制備方法，將纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌分別擴大培養(yǎng)后按配比混合接種于混合發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始PH7. O,通氣量O. 5v/v · min,轉(zhuǎn)速200r/min，37°C培養(yǎng)24 48h，使其菌液的活菌數(shù)量達到25億個每毫升，完成兼性厭氧微生物復合菌劑的制備。本發(fā)明的第三個目的是提供兼性厭氧微生物復合菌劑在降解秸桿中的應用。本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑中各個菌種的作用如下
纖維單胞菌該菌株在有氧及無氧條件下都能生長并代謝產(chǎn)酸，能分解秸桿中的纖維素及半纖維素。白腐真菌該菌株能夠分泌胞外氧化酶降解木質(zhì)素，且降解木質(zhì)素的能力優(yōu)于降解纖維素的能力。黃孢原毛平革菌該菌株功能同白腐真菌，主要降解木質(zhì)素?？莶菅挎邨U菌該菌株是一種好氧產(chǎn)芽孢的桿狀細菌，在此主要功能是分解半纖維素。本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑能很好的降解農(nóng)作物秸桿，并提高農(nóng)作物秸桿的發(fā)酵產(chǎn)氣率。


圖I為本發(fā)明的實施例2-5中制備的兼性厭氧微生物復合菌劑降解秸桿木質(zhì)纖維素的對比圖。圖2為本發(fā)明的實施例2-5中制備的兼性厭氧微生物復合菌劑降解秸桿后接入豬糞發(fā)酵30天的累積產(chǎn)沼氣對比圖。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法和所用的試劑及設備，如無特別說明，均為常規(guī)方法、常規(guī)試劑和設備。本發(fā)明使用的菌種或試劑
1、白腐真菌(white-rotfungi):購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,保藏編號 CICC 40299;
2、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium):購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CICC 40719 ；
3、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis):購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,保藏編號=CICC 10090。本發(fā)明實施例中，應用的培養(yǎng)基配方如下
I、纖維單胞菌初篩培養(yǎng)基(g/L):羧甲基纖維素鈉5. Og ;硫酸銨2. Og ;磷酸二氫鉀2. O g ;七水硫酸鎂I. O g ;七水硫酸鐵10. Omg ；氯化猛5mg ;氯化鈉3. Og ;瓊脂粉20. Og ;蒸懼水IL ;調(diào)pH值6. 7。2、纖維單胞菌復篩培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨2. Og ;酵母膏I. Og ；羧甲基纖維素鈉 5. Og ;硫酸銨2. O g ;磷酸二氫鉀2. O g ;七水硫酸鎂I. O g ;七水硫酸鐵10. Omg ；氯化錳 5mg ;氯化鈉3. O g ;瓊脂粉20. Og ;蒸餾水IL ;調(diào)pH值6.7。刃天青O. 2% (配制后儲存于冰箱內(nèi))1 mL，在IL的大三角瓶中將培養(yǎng)基煮沸IOmin后通入氮氣驅(qū)氧5min再加入質(zhì)量.33.7724513
W O 8 O- 7.
上述5株菌株均在剛果紅平板形成紅色濃郁的透明圈，其中16號菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值最大，可以初步判斷這株菌的產(chǎn)纖維素酶較強。 (2)復篩
配制纖維單胞菌復篩培養(yǎng)基，裝量于Hungate厭氧管中并用氮氣(純度為99. 9%，并經(jīng)除氧銅柱除氧)進行體系氣體置換15min，Hungate厭氧管用橡膠塞密封后加蓋于121°C滅菌30分鐘，無菌操作下將初篩得到的菌株用接種環(huán)從富集平板上沾取少量的菌株接入?yún)?br> 5
百分比為O. 05%的L 一半胱氨鹽酸鹽。3、纖維單胞菌發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨3. Og ;酵母3. Og ；羧甲基纖維素鈉
5.Og ;硫酸銨2. Og ;磷酸二氫鉀2. Og ;七水硫酸鎂l.Og ;七水硫酸鐵10. Omg ;氯化錳5mg ； 氯化鈉3. Og ;瓊脂粉20. Og ;蒸餾水IL ;調(diào)pH值為6. 7。4、黃孢原毛平革菌培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20g ;體積百分含量為20%的馬鈴薯汁 IL ； KH2PO4 3g ； MgSO4 · 7H20 I. 5g ;維生素 BI 微量；瓊脂 15g。5、白腐真菌培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20g;體積百分含量為20%的馬鈴薯汁IL ; KH2PO4 3g ； MgSO4 · 7H20 I. 5g ;維生素 BI 微量；瓊脂 15g。6、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基(g/L):氯化鈉O. 5g ;牛肉膏Ig;蛋白胨Ig;瓊脂 2g ；水 10OmT, ；pH 7. 2。7、混合發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10. Og,羧甲基纖維素鈉5. O g,蛋白胨2. O g,酵母膏I. O g，硫酸銨2. O g，磷酸二氫鉀2. O g，七水硫酸鎂I. O g，七水硫酸鐵10. O mg，氯化錳 5 mg，氯化鈉 10. O g ;蒸餾水 1000 ml, ρΗ7· 0-7. 2。本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑由以下物質(zhì)組成纖維單胞菌、白腐真菌、黃孢原毛平革菌、枯草芽孢桿菌。實施例I 原料的制備
I、纖維單胞菌的分離方法如下
(I)初篩
吸取O. 5ml牛瘤胃液加入到49. 5ml含有玻璃珠的生理鹽水中，作為10_2稀釋度，振蕩 10 min混勻并將上清液10_3、10_4、10_5稀釋，各取O. 2ml稀釋液，采用纖維單胞菌初篩培養(yǎng)基稀釋涂布，每個稀釋度作2次重復，37°C培養(yǎng)48 h，挑取生長較快的菌株進行純化，采用剛果紅平板脫色法從中共分離出20株能產(chǎn)生透明圈的菌株，在此條件下產(chǎn)生透明圈的菌株即為纖維單胞菌，經(jīng)重復比較有5株透明圈與菌落直徑比較大的菌株，分別編號為05、 16、21、37、43，其中菌株16號的比值最大,證明16號菌株的產(chǎn)纖維素酶的能力最佳。選擇此菌株接種到纖維單胞菌初篩培養(yǎng)基斜面，4°C保存。表I菌株透明圈(D)與菌落直徑(d)比
Γ 菌棒編號 (戲道〉 ， d(nMi) …1D/d.
1.2
1.3
1.5 LI
1.6
Λ 3- 3- Λ Λ 2,2.L I 1Α I I I
21
37氧管中滾管，用橡膠塞封口加蓋置于37°C培養(yǎng)，直至滾管上長出菌落為止，挑取菌落再進行分離純化，多次稀釋涂布挑選菌種，直到在顯微鏡下觀測的菌種形態(tài)一致，最終保存。分離得到的纖維單胞菌兼性菌菌株特征菌株在纖維單胞菌復篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 周后，形成的菌落呈圓形或同心圓，不透明、不光滑、表面濕潤、邊緣完整、產(chǎn)黃色素，直徑為 O. 8^3. 7mm,水解圈直徑為3. (Tl3. Omm ;菌株細胞呈短桿狀,兼性厭氧,革蘭氏染色陽性，大小為O. 35 μ πΓ . 2 μ m，少部分菌體產(chǎn)芽孢，能運動，無鞭毛，多數(shù)單生，少數(shù)成對或成串，通過生理生化實驗及分子學初步鑒定確定其為纖維單胞菌(Cel Iulomonas )。2、纖維單胞菌的擴大培養(yǎng)
在250mL的三角瓶中加入50mL纖維單胞菌初篩培養(yǎng)基，121°C滅菌30min后，將復篩后得到的纖維單胞菌菌株接種至纖維單胞菌初篩培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，溫度37°C， 培養(yǎng)時間24 h，即得種子液。將種子液按6%的接種量接入裝有50ml (250mL)纖維單胞菌發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200r/min溫度37°C進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后采用菌落計數(shù)法計數(shù)，使每毫升培養(yǎng)液的纖維單胞菌菌數(shù)在IO9以上。3、白腐真菌的擴大培養(yǎng)
將白腐真菌菌種無菌操作接種于白腐真菌培養(yǎng)基中，制備斜面保藏菌種，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min，溫度37°C，培養(yǎng)時間24 h，即得種子液。將種子液按4%的接種量接入裝有50ml 白腐真菌培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，溫度37°C進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后采用菌落計數(shù)法計數(shù)，使每毫升培養(yǎng)液的白腐真菌菌數(shù)在IO9以上。4、黃孢原毛平革菌的擴大培養(yǎng)
將黃孢原毛平革菌菌種無菌操作接種于黃孢原毛平革菌培養(yǎng)基中，制備斜面保藏菌種，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，溫度37°C，培養(yǎng)時間24 h，即得種子液。將種子液按4%的接種量接入裝有50ml黃孢原毛平革菌培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，溫度37°C進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后采用菌落計數(shù)法計數(shù)，使每毫升培養(yǎng)液的黃孢原毛平革菌菌數(shù)在IO9以上。5、枯草芽孢桿菌的擴大培養(yǎng)
將枯草芽孢桿菌無菌操作接種于枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中，制備斜面保藏菌種，將斜面菌種無菌操作接種于裝有50ml枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，轉(zhuǎn)速200r/min， 37 °C恒溫培養(yǎng)24h。實施例2
本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑的制備
將實施例I中各單獨擴大培養(yǎng)的菌種纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌的種子液分別按接種量20%、15%、15%、20%混合接種于IL混合發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始 PH7. 0，通氣量O. 5ν/ν ·π η，轉(zhuǎn)速200r/min，37°C培養(yǎng)24 48h，使其菌液的活菌數(shù)量達到25 億個每毫升。實施例3
本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑的制備
本實施例與實施例2中的不同之處在于各單獨擴大培養(yǎng)的菌種纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌的種子液分別按接種量25%、20%、20%、25%混合，其余步驟均相同。實施例4本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑的制備
本實施例與實施例2中的不同之處在于各單獨擴大培養(yǎng)的菌種纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌的種子液分別按接種量30%、20%、25%、25%混合，其余步驟均相同。實施例5
本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑的制備
本實施例與實施例2中的不同之處在于各單獨擴大培養(yǎng)的菌種纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌的種子液分別按接種量30%、25%、30%、30%混合，其余步驟均相同。實施例6
本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑降解秸桿實驗
將IOOg小麥秸桿原料破碎，加入尿素水溶液，使系統(tǒng)中總固體含量保持在20%左右，分別接入4% (體積百分數(shù))實施例2-5中制備的本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑，對照組不添加菌劑，于燒杯中拌勻加蓋塑料薄膜進行堆慪，37°C堆慪5天，取樣測秸桿木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的含量及降解率。記錄結(jié)果如表2和圖I。表權(quán)利要求
1.一種兼性厭氧微生物復合菌劑，其特征在于所述復合菌劑由纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌組成；所述纖維單胞菌是從牛瘤胃液中篩選分離得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼性厭氧微生物復合菌劑，其特征在于所述復合菌劑中各組分的體積比如下纖維單胞菌黃孢原毛平革菌白腐真菌枯草芽孢桿菌 =20-30:15-25:15-30:20-30。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兼性厭氧微生物復合菌劑，其特征在于所述復合菌劑中各組分的接種量如下纖維單胞菌30%，黃孢原毛平革菌20%，白腐真菌25%，枯草芽孢桿菌 25%。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的兼性厭氧微生物復合菌劑的制備方法，其特征在于將纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌分別擴大培養(yǎng)后按配比混合接種于混合發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始PH7. 0，通氣量O. 5v/v · min,轉(zhuǎn)速200r/min，37°C培養(yǎng)24 48h，使其菌液的活菌數(shù)量達到25億個每毫升，完成兼性厭氧微生物復合菌劑的制備。
5.權(quán)利要求1-3任一所述的兼性厭氧微生物復合菌劑在降解秸桿中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種兼性厭氧微生物復合菌劑，由纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌組成；纖維單胞菌是從牛瘤胃液中篩選分離得到的。本發(fā)明還提供該兼性厭氧微生物復合菌劑的制備方法，將纖維單胞菌、黃孢原毛平革菌、白腐真菌、枯草芽孢桿菌分別擴大培養(yǎng)后按配比混合接種于混合發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH7.0，通氣量0.5v/v·min，轉(zhuǎn)速200r/min，37℃培養(yǎng)24~48h，使其菌液的活菌數(shù)量達到25億個每毫升，完成兼性厭氧微生物復合菌劑的制備。本發(fā)明還提供兼性厭氧微生物復合菌劑在降解秸稈中的應用。本發(fā)明的兼性厭氧微生物復合菌劑能很好的降解農(nóng)作物秸稈，并提高農(nóng)作物秸稈的發(fā)酵產(chǎn)氣率。
文檔編號C12R1/01GK102586110SQ20121004082
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月22日
發(fā)明者俞建中, 劉思穎, 樊婷婷, 趙雪峰, 龍濤 申請人:無錫豐陸環(huán)保科技有限公司