專利名稱：一種產(chǎn)乙酰膽堿酯酶抑制劑的真菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種產(chǎn)乙酰膽堿酯酶抑制劑的真菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病是一種常見的老年性腦神經(jīng)退行性病變，發(fā)病率較高，已成為現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重威脅老年人生命的疾病之底前腦膽堿能功能障礙和皮層、海馬廣泛的神經(jīng)元丟失和突觸形態(tài)的改變。該疾病典型的病理變化包括β淀粉樣蛋白沉積形成老年斑，神經(jīng)纖維纏結(jié)基底前腦膽堿能功能障礙和皮層、海馬廣泛的神經(jīng)元丟失和突觸形態(tài)的改變。研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者腦內(nèi)皮層及海馬區(qū)的病變比較明顯，以前腦基底核膽堿能神經(jīng)元破壞最多。因此，通過增加乙酰膽堿的含量，或作用于膽堿受體，可增強(qiáng)和改善中樞膽堿能系統(tǒng)的功能，從而達(dá)到促智治病的目的)。乙酰膽堿酯酶抑制劑就建立是建立在這種理論基礎(chǔ)上開發(fā)出來的臨床上用于阿爾茨海默病治療最早最成熟的一類藥物，該類藥物對(duì)輕、中度阿爾茨海默病患者療效確切，可使其認(rèn)知功能及其它癥狀得到部分改善。目前多種乙酰膽堿酯酶抑制劑已經(jīng)用于阿爾茨海默病的治療。但此類藥物的療效依賴于膽堿能神經(jīng)元的完整程度，不適于重度病人。同時(shí)，該類藥物只能提高乙酰膽堿的含量，不能阻止中樞膽堿能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化死亡，隨著病情的發(fā)展，中樞膽堿能神經(jīng)元進(jìn)行性退化死亡，乙酰膽堿酯酶抑制劑的藥效也會(huì)逐漸降低。因此，尋找既能抑制乙酰膽堿酯酶活性又能阻止中樞膽堿能神經(jīng)元退化死亡的新型乙酰膽堿酯酶抑制劑成為尋找阿爾茨海默病治療藥物的關(guān)鍵。在海洋中，由于環(huán)境條件極為復(fù)雜與獨(dú)特，如壓力、溫度、含氧量、光線、鹽度、營(yíng)養(yǎng)狀況等與陸地相異，在那里存在著許多新的微生物，其代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多樣，新穎獨(dú)特，是陸地生物所不具備的。另外，海洋微生物生長(zhǎng)周期短，容易培養(yǎng)可以用發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化。因此，海洋微生物作為巨大的潛在藥物和化學(xué)的資源， 具有廣闊的研究和開發(fā)前景，成為近年來尋找新藥的研究熱點(diǎn)。從海洋中分離海洋微生物并從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化結(jié)構(gòu)新穎的乙酰膽堿酯酶抑制劑，對(duì)抗阿爾茨海默病藥物的研發(fā)和海洋生物資源的開發(fā)利用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了尋找新型的乙酰膽堿酯酶抑制劑，本申請(qǐng)的發(fā)明人從江蘇連云港海域分離海洋微生物并制取其發(fā)酵產(chǎn)物，然后對(duì)獲得的發(fā)酵產(chǎn)物的乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行了研究，結(jié)果找到了一株海洋真菌SH0701。該海洋真菌菌株SH0701是發(fā)明人從中國(guó)江蘇連云港海域的海底沉積物中分離到的一株真菌，發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的乙酰膽堿酯酶抑制活性，經(jīng)鑒定表明它屬于赭曲霉AspergiIIus ochraceus。本發(fā)明所述的的海洋赭曲霉AspergiIIus ochraceus SH0701已于2012年I月10日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(其簡(jiǎn)稱CCTCC)， 保藏編號(hào)為CCTCC M 2012003。
上述的海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701的生物學(xué)形態(tài)描述為在海水 PDA培養(yǎng)基上，菌落圓形呈放射狀，菌絲白色透明、稀疏，孢子細(xì)密、淺黃色，如圖I所示；顯微觀察顯示，菌絲透明，有分枝和分隔，有假根，有分生孢子梗，分生孢子梗無橫隔，光滑，頂囊半球形或球形，小梗呈放射狀，產(chǎn)生分生孢子、細(xì)小圓形，如圖2、圖3、圖4所示。上述的海洋曲霉Aspergillus ochraceus SH0701的遺傳學(xué)特征,該海洋真菌的 ITS序列為GGCTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTGAGGGTCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACC CGTGTATACCGTACCTTGTTGCTTCGGCGAGCCCGCCCCCTTTTTCTTTTAGGGGGCACAGCGCTCGCCGGAGACAC CAACGTGAACACTGTCTGAAGTTTTGTCGTCTGAGTCGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCT CTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAG TCTTTGAACGCACATTGCACCCCCTGGTATTCCGGGGGGTATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGG CTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCCAGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAG CGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCTGCTGGCCGACGCTGAAAAGCAACCAACTATTTTTC CAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA該序列與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)BLAST 比對(duì)結(jié)果顯不，該真菌的ITS序列與曲霉Aspergillus sepultus、Aspergillus ostianus及 Aspergillus ochraceus 同源性最高，達(dá)到 100% 微管蛋白(β-tubulin)基因序列為5 ’ -GCTATCCAGGATCATCTTCGATACCTTAGGACTTATGACTCTCAATCCTTGATACTTGTTTACTGA TAGGTGAATAGGCAAAACATCTCTGGCGAGCACGGCCTTGACGGCGCCGGTGTGTAAGTACATCCCGCGTTTACACC CATCGAAATCAGAGTCGAAAATAGAGGAAAAGAAAGAAACGACCATGGTGGGATTGATTGTCTGATGGGATGAACAG TTACAATGGCTCCTCCGACCTTCAGCTGGAGCGCATGAACGTCTACTTCAACGAGGTTCGTTGCCCGAAAATTTTCT ATCTCCTTTCGCCTATTCGAAACGCCCCGTACAAAGCTCTAACCCACGCTTTTTTCTTCATCTTCTAGGCTTCCGGT GGCAAGTATGTTCCCCGTGCCGTTCTGGTCGATCTTGAGCCCGGTACCATGGACGCTGTCCGTGCCGGTCCCTTCGG TCAGCTTTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTTCGGCCAGTCTGGTGCCGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCACA-3，該序列與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)BLAST 比對(duì)結(jié)果顯示，該真菌的微管蛋白序列與Aspergillus ochraceus相似度最高,達(dá)到99%。前述海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株的發(fā)酵產(chǎn)物、發(fā)酵產(chǎn)物的提取物經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)均具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的特性。發(fā)酵產(chǎn)物的提取物包括發(fā)酵液提取物、極性段提取物、菌體提取物。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這三種提取物均具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的特性。發(fā)酵液提取物發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)管式離心機(jī)離心固液分離，得到發(fā)酵液和菌體；將發(fā)酵液減壓蒸餾濃縮至原體積的三分之一后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，再將乙酸乙酯層減壓干燥后得到發(fā)酵液提取物。極性段提取物將前述的發(fā)酵液提取物以I : 5(W/V)懸浮在水中，再采用液-液分配萃取法用石油醚或氯仿或乙酸乙酯或正丁醇按照I:I比例萃取得到極性段提取物， 極性段提取物為石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或水提取物。菌體提取物發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)管式離心機(jī)離心固液分離，得到發(fā)酵液和菌體；菌體在烘箱中50°C干燥得干燥的菌體；干燥的菌體按I : 20(W/V)加入甲醇萃取3次，合并甲醇提取液，減壓蒸餾干燥得到菌體提取物。前述獲得海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵方法包括菌種活化過程、種子液制備過程和發(fā)酵培養(yǎng)過程。菌種活化過程取所述保藏菌種，采用劃線法接種于海洋PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)得到產(chǎn)生孢子的斜面培養(yǎng)物，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間5天。種子液制備過程將上述的斜面培養(yǎng)物加無菌陳海水后，在無菌條件下刮取孢子， 制備孢子懸液；再將孢子懸液接種于海洋PDA培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)獲得種子液。其中，前述孢子懸液的接種按5%接種量接種于海洋PDA培養(yǎng)基；震蕩培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)為溫度28°C、每分鐘150-180轉(zhuǎn)；培養(yǎng)時(shí)間為3-4天。發(fā)酵培養(yǎng)過程在通氣攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入海洋PDA發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接入種子液攪拌發(fā)酵，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。其中，滅菌的方法為在121°C下放置30min ;種子液的接入按接種量5%接入；攪拌發(fā)酵環(huán)境參數(shù)為通氣量I : O. 5，溫度為28°C，攪拌速度為每分鐘 250轉(zhuǎn)；發(fā)酵時(shí)間為7天。前述發(fā)酵方法中的海洋PDA斜面培養(yǎng)基的配置方法為將馬鈴薯去皮切成小塊， 于海水中煮沸后過濾；然后在濾液中加入庶糖和瓊脂粉，加熱溶解后，加海水定各，再經(jīng)滅菌后獲得海洋PDA斜面培養(yǎng)基。其中，馬鈴薯小塊煮沸時(shí)間為30min ;滅菌方法為121°C下放置25min ;馬鈴薯和海水的比例為200g馬鈴薯對(duì)應(yīng)IOOOmL海水；蔗糖和馬鈴薯的比例為20g蔗糖對(duì)應(yīng)200g馬鈴薯；瓊脂粉和馬鈴薯的比例為15-20g瓊脂粉對(duì)應(yīng)200g馬鈴薯； 加海水定容后培養(yǎng)基體積和馬鈴薯的比例為1000mL對(duì)應(yīng)200g馬鈴薯。前述發(fā)酵方法中的海洋PDA發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法為將馬鈴薯去皮切成小塊， 于海水中煮沸后過濾；然后在濾液中加入蔗糖，加熱溶解后，加海水定容，再經(jīng)滅菌后獲得海洋PDA發(fā)酵培養(yǎng)基。其中，馬鈴薯小塊煮沸時(shí)間為30min ;滅菌方法為121°C下放置 25min ;馬鈴薯和海水的比例為200g馬鈴薯對(duì)應(yīng)IOOOmL海水；蔗糖和馬鈴薯的比例為 20g蔗糖對(duì)應(yīng)200g馬鈴薯；加海水定容后培養(yǎng)基體積和馬鈴薯的比例為1000mL對(duì)應(yīng)200g 馬鈴薯。如上所述,本發(fā)明的海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701菌株發(fā)酵產(chǎn)物、 發(fā)酵產(chǎn)物的提取物具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的特點(diǎn)。因此，發(fā)酵產(chǎn)物、發(fā)酵產(chǎn)物的提取物用于治療阿爾茨海默病或治療阿爾茨海默病的藥物，或者可用于提取分離具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化合物用于治療阿爾茨海默病或治療阿爾茨海默病的藥物。該治療阿爾茨海默病的藥物包含上述發(fā)酵產(chǎn)物，或發(fā)酵產(chǎn)物的提取物，或由發(fā)酵產(chǎn)物的提取物提煉的提煉物。


圖I為海洋赭曲霉Aspergillus 圖2為海洋赭曲霉Aspergillus 圖3為海洋赭曲霉Aspergillus 圖4為海洋赭曲霉Aspergillus 圖5為海洋赭曲霉Aspergillus
ochraceus SH0701菌株的菌落形態(tài)。 ochraceus SH0701菌株的菌絲體。 ochraceus SH0701菌株的產(chǎn)抱結(jié)構(gòu)。 ochraceus SH0701菌株的分生抱子。 ochraceus SH0701菌株發(fā)酵液提取物對(duì)乙酰膽
堿酯酶的抑制活性。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實(shí)施例I 海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701 (CCTCC M 2012003)的分離
培養(yǎng)方法選擇性海洋PDA培養(yǎng)基200g馬鈴薯去皮切成2cm3左右小塊，于IOOOmL陳海水中煮沸30min，過濾，在濾液中加入20g蔗糖和15_20g瓊脂粉，用陳海水定容至1000mL，pH自然。分裝于250mL三角瓶中，于121°C滅菌25min。滅菌后，待冷至約45°C時(shí)，加入氨芐青霉素、硫酸鏈霉素的無菌水稀釋液(終濃度為100yg/mL)混合均勻后分別倒平板，冷卻后備用。海洋PDA斜面培養(yǎng)基200g馬鈴薯去皮切成2cm3左右小塊，于IOOOmL陳海水中煮沸30min，過濾，在濾液中加入20g蔗糖和15_20g瓊脂粉，加熱溶解后，用陳海水定容至 IOOOmL, pH自然。分裝于試管中，于121°C滅菌25min后,擺斜面,備用。從連云港燕尾港港口采集海底淤泥，取Ig海底淤泥懸浮在5mL無菌海水中。取上清液ImL加入盛有9mL無菌海水的大試管中充分混勻，然后從此試管中吸取ImL加入另一盛有9mL無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10' 10_2、10' 10_4、10_5、10_6不同稀釋度的溶液。從不同稀釋度的試管中吸取100 μ L溶液，小心地滴在選擇性海洋PDA培養(yǎng)基平板表面中央位置。用無菌玻璃涂布棒涂開，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5 10分鐘，使菌液浸入培養(yǎng)基。每個(gè)梯度涂4至5皿，作為重復(fù);該平板置于25_28°C培養(yǎng)4 7天；挑取單菌落接種于海洋PDA斜面培養(yǎng)基上即獲得純培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物在28 V培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后，放在4 V冰箱中保存。實(shí)施例2海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701 (CCTCC M 2012003)的發(fā)酵方法I、海洋PDA發(fā)酵培養(yǎng)基200g馬鈴薯去皮切成2cm3左右小塊，于IOOOml陳海水中煮沸30min,過濾,在濾液中加入20g鹿糖,用陳海水定容至1000ml,pH自然。分裝,于121 °C 滅菌25min,備用。2、海洋PDA斜面培養(yǎng)基200g馬鈴薯去皮切成2cm3左右小塊，于IOOOml陳海水中煮沸30min，過濾，在濾液中加入20g蔗糖和15_20g瓊脂粉，加熱溶解后，用陳海水定容至 1000ml, pH自然。分裝于試管中，于121°C滅菌25min后，擺斜面，備用。3、菌種活化取海洋赭曲霉(Aspergillus ochraceus SH0701)斜面保藏菌種,采用劃線法接種于海洋PDA斜面培養(yǎng)基上，在28°C條件下培養(yǎng)5天得到產(chǎn)生孢子的斜面培養(yǎng)物。利用此法將菌種連續(xù)活化三次以上備用。4、種子液制備移取5mL無菌陳海水到培養(yǎng)好的海洋赭曲霉斜面培養(yǎng)物上，在無菌條件下再用接種針刮取海洋赭曲霉孢子，制備海洋赭曲霉孢子懸液(IO7個(gè)/ml)。按5% 接種量，取海洋赭曲霉孢子懸液IOml，接種到已滅菌含有200mL海洋PDA培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于溫度為28°C、轉(zhuǎn)速150 180轉(zhuǎn)/分鐘的電熱全溫震蕩培養(yǎng)箱中，震蕩培養(yǎng)3天， 獲得種子液。5、發(fā)酵培養(yǎng)于50L通氣攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入30L海洋PDA發(fā)酵培養(yǎng)基，在121°C下滅菌30min后冷卻至28°C，按接種量5%接入種子液。在通氣量I : O. 5，溫度為28°C， 攪拌速度為250轉(zhuǎn)/分鐘條件，發(fā)酵7天，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。實(shí)施例3海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701 (CCTCC M 2012003)在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，從發(fā)酵產(chǎn)物提取具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的提取物的方法發(fā)酵液提取物的提取方法I.發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過管式離心機(jī)離心固液分離，得到發(fā)酵液和菌體。2.發(fā)酵液減壓蒸餾濃縮至原體積的三分之一后用等體積的乙酸乙酯萃取3次。3.乙酸乙酯層減壓干燥得到發(fā)酵液提取物。極性段提取物提取方法將上述得到的發(fā)酵液提取物以I : 5 (W/V)懸浮在水中，再采用液-液分配萃取法依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇按照I : I比例萃取，把發(fā)酵液提取物分成石油醚、 氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水5個(gè)極性段。極性段提取物分別為石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。菌體提取物提取方法a.將發(fā)酵液提取物提取方法中步驟I得到的.菌體在烘箱中50°C干燥得干燥的菌體。b.干燥的菌體按I : 20 (W/V)加入甲醇萃取3次，合并甲醇提取液。c.減壓蒸餾干燥得到菌體提取物。實(shí)施例4乙酰膽堿酯酶的抑制活性檢測(cè)本實(shí)施例測(cè)試實(shí)施例2中海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701發(fā)酵產(chǎn)物和實(shí)施例3中發(fā)酵液提取物、發(fā)酵液提取物的極性提取物及菌體提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性。發(fā)酵產(chǎn)物直接取發(fā)酵產(chǎn)物10 μ L進(jìn)行測(cè)試，發(fā)酵液提取物及干燥菌體提取物溶解在甲醇中配置成不同濃度的溶液，取樣品10 μ L進(jìn)行測(cè)試。I、活兔處死后迅速取出大腦，用冷生理鹽水將腦組織表面漂洗干凈，輕輕用濾紙吸干表面水份，稱重后按W/V為I : 4的比例與含有O. lmol/L磷酸緩沖液(PH值7. 4)混合，在冰浴條件下，用玻璃勻漿器充分勻漿后，裝入離心管中置于高速冷凍離心機(jī)在4°C條件下IOOOOr ·η η-1離心30min,取上清液，即得酶液,記錄體積并在4°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?、在96孔板中加入140 μ L的磷酸鹽緩沖溶液，10 μ L酶液，20 μ L顯色劑(DTNB)， 20 μ L底物(ATCI)和10 μ L待測(cè)物溶液。96孔板置于酶標(biāo)儀，在波長(zhǎng)412nm的可見光下， 每隔I. 5min記錄反應(yīng)液的A412nm值,持續(xù)9min。所有樣品都重復(fù)三次。以未加樣品孔(加入相應(yīng)體積的用培養(yǎng)基或甲醇)的光密度值作為100%，樣品測(cè)定孔的光密度與之比較，降低的百分率即為酶抑制率。在IC5tl測(cè)試中，每個(gè)樣品測(cè)5個(gè)濃度梯度對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性，通過化合物濃度對(duì)數(shù)對(duì)抑制率作圖求IC5tl值(抑制50%酶活性時(shí)化合物的濃度)。如圖5所示，發(fā)酵液提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，不同濃度下發(fā)酵液提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率見表I。其抑制乙酰膽堿酯酶的IC5tl值為 7. 8±2· 8 μ g/mL。表I不同濃度的發(fā)酵液提取對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用濃度(μ g/mL)抑制率(％)100096. 34±2. 1010085. 98±4. 271066. 97±0. 82I19. 96±7. 48O. I3. 17±3. 26O. 01I. 48±4. 75發(fā)酵培養(yǎng)過程中每隔12小時(shí)取樣監(jiān)測(cè)一次，如表2所示，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵開始時(shí)， 隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行發(fā)酵液的乙酰膽堿酯酶抑制活性迅速升高，發(fā)酵到2天時(shí)發(fā)酵液的乙酰膽堿酯酶抑制活性達(dá)到最高值。其后，發(fā)酵液的乙酰膽堿酯酶活性略有下降，但變化不大。表2不同發(fā)酵時(shí)間段發(fā)酵液對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性
發(fā)酵時(shí)間(h)抑制率(％ )0. 50. 58 ±0. 78I24. 60±7. 45I. 563. 94±4. 80281.62±1. 702. 576. 82±6. 51376. 626±5. 103. 571.88±2. 78471. 55±5. 894. 567. 51±4. 31583. 23±3. 975. 566. 10±5. 99667. 18±5. 616. 567. 53±2. 53
發(fā)酵液提取物用不同極性的溶劑分段后，各極性段的乙酰膽堿酯酶抑制活性不同 (見表3)，在5 μ g/mL濃度下，乙酸乙酯極性段具有最高的乙酰膽堿酯酶抑制活性，氯仿相次之。因此,海洋赭曲霉 Aspergillus ochraceus SH0701 (CCTCC M 2012003)發(fā)酵產(chǎn)物中的乙酰膽堿酯酶抑制劑主要分布在中等極性大小的極性段。干燥菌體提取物在100 μ g/mL 時(shí)對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率65. 2%。表3發(fā)酵液提取物的不同極性段對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性
抑制率(％)石油醚極性段51. 84±9· 07氯仿極性段65. 06±2· 46乙酸乙酯極性段71. 55±6· 27正丁醇極性段19. 02± I. 82水極性段5. 43±4· 46
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權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)乙酰膽堿酯酶抑制劑的真菌，分類命名為海洋赭曲霉Aspergillus ochraceus SH0701,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年I月10日，保藏編號(hào)為 CCTCC M 2012003。
2.一種具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)物由權(quán)利要求I所述的真菌發(fā)酵獲得。
3.一種具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的提取物，其特征在于，所述的提取物由權(quán)利要求 2所述的發(fā)酵產(chǎn)物提煉獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取物，其特征在于，所述的提取物是由權(quán)利要求2所述的發(fā)酵產(chǎn)物提煉獲得的發(fā)酵液提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取物，其特征在于，所述的提取物是由權(quán)利要求2所述的發(fā)酵產(chǎn)物提煉獲得的極性段提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取物，其特征在于，所述的提取物是由權(quán)利要求2所述的發(fā)酵產(chǎn)物提煉獲得的菌體提取物。
7.一種治療阿爾茨海默病的藥物，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的發(fā)酵產(chǎn)物或其提煉物，或包含權(quán)利要求3所述的提取物或其提煉物，或包含權(quán)利要求4所述的提取物或其提煉物，或包含權(quán)利要求5所述的提取物或其提煉物，或包含權(quán)利要求6所述的提取物或其提煉物。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵方法，其特征在于，包括菌種活化過程、種子液制備過程和發(fā)酵培養(yǎng)過程；所述菌種活化過程為取所述保藏菌種，采用劃線法接種于海洋PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)得到產(chǎn)生孢子的斜面培養(yǎng)物；所述種子液制備過程為將上述的斜面培養(yǎng)物加無菌陳海水后，在無菌條件下刮取孢子，制備孢子懸液；再將孢子懸液接種于海洋PDA培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)獲得種子液；所述發(fā)酵培養(yǎng)過程為在通氣攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入海洋PDA發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后，接入種子液攪拌發(fā)酵，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述的海洋PDA斜面培養(yǎng)基的配置方法為將馬鈴薯去皮切成小塊，于海水中煮沸后過濾；然后在濾液中加入蔗糖和瓊脂粉，加熱溶解后，加海水定容，再經(jīng)滅菌后獲得海洋PDA斜面培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述的海洋PDA發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法為將馬鈴薯去皮切成小塊，于海水中煮沸后過濾；然后在濾液中加入蔗糖，加熱溶解后,加海水定容,再經(jīng)滅菌后獲得海洋PDA發(fā)酵培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)乙酰膽堿酯酶抑制劑的真菌及其用途，分類命名為海洋赭曲霉Aspergillusochraceus SH0701，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年1月10日，保藏編號(hào)為CCTCCM2012003。該真菌發(fā)酵后得到的發(fā)酵產(chǎn)物、以及發(fā)酵液提取物和菌體提取物均有具有顯著的乙酰膽堿酯酶抑制活性。乙酰膽堿酯酶抑制活性的特性使得該真菌發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵產(chǎn)物的提取物可以用于制備治療阿爾茨海默病的藥物。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102586121SQ20121003998
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者劉煒瑋, 劉玉委, 史大華, 吳小兵, 張?chǎng)析? 徐加濤, 朱強(qiáng) 申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院