專(zhuān)利名稱(chēng)：一種聾病易感基因12S rRNA 1494C＞T熒光檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)聾病易感基因12S rRNA 1494C > T及Amelogenin基因座的熒光檢測(cè)試劑盒，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)對(duì)聽(tīng)力語(yǔ)言殘疾者進(jìn)行的致病因素研究表明，約60-80%患者的病因與遺傳因素有關(guān)，其中發(fā)達(dá)國(guó)家的臨床研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80%。 因此近十幾年來(lái)，遺傳性耳聾的發(fā)病機(jī)制及其分子流行病學(xué)的研究成為了聾病研究最重要的內(nèi)容之一。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進(jìn)步，聾病的分子遺傳學(xué)研究和分子流行病學(xué)的數(shù)據(jù)使研究者們逐步認(rèn)識(shí)到聾病易感基因突變?cè)诰S護(hù)聽(tīng)力健康和發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力異常中的重要性。藥物的耳毒性是導(dǎo)致語(yǔ)前聽(tīng)力損失的一個(gè)重要因素，部分與線(xiàn)粒體12S rRNA基因突變有關(guān)，在中國(guó)群體中發(fā)現(xiàn)了 12S rRNA基因1494C > T突變與藥物性耳聾的關(guān)系，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三個(gè)大的家系是由于1494C > T突變導(dǎo)致的。1494C > T突變者在出生時(shí)往往聽(tīng)力正常，很難通過(guò)聽(tīng)力篩查而被提前發(fā)現(xiàn)和預(yù)測(cè)，卻存在因耳毒性藥物的使用而發(fā)生聽(tīng)力損失的隱患。目前常用的基因檢測(cè)方法有直接測(cè)序(direct sequencing，DS)、連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing high performance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復(fù)性差、假陰性假陽(yáng)性多等問(wèn)題。采用熒光標(biāo)記技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過(guò)帶熒光標(biāo)記物的引物對(duì)12S rRNA 1494C > T位點(diǎn)特異性的擴(kuò)增，并在此引物中摻入核酸類(lèi)似物提高引物的Tm值，進(jìn)一步增強(qiáng)引物的特異性，而后經(jīng)毛細(xì)管電泳后分析PCR產(chǎn)物出峰情況，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)耳聾基因位點(diǎn)的檢測(cè)。該方法靈敏度高、判讀清晰準(zhǔn)確，僅需采取少量血樣或口腔拭子樣本，即可進(jìn)行檢測(cè)， 采樣方便尤其適合新生嬰幼兒樣本的采集。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種聾病易感基因12S rRNA 1494C > T熒光檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案一種聾病易感基因12S rRNA 1494C > T熒光檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增后的基因分型用試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，2對(duì)引物混合物以及超純水；所述擴(kuò)增后試劑包括用于基因分型的對(duì)應(yīng)于12S rRNA 1494C>T檢測(cè)和 Amelogenin性別鑒定基因座的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物的混合物和內(nèi)標(biāo)R0X-300 ；
使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)的條件PCR擴(kuò)增體系的pH值為
8.0-9. 0，鎂離子濃度為1.5-3. 5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300μΜ，Taq酶的用量為 O. 1-0. 4U/ μ L，2對(duì)引物混合物中的單對(duì)引物終濃度為O. 2-0. 4 μ M0使用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增 12S rRNA 1494C > T 和 Amelogenin 基因座。用于12S rRNA 1494C > T 突變檢測(cè)的引物為SEQ NO. 01 和 SEQ NO. 02。SEQ NO. 02為摻入了 LNA核苷的引物(LNA核苷以斜體字表示)SEQ NO. I :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’SEQ NO. 2 :5’ -GACACACCGCCCGTCTCT-3’用于Amelogenin基因座檢測(cè)的引物為SEQ NO. 03 5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’、SEQ NO. 04 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。所述的2對(duì)引物，其中每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，所用的熒光染料可以為相同或不同的熒光素。所述復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。其中所檢測(cè)的人基因組DNA為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對(duì)來(lái)源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ;所述的來(lái)源樣本為來(lái)源于人類(lèi)的濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液/痕、組織、羊水。使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在任何型號(hào)的PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序94-98°C l-5min ;26-32 個(gè)循環(huán)的 94-98°C 15_60s，55-65。。15-60s,72°C 15-60 ； 60 °C 30-60min。對(duì)于12S rRNA 1494C > T突變的檢出，使用的帶熒光標(biāo)記并經(jīng)LNA核苷單體摻入修飾的引物，提高了引物的Tm值，縮短了引物長(zhǎng)度，從而增加了引物的靈敏度和特異性，防止假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)。對(duì)于Amelogenin的檢出，一方面是內(nèi)參的作用指示模板DNA是否有效或濃度范圍；另一方面能有效指示是否存在PCR產(chǎn)物污染，防止因污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性。


圖I是經(jīng)修飾的引物對(duì)同一男性確證病例不同濃度DNA的分型結(jié)果。圖2是未修飾的引物對(duì)同一男性確證病例不同濃度DNA的分型結(jié)果。圖3是經(jīng)修飾的引物對(duì)同一男性正常個(gè)體不同濃度DNA的分型結(jié)果。圖4是未修飾的引物對(duì)同一男性正常個(gè)體不同濃度DNA的分型結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例I聾病易感基因12S rRNA 1494C > T熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)突變及正常個(gè)體的DNA 樣本，用于聾病易感基因12S rRNA 1494C > T檢測(cè)的引物、用于Amelogenin基因座擴(kuò)增的引物均采用黃色熒光染料TAMRA標(biāo)記；內(nèi)標(biāo)采用紅色熒光染料標(biāo)記，熒光標(biāo)記物為
4R0X。其中，用于聾病易感基因12S rRNA 1494C > T檢測(cè)的引物使用經(jīng)過(guò)LNA核苷單體摻入修飾的引物(SEQ NO. 2 :5，-GACACACCGCCCGTCTCT-3’ )和普通引物(SEQ NO. 2. O 5’ -GACACACCGCCCGTCTCT-3’ )進(jìn)行擴(kuò)增效果的比較。I、待測(cè)樣本100份，都已經(jīng)使用“DNA提取-PCR擴(kuò)增-測(cè)序”的技術(shù)方法對(duì)12S rRNA 1494位點(diǎn)進(jìn)行過(guò)測(cè)序檢測(cè)，其中突變樣本2份。2、檢材的基因組DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL離心管中，加入SdH2O ImL,振蕩離心，棄上清液，重復(fù)步驟兩次，棄上清液，將5% Chelex-IOO震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數(shù)秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數(shù)秒。95°C沸水浴 IOmin,輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min,上清中為提取的DNA。3、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析3. I PCR 擴(kuò)增體系
組分體積(pL)組分說(shuō)明Reaction Mix10含 pH 為 8.3 的 2.5xPCR 緩沖液、7.5 mM 的 MgCl2. 750 μΜ dNTP MixTaq 酶 (5υ/μΟIPrimers52組引物對(duì)(0.3uM): SEQ NO.01 5，- TAMRA -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3 ’ SEQ N0.2 S’-GACACACCGCCCGTCTCT-Y orSEQ N0.2.0 5，-GACACACCGCCCGTCTCT-3， SEQ N0.3: 5，-TAMRA-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3， SEQ N0.4·· 5，-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’模板0.2-5ng分別為 0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 ngSdH2O補(bǔ)足至 25.0μΙ,3. 2 PCR 擴(kuò)增程序
權(quán)利要求
1.一種聾病易感基因12S rRNA 1494C > T熒光檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其緩沖溶液、擴(kuò)增12S rRNA 1494C > T及Amelogenin基因座的引物、基因突變位點(diǎn) 12S rRNA 1494C > T和Amelogenin基因座的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于突變熱點(diǎn)12SrRNA 1494C>T檢測(cè)的引物為SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 ；SEQ NO. I :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’SEQ NO. 2 :5’ -GACACACCGCCCGTCTCT-3’ 其中LNA核苷以斜體字表示。<
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述Amelogenin基因座檢測(cè)的引物為SEQ NO. 3 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’SEQ NO. 4 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述12SrRNA 1494C > I'和 Amelogenin的檢測(cè)引物，每對(duì)引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述12SrRNA 1494C>T檢測(cè)的引物和用于Amelogenin基因座擴(kuò)增的引物可以米用相同或不同的突光染料標(biāo)記；內(nèi)標(biāo)選用不同于上述的突光染料標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述12SrRNA 1494C > T和 Amelogenin基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。
7.應(yīng)用權(quán)利要求I所述試劑盒檢測(cè)聾病易感基因12SrRNA 1494C > T的方法，其特征在于通過(guò)熒光引物PCR及毛細(xì)管電泳特異性檢測(cè)聾病易感基因12S rRNA 1494C > I'及 Amelogenin基因座；用于12S rRNA 1494C > T突變檢測(cè)的引物如SEQ NO. I和SEQ NO. 2所示；用于Amelogenin基因座檢測(cè)的引物如SEQ NO. 3,SEQ NO. 4所示；所述12S rRNA 1494C > T和Amelogenin基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)聾病易感基因12SrRNA1494C>T的熒光檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增前試劑和擴(kuò)增后試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴(kuò)增12SrRNA1494C>T及Amelogenin基因座的引物混合物；所述擴(kuò)增后試劑包括基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明以12SrRNA1494C>T、Amelogenin基因座為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)聾病易感基因的檢測(cè)，尤其是對(duì)新生兒耳聾基因的篩查具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586433SQ20121003310
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者萬(wàn)戈江, 夏子芳, 步訊, 魏宏泉 申請(qǐng)人:北京科聆金儀生物技術(shù)有限公司