專利名稱：一種用于有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及持久性有機氯污染土壤的原位修復(fù)，具體的說是一種用于有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的制備方法。
背景技術(shù)：
有機氯化物是一類毒性強、難降解的環(huán)境污染物，傳統(tǒng)處理技術(shù)存在著降解不完全、效率低等不足。納米技術(shù)的發(fā)展給有機氯污染物的處理帶來了一種新的頗具潛力的方法，即應(yīng)用納米還原性金屬顆粒對有機氯化物進行脫鹵，降低其毒性。目前，以Fe2+和Fe3+ 等常見原料合成納米鐵顆粒的技術(shù)已經(jīng)成熟，納米顆粒對有機氯污染物也顯示出高效的降解性能。更重要的是，其可靈活應(yīng)用于地下水和污染土壤的原位和異位修復(fù)，尤其適用于原位修復(fù)。
磁性納米微球是近年來發(fā)展起來的一種新型材料，不但具有普通納米粒子所具有的4個基本效應(yīng)(即表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、體積效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng))，還具有異常的磁學(xué)性質(zhì)，如超順磁性、高矯頑力、低居里溫度與高磁化率等特性。此外，將其與有機高分子材料結(jié)合，可對其表面進行修飾和改性，進一步調(diào)節(jié)其表面親水性(或疏水性)以及生物兼容性等。由于其具有以上特點，將其作為固定化載體，在環(huán)境工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。磁性固定化技術(shù)是指通過采用化學(xué)或物理的方法將微生物(或酶)定位于磁性固定化載體的限定空間區(qū)域內(nèi)，在固定化反應(yīng)結(jié)束后，再利用外部磁場對其進行分離，實現(xiàn)微生物 (或酶)保持活性并可反復(fù)使用的固定化技術(shù)。微生物(或酶)在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，但通常難以回收，循環(huán)使用次數(shù)較少。將磁性納米微球作為微生物(或酶)的固定化載體具有以下優(yōu)勢①磁性納米微球中含有有機高分子物質(zhì)，易實現(xiàn)其功能的調(diào)整，可根據(jù)固定化需求人為控制微球表面的功能基團可利用外部磁場控制磁性材料的運動方式，此舉既可替代傳統(tǒng)的機械攪拌，又可改善固定化微生物(或酶)的作用效果，同時便于將微生物(或酶)從反應(yīng)體系中分離和回收；③通過將固定有微生物(或酶)的磁性載體放入磁場穩(wěn)定的流動床反應(yīng)器中，大幅減少反應(yīng)體系中的人工操作，易實現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)。
制備磁性納米微球通常使用的磁性物質(zhì)有純鐵粉、羰基鐵、磁鐵礦、正鐵酸鹽、鐵鈷合金等，尤以Fe3O4磁流體居多。與磁性材料相結(jié)合的有機材料中天然高分子材料有殼聚糖、葡聚糖、明膠、纖維素、淀粉、環(huán)糊精等，合成高分子材料有聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸等。其中天然高分子材料因具有價廉易得、生物相容性好、可被生物降解等優(yōu)點，得到了廣泛的研究和應(yīng)用。
采用固定化技術(shù)將各種生物酶固定在載體上用于生物醫(yī)學(xué)、食品釀造或污水處理已有一些研究，但將降解菌固定化磁性納米微球用于污染土壤的生物修復(fù)則未見報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的制備方法，即以納米Fe3O4顆粒為載體吸附固定有機氯降解菌，將得到的磁性納米生物微球用于污染土壤的原位修復(fù)，納米Fe3O4的還原脫氯作用可使有機氯的毒性降低，微生物的共代謝作用加速有機氯的降解，最終實現(xiàn)土壤中殘留有機氯的高效去除。
本發(fā)明所述用于有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的制備方法，包括納米 Fe3O4顆粒的制備，以及如下步驟
(I)將l_2g殼聚糖溶解在IOOmL質(zhì)量濃度為15_20%的醋酸溶液中，形成均一透明的膠體溶液，再將5-10g制備的納米Fe3O4顆粒加入,攪拌20-30min,得到磁性納米顆粒， 用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，烘干待用；
(2)將步驟(I)制得的磁性納米顆粒，加入到pH = 5. 0-8. 0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中，超聲分散得到質(zhì)量濃度為0. 2-0. 5g/mL的磁流體；
(3)取步驟⑵所述的磁流體，加入其體積量0. 5-2倍的菌體濃度為IO5-IO7個/ ml的細(xì)菌溶液，再滴加其體積量0. 5-2倍的質(zhì)量濃度為2-5%的交聯(lián)劑溶液，充分混勻后在 250C _30°C溫度條件下，交聯(lián)0. 5-1. 5h，在外磁場作用下固液分離，然后用蒸餾水洗滌固相產(chǎn)物3-4次，得到磁性納米生物微球；所述細(xì)菌溶液是假單胞菌、芽孢桿菌、紅球菌、無色桿菌中的一種或多種混合。
本發(fā)明制備方法，作為優(yōu)先，納米Fe3O4顆粒的制備采用共沉淀法，所述共沉淀法是以氨水作為沉淀劑，氮氣保護下加入FeCl3與FeCl2，其中Fe3+ Fe2+ 0H_的摩爾比為 2:1: 8，化學(xué)反應(yīng)的方程式是2Fe3++Fe2++80H_ = Fe304+4H20 ;反應(yīng)后經(jīng)冷凍干燥得表面吸附氨基的納米Fe3O4顆粒。
作為優(yōu)先所述檸檬酸-磷酸緩沖溶液pH為5. 5-6. 0 ;所述磁流體的質(zhì)量濃度為0.3-0. 4g/mL。
所述細(xì)菌溶液的加入量是磁流體體積量的0. 5-1. 5倍。
所述交聯(lián)劑溶液的滴加量是磁流體體積量的0. 5-1. 5倍。
所述交聯(lián)劑溶液選自羧甲基纖維素、海藻酸鈉、3 -環(huán)糊精、淀粉中的一種，其質(zhì)量濃度為2% -5%。
所述交聯(lián)溫度是30°C，交聯(lián)時間是I. Oh。
本發(fā)明的原理是
土壤中毒性強的有機氯污染物難以被自然降解和微生物利用，而通過納米顆粒鐵對土壤中有機氯污染物的高效還原脫氯作用，進而促進微生物降解菌對化學(xué)降解過程中一些中間產(chǎn)物的利用，提高了土壤有機氯污染物的降解效率。
采用固定化技術(shù)將有機氯降解菌固定在載體上使用，可以達到增強菌體活性、提高降解效率的目的。納米Fe3O4具有生物降解性、無毒性、惰性、抗菌性、對重金屬的鰲合作用、凝膠成型性質(zhì)、親水性以及對蛋白質(zhì)顯著的親和性等特性，常用作微生物固定化的載體。
本發(fā)明方法將殼聚糖的醋酸水溶液和Fe3O4納米磁粉分散于適當(dāng)?shù)挠袡C介質(zhì)中， 形成細(xì)小的殼聚糖微粒，在交聯(lián)劑的作用下與細(xì)菌作用，從而交聯(lián)形成高微生物載量的固定化菌。整個過程中微生物活力喪失少，操作簡便易行，所得固定化微生物性質(zhì)穩(wěn)定，活性聞。
磁性Fe3O4微球具有磁響應(yīng)性，在外加磁場的作用下可以很方便地分離，避免了由于攪拌而造成對載體和微生物的破壞；粒徑小，表面積大，表面特性多樣，易于吸附，可以通過共聚、表面改性，賦予其表面多種反應(yīng)性功能基團(如-OH、-C00H、-CHO, -NH2, -SH等)， 進而可以結(jié)合各種酶、細(xì)胞、抗體等生物活性物質(zhì)。一些嗜磁病毒和菌種，如常見的大腸桿菌就很喜歡吸附在磁性粒子表面上；近年發(fā)現(xiàn)并研究較多的趨磁細(xì)菌則由于能從生活水環(huán)境中吸收磁鐵礦成分并在細(xì)胞內(nèi)合成具超順磁性的磁小體，因而具有沿磁場方向移動的固有特性。
納米Fe3O4顆粒對微生物固定化的過程中，靜電引力、范德華力、疏水作用力及表面粗糙程度都會影響細(xì)菌在磁性微球表面的吸附。當(dāng)體系pH = 5. 5 6. 0時，靜電吸引力可能起到主導(dǎo)作用。這是因為細(xì)菌的等電點(Pl) —般在2 5，其中革蘭氏陽性菌一般為 2 3、革蘭氏陰性菌為4 5。當(dāng)體系的pH值大于等電點時，細(xì)菌帶負(fù)電荷。納米Fe3O4磁顆粒表面顯示其既具有Lewis堿又具有Lewis酸特性，在酸性環(huán)境中磁顆粒帶正電荷。因此，體系pH = 5. 5 6. 0時,磁顆粒正好帶正電荷,而細(xì)菌帶負(fù)電荷,從而能顯著增加吸附率。此外，與塊體材料相比，由于納米材料具有更多的角、邊和離子空穴，所以有著更大的吸附容量。納米磁顆粒具有比表面積大、吸附容量大、磁響應(yīng)性強、易于分離等優(yōu)點，在細(xì)菌的非特異性吸附分離和富集方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
殼聚糖是自然界大量存在的天然陽離子生物聚合物，具有良好的生物相容性、可降解性，其分子鏈上豐富的羥基和氨基使其易于進行化學(xué)修飾而被賦予多種功能。
海藻酸鈉是一種從海藻中提取的親水性膠態(tài)多聚糖，它是由P-l，4-D型甘露糖醛酸和a -1,4-L型古羅糖醛酸組成的線性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和羥基， 可溶于不同溫度的水中。海藻酸鈉可生物降解，生物相容性好，穩(wěn)定、無毒、成膜性或成球性較好，是常用的載體材料。
￠-環(huán)糊精是由7個葡萄糖分子以a _1，4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖，其非極性的疏水空腔可以范德華力、疏水作用力和氫鍵等與分子間尺寸相匹配的許多疏水性客體分子或某些客體分子的疏水性基團形成穩(wěn)定的超分子包結(jié)化合物。
淀粉是一種多糖，分子式為(C6HltlO5)n，是白色顆粒狀的固體，其顆粒大小，形狀及水溶性因其來源和結(jié)構(gòu)不同而異。淀粉是植物界中存在的極為豐富的有機化合物，大量存在于植物的種子、根、莖等部位。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
I.磁性納米生物微球形狀均一，制作簡單，使用方便。
磁性納米Fe3O4顆粒作為微生物固定化載體，具有較大的比表面積，能有效地提高載菌量，表面帶有一定的正電荷，便于吸附弱負(fù)性的微生物；較小的顆粒直徑，具有很小的擴散限制，在溶液中能穩(wěn)定存在；較少的質(zhì)量傳遞阻力和較少的污染；利用外加磁場，很容易從混合物中分離包被的細(xì)菌。含有有機功能基團的有機分子和聚合物被引入到磁性納米Fe3O4顆粒的表面，然后通過多種方式將細(xì)菌鍵合，得到磁性納米生物微球。該方法快速簡便、成本低，經(jīng)磁性納米顆粒固定化的微生物對溫度、PH等表現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性。
2.磁性納米生物微球的微生物活性高。
納米Fe3O4顆粒具有良好的生物相容性，作為微生物的載體基本上不會對微生物造成損傷。納米Fe3O4的磁場能刺激細(xì)菌的生長，并促進微生物生長掛膜和新陳代謝，另外還可提高微生物細(xì)胞膜的通透性，使水和氧分子等易于進入細(xì)胞。磁致生物效應(yīng)能誘導(dǎo)微生物的酶活和酶合成，提高細(xì)菌的活性，對細(xì)菌降解有機污染物有明顯的促進作用，縮短細(xì)菌降解污染物質(zhì)的周期。
3.磁性納米生物微球?qū)ν寥烙袡C氯去除效果好。
將納米Fe3O4顆粒固定有機氯降解菌的磁性納米生物微球用于污染土壤的原位修復(fù)，包含納米Fe3O4催化脫氯-微生物協(xié)同降解，納米Fe3O4的還原脫氯作用可使有機氯的毒性降低，微生物的共代謝作用加速有機氯的降解，從而實現(xiàn)土壤中殘留有機氯完全降解。


圖I為阿特拉津降解菌在實施例I磁性納米微球上的生長曲線
圖2為多氯聯(lián)苯降解菌在實施例I磁性納米微球上的生長曲線具體實施方式
實施例I
(I)用共沉淀法制備納米Fe3O4，共沉淀法是以氨水作為沉淀劑，氮氣保護下加入FeCl3與FeCl2，其中Fe3+ Fe2+ 0H_的摩爾比為2 I 8，化學(xué)反應(yīng)的方程式是 2Fe3++Fe2++80r = Fe304+4H20 ;反應(yīng)后經(jīng)冷凍干燥得表面吸附氨基的納米Fe3O4顆粒；
(2)將Ig殼聚糖溶解在IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的醋酸溶液中，形成均一透明的膠體溶液，再將5g已制備的納米Fe3O4顆粒加入,攪拌20min,得到磁性納米顆粒,用蒸懼水反復(fù)洗滌至中性，烘干待用；
(3)將制得的磁性納米顆粒，加入到0. IM pH = 5. 0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中， 超聲分散得到質(zhì)量濃度為0. 5g/mL的磁流體；
(4)用接種環(huán)將保存在斜面培養(yǎng)基上的假單胞菌(Pseudomonas sp.),接入到液體種子培養(yǎng)基(其組分重量比是葡萄糖I. 25%，牛肉膏0.25%，NH4NO3 0.1%, MgSO4 IW2O0.02%，KCl 0. 02%, pH 7. 0-7. 2)中，在搖床轉(zhuǎn)速 130-150r/min、28-30°C 條件下，培養(yǎng) 20-24h，制得細(xì)菌種子液，菌體濃度為IO5-IO7個/ml。
(5)按照總質(zhì)量1000g，稱取50g羧甲基纖維素，溶于蒸餾水中，pH值自然，制得質(zhì)量濃度為5%的交聯(lián)劑溶液。
(6)取步驟⑶所述的磁流體，加入其體積量0. 5倍的菌體濃度約IO7個/ml的細(xì)菌溶液，再滴加其體積量0. 5倍的質(zhì)量濃度為5%的羧甲基纖維素交聯(lián)劑溶液，充分混勻后在25°C溫度條件下，交聯(lián)I. 5h，在外磁場作用下固液分離，然后用蒸餾水洗滌固相產(chǎn)物3 次,得到磁性納米生物微球。
(7)將制得的磁性納米生物微球投加比5% (指生物微球占土壤的質(zhì)量百分比，下同)，當(dāng)土壤中有機氯除草劑阿特拉津的初始濃度為30mg/kg時,修復(fù)35d,阿特拉津的去除率為67%。
實施例2
與實施例I不同之處在于
所述磁性納米顆粒是將2g殼聚糖溶解在IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 %的醋酸溶液中，形成均一透明的膠體溶液，再將IOg已制備的納米Fe3O4顆粒加入,攪拌30min制得。
將制得的磁性納米生物微球投加比5%，當(dāng)土壤中有機氯除草劑阿特拉津的初始濃度為30mg/kg時，修復(fù)35d，阿特拉津的去除率為65%。
實施例3
與實施例I不同之處在于
所述磁流體的質(zhì)量濃度為0. 4g/mL, pH = 6. 0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液。
所述菌種為芽孢桿菌(Bacillus sp.)加入為磁流體體積量I倍的菌體濃度約IO6 個/ml的細(xì)菌溶液。
所述交聯(lián)劑為磁流體體積量2倍的質(zhì)量濃度2%海藻酸鈉，交聯(lián)時間lh，交聯(lián)溫度 30。。。
將制得的磁性納米生物微球投加比2%，當(dāng)土壤中有機氯除草劑2，4-D的初始濃度為30mg/kg時，修復(fù)35d，2，4-D的去除率為55%。
實施例4
與實施例I不同之處在于
所述磁流體的質(zhì)量濃度為0. 3g/mL, pH = 7. 0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液。
所述菌種為紅球菌(Rhodococcus sp.)加入為磁流體體積量2倍的菌體濃度約 IO7個/ml的細(xì)菌溶液。
所述交聯(lián)劑為磁流體體積量I. 5倍的質(zhì)量濃度3% ^ -環(huán)糊精，交聯(lián)時間lh，交聯(lián)溫度30°C。
將制得的磁性納米生物微球投加比5%，當(dāng)土壤中多氯聯(lián)苯PCB77的初始濃度為 4mg/kg時，修復(fù)28d，PCB77的去除率為63%。
實施例5
與實施例I不同之處在于
所述磁流體的質(zhì)量濃度為0. 2g/mL, pH = 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液。
所述菌種為無色桿菌(Achromobacter sp.)。加入為磁流體體積量I. 5倍的菌體濃度約IO7個/ml的細(xì)菌溶液。
所述交聯(lián)劑為磁流體體積量I倍的質(zhì)量濃度4%淀粉，交聯(lián)時間0. 5h,交聯(lián)溫度 25。。。
將制得的磁性納米生物微球投加比2%，當(dāng)土壤中多氯聯(lián)苯PCB28的初始濃度為 4mg/kg時，修復(fù)28d，PCB28的去除率為52%。
實施例6
與實施例不同之處在于
所述菌種為假單胞菌、芽孢桿菌兩種組合，加入為磁流體體積量I. 5倍的菌體濃度約IO7個/ml的細(xì)菌溶液。
將制得的磁性納米生物微球投加比2%，當(dāng)土壤中多氯聯(lián)苯PCB28的初始濃度為 4mg/kg時，修復(fù)28d，PCB28的去除率為55%。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
權(quán)利要求
1.一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球制備方法，包括納米 Fe3O4顆粒的制備，其特征在于還包含如下步驟(1)將l_2g殼聚糖溶解在IOOmL質(zhì)量濃度為15-20%的醋酸溶液中，形成均一透明的膠體溶液，再將5-10g制備的納米Fe3O4顆粒加入,攪拌20-30min,得到磁性納米顆粒,用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，烘干待用；(2)將步驟⑴制得的磁性納米顆粒，加入到pH= 4. 0-8. 0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中，超聲分散得到質(zhì)量濃度為0. 2-0. 5g/mL的磁流體；(3)取步驟(2)所述的磁流體，加入其體積量0.5-2倍的菌體濃度為IO5-IO7個/ml 的細(xì)菌溶液，再滴加其體積量0. 5-2倍的質(zhì)量濃度為2-5%的交聯(lián)劑溶液，充分混勻后在 250C -30°C溫度條件下，交聯(lián)0. 5-1. 5h，在外磁場作用下固液分離，然后用蒸餾水洗滌固相產(chǎn)物3-4次，得到磁性納米生物微球；所述細(xì)菌溶液是假單胞菌、芽孢桿菌、紅球菌、無色桿菌中的一種或多種混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球制備方法，其特征在于，所述共沉淀法是以氨水作為沉淀劑，氮氣保護下加入FeCl3與FeCl2, 其中Fe3+ Fe2+ 0H_的摩爾比為2 I 8，化學(xué)反應(yīng)的方程式是2Fe3++Fe2++80H_ = Fe304+4H20 ;反應(yīng)后經(jīng)冷凍干燥得表面吸附氨基的納米Fe3O4顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的制備方法，其特征在于所述檸檬酸-磷酸緩沖溶液PH為5. 5-6. 0 ;所述磁流體的質(zhì)量濃度為 0.3-0. 4g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求制備方法，其特征在于
5.根據(jù)權(quán)利要求制備方法，其特征在于
6.根據(jù)權(quán)利要求制備方法，其特征在于的一種，其質(zhì)量濃度為I所述一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的 :所述細(xì)菌溶液的加入量是磁流體體積量優(yōu)選為0. 5-1. 5倍。I所述一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的 :所述交聯(lián)劑溶液的滴加量是磁流體體積量的0. 5-1. 5倍。I所述一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的 :所述交聯(lián)劑溶液選自羧甲基纖維素、海藻酸鈉、3 -環(huán)糊精、淀粉中 2% -5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的制備方法，其特征在于所述交聯(lián)溫度是30°C，交聯(lián)時間優(yōu)選是I. Oh。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于持久性有機氯污染土壤修復(fù)的磁性納米生物微球的制備方法，包括(1)用共沉淀法制備表面吸附氨基的納米Fe3O4顆粒；(2)將殼聚糖溶解在醋酸溶液中形成均一透明的膠體溶液，再與納米Fe3O4顆?；旌蠑嚢?，得到磁性納米顆粒；(3)將制得的磁性納米顆粒，加入到檸檬酸緩沖溶液中，超聲分散得到磁流體；(4)將磁流體加入到細(xì)菌溶液，再滴加交聯(lián)液進行吸附-交聯(lián)，在外磁場作用下固液分離，得到磁性納米生物微球。本發(fā)明方法快速、簡便、廉價，所得磁性納米生物微球具有形狀均一、比表面積大及微生物活性高等特點，適用于有機氯污染物降解及污染土壤的原位修復(fù)。
文檔編號C12N11/10GK102533716SQ20121001910
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者劉小紅, 司友斌, 司雄元, 張進霞 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)