專利名稱：一種流感病毒疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種流感病毒疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
流感病毒感染導(dǎo)致急性呼吸道傳染病-流行性感冒，給人類健康和社會生活造成嚴(yán)重危害。流感病毒類型多、變異快，當(dāng)新亞型病毒出現(xiàn)時，人群特異性免疫往往難以奏效。接種流行株疫苗是預(yù)防流感流行、保護(hù)易感人群最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。目前獲得批準(zhǔn)生產(chǎn)的流感疫苗主要是雞胚來源的滅活疫苗，這種疫苗存在諸多不足，如生產(chǎn)成本高、周期長，過敏反應(yīng)，雞胚連續(xù)傳代可導(dǎo)致病毒抗原性變異，雞胚還存在可能的外源因子的污染等，特別是如果禽流感爆發(fā)，雞群大量死亡，雞胚供應(yīng)及產(chǎn)量會成為瓶頸。因此，世界衛(wèi)生組織積極推薦各國發(fā)展哺乳細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒疫苗的制備。目前，多種哺乳細(xì)胞被應(yīng)用于一些病毒性疫苗的生產(chǎn)，Vero細(xì)胞全球公認(rèn)，MDCK 細(xì)胞美國、歐洲認(rèn)可。而MDCK細(xì)胞又被公認(rèn)為是培養(yǎng)流感病毒最合適的細(xì)胞系，該細(xì)胞比目前所知的其他細(xì)胞對流感病毒更敏感，短時間即可獲得較高滴度的病毒，同時保持流感病毒抗原的穩(wěn)定性，但MDCK細(xì)胞對于每年WHO發(fā)布的流感疫苗病毒株不是全能的敏感， 而使得生產(chǎn)的病毒滴度仍有不確定性已成為疫苗生產(chǎn)的瓶頸。有文獻(xiàn)報道同種哺乳細(xì)胞表面存在的流感病毒受體的類型和數(shù)量是不同的(Govorkova EA，Murti G, Meignier B, Taisne C DE, Webster RG.African Green Monkey Kidney (Vero) Cells Provide an AlternativeHost Cell System for Influenza A and B Viruses. J Virol,1996, 70 (8) 5519-5524.)，因此，建立細(xì)胞單克隆庫，篩選病毒敏感的單克隆株，獲得病毒適應(yīng)性細(xì)胞單克隆，提高病毒產(chǎn)量，可為工業(yè)化生產(chǎn)流感疫苗奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種流感病毒疫苗的制備方法，提高流感病毒產(chǎn)量，使其適用于工業(yè)化生產(chǎn)。一種流感病毒疫苗的制備方法，按照如下步驟進(jìn)行(1)哺乳動物細(xì)胞單克隆庫的建立將哺乳動物細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至匯合度70-90%，用含EDTA的胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，取100個細(xì)胞稀釋至20ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻，接種于96孔板，每孔 200 μ 1，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至40-60%匯合度，消化后轉(zhuǎn)移至M孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每一株單克隆化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一孔，待長至85-95%匯合度后消化、轉(zhuǎn)移至兩個M孔中繼續(xù)培養(yǎng)，待長至85-95%匯合度將細(xì)胞進(jìn)行凍存；(2)病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株的篩選取單克隆細(xì)胞接種至M孔板，培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2-6次，加入流感病毒及TPCK-TrypSin，37°C培養(yǎng)48_90h后測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的血凝滴度，血凝滴度大于28 為病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株；
(3)優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件取病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株鋪至M孔板中，培養(yǎng)過夜，分別優(yōu)化病毒培養(yǎng)的溫度、收獲時間、添加TPCK-Trypsin的量和感染指數(shù)MOI，獲得病毒在病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株中最佳生長參數(shù)；(4)在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株，培養(yǎng)48_90h后收集培養(yǎng)液，收集的培養(yǎng)液經(jīng)超濾膜包濃縮、蔗糖密度梯度離心純化、超離脫糖、滅活，測定血凝素含量后配制成單價或多價流感疫苗。所述哺乳動物細(xì)胞為狗腎細(xì)胞MDCK、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero、PER. C6細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞。所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒或具有流感病毒表型的重配病毒株。所述生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株的方式為微載體懸浮培養(yǎng)或無載體懸浮培養(yǎng)。所述微載體懸浮培養(yǎng)中的微載體為葡聚糖微載體，用量為10_20g/L。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過建立細(xì)胞單克隆庫、篩選病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株、應(yīng)用大規(guī)模生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)流感病毒疫苗，克服傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)流感疫苗生產(chǎn)成本高、周期長，過敏反應(yīng)、雞胚連續(xù)傳代可導(dǎo)致病毒抗原性變異等缺點(diǎn)，大大提高病毒產(chǎn)量，安全、有效、穩(wěn)定。


圖1為MDCK單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)甲型Hmi流感病毒疫苗株的血凝滴度檢測。圖2為大規(guī)模培養(yǎng)的病毒適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株在微載體cytodex 3上生長的顯微照片。圖3為細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒純化后的電鏡照片。圖4為細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒純化后SDS-PAGE電泳圖；圖中，M-蛋白marker、1-細(xì)胞來源的Hmi流感病毒、2-雞胚來源的Hmi流感病
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1以篩選甲型Hmi流感病毒疫苗株(A/reassortant/NYMC X-179A)高適應(yīng)性MDCK 細(xì)胞單克隆株、應(yīng)用該單克隆細(xì)胞株生產(chǎn)單價甲型Hmi流感病毒疫苗為例。(I)MDCK細(xì)胞單克隆庫的建立將從美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)弓丨進(jìn)的MDCK細(xì)胞(p = 53)在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至匯合度80 %，用含EDTA的胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，取100個細(xì)胞稀釋至 20ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻，接種于96孔板，每孔200 μ 1，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日觀察，適時換液，待細(xì)胞長至50%匯合度，消化后轉(zhuǎn)移至M孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每一株單克隆化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一孔，待長至90%匯合度后消化、轉(zhuǎn)移至兩個M孔中繼續(xù)培養(yǎng)，待長至90%匯合度取適量細(xì)胞進(jìn)行凍存，建立MDCK細(xì)胞單克隆庫。(2)篩選病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株取相同數(shù)量的單克隆細(xì)胞接種至M孔板，培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入以細(xì)胞維持液稀釋的等量流感病毒(10 μ 1)及1 μ g/ml TPCK-Trypsin，37°C培養(yǎng)7 后測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的血凝滴度，血凝滴度大于28為流感病毒適應(yīng)性細(xì)胞株M77(圖1)。(3)優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件取相同數(shù)量的獲得的流感病毒高適應(yīng)細(xì)胞株(M77)鋪至M孔板中，培養(yǎng)過夜， 分別優(yōu)化病毒培養(yǎng)的溫度、收獲時間、添加TPCK-Trypsin的量及感染指數(shù)(Μ0Ι = 0. 001， 0. 005,0.01,0. 025,0. 1,0. 25,0. 5,1,1. 5，2，3，5，7)，獲得流感病毒在適應(yīng)株中最佳生長參數(shù)，從而獲得更多流感病毒。流感病毒最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為37°C，添加1 μ g/ml TPCK-Trypsin，感染指數(shù)MOI介于0. 001至0. 005間，病毒收獲時間為72h。(4)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞以培養(yǎng)流感病毒及疫苗制備使用的主要設(shè)備是美國NBS公司7. 5L生物反應(yīng)器，工作體積為4L。在生物反應(yīng)器罐體中加入40g cytodex 3型微載體(GE Healthcare)，同時加入2L磷酸鹽緩沖液PBS，8磅高壓40min，排空PBS，加入10 %胎牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速、溫度和通氣，預(yù)培養(yǎng)過夜。消化4個10層細(xì)胞工廠的細(xì)胞接種入罐內(nèi)，將培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為65rpm，溶氧設(shè)為40%，pH設(shè)為7. 4，進(jìn)行培養(yǎng)，間隔他測定培養(yǎng)液中葡萄糖含量，當(dāng)葡萄糖含量<lg/L時排出罐內(nèi)培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿微載體(圖2)， 全部排空罐內(nèi)培養(yǎng)液，用Hank's液將罐體和微載體洗3次，加入含1 μ g/ml TPCK-Trypsin 的細(xì)胞維持液4L，同時接種流感病毒(感染指數(shù)MOI = 0. 001-0. 005)。間隔他測定維持液葡萄糖濃度，低于lg/L時補(bǔ)加葡萄糖至4g/L，72h后收集病毒培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含有高濃度流感病毒(圖幻。收獲的病毒培養(yǎng)液經(jīng)300kD分子量超濾膜包濃縮、蔗糖密度梯度離心純化(純化后的電泳檢測如圖4所示)、超離脫糖、甲醛滅活、Triton X_100裂解，單擴(kuò)測定血凝素含量，按照15 μ g HA (血凝素)/劑配制成流感疫苗。
權(quán)利要求
1.一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行(1)哺乳動物細(xì)胞單克隆庫的建立將哺乳動物細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至匯合度70-90%，用含EDTA的胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，取100個細(xì)胞稀釋至20ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻，接種于96孔板，每孔 200 μ 1，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至40-60%匯合度，消化后轉(zhuǎn)移至M孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每一株單克隆化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一孔，待長至85-95%匯合度后消化、轉(zhuǎn)移至兩個M孔中繼續(xù)培養(yǎng)，待長至85-95%匯合度將細(xì)胞進(jìn)行凍存；(2)病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株的篩選取單克隆細(xì)胞接種至M孔板，培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2-6次，加入流感病毒及 TPCK-TrypSin，37°C培養(yǎng)48_90h后測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的血凝滴度，血凝滴度大于28為病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株；(3)優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件取病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株鋪至M孔板中，培養(yǎng)過夜，分別優(yōu)化病毒培養(yǎng)的溫度、 收獲時間、添加TPCK-Trypsin的量和感染指數(shù)Μ0Ι，獲得病毒在病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株中最佳生長參數(shù)；(4)在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株，培養(yǎng)48-90h后收集培養(yǎng)液，收集的培養(yǎng)液經(jīng)超濾膜包濃縮、蔗糖密度梯度離心純化、超離脫糖、滅活，測定血凝素含量后配制成單價或多價流感疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述哺乳動物細(xì)胞為狗腎細(xì)胞MDCK、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero、PER. C6細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒或具有流感病毒表型的重配病毒株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒高適應(yīng)性細(xì)胞單克隆株的方式為微載體懸浮培養(yǎng)或無載體懸浮培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述微載體懸浮培養(yǎng)中的微載體為葡聚糖微載體，用量為10-20g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域的一種流感病毒疫苗的制備方法。該方法首先將哺乳動物細(xì)胞單克隆化，建立單克隆細(xì)胞庫，然后篩選流感病毒適應(yīng)的單克隆化細(xì)胞株，然后優(yōu)化病毒適應(yīng)性細(xì)胞株培養(yǎng)病毒條件，最后將病毒適應(yīng)性細(xì)胞株在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至一定密度時接種流感病毒，參照優(yōu)化后的病毒培養(yǎng)條件培養(yǎng)病毒，病毒收獲后進(jìn)行濃縮、純化、滅活和裂解，測定血凝素含量，制備流感病毒疫苗。本發(fā)明的方法大大提高病毒產(chǎn)量，安全、有效、穩(wěn)定。
文檔編號C12N5/071GK102526720SQ20121000768
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者劉坤, 姚志東, 張良艷, 王希良, 邢麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所