專利名稱：一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母重組菌株，該菌株表達(dá)了克隆自谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium glutamicum的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE的表達(dá)提高了釀酒酵母菌株對木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。本發(fā)明還涉及該木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的菌株在構(gòu)建可代謝木糖的重組釀酒酵母中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，能源緊缺問題受到世界各國的廣泛關(guān)注，用可再生資源生產(chǎn)能源物質(zhì)來代替非再生的化石資源對未來社會可持續(xù)發(fā)展具有重大的意義。我國，以農(nóng)業(yè)廢棄物為主的木質(zhì)纖維素原料是年產(chǎn)量巨大的可再生生物質(zhì)資源，以之作為新能源物質(zhì)的生產(chǎn)原料對促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展和保障國家安全具有戰(zhàn)略意義。木質(zhì)纖維素原料水解后，會產(chǎn)生大量單糖，其中，主要成分是葡萄糖，其次是木糖和阿拉伯糖。木糖在水解液中含量可達(dá)到總糖的30%， 其有效利用是木質(zhì)纖維素實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)化大生產(chǎn)的必要條件。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是廣泛使用于食品及化工工業(yè)的生產(chǎn)菌株，具有抗逆性強(qiáng)、發(fā)酵條件易控制、遺傳背景清楚、食品級安全等許多優(yōu)良特性，是優(yōu)秀的細(xì)胞工廠菌株。但天然的釀酒酵母菌株并不能發(fā)酵木糖。不同來源木糖代謝途徑的引入可以使釀酒酵母利用木糖，但利用效率仍舊不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。制約酵母對木糖利用的瓶頸問題主要有兩個①酵母木糖代謝效率還有待進(jìn)一步提高；②酵母對木糖的攝取效率偏低。天然的釀酒酵母通過非特異性己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(主要有Hxtl、Hxt2、Hxt4、Hxt5和 Hxt7)和半乳糖透性酶(GaU)攝取木糖，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都屬于主要易化子超家族(Major Facilitator SuperfamiIy，MFS)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對木糖的親和性較低，其Km值是葡萄糖的10 100倍，因此，木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)受到葡萄糖的強(qiáng)烈抑制。異源表達(dá)高親和力木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或提高現(xiàn)有木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親和力，對提高釀酒酵母的木糖代謝的研究十分重要。到目前為止，已報道了部分真菌來源的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母中的異源表達(dá)，并且可以促進(jìn)菌株對木糖的利用，例如，來源于間型假絲酵母(Candida intermedia)的focfl、樹干畢赤酵母 (Pichia stipitis)的 Sutl 和擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的 At5g5920 等，但要滿足構(gòu)建高效木糖利用重組釀酒酵母的需求，尚需要對木糖的親和力更高的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。2009 年，Hideo等人從十種谷氨酸棒狀桿菌中篩選到了一株可利用阿拉伯糖為唯一碳源的菌株 Corynebacterium glutamicum ATCC31831，其利用阿拉伯糖的能力是利用葡萄糖的2倍，在此種菌株中不受葡萄糖代謝抑制(CCR機(jī)制)的影響。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)了具有高活性阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且此轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對木糖的利用同樣有較明顯的促進(jìn)作用。推測，此蛋白在谷氨酸棒狀桿菌中是戊糖誘導(dǎo)的高親和性質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在低濃度阿拉伯糖和木糖培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運(yùn)效果明顯，其超表達(dá)可使谷氨酸棒狀桿菌的戊糖消耗速率提高3 倍，可使戊糖與葡萄糖同時被利用，即AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不受葡萄糖抑制。此蛋白的優(yōu)良特性使其在釀酒酵母中具有潛在的篩選木糖專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究價值。
釀酒酵母內(nèi)源的木糖運(yùn)輸?shù)鞍资悄?nèi)在蛋白，主要含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，其功能表達(dá)需要正確定位在細(xì)胞膜上。細(xì)菌和真菌的細(xì)胞膜骨架雖均為脂雙層結(jié)構(gòu)，但兩者含有不同的附屬物，如固醇類物質(zhì)、膜蛋白等，造成兩者化學(xué)組成存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)膜間的不相容性，另外，細(xì)菌和真菌細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)和膜蛋白輔助調(diào)節(jié)因子均存在差異，造成了細(xì)菌源的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母菌株中正確表達(dá)、膜定位和發(fā)揮完整功能的難度。至今，尚缺少關(guān)于細(xì)菌源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母中功能表達(dá)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株，該菌株表達(dá)了克隆自谷氨酸棒狀桿菌Corynekicterium glutamicum的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE的表達(dá)提高了釀酒酵母菌株對木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。本發(fā)明還提供了該木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的菌株在構(gòu)建可代謝木糖的重組釀酒酵母中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株，該菌株命名為BSW2ABE，已于2011年12月 27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC5658。該菌株表達(dá)了有功能的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE。該araE木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆自谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC31831)。為了檢測方便，此菌株還在胞內(nèi)表達(dá)了 木糖苷酶。該酵母菌株生物學(xué)特征是單細(xì)胞真核微生物，橢圓形，不運(yùn)動，營養(yǎng)細(xì)胞為單倍體，固體或液體的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SC-Leu-Ura，該培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術(shù)中已有的)的培養(yǎng)條件下為出芽生殖，液體培養(yǎng)條件下以單細(xì)胞形式存在，固體培養(yǎng)時，呈菌落存在，菌落表面濕潤、光滑，呈乳白色。本發(fā)明的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株是發(fā)明人通過重組構(gòu)建并利用發(fā)明人在本申請之前申請的另一項發(fā)明專利(該發(fā)明專利的申請日為2011年12月15日，申請?zhí)枮?01110420908.4)中提到的篩選表達(dá)有活性的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母菌株的方法篩選得到的，本發(fā)明的菌株在構(gòu)建能利用木糖生產(chǎn)食品、化工等產(chǎn)品以及研究木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白機(jī)理等方面有重要的應(yīng)用價值。本發(fā)明的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法如下(1)表達(dá)載體構(gòu)建建立包含有木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE的重組載體；(2)重組菌株構(gòu)建將步驟(1)中建立的重組載體轉(zhuǎn)化到胞內(nèi)表達(dá)有β -木糖苷酶的釀酒酵母重組菌株BSW2AB中，并通過篩選得到轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子；( 對上述轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，篩選方法為“篩選表達(dá)有活性的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母菌株的方法”，得到木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株BSW2ABE。具體的構(gòu)建步驟如下(1)受體菌株選擇選用胞內(nèi)異源表達(dá)有木糖苷酶的實驗室菌株BSW2AB(CEN. PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt)做受體株菌，該菌株分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC No. M65(在同一申請人提交的申請日為2011年12月15日，申請?zhí)枮?01110420908.4的發(fā)明專利申請中有提到)。其菌學(xué)特征為CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3_52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt,該酵母菌株是單細(xì)胞真核微生物，橢圓形，不運(yùn)動，固體或液體的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SC-Leu，該培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術(shù)中已有的)的培養(yǎng)條件下為出芽生殖，液體培養(yǎng)條件下以單細(xì)胞形式存在，固體培養(yǎng)時，呈菌落存在，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，呈乳白色；(2)表達(dá)載體選擇采用實驗室前期構(gòu)建的pJFE3(YEplacl95，TEFp-PGKt, Ura， Amp+)空質(zhì)粒；(3)表達(dá)載體構(gòu)建將從谷氨酸棒狀桿菌DNA上擴(kuò)增得到的araE基因序列構(gòu)建于步驟O)中的表達(dá)載體；(4)重組菌株構(gòu)建將步驟(3)中的表達(dá)載體用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化BSW2AB菌株， 用添加2%葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SC-Leu-Ura(該培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術(shù)中已有的)篩選正確轉(zhuǎn)化子。(5)上述篩選得到的轉(zhuǎn)化子，用申請日為2011年12月15日，申請?zhí)枮?201110420908.4的發(fā)明專利申請中提到的篩選表達(dá)有活性的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母菌株的方法進(jìn)行篩選和檢測，與未表達(dá)此轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的對照菌株BSW2ABP(CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3_52，pYX242_PGKt_TEFp TPIp-xynB-PGKt, pJFE3)相比，篩選得到了一株對木糖的運(yùn)輸能力提高了 1. 9倍的菌株，即為本發(fā)明的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株。本發(fā)明的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的菌株BSW2ABE，測定胞內(nèi)木糖積累量結(jié)果顯示，在胞外木糖濃度的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.4%、2(%和4(%時，其比對照菌株851248 的胞內(nèi)木糖積累量分別提高了 20%、18%和1%，可以預(yù)料，本發(fā)明的菌株將在構(gòu)建可代謝木糖的釀酒酵母中有著廣闊的應(yīng)用前景。


菌株BSW2ABE，分類命名為釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，已于 2011 年 12 月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC5658， 保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。圖1是釀酒酵母附加體穿梭質(zhì)粒pJFE3-araE示意圖。其中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE 克隆自谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC31831)，在釀酒酵母TEFp啟動子控制下表達(dá)。圖2是釀酒酵母附加體穿梭質(zhì)粒p^^42-PGKt-TEFp-XynB示意圖。其中木糖苷酶基因(xynB)克隆自短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)，在釀酒酵母TPIp啟動子控制下表達(dá)。
3 ^ ^ ^ BSW2ABE (CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3， ura3-52, pYX242_PGKt_TEFp TPIp-xynB-PGKt, pJFE3-araE)相比于 BSW2ABP(CEN. PK102-3Aderivative, MATa,leu2_3，ura3-52,pYX242_PGKt_TEFp TPIp-xynB-PGKt,pJFE3) 菌株的pNPX運(yùn)輸能力測定結(jié)果。菌株培養(yǎng)時間為10h。超表達(dá)araE基因的菌株其木糖運(yùn)輸能力顯著增強(qiáng)，比對照菌株提高了 1. 9倍。圖4是檢測菌株BSW2ABP和BSW2ABE轉(zhuǎn)運(yùn)pNPX和不同濃度木糖之間的競爭關(guān)系。 其中，□代表BSW2ABP菌株，■代表BSW2ABE菌株；菌株培養(yǎng)時間為10h。隨著胞外木糖濃度的提高，兩株菌的PNPX的利用速率呈下降趨勢，而且BSW2ABE菌株下降趨勢更明顯，證明無論對于釀酒酵母內(nèi)源性木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還是AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而言，pNPX和木糖之間均存在
競爭關(guān)系。圖5菌株BSW2ABP和BSW2ABE胞內(nèi)木糖積累水平的測定結(jié)果。其中，1、2、3分別代表胞外木糖濃度為0. 4%、2%和4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)時的實驗結(jié)果；□代表BSW2ABP菌株，■代表 BSW2ABE菌株；菌株培養(yǎng)時間為IOh ；在胞外木糖濃度分別為0. 4%、2%和4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)時， BSW2ABE菌株比對照菌株BSW2ABP胞內(nèi)木糖積累量分別提高了 20%、18%和1%。說明，超表達(dá)AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以提高釀酒酵母菌株對木糖的攝取量，這種攝取優(yōu)勢在低濃度胞外木糖濃度下顯著。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1 :araE釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下(1)載體選擇采用實驗室前期構(gòu)建的 pJFE3 (Yeplacl95, TEFp-PGKt, Ura，Amp+) 空質(zhì)粒；(2)表達(dá)載體構(gòu)建用上下游引物 AraE3up 5’-ATCGCGGATCCATGGCAGGGCACATCATC CGCTCAG-3 ’ 和 AraEdown-Hi s 5，-ACGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTAAGGAGTGTTTAA GAGC-3，從谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 31831) DNA上克隆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE，利用BamH I和Ml I兩酶切位點在(1)中的質(zhì)粒上構(gòu)建釀酒酵母附加體穿梭質(zhì)粒pJFE3-araE，見附圖1 ；實施例2 表達(dá)AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的菌株BSW2ABE的構(gòu)建方法如下(1)菌種選擇選用構(gòu)建的胞內(nèi)異源表達(dá)有木糖苷酶的實驗室菌株BSW2AB(CEN. PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt)做受體株菌，該菌株含有構(gòu)建的p^(M2-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt異源表達(dá)載體，見圖2，該菌株已于2011年11月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No. 5465 ；(2)菌株構(gòu)建將實施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒pJFE3-araE用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化BSW2AB 菌株，用添加2%葡萄糖的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SC-Leu-Ura篩選正確轉(zhuǎn)化子；(3)菌株驗證將步驟( 中驗證正確的轉(zhuǎn)化子單菌落用添加2%葡萄糖的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SC-Leu-Ura培養(yǎng)，反提質(zhì)粒，用載體的上游引物TEF W up :5’_CCCAAGCT TCACAATGCATACTTTGTACGTT-3，和 araE 基因的下游引物 AraEdown-Hi s 5，-ACGCBGTCGACCTT AGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTAAGGAGTGTTTAAGAGC-3，進(jìn)行 PCR 驗證，得到正確的 BSW2ABE 重組菌株。實施例3 菌株BSW2ABE的pNPX運(yùn)輸能力的測定方法如下(1)常規(guī)菌株選擇選用構(gòu)建的胞內(nèi)異源表達(dá)有木糖苷酶(Bp-xynB)和含有空質(zhì)粒 PJFE3 的實驗室菌株 BSW2ABP(CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3-52,pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt, pJFE3)做常規(guī)株菌；(2)菌株培養(yǎng)將菌株BSW2ABP和BSW2ABE的單菌落用添加2%葡萄糖的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SC-Leu-Ura活化兩次，轉(zhuǎn)接40ml于IOOml小三角瓶中，初始600nm光吸收 (表示為OD600或OD600J接為0. 5，培養(yǎng)條件均為300C，200r · mirT1 ；(3)完整細(xì)胞懸液制備取步驟(2)中培養(yǎng)10小時的菌液，離心(3000r · min—1， 5min)去掉原培養(yǎng)基后用pH6. 5的50mmol/L PBS液重懸；(4)完整細(xì)胞狀態(tài)下測定木糖苷酶酶活用96孔平板或EP管取適量步驟(3)中的完整細(xì)胞懸液，加入終濃度為6mmol/L的pNPX，兩者總體系為120 μ 1，隨后置于30°C， 200r · mirT1搖床中孵育30分鐘，離心取上清100 μ 1加入96孔平板中，再加入等體積的 0. 4mol/L的Na2CO3水溶液，混勻后，用酶標(biāo)儀測定孵育30分鐘前后405nm光吸收(表示為OD4tl5或OD4tl5nm),該光吸收由生成的對硝基酚(pNP)產(chǎn)生。孵育初始值測定時，先不加 PNPX，只加菌懸液與實驗組共同孵育，離心取適量體積上清后加入終濃度6mmol/L的pNPX， 兩者總體系為100 μ 1，再加入100 μ 1的0. 4mol/L的碳酸鈉水溶液，混勻后，用酶標(biāo)儀測定 OD405nm 根據(jù) pH6. 5 的 PBS 液配制的 pNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線 y(_5nm) = 0. 0916x(pNP/miol)+0. 0735 和實驗室菌株的菌液OD6tltlnm值和細(xì)胞干重的對應(yīng)關(guān)系y(mg dw/ml) = 0. 2365x(OD600nm)+0. 1149，計算得到該菌株對PNPX的轉(zhuǎn)運(yùn)速率；見圖3，可見，BSW2ABE重組菌株的木糖運(yùn)輸能力顯著增強(qiáng)，比對照菌株提高了 1. 9倍，因此，將該菌株進(jìn)行了保藏，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2011年12月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC5658。實施例4 菌株BSW2ABE的pNPX和木糖的競爭關(guān)系測定方法如下(1)選用實施例3步驟(3)中培養(yǎng)10小時的菌液，離心(3000r · πι η^,δπι η)去掉原培養(yǎng)基后用ΡΗ6. 5的50mmol/L PBS液重懸；(2)競爭關(guān)系驗證用96孔平板或EP管取適量步驟(1)中的完整細(xì)胞懸液，加入終濃度為6mmol/L的pNPX，另外加入終濃度分別為50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、 200mmol/L、250mmol/L的木糖，三者總體系為120 μ 1，隨后置于30°C,200r · mirT1搖床中孵育30分鐘，離心取上清100 μ 1加入96孔平板中，再加入等體積的0. 4mol/L的Na2CO3 水溶液，混勻后，用酶標(biāo)儀于405nm下測定孵育30分鐘后生成的對硝基酚(pNP)的光吸收值。孵育初始值測定時，先不加PNPX，只加菌懸液與實驗組共同孵育，離心取適量體積上清后加入終濃度6mmol/L的pNPX，兩者總體系為100 μ 1，再加入100 μ 1的0. 4Μ的碳酸鈉水溶液，混勻后，用酶標(biāo)儀測定OD4tl5nm ；根據(jù)ΡΗ6.5的PBS液配制的pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線y((I)4(15mi)= 0. 0916x(pNP/miol)+0. 0735和實驗室菌株的菌液OD6tltlnm值和細(xì)胞干重的對應(yīng)關(guān)系y(mg dw/ml)= 0. 2365x(OD600nm)+0. 1149，計算得到該菌株對pNPX的轉(zhuǎn)運(yùn)速率；在兩菌株中檢驗不同濃度的木糖對pNPX的競爭關(guān)系，見圖4。實施例5 菌株BSW2ABE胞內(nèi)木糖積累水平的測定方法如下(1)常規(guī)菌株選擇選用構(gòu)建的胞內(nèi)異源表達(dá)有木糖苷酶(Bp-xynB)和含有空質(zhì)粒 PJFE3 的實驗室菌株 BSW2ABP(CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3-52, pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt, pJFE3)做常規(guī)株菌；
(2)菌株培養(yǎng)將菌株BSW2ABP和BSW2ABE的單菌落用添加2%葡萄糖的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SC-Leu-Ura活化兩次，各轉(zhuǎn)接150ml于500ml三角瓶中，初始0D_接為 0. 5，培養(yǎng)條件均為 30°C，200r · mirT1 ；(3)完整細(xì)胞懸液制備取步驟O)中培養(yǎng)10小時的菌液，用刻度離心管收集 150ml 菌液(3000r · mirT1，5min)，去掉原培養(yǎng)基后用 IOml ρΗ6· 5 的 50mmol/LPBS 液重懸；(4)完整細(xì)胞狀態(tài)下測定胞內(nèi)木糖積累水平每株菌分別取步驟(3)中的完整細(xì)胞懸液各3ml三份，分裝于三個5ml離心管中，添加木糖，木糖終濃度分別為0. 4%、2%和 4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))三個胞外木糖濃度水平；置于30度搖床中孵育30min ；到時間后取菌液離心(5000r IirT1J-^iin)，棄上清，置于冰上放置；加入等體積的冰浴無菌水，混勻，分成三管，每管Iml ；快速洗滌兩次(8000r ^irT1,15s)，最后用Iml冰浴的無菌水重懸，在37 °C中搖床孵育Ih ；測定每管的OD6qq, 13000r · mirT1，離心5min，上清液凍存于_20°C中。(5)取步驟(4)中的上清液，用HPLC測定木糖和木糖醇濃度，因為木糖和木糖醇等摩爾轉(zhuǎn)化，最終可換算出胞內(nèi)的總木糖積累水平，見圖5。上述未詳盡展開描述的內(nèi)容，均為公知常識或在同一申請人提交的申請日為2011 年12月15日，申請?zhí)枮?01110420908. 4的發(fā)明專利申請中有涉及，故在此不再贅述。
權(quán)利要求
1.一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株，其特征在于該菌株為BSW2ABE，分類命名為釀酒酵母&iccharomyces cerevisiae，已于2011年12月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC5658。
2.權(quán)利要求1所述的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下(1)表達(dá)載體構(gòu)建建立包含有木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE的重組載體；(2)重組菌株構(gòu)建將步驟(1)中建立的重組載體轉(zhuǎn)化到胞內(nèi)表達(dá)有木糖苷酶的釀酒酵母重組菌株BSW2AB中，并通過篩選得到轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子；(3)對上述轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，篩選方法為“篩選表達(dá)有活性的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母菌株的方法”，得到木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述表達(dá)載體構(gòu)建是將木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE克隆到空載體pJFE3上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE克隆自 ^ Corynebacterium glutamicum ATCC31831。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化方法為醋酸鋰轉(zhuǎn)化法。
6.權(quán)利要求1所述的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株在構(gòu)建可代謝木糖的重組釀酒酵母中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高的釀酒酵母菌株，該菌株為BSW2ABE，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年12月27日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC5658。該菌株表達(dá)了克隆自谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE，表達(dá)該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母菌株利用篩選表達(dá)有活性的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母菌株的方法(見同一申請人提交的申請日為2011年12月15日，申請?zhí)枮?01110420908.4的發(fā)明專利申請)進(jìn)行檢測，其轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的速率較出發(fā)菌株提高了1.9倍。本發(fā)明還涉及該木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高的菌株在構(gòu)建可代謝木糖的重組釀酒酵母中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK102559527SQ20121000743
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者汪城墻, 沈煜, 鮑曉明 申請人:山東大學(xué)