專利名稱：一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和分析技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是ー種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)及其在木糖快速檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木糖是ー種重要的碳水化合物，在人們的生產(chǎn)生活中具有非常重要的作用。在自然界中，天然D-木糖是以多糖的形態(tài)存在于植物中，它們在農(nóng)產(chǎn)品的廢棄部分中(例如玉米的穗軸、秸桿、棉桃的外皮)含量很高，木糖是其自然降解和人為降解中的重要產(chǎn)物。利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)こ醇可以提高原料的利用率和燃料こ醇的產(chǎn)量，降低燃料こ醇的生產(chǎn)成本，因此目前已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。在細(xì)菌中有的能利用D-木糖作為碳源生長，在動(dòng)物中羊幾乎能完全地利用木糖。在動(dòng)物的蛋白多糖中D-木糖與多肽鏈的絲氨酸殘基以糖苷鍵連接，成為多糖側(cè)鏈與蛋白質(zhì)的橋接結(jié)構(gòu)。木糖醇是木糖通過加氫制得的，其用途非常廣泛。在發(fā)達(dá)國家木糖已應(yīng)用于寵物飼料。木糖可以作為糖尿病人的耐受性好的無熱量甜味劑、營養(yǎng)劑和治療劑。它還可以作為加熱食品增香劑，用于焙烤食品、火腿、香腸、臘肉、人造肉等。木糖還被廣泛應(yīng)用于肉食加工、肉類香料以及制備食品抗氧劑等方面。另外，木糖已作為軟化劑、離子表面活性剤、增塑劑、水分調(diào)節(jié)劑等用于油漆、牙膏、卷煙、制革、鋳造、火藥等多種行業(yè)。因此，快速、高靈敏度、高選擇性、實(shí)時(shí)的木糖檢測對遺傳、人類營養(yǎng)、食品技術(shù)、醫(yī)藥以及包括生物燃料在內(nèi)的生物過程等領(lǐng)域極其重要。目前，木糖的檢測方法有還原法、酶學(xué)方法、色譜法、拉曼光譜法和紅外光譜法等。但是這些方法存在各種各樣的問題，例如，采用還原法檢測時(shí)，其靈敏度較低，而且易受到其他有顔色和還原性物質(zhì)的干擾；在酶學(xué)方法中，酶的來源和純化是個(gè)至關(guān)重要的問題；色譜法包括氣相色譜法、液相色譜法和離子色譜法，存在的主要問題是樣品制備過程復(fù)雜、操作費(fèi)時(shí)、誤差較大、需要昂貴設(shè)備等。因此，建立ー種快速、靈敏、特異的木糖實(shí)時(shí)檢測方法，勢在必行。 酶學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性好，但是酶的純化和穩(wěn)定性是難以解決的問題。木糖脫氫酶(XDH) (EC 1.1.1.175)是ー些微生物中木糖代謝途徑的關(guān)鍵酶。木糖在木糖脫氫酶的催化下，借助于輔酶NAD+，被氧化成木糖酸內(nèi)酷，輔酶NAD+則被還原為NADH。細(xì)菌表面呈現(xiàn)系統(tǒng)是微生物表面呈現(xiàn)系統(tǒng)的ー個(gè)重要分支，其基本策略也是將外源蛋白或多肽與細(xì)菌表面蛋白融合或嵌合并活性表達(dá)于細(xì)菌表面。自從發(fā)現(xiàn)大腸桿菌外膜蛋白LamB、OmpA和PhoE能夠作為外源蛋白的表面呈現(xiàn)載體以來，該技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)，在微生物學(xué)、分子生物學(xué)、疫苗學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中得到了廣泛應(yīng)用。冰核蛋白(ice-nucleation protein, INP))是丁香假單胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速純水的冰晶形成。INP通過糖基磷脂酰肌醇而錨定在細(xì)菌表面，利于大分子蛋白的表面呈現(xiàn)。冰核蛋白細(xì)菌包括假單胞菌屬、歐文氏菌屬和黃單胞菌等。目前，利用全長的冰核蛋白、去掉中間重復(fù)序列的串連N端、C端結(jié)構(gòu)域的蛋白或只用N端結(jié)構(gòu)域的蛋白均在大腸桿菌表面成功展示了外源蛋白，例如:綠色熒光蛋白、幾丁質(zhì)酶和磷酸鹽結(jié)合蛋白等。近年來,在Pseudomonas borealis菌株中發(fā)現(xiàn)一種新的冰核蛋白基因inaPb,它與已熟知的冰核蛋白只有 66 %的同源性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于冰核蛋白的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)及其在木糖檢測中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:ー種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng):細(xì)菌表面展示系統(tǒng)為編碼目標(biāo)蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負(fù)責(zé)跨膜定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因序列 inaPb-N。編碼目標(biāo)蛋白木糖脫氫酶的基因序列XylB和負(fù)責(zé)跨膜定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因序列inaPb-N融合，表達(dá)于宿主細(xì)胞表面，得到基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)?；诒说鞍椎哪咎敲摎涿讣?xì)菌表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用:所述細(xì)菌表面展示系統(tǒng)用于木糖的高特異性、高靈敏度檢測。所述細(xì)菌表面展示系統(tǒng)用于D-木糖的高特異性、高靈敏度檢測。檢測原理是木糖在菌體表面的木糖脫氫酶的催化下，借助于輔酶煙酰胺腺嘌呤ニ核苷酸(NAD+)被氧化成木糖酸內(nèi)酷，輔酶NAD+則被還原為還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。NADH在340nm處有特征吸收峰，因此可以根據(jù)340nm處的吸光值來求得木糖的含 量。本發(fā)明的效果是:1.本發(fā)明利用冰核蛋白表面展示系統(tǒng)將木糖脫氫酶穩(wěn)定地展示在細(xì)菌的表面，從而解決了胞內(nèi)酶提取過程復(fù)雜和穩(wěn)定性低的難題。2.本發(fā)明細(xì)菌表面展示的木糖脫氫酶酶活高，與原始菌株中胞內(nèi)的木糖脫氫酶相比，穩(wěn)定性好。3.本發(fā)明細(xì)菌表面展示的木糖脫氫酶特異性好，其他糖類，如D-葡萄糖、纖維ニ糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-果糖、D-蔗糖、D-木糖醇、D-麥芽糖和L-阿拉伯糖對D-木糖的測定均無干擾。4.本發(fā)明構(gòu)建的基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)靈敏度高，具有較寬的木糖檢測范圍(5-900 PM)和較低的檢測限(2 PM)。5.本發(fā)明構(gòu)建的木糖脫氫酶展示菌株可以固定在電極上，構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)木糖的檢測，而且此菌體可以重復(fù)多次使用，穩(wěn)定性好。6.本發(fā)明構(gòu)建的木糖脫氫酶展示菌株可開發(fā)成ー種生物催化劑，用于生物燃料電池等領(lǐng)域。7.通過本發(fā)明提供的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)建立了木糖快速檢測的方法。此方法靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低，可用于食品、果蔬、糖酒飲料、肉食、食品添加剤、保健品、醫(yī)藥，和化妝品、牙膏、卷煙等エ業(yè)領(lǐng)域，以及發(fā)酵、生物轉(zhuǎn)化、生物能源等生物過程領(lǐng)域中木糖的監(jiān)測。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的木糖脫氫酶基因xdh的PCR產(chǎn)物膠回收圖。A是DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)是基因xdh的PCR產(chǎn)物膠回收條帯。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的木糖脫氫酶基因inaPb-N的PCR產(chǎn)物膠回收圖。A是DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；B是基因inaPb-N的PCR產(chǎn)物膠回收條帶。圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的載體構(gòu)建流程圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的紫外分光光度計(jì)檢測D-木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。本發(fā)明目的、功能及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例，參照附圖做進(jìn)ー步說明。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明構(gòu)建基于木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)，利用紫外分光光度計(jì)檢測信號(hào)，從而得到木糖的含量，進(jìn)而用于木糖的快速檢測，具體為:1.構(gòu)建基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)；2.制作木糖檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；3.測定實(shí)際樣品中的木糖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出木糖的含量。實(shí)施例1細(xì)胞表面展示木糖脫氫酶菌體的獲得:1.培養(yǎng)木糖脫氫酶的新月柄桿菌株(Caulobacter crescentus NA1000)(市購產(chǎn)品):將上述菌株接種于培養(yǎng)基中置30°C，200rpm，搖床培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)基成分:植物蛋白胨5.0g，酵母提取物2.5g，K2HPO4 3.7g, KH2PO4L 3g,MgSO4 7H20 0.5g，NaCl 1.0g,蒸餾水 1.0L, pH 7.2-7.5，高溫滅菌，待用；2.培養(yǎng)冰核蛋白細(xì)菌Pseudomonas borealis (市購產(chǎn)品):將上述菌株于培養(yǎng)基中置22°C，200rpm，搖床培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)基成分是:胰蛋白胨1.5% (g/100ml)，大豆蛋白胨0.5% (g/100ml)，氯化鈉
0.5% (g/100ml)，用蒸餾水配制而成，調(diào)節(jié)pH為7.2±0.2，經(jīng)121 °C壓カ蒸汽滅菌后，待用。3.重組表達(dá)載體的構(gòu)建。I)以新月柄桿菌(C.crescentus NA1000)基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)并合成引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到編碼木糖脫氫酶的基因xylB。引物是Pl (5，— 3，):CGGGATCCATGTCCTCAGCCATCTATCCCAGCC 和 P2 (5，— 3，):CCCAAGCTTACGCCAGCCGGCGTCGATCCAGT。PCR 反應(yīng)體系為:ddH20 34.7 y L，模板DNA 1 u L, IOXPCR Buffer (Mg2+Free) 5 u L,MgCl2(25mmol/L)3u L,引物 Pl (20pmol/y L) I y L，引物 P2 (20pmol/μL) I y L，dNTPMixture (各 2.5mmol/L)4u L, TaKaRa Taq (5U/u L) 0.3 u L0 反應(yīng)參數(shù)為:95°C 預(yù)變性 5min，94°C 30s，59°C 30s, 72°C 60s，30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收(參見圖1)，連接于PMD-19Tsimple載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,命名為pMDXdh。2)以冰核蛋白細(xì)菌Pseudomonas borealis菌株基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)并合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到編碼冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因inaPb-N。
弓丨物是 P3 (5，— 3，):CATGCCATGGGCATGAACGATGACAAAGTTTTGGTC 和 P4 (5，— 3，):CGGGATCCCACCGCTGTCTCCAGCGTTTGTG。PCR 反應(yīng)體系為:ddH20 34.7 y L，模板DNA I u L, 10XPCR Buffer (Mg2+Free) 5 u L,MgCl2(25mmol/L)3u L,引物 P3 (20pmol/y L) I y L，引物 P4 (20pmol/y L) I y L，dNTPMixture (各 2.5mmol/L)4u L, TaKaRa Taq (5U/u L) 0.3 u L0 反應(yīng)參數(shù)為:95°C 預(yù)變性 5min，94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 60s，30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收(參見圖2)，連接于pMD-19Tsimple載體。得到的重組載體用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I雙酶切，然后連接到經(jīng)同樣雙酶切的載體pET28a(+)上，得到的重組載體命名為pTInaPb-N。3)將上述載體pMDXdh用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III雙酶切，然后與同樣雙酶切的載體PTInaPb-N連接，得到xylB和inaPb-N的融合基因；4.重組載體的表達(dá)。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3),即得到細(xì)胞表面展示木糖脫氫酶的菌體(參見圖3)。酶切鑒定正確后接種于新鮮的含卡那霉素(30ii g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至吸光度(OD6J為 0.4時(shí)，加入IPTG (異丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷)使其終濃度為lmmol/L，25°C誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，待用。大腸桿菌E.coli BL21(DE3)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LB培養(yǎng)基成分為:5g/L酵母膏，10g/L 蛋白胨，10g/L NaCl。實(shí)施例2利用構(gòu)建的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)，借助紫外分光光度計(jì)進(jìn)行木糖的快速檢測:
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:將上述實(shí)施例所得細(xì)胞表面展示木糖脫氫酶菌體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，24h后收獲菌體，用50mM PBS緩沖液(pH 8.0)洗滌三次，將菌體密度調(diào)整至OD6tltl =
1.0。向Iml反應(yīng)液(50mM PBS緩沖液，pH 8.0)中加入上述100 u L的菌液、NAD+(終濃度為ImM)和不同濃度的D-木糖溶液(終濃度為0-1000 u M)，進(jìn)行平行操作，混勻，在30°C水浴鍋中放置，10分鐘后取出，12000rpm/min，離心I分鐘，取上清液，移入微量比色皿中，波長340nm處進(jìn)行光譜測定，以50mMPBS緩沖液(pH 8.0)調(diào)零。最后以木糖濃度為橫坐標(biāo)，波長340nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得一條直線，求出其斜率，即為D-木糖的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(參見圖4)。D-木糖的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，由圖可知，該工作標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值達(dá)到
0.999，線性擬合度很好，其斜率為0.0029。2.D-木糖的檢測過程。向反應(yīng)液中加入上述IOOii L的菌液、NA+(最終濃度為ImM)和經(jīng)稀釋過的含有D-木糖的待測樣品，進(jìn)行平行操作，混勻，在30°C水浴鍋中放置，10分鐘后取出，離心，取上清液于分光光度計(jì)波長340nm處測量其吸光度，以50mM PBS緩沖液(pH8.0)調(diào)零。根據(jù)測得的吸光度，利用D-木糖工作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出D-木糖的含量。實(shí)施例3秸桿經(jīng)過物理化學(xué)處理之后的降解產(chǎn)物中D-木糖含量的測定:1.樣品處理:將秸桿經(jīng)物理化學(xué)處理之后的降解液用0.22 Pm的一次性濾膜進(jìn)行過濾處理，用50mM PBS緩沖液(pH 8.0)進(jìn)行稀釋(稀釋比例分別是10倍、100倍、1000
倍)，備用。
2.制備展示有木糖脫氫酶的菌體:將上述實(shí)施例所得細(xì)胞表面展示木糖脫氫酶菌體接種于新鮮的含卡那霉素(30iig/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至吸光度(0D_)為 0.4時(shí)，加入IPTG使其終濃度為lmmol/L，25°C誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，收獲菌體，洗滌，用50mMPBS緩沖液(pH 8.0)將菌體密度調(diào)整至OD600 = 1.0。3.D-木糖檢測過程:具體步驟見實(shí)施例2。4.D-木糖濃度的計(jì)算:取吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的稀釋比例的吸光值來進(jìn)行計(jì)算，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的計(jì)算公式，最后乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，從而得到原秸桿降解液中D-木糖的濃度為84.87 ± 1.45mM。D-木糖濃度計(jì)算公式為:
權(quán)利要求
1.一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)，其特征在于:細(xì)菌表面展示系統(tǒng)為編碼目標(biāo)蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負(fù)責(zé)跨膜定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因序列inaPb-N。
2.按權(quán)利要求1所述的基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)，其特征在于:編碼目標(biāo)蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負(fù)責(zé)跨膜定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因序列inaPb-N融合，表達(dá)于宿主細(xì)胞表面，得到基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)。
3.一種權(quán)利要求1所述的基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)菌表面展示系統(tǒng)用于木糖的高特異性、高靈敏度檢測。
4.權(quán)利要求3所述的基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)菌表面展示系統(tǒng)用于D-木糖的高特異性、高靈敏度檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和分析技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細(xì)菌表面展示系統(tǒng)及其應(yīng)用。細(xì)菌表面展示系統(tǒng)為編碼目標(biāo)蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負(fù)責(zé)跨膜定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因序列inaPb-N。將所述細(xì)菌表面展示系統(tǒng)用于木糖檢測。本發(fā)明對木糖檢測的方法靈敏度高、特異性好、方法簡單，適用于食品、果蔬、糖酒、飲料、肉食、食品添加劑、保健品、醫(yī)藥，和化妝品、牙膏、卷煙等工業(yè)領(lǐng)域，以及發(fā)酵、生物轉(zhuǎn)化、生物能源等生物過程領(lǐng)域中木糖的監(jiān)測。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103087969SQ201210007398
公開日2013年5月8日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者劉愛驊, 梁波 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所