Etfb在細(xì)胞異常增殖中的應(yīng)用方法以及異常增殖抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供早期鑒別、抑制成纖維細(xì)胞的異常增殖的手段。本發(fā)明提供一種成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法，該成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法以ETFB(電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基)的表達(dá)的程度作為指標(biāo)；其中，該ETFB的表達(dá)的程度高的情況下，判定為發(fā)生成纖維細(xì)胞的異常增殖的蓋然性高，ETFB的表達(dá)的程度低的情況下，判定為成纖維細(xì)胞的增殖保持正常的蓋然性高。此外，通過抑制ETFB，能夠抑制成纖維細(xì)胞的異常增殖。
【專利說明】ETFB在細(xì)胞異常增殖中的應(yīng)用方法以及異常增殖抑制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基(Electron transfer flavoprotein betasubunit ；ETFB)在細(xì)胞增殖中的應(yīng)用、其抑制劑、包含該抑制劑的細(xì)胞的異常增殖癥的處置藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]成纖維細(xì)胞的異常增殖與例如創(chuàng)傷中產(chǎn)生的增生性疤痕、肺中的纖維癥、肝硬化、腎硬化癥等各種疾病相關(guān)。在誘發(fā)這些異常增殖的過程中，TGF-β被認(rèn)為參與其中(參照例如專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3)，但TGF-β是多任務(wù)生物物質(zhì)，因而從很多方面來看，不能以單純的抑制來應(yīng)對，正是由于上述原因，尚不存在副作用少的有效的TGF-β阻礙劑。即，在TGF-β的下游找到與該疾病直接相關(guān)的成纖維細(xì)胞異常增殖的因子，并對其進(jìn)行選擇性地抑制，被認(rèn)為是所述成纖維細(xì)胞異常增殖癥的有效的抑制手段。
[0003]另一方面，ETFB是涉及電子轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)(參照例如專利文獻(xiàn)4、專利文獻(xiàn)5、專利文獻(xiàn)6、專利文獻(xiàn)7)，時而還被用作生物標(biāo)志物，但對于其實際狀態(tài)并不是特別了解。有報告稱在脂質(zhì)潴留性肌肉疾病中可見ETFB的突變(參照例如非專利文獻(xiàn)I)，并有暗示其是II型糖尿病的原因之一(例如參照非專利文獻(xiàn)2)、以及多種?；o酶A脫氫酶缺乏癥(Multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency ；MADD)的一個因素(參照例如非專利文獻(xiàn)3)等，但全 然不知其與皮膚等的相關(guān)性、以及與成纖維細(xì)胞的關(guān)系。此外，ETFB與TGF- β的關(guān)聯(lián)也是全然不知的。
[0004]另一方面，已經(jīng)有報告稱，在將成纖維細(xì)胞在膠原凝膠中施加張力進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，細(xì)胞增殖亢進(jìn)，膠原表達(dá)等上升，觀察到近似纖維化的現(xiàn)象；在其中存在TGF-β的情況下，還觀察到成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化(參照例如非專利文獻(xiàn)4)。然而，這樣的現(xiàn)象中的細(xì)胞增殖因子尚不明確。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:日本特開2010-222351號公報
[0008]專利文獻(xiàn)2:日本特開2010-59124號公報
[0009]專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-40796號公報
[0010]專利文獻(xiàn)4:日本特表2010-508014號公報
[0011]專利文獻(xiàn)5:國際公開W02006/054722號小冊子
[0012]專利文獻(xiàn)6:日本特表2010-514441號公報
[0013]專利文獻(xiàn)7:日本特開2010-107461號公報
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)1:Wen B.et.al., J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry.2010 ；81 (2):231-6
[0016]非專利文獻(xiàn)2:Lu H.et.al., J.Mol.Cell Proteomics.2008 ；7(8):1434-51[0017]非專利文獻(xiàn)3 =Schiff M.et.al.，Mol.Genet.Metab.2006 ；88 (2): 153-8
[0018]非專利文獻(xiàn)4:Au K.et.al., Exp.Mol.Pathol.2010 ；89 (3):236-240

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明正是在這樣的情況下完成的，其課題是，提供對成纖維細(xì)胞的異常增殖進(jìn)行早期鑒別、抑制其的手段。
[0020]鑒于這樣的情況，本發(fā)明人為尋求對成纖維細(xì)胞的異常增殖進(jìn)行早期鑒別、抑制其的手段而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果通過對將成纖維細(xì)胞在存在張力的條件下于膠原凝膠中進(jìn)行培養(yǎng)的情況、與在不存在張力的條件下于膠原凝膠中進(jìn)行培養(yǎng)的情況的表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了 ETFB的表達(dá)在前一條件下亢進(jìn)，凸顯出其是成纖維細(xì)胞的異常增殖的因子，從而完成了發(fā)明。
[0021]即，本發(fā)明如下所示。
[0022]<1> 一種成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法，該成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法以ETFB(電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基)的表達(dá)的程度作為指標(biāo)，其中，
[0023]該ETFB的表達(dá)的程度高的情況下，判定為發(fā)生成纖維細(xì)胞的異常增殖的蓋然性聞，
[0024]ETFB的表達(dá)的程度低的情況下，判定為成纖維細(xì)胞的增殖保持正常的蓋然性高。
[0025]〈2X1〉所述的鑒別方法，其中，
[0026]所述ETFB的表達(dá)的程度高的情況是被檢試樣的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相對于對照的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量高的情況，
[0027]所述ETFB的表達(dá)的程度低的情況是被檢試樣的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相對于對照的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相同或低的情況。
[0028]〈3>〈1>所述的鑒別方法，其中，所述成纖維細(xì)胞的異常增殖是纖維化。
[0029]〈4>〈3>所述的鑒別方法，其中，所述纖維化歸因于成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化。
[0030]〈5>〈1>所述的鑒別方法，其中，成纖維細(xì)胞的異常增殖是增生性疤痕的形成。
[0031]〈6>—種臟器中的纖維化的鑒別方法，該臟器中的纖維化的鑒別方法以被懷疑纖維化的臟器的成纖維細(xì)胞中的、ETFB的表達(dá)程度為指標(biāo)，其中，
[0032]在ETFB的表達(dá)程度高的情況下，判定為該臟器中發(fā)生纖維化的蓋然性高，
[0033]在未確認(rèn)到ETFB的亢進(jìn)的情況下，判定未發(fā)生纖維化的蓋然性低。
[0034]<7><6>所述的臟器中的纖維化的鑒別方法，其中，
[0035]ETFB的表達(dá)的程度高的情況是指被檢試樣在臟器中的表達(dá)量相對于對照中的表達(dá)量聞的情況，
[0036]未確認(rèn)到ETFB的允進(jìn)的情況是被檢試樣在臟器中的表達(dá)量相對于對照中的表達(dá)量相同或低的情況。
[0037]<8><7>所述的臟器中的纖維化的鑒別方法，其中，所述臟器為皮膚。
[0038]〈9> 一種纖維化抑制劑 的鑒別方法，其中，將成纖維細(xì)胞在張力存在下的膠原凝膠中、于存在和不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，
[0039]在存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時，ETFB的表達(dá)量與在不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時相比低的情況下，將該被檢物質(zhì)作為纖維化抑制劑。
[0040]〈10>〈9>所述的異常纖維化抑制劑的鑒別方法，其中，所述纖維化是增生性疤痕的形成。
[0041]〈11X10〉所述的纖維化抑制劑的鑒別方法，其中，所述纖維化是皮膚的增生性疤痕。
[0042]<12><1>~〈11>中任一項所述的鑒別方法，其中，所述ETFB的表達(dá)是蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0043]〈13X1〉~〈I 1>中任一項所述的鑒別方法，其中，所述ETFB的表達(dá)是RNA的表達(dá)。
[0044]〈14X13〉所述的鑒別方法，其中，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來測定ETFB的表達(dá)的程度。
[0045]〈15X14〉所述的鑒別方法，其中，用于所述PCR的引物是:
[0046]SEQ ID NO:1所述的寡核苷酸或具有其作為部分序列、且能夠擴(kuò)增編碼ETFB的堿基序列的寡核苷酸；以及
[0047]SEQ ID NO:2所述的寡核苷酸或具有其作為部分序列、且能夠擴(kuò)增編碼ETFB的堿基序列的寡核苷酸。
[0048]<16> 一種纖 維化抑制劑，其由下述被檢物質(zhì)組成:
[0049]將成纖維細(xì)胞在張力存在下的膠原凝膠中、于存在和不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時，ETFB的表達(dá)量與在不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時相比低。
[0050]〈17X16〉所述的纖維化抑制劑，其中，所述纖維化是增生性疤痕的形成。
[0051]<18> 一種增生性疤痕處置藥物，其以〈16>所述的纖維化抑制劑作為有效成分。
[0052]〈19X18〉所述的增生性疤痕處置藥物，其用于已發(fā)生的增生性疤痕的治療。
[0053]〈20X18〉所述的增生性疤痕處置藥物，其用于預(yù)防，使得已發(fā)生的增生性疤痕不惡化。
[0054]〈21X18〉所述的增生性疤痕處置藥物，其用于預(yù)防，以防止產(chǎn)生發(fā)生蓋然性高的疤痕。
[0055]〈22>能夠擴(kuò)增編碼ETFB的堿基序列的、與SEQ ID NO:1或2所示的寡核苷酸基本相同的寡核苷酸。
[0056]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供早期鑒別、抑制成纖維細(xì)胞的異常增殖的手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057][圖1]顯示實施例1的膠原凝膠內(nèi)培養(yǎng)的結(jié)果的圖。
[0058][圖2]顯示實施例1的ETFB對成纖維細(xì)胞的增殖的影響的圖。
[0059][圖3]顯示實施例1的ETFBsiRNA對TGF-β誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成的影響的圖(照片)。對于導(dǎo)入了 ETFB或陰性對照(Negative control) siRNA的CCD_1113sk細(xì)胞添加TGF-β (llng/ml)后，培養(yǎng)3日，然后實施了鬼筆環(huán)肽染色。
[0060][圖4]顯示實施例1的ETFBsiRNA對膠原凝膠收縮的影響的圖。導(dǎo)入ETFB或陰性對照SiRNA，實施膠原凝膠內(nèi)培養(yǎng)，對凝膠收縮進(jìn)行了觀察(η = 6)。
[0061][圖5]顯示實施例1的ETFBsiRNA對編碼α -平滑肌肌動蛋白(SMA)的RNA的產(chǎn)生量的影響(Negative control)的圖。導(dǎo)入ETFB或陰性對照siRNA,實施膠原凝膠內(nèi)培養(yǎng)，每培養(yǎng)I日收集RNA，通過qRT-PCR確認(rèn)了膠原IAl (COLlAl)⑶以及SMA (C)的mRNA表達(dá)。A顯示導(dǎo)入陰性對照siRNA的情況下，附著狀態(tài)以及游離狀態(tài)中的ETFB的表達(dá)量；B顯示導(dǎo)入陰性對照siRNA的情況下，附著狀態(tài)以及游離狀態(tài)中的COLlAl的表達(dá)量；C顯示導(dǎo)入陰性對照siRNA的情況下，附著狀態(tài)以及游離狀態(tài)中的SMA的表達(dá)量。
[0062][圖6]顯示實施例1的ETFBsiRNA對膠原產(chǎn)生、SMA產(chǎn)生的影響的圖。導(dǎo)入ETFB或陰性對照siRNA，在添加或不添加TGF-β (300ng/ml)的狀態(tài)下實施膠原凝膠內(nèi)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)I日后的RNA，通過qRT-PCR確認(rèn)了 COLlAl (A) ,SMA⑶以及ETFB (C)的mRNA表達(dá)。A顯示TGF-β存在或不存在下、陰性對照siRNA或ETFB siRNA的導(dǎo)入引起的COLlAl的表達(dá)量的變化顯示TGF-β存在或不存在下、陰性對照siRNA或ETFB siRNA的導(dǎo)入引起的SMA的表達(dá)量的變化；C顯示TGF- β存在或不存在下、陰性對照siRNA或ETFB siRNA的導(dǎo)入引起的ETFB的表達(dá)量的變化。
[0063]發(fā)明的【具體實施方式】
[0064](ETFB)
[0065]作為本發(fā)明的主要素的ETFB也稱為電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基，其具體堿基序列、氨基酸序列已經(jīng)在基因銀行等基因數(shù)據(jù)庫中登錄。例如，人型的ETFB在基因銀行中登錄為CAG33108.1。其經(jīng)由以下程序被鑒定為成纖維細(xì)胞的增殖因子。
[0066]在成纖維細(xì)胞的增殖因子的鑒定中采用的、膠原凝膠中的張力負(fù)荷條件下的培養(yǎng)中，成纖維細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞增殖、膠原表達(dá)上升等，在該增殖中細(xì)胞的形態(tài)、液性因子的表達(dá)近似纖維化的狀態(tài)。另一方面，在沒有張力負(fù)荷的情況下，觀察不到這樣的增殖現(xiàn)象。即，如果獲得將成纖維細(xì)胞在膠原凝膠中、張力負(fù)荷下進(jìn)行培養(yǎng)時，與在無張力負(fù)荷的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時的表達(dá)蛋白質(zhì)或者表達(dá)RNA相比，僅在張力負(fù)荷的條件下表達(dá)或在張力負(fù)荷的條件下表達(dá)亢進(jìn)的蛋白質(zhì)、RNA，則其是成纖維細(xì)胞的增殖的因子、纖維化的因子的蓋然性高。對于這樣鑒定出的蛋白質(zhì)或RNA，使用siRNA等進(jìn)行敲低實驗，其結(jié)果如果是抑制成纖維細(xì)胞的增殖或者纖維化，則可以說是成纖維細(xì)胞的增殖因子或者纖維化的因子。
[0067]因此，本發(fā)明中可以以RNA等基因作為靶標(biāo)，也可以以蛋白質(zhì)作為靶標(biāo)。
[0068]在以蛋白質(zhì)作為靶標(biāo)的情況下，對于成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物和/或培養(yǎng)產(chǎn)物，可以進(jìn)行基于例如DD法(差異顯示法)的蛋白質(zhì)組解析等。即，利用二維電泳進(jìn)行展開、DD，對所得斑點用MALD1-T0F-MS進(jìn)行鑒定。針對鑒定出的蛋白質(zhì)實施功能抑制，確認(rèn)病態(tài)是否改善或是否存在其可能性。然后，調(diào)查該成為靶標(biāo)的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，探求其活性中心，設(shè)計對該活性中心以高親和性結(jié)合的化合物。蛋白質(zhì)組解析中的基于DD、siRNA等的功能抑制技術(shù)、利用計算機(jī)進(jìn)行的靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)解析以及基于生物學(xué)實驗的活性中心研究是常規(guī)技術(shù)。
[0069]作為用于這樣的解析的成纖維細(xì)胞，只要是樹立的細(xì)胞均可無限制地使用，因最終實施方式是人的成纖維細(xì)胞，故可以使用人的成纖維細(xì)胞。作為人的成纖維細(xì)胞，優(yōu)選可以示例出(XD-1113Sk細(xì)胞(ATCC N0.CRL2439、人皮膚真皮正常成纖維細(xì)胞、39歲黑人女性來源)、CXD-1109Sk (ATCC N0.CRL2361、人皮膚真皮正常成纖維細(xì)胞、白人21歲男性來源)、或CXD-1032Sk(ATCC N0.CRL2439、人皮膚真皮正常成纖維細(xì)胞、白人新生兒來源)等，這些可以通過從ATCC等有償分讓來加以利用。它們的培養(yǎng)可以使用加FBS的DMEM培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基等來進(jìn)行培養(yǎng)。
[0070] 此外，通過這樣利用蛋白質(zhì)組解析來對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，利用基因銀行等的基因信息，能夠推定對應(yīng)的基因的堿基序列。由此，能夠利用PCR擴(kuò)增出對應(yīng)的c-DNA、RNA。進(jìn)一步，還能夠制作siRNA、進(jìn)行敲除實驗。通過敲除實驗，能夠驗證該靶標(biāo)蛋白質(zhì)實際上是否對成纖維細(xì)胞的增殖、纖維化做出貢獻(xiàn)。
[0071](成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法)
[0072]經(jīng)過這樣的過程，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在成纖維細(xì)胞的膠原凝膠中的張力負(fù)荷培養(yǎng)、具體是在細(xì)胞附著于培養(yǎng)器的壁面或底面的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)的條件下，特異性地產(chǎn)生ETFB。即，在成纖維細(xì)胞的膠原凝膠中的培養(yǎng)中，以ETFB的產(chǎn)生量作為指標(biāo)，能夠鑒別是否促進(jìn)纖維化等成纖維細(xì)胞的異常增殖。
[0073]即，本發(fā)明的一個實施方式是:在成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法中，以ETFB (電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基)的表達(dá)的程度作為指標(biāo)的增殖狀態(tài)的鑒別方法，該成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法中，
[0074]在ETFB的表達(dá)的程度高的情況下，判定為發(fā)生成纖維細(xì)胞的異常增殖的蓋然性聞，
[0075]在ETFB的表達(dá)的程度低的情況下，判定為成纖維細(xì)胞的增殖保持正常的蓋然性聞。
[0076]這里，“以ETFB的表達(dá)的程度作為指標(biāo)”也可以說成“測定ETFB的表達(dá)的程度作為標(biāo)志”。
[0077]“發(fā)生成纖維細(xì)胞的異常增殖的蓋然性高”也可以說成“發(fā)生成纖維細(xì)胞的異常增殖的風(fēng)險高”?！俺衫w維細(xì)胞的增殖保持正常的蓋然性高”也可以說成“發(fā)生成纖維細(xì)胞的異常增殖的風(fēng)險低”?！俺衫w維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法”也可以說成是“成纖維細(xì)胞的異常增殖的風(fēng)險的預(yù)測方法”。
[0078]ETFB的表達(dá)的程度高的情況可以是指，被檢試樣的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相對于對照的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量高的情況，
[0079]ETFB的表達(dá)的程度低的情況可以是指，被檢試樣的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相對于對照的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相同或低的情況。
[0080]對于ETFB的表達(dá)的程度高的情況沒有限制，可以是例如，在被檢試樣的成纖維細(xì)胞中表達(dá)，但在對照的成纖維細(xì)胞中不表達(dá)；或者，在被檢試樣的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相對于對照的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量為150%以上、300%以上、500%以上；
[0081]對于ETFB的表達(dá)的程度低的情況沒有限制，可以是例如，在被檢試樣的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相對于對照的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量為相同或70%以下、50%以下、10%以下。
[0082]被檢試樣的成纖維細(xì)胞是有對成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)進(jìn)行鑒別的必要的對象的細(xì)胞，對其沒有特殊限制，可以是人、豬、猴、大猩猩、犬、牛、兔、大鼠、小鼠等哺乳動物等來源的細(xì)胞。
[0083]對照的成纖維細(xì)胞可以是對象的正常成纖維細(xì)胞或與對象同一或類似的生物種的正常成纖維細(xì)胞或樹立的正常成纖維細(xì)胞。作為樹立的正常成纖維細(xì)胞，可以使用與上述一樣的樹立的細(xì)胞。[0084]ETFB的表達(dá)的程度如后述，可以測定ETFB蛋白質(zhì)的表達(dá)，也可以測定編碼ETFB的RNA等基因的表達(dá)。對于成纖維細(xì)胞中的ETFB蛋白質(zhì)或編碼ETFB的基因的測定方法沒有特殊限制，例如可以這樣來進(jìn)行，按照常規(guī)方法破碎細(xì)胞，得到包含ETFB蛋白質(zhì)或編碼ETFB的基因的細(xì)胞提取液，采用如后述的通常的測定方法測定細(xì)胞提取液中所含的ETFB蛋白質(zhì)或編碼ETFB的基因。
[0085]在本發(fā)明中，“成纖維細(xì)胞的異常增殖”可以是指成纖維細(xì)胞的異常增殖引起的疾病狀態(tài)。對于成纖維細(xì)胞的異常增殖引起的疾病狀態(tài)沒有特殊限制，可以是例如纖維化(具體有增生性疤痕、瘢痕瘤、硬皮病、粉刺疤痕、肺纖維癥、肝纖維癥等)、成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化引起的纖維化等。
[0086]本發(fā)明的其他方面提供一種臟器中的纖維化的鑒別方法，該臟器中的纖維化的鑒別方法以被懷疑纖維化的臟器的成纖維細(xì)胞中的、ETFB的表達(dá)的程度作為指標(biāo)，其中，在ETFB的表達(dá)的程度高的情況下，判定為在該臟器中發(fā)生纖維化的蓋然性高，在未確認(rèn)到ETFB的亢進(jìn)的情況下，判定為發(fā)生纖維化的蓋然性低。
[0087]這里，“在臟器中發(fā)生纖維化的蓋然性高”也可以說成“在臟器中發(fā)生纖維化風(fēng)險高”?！鞍l(fā)生纖維化的蓋然性低”也可以說成“發(fā)生纖維化的風(fēng)險低”?！芭K器中的纖維化的鑒別方法”也可 以說成“臟器中的纖維化的風(fēng)險的預(yù)測方法”。
[0088]ETFB的表達(dá)的程度高的情況可以是指，被檢試樣在臟器中的表達(dá)量相對于對照中的表達(dá)量高的情況，
[0089]未確認(rèn)到ETFB的亢進(jìn)的的情況可以是指，被檢試樣在臟器中的表達(dá)量相對于對照中的表達(dá)量相同或低的情況。
[0090]對于ETFB的表達(dá)的程度高的情況沒有限制，可以是例如，在被檢試樣的臟器中表達(dá)，而在對照中不表達(dá)；或者，在被檢試樣在臟器中的表達(dá)量相對于對照中的表達(dá)量為150%以上、300%以上、500%以上；
[0091]對于ETFB的表達(dá)的程度低的情況沒有限制，可以是例如，在被檢試樣在臟器中的表達(dá)量相對于對照中的表達(dá)量為相同或70%以下、50%以下、10%以下。
[0092]被檢試樣的臟器是有對臟器中的纖維化進(jìn)行鑒別的必要的對象的臟器，對其沒有特殊限制，可以是人、豬、猴、大猩猩、犬、牛、兔、大鼠、小鼠等哺乳動物等來源的臟器。而且，從對象的臟器得到的培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)組織、血液等可以用作被檢試樣。
[0093]對照可以是對象的同一或其他臟器的正常部分或與對象同一或類似的生物種的臟器或細(xì)胞或者樹立的正常細(xì)胞。作為樹立的正常細(xì)胞，可以使用與上述一樣的樹立的細(xì)胞。
[0094]對于作為本發(fā)明的臟器中的纖維化的鑒別方法的對象“臟器”沒有特殊限制，可以是例如皮膚、肺或者肝臟等內(nèi)臟等。
[0095]ETFB的表達(dá)的程度如后述，可以測定ETFB蛋白質(zhì)的表達(dá)，也可以測定編碼ETFB的RNA等基因的表達(dá)。對于臟器的成纖維細(xì)胞中的ETFB蛋白質(zhì)或編碼ETFB的基因的測定方法沒有特殊限制，例如可以這樣來進(jìn)行，按照常規(guī)方法破碎細(xì)胞，得到包含ETFB蛋白質(zhì)或編碼ETFB的基因的細(xì)胞提取液，采用如后述的通常的測定方法測定細(xì)胞提取液中所含的ETFB蛋白質(zhì)或編碼ETFB的基因。
[0096](異常增殖抑制劑的鑒別方法)[0097]如果采用本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法，則可以通過在存在被檢物質(zhì)的條件下ETFB的產(chǎn)生量是提高還是受到抑制，來鑒別該被檢物質(zhì)是異常生長促進(jìn)劑還是異常增殖抑制劑。
[0098]這里，異常增殖可以是指成纖維細(xì)胞的異常增殖引起的疾病狀態(tài)。對于成纖維細(xì)胞的異常增殖引起的疾病狀態(tài)沒有特殊限制，可以是例如纖維化(具體有增生性疤痕、瘢痕瘤、硬皮病、粉刺疤痕、肺纖維癥、肝纖維癥等)、成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化引起的纖維化等。
[0099]本發(fā)明的一個方面提供一種纖維化抑制劑的鑒別方法，其中，將成纖維細(xì)胞在張力存在下的膠原凝膠中、在存在或不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，
[0100]在與不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時相比，存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時ETFB的表達(dá)量低的情況下，將該被檢物質(zhì)作為纖維化抑制劑。
[0101]對于與不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時相比，存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時ETFB的表達(dá)量低的情況沒有限制，可以是例如，存在被檢物質(zhì)的條件下不表達(dá)，或者存在被檢物質(zhì)的條件下的ETFB的表達(dá)量為不存在的條件下的ETFB的表達(dá)量的70%以下、50%以下、10%以下。
[0102]膠原凝膠中的存在或不存在被檢物質(zhì)的條件下的培養(yǎng)，可以是陰性對照的細(xì)胞的增殖良好、存在或不存在被檢物質(zhì)的條件下的細(xì)胞的增殖差異明確的培養(yǎng)條件，對其沒有限制，可以通過例如，在膠原濃度0.05~0.5?七％凝膠中、30~40°C、培養(yǎng)12~72小時來進(jìn)行。
[0103]“纖維化抑制劑的鑒別方法”也可以說成“纖維化抑制劑的篩選法”。
[0104]作為被檢物質(zhì)，可以是天然物或合成品，可以是通?？勺鳛獒t(yī)藥等的候選物質(zhì)的那些，具體可以列舉出植物和微生物來源的提取物及其純化品、小分子合成化合物、抗體、肽、適體、siRNA、可用于基因治療的核酸、其修飾體、衍生物等。
[0105]在這樣的鑒別中，ETFB可以以蛋白質(zhì)的形式來定量，也可以以編碼ETFB的RNA等基因的形式來定量。作為蛋白質(zhì)或基因的定量方法，可以使用常規(guī)方法。可以采用例如，凝膠電泳法、Western印跡法、ELISA法等免疫測定法、免疫組織化學(xué)分析法、Northern印跡法、PCR法等來進(jìn)行測定。RNA等基因的定量中可以采用基于PCR的擴(kuò)增法，因而特別優(yōu)選。
[0106]在將ETFB以蛋白質(zhì)的形式來定量的情況下，可以使用可對凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色的試劑、特異性識別ETFB的抗體?？贵w可以是單克隆抗體、多克隆抗體中的任一種。這些抗體可以采用公知的方法生產(chǎn)?？贵w視需要，可以用熒光色素、放射性同位元素、酶等進(jìn)行標(biāo)記。
[0107]在將ETFB以基因的形式進(jìn)行定量的情況下，可以使用由能夠與ETFB的mRNA特異性雜交的核酸引物以及能夠與以所述mRNA作為模板合成的cDNA特異性雜交的核酸引物組成的I對核酸引物。引物可以基于作為測定的對象的基因的序列信息來設(shè)計。
[0108]作為用于PCR反應(yīng)的引物，可以使用例如，序列表的SEQ ID N0:1或者序列表的SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸。包含該序列作為部分序列、且能夠擴(kuò)增編碼ETFB的堿基序列的、顯示同樣效果的寡核苷酸也屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。作為該寡核苷酸的長度沒有限制，可以是例如，10~50個堿基、15~30個堿基左右。
[0109](異常增殖抑制劑)[0110]如此這般，對被檢物質(zhì)進(jìn)行評價，對于確認(rèn)了 ETFB表達(dá)的抑制作用的那些，可以判定為成纖維細(xì)胞異常增殖抑制劑。該成纖維細(xì)胞異常增殖抑制劑通過將該抑制劑作為有效成分加工成皮膚外用劑、醫(yī)藥組合物，可以作為疤痕、特別是增生性疤痕等的成纖維細(xì)胞異常增殖引起的疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥。作為預(yù)防藥，例如，優(yōu)選可以列舉出在疤痕特別是增生性疤痕等發(fā)生的蓋然性高的部位、例如手術(shù)中的切除位置的周圍等、在增生性疤痕發(fā)生前預(yù)先施用，來防止增生性疤痕的生成，或者預(yù)先施用來使已發(fā)生的增生性疤痕不惡化；在治療方面，優(yōu)選可以示例出這樣的應(yīng)用:施用于業(yè)已生成的增生性疤痕等疤痕，來縮小該疤痕。該醫(yī)藥的制劑化可以通過加入所述纖維芽異常增殖抑制劑和用于制劑化的任意成分、例如賦形劑、崩解劑、結(jié)合劑、著色劑、矯味劑、除臭劑、分散劑、表面活性劑等，按照常規(guī)方法來進(jìn)行處理，加工成醫(yī)藥制劑。作為醫(yī)藥制劑，可以加工成內(nèi)服藥、外用劑、注射劑等劑型，特別優(yōu)選加工成外用劑。
[0111]此外，對于皮膚片等從生物體采集的樣品，通過利用PCR等確認(rèn)該樣品中ETFB怎樣程度地表達(dá)，可以知道該樣品周圍的疤痕化傾向。
[0112]以下，列舉實施例進(jìn)行更詳細(xì)的說明。
[0113]實施例1
[0114](細(xì)胞培養(yǎng))
[0115]就人皮膚正常成纖維細(xì)胞的種類而言，有許多可以從ATCC獲得的細(xì)胞，但優(yōu)先使用了與作為瘢痕瘤細(xì) 胞株的(KELFIB)的概貌(profile)最為接近的(XD_1113Sk細(xì)胞(39歲黑人女性來源)。
[0116]將成纖維細(xì)胞用添加了 10% FBS的DMEM(D-6046、Sigma)的培養(yǎng)基在組織培養(yǎng)燒瓶(353024、BD FALCON))中于設(shè)定為37°C、CO2濃度5%的環(huán)境下的孵育器(M14-3158、Forma Scientific、SANYO)中進(jìn)行培養(yǎng)。傳代時，用PBS洗滌細(xì)胞后，添加0.05%胰蛋白酶溶液(T4049、Sigma)，于孵育器中溫育2~3分鐘,然后回收細(xì)胞,進(jìn)行傳代來使用。傳代每隔3~4日實施，該情況下，使用傳代數(shù)至7~12為止的那些。
[0117](膠原凝膠中的細(xì)胞培養(yǎng))
[0118]膠原凝膠中的培養(yǎng)按Varedi等的方法的改進(jìn)方法進(jìn)行。即，從粉末培養(yǎng)基制作通常的5倍濃縮的DMEM(5xDMEM、D5523、Sigma)，按以下所示的混合比制作了膠原溶液，使得最終成為與DMEM培養(yǎng)基同樣的組成。制作的膠原溶液在恒溫槽中于12°C保存至使用。用膠原原液的必要量(lmg/mL 時為 7mL)、5xDMEM7mL、200mM HEPES3.5mL、0.03% NaH2C033.5mL、0.01% NaOHl.5mL、FBS必要量(10%時為3.5mL)、H2O使得總量為31.5mL。在制作基底層(Basal layer)的情況下，預(yù)先在24孔或6孔組織培養(yǎng)平板(24孔；353047、6孔;353046、BD FALCON)上添加膠原溶液(24孔時為250 μ L、6孔時為ImL)，于孵育器中靜置15分鐘以上使膠原凝固。
[0119]制作IxlO6細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸浮液，將其與12°C保存的膠原溶液以膠原溶液:細(xì)胞懸浮液=9:1的混合比進(jìn)行混合，充分?jǐn)嚢韬?，迅速接種于平板，移動至孵育器。接種量為24孔平板lmL、6孔平板4mL (均為IxlO5細(xì)胞/mL)。在制作懸浮凝膠的情況下，于孵育器中培養(yǎng)2小時后，用藥勺從孔的邊緣剝離凝膠，使之游離，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0120](細(xì)胞計數(shù))
[0121]在經(jīng)過各實驗確定的培養(yǎng)時間后，將膠原凝膠用藥勺從平板剝離，并添加至使用DMEM制備的最終濃度310U/mL的膠原酶溶液中，于37°C振蕩20~40分鐘，消化膠原。消化的細(xì)胞懸浮液以1500rpm離心3~5分鐘進(jìn)行分離，回收細(xì)胞。對于回收的細(xì)胞,添加100 μ L的培養(yǎng)基，實施臺盼藍(lán)染色后，使用Burkel-Turk血球計數(shù)板以1/5的稀釋率對活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。
[0122](TUNEL 染色)
[0123]消化膠原凝膠的膠原，回收細(xì)胞后，加入ImL的DMEM培養(yǎng)基和細(xì)胞固定液(Collection Fluid、6768315、Thermo Shandon)，顛倒混合。將該細(xì)胞懸浮液用Cytospin (Thermo scientific)進(jìn)行離心,將其附著于載玻片，制作了標(biāo)本。對于所制作的標(biāo)本，使用 in situ Apoptosis Detection Kit (MK500, Takara)按照操作說明書實施了TUNEL染色。鏡檢使用熒光顯微鏡(ECLIPSE E600,Nikon)以100~400倍的倍率來進(jìn)行，觀察附著條件下和游離條件下的陽性細(xì)胞出現(xiàn)。
[0124](二維電泳) [0125]附著狀態(tài)和游離狀態(tài)培養(yǎng)的膠原凝膠平板分別制作8~10張，培養(yǎng)后I日像前述方法那樣消化膠原。但為了盡可能抑制膠原酶引起的非特異性的蛋白質(zhì)分解，在 ImM 的鹽酸苯甲脈水合物(Benzamidinehydrochrolide Hydrate) (B6506、Sigma)和0.1mM的N- α -對甲苯磺酰基-L-賴氨酸氯甲基酮鹽酸(N- a -p-Tosy 1-L-LysineChloromethylketone Hydrochloride) (TLCK、T7254、Sigma)存在下實施。
[0126]對消化后的細(xì)胞進(jìn)行離心分離，回收于Eppendorf管中，用PBS洗滌2次。在此期間的作業(yè)盡可能在冰冷下實施。此時的細(xì)胞濕重為100~200mg。膜級分的提取使用ProteoPrep Membrane Extraction Kit (Sigma)按操作說明書進(jìn)行。而且，融化細(xì)胞時，按操作說明書添加蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail、P2714、Sigma)和憐酸酶抑制劑(Phosphatase inhibitor cocktail I&I1、P2850&P5726、Sigma)。提取的蛋白質(zhì)用Coomassie Protein Assay Reagent Kit (2320、PIERCE)按操作說明書對蛋白質(zhì)量進(jìn)行測定，保存于低溫冰箱中直至使用。I次提取的提取率(從細(xì)胞的濕重得到的膜蛋白質(zhì)的量)為約1/300。
[0127]二維電泳使用Pharmacia公司的二維電泳裝置來實施。等電點電泳使用18cm的凝膠(Immobile Dry Strip、Amersham),研究了 pi 范圍:3 ~IONL (non-linear)、5.5 ~6.7 和6~9。蛋白質(zhì)的上樣量為100~300 μ g。等電點電泳按照操作說明書采用Cup loading法進(jìn)行展開。電泳裝置使用Ettan IPGphor IEF System(Amersham),展開條件是如下所示的條件。
[0128]50 μ A/Strip、20°C
[0129]SI:Gradient500Vlmin.[0130]S2:Gradient4000V4h
[0131]S3:Step-n-hold8000V10h
[0132]S4:Step-n-hold6000V 至回收
[0133]等電點電泳后，用Multiphor II electrophoresis unit (18-1018_06、Amersham)和 Electrophoresis Power supply (19-3500-01、Amersham)實施了 SDS-PAGE。凝膠使用預(yù)制凝膠(Excel-Gel SDS、80-1255_53、Amersham、245X 110mm、0.5mm 厚、Gradient8_18% )，電泳條件為 S1:600V、400mA、13W、30min ；S2:600V、400mA、30W、16h。對于展開后的凝膠，應(yīng)用自動染色裝置(Hoefer Processor Plus、Amersham)用 Silver stain MSkit (299-58901、和光純藥)按操作說明書實施了銀染色，實施染色使得各凝膠的染色條件等同。而且，顯影時間為6分鐘。重復(fù)以上的操作，對附著狀態(tài)和游離狀態(tài)，每pi范圍分別制作了 5張凝膠。在8.7%甘油液中于4°C保存直至MALD1-TOF-MS解析。
[0134](差異顯示解析)
[0135] 對于染色結(jié)束后的凝膠，使用掃描儀(ImageScanner III>28-9076-07>Amersham)掃描錄入計算機(jī)。對于錄入的圖像，使用圖像解析軟件(2D Master Elite Ver.4.01>2DMaster Database Ver.4.00、Amersham)按照以下的順序?qū)嵤┙馕?。DD中的整體流程如下所示。
[0136](I)利用計算機(jī)進(jìn)行斑點的自動檢測，通過目測確認(rèn)對重復(fù)斑點進(jìn)行修正
[0137](2)在未作為斑點檢測到的凝膠的背景和染色的斑點整體的染色強度的凝膠間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化
[0138](3)對凝膠間因遷移率而被識別為共通存在的斑點進(jìn)行編號(匹配，這里檢測的編號稱為Match N0.)，以及相同樣品的電泳圖像是否真正等同的統(tǒng)計處理(本處理中判斷為等同的凝膠用于DD)。
[0139](4)通過t檢驗進(jìn)行DD (剔除率10% )
[0140]此外，同時通過目測實施DD，判斷計算機(jī)處理計算出的斑點是否真正存在染色強度差異；以及，實施在計算機(jī)處理中未判定為顯著、但目測中強度不同的斑點的追加。
[0141]〈1>斑點檢測
[0142]用ImageScanner III對讀取的圖像進(jìn)行修整,使之大小等同。用2DMaster Elite按以下參數(shù)實施自動斑點檢測。
[0143]Peak Dilation Parameters:
[0144]Min.Peak Area85
[0145]Max.Peak AreallOO
[0146]Min.Aspect Ratio0.4
[0147]Max.Aspect Ratio4.5
[0148]Min.Area Ratio50
[0149]<2>背景除去和斑點強度標(biāo)準(zhǔn)化
[0150]按照操作說明書實施2D Master Elite中加載的背景除去設(shè)定和掃描到的凝膠染色濃度的標(biāo)準(zhǔn)化的作業(yè)。
[0151]Max.Number of Touching Peaks20
[0152]Background Intensity。
[0153]Step Sizel
[0154]Smoothing Sizel
[0155]Histogram Equalization 無
[0156]Tidy Edges 有
[0157]然后，目測確認(rèn)斑點，實施了重復(fù)識別的斑點的修正。
[0158]<3>斑點匹配和凝膠等同性判斷
[0159]將斑點像良好且斑點數(shù)多的游離狀態(tài)的凝膠像設(shè)定為Reference gel，按照操作說明書實施了斑點的匹配。此外，使用2D Master Database中加載的Test Hypothesis功能，實施與Reference gel的Dunnett檢驗,對于5張凝膠中有3張以上確認(rèn)為等同的組實施了〈4>的作業(yè)。
[0160]<4>附著狀態(tài)和游離狀態(tài)的培養(yǎng)細(xì)胞的DD
[0161]使用2D Master Database對匹配的斑點實施剔除率10%的t檢驗,提取了斑點強度上有差異的。然后，對算出的斑點進(jìn)行目測確認(rèn)，確認(rèn)了目測中是否也存在差異。此外，同時對斑點整體進(jìn)行目測再確認(rèn)，追加計算機(jī)處理中未檢測到的、附著狀態(tài)-游離狀態(tài)下濃度有差異的斑點。
[0162]對于采用前述手段確認(rèn)了表達(dá)量存在差異的斑點，利用MALD1-T0F-MS實施了推定。對于通過解析判斷為等同的3~4張凝膠，切下表達(dá)量多的組的斑點。由于預(yù)想蛋白量少，因而將這些凝膠片段匯總作為一個樣品用于試驗。斑點的脫銀和胰蛋白酶消化使用96孔的胰蛋白酶消化裝置和試劑盒(Montage In-GelDigest Kit、Millipore)按照操作說明書來實施。將實施了胰蛋白酶消化的蛋白質(zhì)與基質(zhì)一起在錨芯片(74115、Bruker Daltonics)上(CHCAmatrix ; 10mg/mLa-CHCA in acetone-Ethanoll:lv/v)點樣 1 μ L,干燥后用 MALD1-TOF-MS (AutoFlex I1、Bruker Daltonics)實施 Peptide MassFingerprinting(PMF)解析。PMF解析是根據(jù)從基質(zhì)飛出的肽片段的質(zhì)量模式推定蛋白質(zhì)的方法。對于含有足夠量的蛋白質(zhì)的斑點，實施了類似MS/MS解析、能夠解析氨基酸序列的Post Source Decay (PSD)解析，進(jìn)行了鑒定。將解析結(jié)果用于數(shù)據(jù)庫檢索并得到了結(jié)果，其中，該數(shù)據(jù)庫使用MASCOT (Ver.1.9、Matrix science), PMF解析中得到的結(jié)果中將在基于MOffSE算法的得分分布中概率95%以上、在MASCOT上計算出的分子量和等電點等同的確定為該蛋白。PSD解析中，根據(jù)其氨基酸序列使用該數(shù)據(jù)庫對候選物進(jìn)行檢索，將分子量和等電點等同的作為該蛋白質(zhì)。在本實驗條件下，使用BSA的PMF解析中的檢測下限為5fmol。
[0163]對于總計31個斑點進(jìn)行了確定。MALD1-TOF-MS中確定的蛋白的列表如表1和2。在31個斑點中，確定的蛋白為18個(中性區(qū)域8個、堿基性區(qū)域10個)。其中，在附著狀態(tài)下表達(dá)量高的蛋白有8個，在游離狀態(tài)下表達(dá)量高的蛋白有9個，被認(rèn)為是斑點移動的蛋白有I個。此外，定位于膜的蛋白為9，定位于核的為2，定位于細(xì)胞質(zhì)的為3，分泌蛋白為1，不明的為3。雖未得到外膜的蛋白，但在某種程度上得到了細(xì)胞內(nèi)的膜蛋白，總蛋白大量獲得的伴侶蛋白有2種，可以認(rèn)為級分化是有效果的。在附著狀態(tài)下表達(dá)量高的8種蛋白中定位于線粒體膜的有3種，存在于核的有2種，定位于膜的有I種，定位不明的有2種。此外，所得蛋白中，就涉及創(chuàng)傷治愈和疤痕形成的報告而言，存在下述報告:檸檬酸合酶(Citratesynthase)在創(chuàng)傷形成后10日內(nèi)表達(dá)量提高,半乳糖凝集素_3 (Galectin_3)的敲除小鼠中確認(rèn)角膜創(chuàng)傷后的再上皮化延遲，ETFB在對成纖維細(xì)胞照射低輸出的紅色光時表達(dá)上升；其他不明。
【權(quán)利要求】
1.一種成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài)的鑒別方法，該方法以ETFB(電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基)的表達(dá)的程度作為指標(biāo)，其中， 該ETFB的表達(dá)的程度高的情況下，判定為發(fā)生成纖維細(xì)胞的異常增殖的蓋然性高， 該ETFB的表達(dá)的程度低的情況下，判定為成纖維細(xì)胞的增殖保持正常的蓋然性高。
2.權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其中， 所述ETFB的表達(dá)的程度高的情況是被檢試樣的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相對于對照的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量高的情況， 所述ETFB的表達(dá)的程度低的情況是被檢試樣的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相對于對照的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量相同或低的情況。
3.權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其中，所述成纖維細(xì)胞的異常增殖是纖維化。
4.權(quán)利要求3所述的鑒別方法，其中，所述纖維化歸因于成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化。
5.權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其中，成纖維細(xì)胞的異常增殖是增生性疤痕的形成。
6.一種臟器中的纖維化的鑒別方法，該臟器中的纖維化的鑒別方法以被懷疑纖維化的臟器的成纖維細(xì)胞中的、ETFB的表達(dá)的程度作為指標(biāo)，其中， ETFB的表達(dá)的程度高的情況下，判定為該臟器中發(fā)生纖維化的蓋然性高， 未確認(rèn)到ETFB的亢進(jìn)的情況下，判定為發(fā)生纖維化的蓋然性低。
7.—種權(quán)利要求6所述的臟器中的纖維化的鑒別方法，其中， 所述ETFB的表達(dá)的程度高的情況是被檢試樣的臟器中的表達(dá)量相對于對照中的表達(dá)量高的情況， 未確認(rèn)到ETFB的允進(jìn)的情況是被檢試樣在臟器中的表達(dá)量相對于對照中的表達(dá)量相同或低的情況。
8.權(quán)利要求6所述的臟器中的纖維化的鑒別方法，其中，所述臟器為皮膚。
9.一種纖維化抑制劑的鑒別方法，其中， 將成纖維細(xì)胞在張力存在下的膠原凝膠中、于存在和不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)， 在與不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時相比，存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時ETFB的表達(dá)量低的情況下，將該被檢物質(zhì)作為纖維化抑制劑。
10.權(quán)利要求9所述的異常纖維化抑制劑的鑒別方法，其中，所述纖維化為增生性疤痕的形成。
11.權(quán)利要求10所述的纖維化抑制劑的鑒別方法，其中，所述纖維化為皮膚的增生性疤痕。
12.權(quán)利要求1~11中任一項所述的鑒別方法，其中，所述ETFB的表達(dá)為蛋白質(zhì)的表達(dá)。
13.權(quán)利要求1~11中任一項所述的鑒別方法，其中，所述ETFB的表達(dá)為RNA的表達(dá)。
14.權(quán)利要求13所述的鑒別方法，其中，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測定ETFB的表達(dá)的程度。
15.權(quán)利要求14所述的鑒別方法，其中，用于所述PCR的引物是: SEQ ID NO:1所述的寡核苷酸或具有其作為部分序列、且能夠擴(kuò)增編碼ETFB的堿基序列的寡核苷酸；以及 SEQ ID NO:2所述的寡核苷酸或具有其作為部分序列、且能夠擴(kuò)增編碼ETFB的堿基序列的寡核苷酸。
16.一種纖維化抑制劑，其由下述被檢物質(zhì)組成: 將成纖維細(xì)胞在張力存在下的膠原凝膠中、于存在和不存在被檢物質(zhì)的條件下培養(yǎng)，與在不存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時相比，在存在被檢物質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時，ETFB的表達(dá)量低。
17.權(quán)利要求16所述的纖維化抑制劑，其中，所述纖維化是增生性疤痕的形成。
18.—種增生性疤痕處置藥物，其以權(quán)利要求16所述的纖維化抑制劑作為有效成分。
19.權(quán)利要求18所述的增生性疤痕處置藥物，其用于已發(fā)生的增生性疤痕的治療。
20.權(quán)利要求18所述的增生性疤痕處置藥物，其用于預(yù)防，使得已發(fā)生的增生性疤痕不惡化。
21.權(quán)利要求18所述的增生性疤痕處置藥物，其用于預(yù)防，以防止產(chǎn)生發(fā)生蓋然性高的疤痕。
22.能夠擴(kuò)增編碼ETFB的堿基序列的、與SEQID NO:1或2所示的寡核苷酸基本相同的寡核苷酸。
【文檔編號】C12N15/09GK103917659SQ201180074671
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月5日
【發(fā)明者】廣川重成, 北島裕之, 島貫智匡 申請人:寶麗制藥股份有限公司