用于預測體外受精的成功的新方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明包括一種基于比率確定成功懷孕的方法，所述比率表示為使用在受試者的樣品，優(yōu)選為尿液樣品中存在的乳酸菌和葡萄球菌與存在的細菌總量之間的關系的公式。本發(fā)明還包括一種用于實施本發(fā)明的方法并且輸出結果的試劑盒，優(yōu)選為qPCR試劑盒。這種方法和試劑盒在正在經(jīng)歷或符合進行人工受精方法的條件(例如IVF或ICSI)的受試者中預測成功懷孕的可能性是尤其有利。
【專利說明】用于預測體外受精的成功的新方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及人類生殖的領域，更具體地涉及人類生殖失敗的狀況。在這種情況中，人工方法被適當?shù)赜糜趨f(xié)助婦女懷孕，但是這些治療的成功比較低，并且更重要地是，這些治療的成功是不可預測的。本發(fā)明現(xiàn)提供了一種更可靠的方法，用于預測體外受精中的成功的可能性。
【背景技術】
[0002]在西方世界，生育能力低下影響10%至15%的夫婦。這種生育能力低下在一半情況中可歸因于女性因素，在20%至26%的情況中可歸因于男性因素，并且在25%至30%的情況中的因素是未知的(Evers，J.L.，2002，Lancet360:151-159)。許多夫婦轉向體外受精(IVF)或胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)來滿足他們想要孩子的愿望。這些技術的成功率約為每個起始周期的 25% (Andersen, A.等人.2007，Hum.Reprod.22:1513-1525)。如果能夠提高該成功率，將具有極大的情感和經(jīng)濟效益。考慮到輔助的懷孕治療的個人和社會的負擔，可取的是識別具有非常低的成功可能性的夫婦和具有高自然懷孕可能性的夫婦。特別是不育的原因是未知的夫婦顯示出高自然懷孕率，并且期待治療對于他們是可取的(Brandes，Μ.等人.，2011，Hum.R印rod.26:360-368)。因此，為了改進該治療并且為了確定個體情況中是否繼續(xù)，就需要有能夠準確預測婦女在IVF/ICSI之后是否會懷孕并且活產(chǎn)(livebirth)的模型。十多年來，已經(jīng)獲得了多種模型，這些模型基于臨床數(shù)據(jù)(包括年齡、先前失敗的IVF嘗試的數(shù)目以及不育的可能原因)來預測活產(chǎn)的可能性(Templet0n，W.等人.，1996，Lancet348:1402-1406)。對于大規(guī)模的組來說，預測的活產(chǎn)與觀測到的活產(chǎn)的比率為40%?60% (Nelson, S.Μ.和 Lawlor D.A.2011, PLOS Medicine8:1-10)。這些作者利用了更多年齡分層和不育的原因、(待)使用的程序、卵細胞的來源和想要孩子的愿望的持續(xù)時間，基于來自超過140000婦女的數(shù)據(jù)開發(fā)了一種改進的模型。當新模型的報告操作曲線(reporter operated curve)的曲線下的面積(AUROC)被用于指示該新模型功能如何時,報道了輕微但顯著的增加(從0.6184增加至0.6335)。該模型似乎給出了對較大組(多于10000)的婦女的良好預測。然而，還未知的是該模型對于個體的預測怎么樣。
[0003]實現(xiàn)活產(chǎn)的途徑可歸納為三個關鍵步驟:卵細胞的受精，受精卵被女性環(huán)境接受，以及受精卵進一步發(fā)育直到實現(xiàn)實際的活產(chǎn)。當?shù)谝徊襟E是人工進行(諸如IVF和ICSI)時，可以通過第二步驟的標記物描述成功獲得活產(chǎn)的可能性。然而，影響受精卵的接受的因素幾乎是未知的。因此，目前不可能在該第二步驟中建立預測成功的標準。
[0004]因此，仍然需要一種能夠基于個體更可靠地預測成功的IVF/ICSI治療的可能性的模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以開發(fā)一種模型，該模型能夠在個體基礎上將成功的(或未成功的)IVF/ICSI治療的可能性的預測增加至75%至100%。[0006]本發(fā)明包括一種預測受試者成功懷孕的可能性的方法，所述方法包括以下步驟:
[0007]a.采集尿液樣品；
[0008]b.確定乳酸菌菌種和葡萄球菌菌種的量占所述樣品中存在的細菌總量的百分比；
[0009]c.基于所述細菌之間的比率預測成功懷孕的可能性。
[0010]優(yōu)選地，在所述方法中，所述受試者正在經(jīng)歷人工受精的方法或符合進行人工受精方法的條件，該人工受精的方法例如為IVF或ICSI。在另一優(yōu)選的實施方案中，乳酸菌種為卷曲乳酸菌，并且所述葡萄球菌種為金黃色葡萄球菌。
[0011]進一步優(yōu)選地，通過PCR，更優(yōu)選通過qPCR來進行所述細菌的量的測量。然后在該方法中，優(yōu)選通過使用引物5’ -GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3’和5’ -GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3’來確定葡萄球菌，并且優(yōu)選通過使用引物5’ -GAITTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3’ 和 5’ -AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3’ 來確定乳酸菌。
[0012]可替代地，通過質譜分析法，更優(yōu)選通過MALD1-T0F質譜分析法來進行所述細菌的量的測量。
[0013]更具體地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，通過以下公式確定成功懷孕的可能性:
[0014]Y = a*(%乳酸菌)-b*(%葡萄球菌)-c,
[0015]其中，
[0016]a 具有 0.025 ?0.051 的值；
[0017]b 具有 0.04 ?0.07 的值；
[0018]c 具有-1.10 ?-0.66 的值；
[0019]%乳酸菌為以占細菌總量的百分比的形式表示的乳酸菌細菌的量；
[0020]%葡萄球菌為以占細菌總量的百分比的形式表示的葡萄球菌細菌的量；
[0021]以及其中Y代表成功的可能性。
[0022]優(yōu)選地，在該公式中，a具有0.025?0.04的值；還優(yōu)選地b具有0.04?0.06的值；并且進一步優(yōu)選地c具有-1.06?-0.9的值，更優(yōu)選具有-1.06?-1.01的值。
[0023]在其中檢測細菌的樣品可為尿液樣品，并且優(yōu)選該細菌在中段尿液樣品中檢測，但是該樣品也可為陰道樣品，例如陰道涂片。
[0024]本發(fā)明還包括一種用于預測成功懷孕的可能性的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0025]a.用于測量來自受試者的樣品中的細菌總含量的構件；
[0026]b.用于測量乳酸菌細菌的含量的構件；
[0027]c.用于測量葡萄球菌細菌的含量的構件；
[0028]d.根據(jù)上述限定的公式計算可能性的構件。
[0029]優(yōu)選地，在這樣的試劑盒中，用于測量乳酸菌細菌的含量的構件包括引物5’ -GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3’ 和 5’ -AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3’，而用于測量葡萄球菌細菌的含量的構件包括引物5 ’ -GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3 ’和5’ -GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3’。還優(yōu)選地，在這樣的試劑盒中，用于測量來自受試者的樣品中的細菌總含量的構件包括對細菌16s rDNA具有特異性的通用引物組，更優(yōu)選地，所述通用引物組包括至少一個正向EUB引物和至少一個反向EUB引物。
[0030]進一步優(yōu)選地，在所述試劑盒中，用于計算可能性的構件包括處理器，所述處理器能夠接收測量的細菌值作為輸入，并且根據(jù)上述限定的式計算可能性，并且優(yōu)選地，該處理器能夠將可能性輸出至信號構件，所述信號構件能夠被使用所述試劑盒的人員讀出。
【具體實施方式】
[0031]在下列描述和實施例中，使用了許多術語。為了提供對說明書和權利要求書(包括這些術語被給予的范圍)的清楚且一致的理解，提供了以下限定。除非本文另有限定外，本發(fā)明使用的技術術語和科學術語具有本發(fā)明所屬領域的普通技術人員的常規(guī)理解的含義。
[0032]‘IVF’或體外受精為將卵細胞(卵子)移出婦女卵巢的過程。該卵細胞在實驗室程序中經(jīng)精子受精，并且隨后將受精卵(胚胎)送回到婦女的子宮中。
[0033]iIcsr代表胞漿內(nèi)精子注射，是精子被直接注射到卵細胞中以實現(xiàn)受精的試管受精程序。ICSI主要用于男性不育并且可形成TVF程序的一部分。
[0034]‘中段尿液’在本文中被限定為在尿道口已經(jīng)(通過已流過的尿液)仔細清洗之后，在尿液流出的中間過程中收集的尿液樣本。中段尿液樣品也被稱為‘清潔的捕獲樣本’。
[0035]‘尿路感染(UTI) ’是影響尿路的任一部分的細菌感染。癥狀包括頻繁的排尿感和/或需要排尿、排尿過程中的疼痛和尿液混濁。
[0036]‘ 16S rDNA’為細胞核的核仁中的DNA，編碼隨后形成核糖體成分的RNA類型，在核糖體上完成信使RNA向蛋白質鏈的翻譯。不同生物體的核糖體RNA的基因序列比對已被用于確定生物體之間的進化關系。
[0037]本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過在女性的泌尿-生殖區(qū)中的細菌菌群的構建形成預測受精卵成功植入在子宮內(nèi)的因素之一。已知的是，(例如在腸或陰道內(nèi)的)細菌菌群的構成是它們的直接環(huán)境的反映，并且該構成能夠根據(jù)其環(huán)境的改變而改變。例如，明顯地發(fā)現(xiàn)，在所有人群中，腸道中的常駐細菌并不是我們遇到的多種細菌種的隨機集合。它們是明顯不同的菌群，與其寄主所提供的環(huán)境處于動態(tài)平衡(Blaser，M.J.和Falkow，S.,2009,NatureRev.Microbiol.7:887-894) 0人類的腸中帶有細菌，這些細菌因為它們賦予了人類腸細胞所缺乏的能力且響應它們的宿主的飲食的能力而被接受(De Filippo, C.等人.，2010，PNAS107:14691-14696)。事實上，飲食的改變是細菌生存環(huán)境的化學構成的改變。其它會影響腸道微生物構成的環(huán)境因素包括宿主因素，例如(免疫)防御系統(tǒng))、細胞表面特征和它們存在的小生境的物理特征(Backhed, F.等人.,2005, Science307:1915-1920)。
[0038]來自尿生殖道的實例為當陰道條件改變時，陰道的細菌菌群發(fā)生變化。一般來說，陰道提供了低PH環(huán)境，該低pH環(huán)境有利于由I至6種細菌種組成的且乳酸菌種占主導的菌群(Fredricks, D.N.等人.，2005, New Eng.J.Med., 353:1899-1911) ? 乳酸菌進一步維持了低PH，且還積極地保護它們的小生境以抵御其它細菌。在患有細菌性陰道病的婦女中，PH較高，陰道細菌菌群擴展至17種，并且極大地減小了乳酸菌的存在從而有利于致病細菌的入侵。細菌菌群構成中的這種轉變的開始可為乳酸菌種的減少或為其它細菌的入侵。然而，持續(xù)會成為乳酸菌種的減少、PH的增加和在新狀況中生長旺盛的菌種(例如葡萄球菌)的增加之間的動態(tài)平衡(shifting balance)。如果這些轉變先于陰道病的癥狀,則該轉變平衡仍會被建立。
[0039]在對患有或未患有尿道炎的男性中的小規(guī)模研究中，發(fā)現(xiàn)細菌菌群可被用于預測特定狀況的跡象，其中用廣譜16s rDNA分析法研究細菌菌群(Riemersma，W.A.等人，2003，J.Clin.Microbiol.41:1977-1986)。三種迄今為止未知的細菌的存在與未患有尿道炎相關。
[0040]在得到本發(fā)明的研究中，發(fā)明人主要追問兩個問題:婦女的尿液細菌菌落持有婦女的內(nèi)部環(huán)境是否適于進行IVF或ICSI以實現(xiàn)懷孕的信息嗎，以及細菌菌群與尿路感染的改變的風險相關嗎？引導第一個目標的想法是:IVF或ICSI的成功的第一步是在卵細胞必須著床的過程中，異物(受精卵)被婦女內(nèi)部環(huán)境接受。該內(nèi)部環(huán)境將受激素的調控。該調控的性質并未完全已知，但是可能的是激素的調控將不僅僅影響子宮內(nèi)的條件，還影響身體內(nèi)的其它地方(如尿路)的條件。因而，激素的調控將影響異物的接受、在該尿路中的常駐菌群?；谶@種想法，制定了兩個假設來推動該研究:第一，婦女體內(nèi)的細菌菌群指示了受精卵將在多大程度上被接受；并且第二，尿液中的細菌菌群將對婦女在懷孕時體內(nèi)發(fā)生的環(huán)境改變作出反應。在懷孕期間，尿路經(jīng)歷解剖學變化，例如腎盂和尿道的擴張、膀胱的位移，以及與膀胱平滑肌的松弛和化學改變(尿液pH、尿滲透壓、糖尿和氨基酸尿)有關的尿停滯?？梢灶A期這些被改變的條件更適宜于除了常駐細菌之外的細菌類型。由于常駐細菌也可為尿路自身的內(nèi)部問題(感染)的來源，因此在研究中，還研究了尿液中的細菌菌群的構成和尿路感染之間的關系。
[0041]在該研究中，顯示出在測試的所有情況(懷孕、未懷孕、在IVF/ICSI后未懷孕)下，發(fā)現(xiàn)五種細菌菌種/菌株的核心組。卷曲乳酸菌(Lactobacillus crispatus)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)存在于所有樣品的大多數(shù)中，而在少量的樣品中發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌種(Streptomyces sp.)和未培養(yǎng)的細菌分離物CH96Fc_HlO0在所有的婦女中，總菌群中大于70%由最多4種類型組成，這4種類型獨立地以大于總群體的10%。包括五種提及的細菌菌種加上其他類型的備選清單(參見表5)。在一個或幾個樣品中發(fā)現(xiàn)了百分比較小的細菌類型的初選清單(參見表3)。
[0042]在所有的測試條件下，在婦女中發(fā)現(xiàn)的5種細菌菌種的核心組可能代表具有較高的可能性從外部庫(pool)入侵尿道，能夠更好地適應尿路中的條件或能夠更好地被宿主接受的菌種。第二組由不經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)的但是可在個別婦女體內(nèi)存活一段時間并且甚至成為主導菌種的菌種組成。這些菌種為什么未能更經(jīng)常地被發(fā)現(xiàn)的原因可能是尿路暴露于這些細菌的外部庫對于所有婦女來說是不同的，或特定的宿主因素允許這些細菌僅存在于小部分的婦女體內(nèi)。僅在單一樣品中發(fā)現(xiàn)的大量的菌種可代表在尿路中不能良好存活的“過路人(passer-by)”。
[0043]從該研究中能夠總結出:當婦女懷孕時，尿路中的細菌菌群的構成急劇變化。在懷孕之前，各種乳酸菌菌株(主要是卷曲乳酸菌)在細菌菌群中占優(yōu)勢。在懷孕期間，乳酸菌被其它常常變成優(yōu)勢菌株的細菌(主要是金黃色葡萄球菌)所替代。這種轉變并不是由于婦女曾經(jīng)經(jīng)歷的程序所導致的，因為這種轉變并未發(fā)生在曾經(jīng)歷IVF/ICSI卻并未受孕的婦女中。
[0044]當然，因為存在確定懷孕的更容易的方法，所以尿路菌群反映婦女是否懷孕的發(fā)現(xiàn)在臨床上是無關緊要的。但是通過觀測得出婦女的生育狀態(tài)顯然影響尿路中的細菌菌群的關聯(lián)。這樣就支持了如下的假設:尿路中的細菌菌群是用于宿主內(nèi)部條件的標記物。
[0045]該研究示出該標記物的功能足以特異性地診斷想要受孕的婦女的生育能力。從實驗部分可以清楚得出，在IVF/ICSI程序之前基于尿液中的乳酸菌種和葡萄球菌種的相對存在建立的模型能夠預測IVF/ICSI的成功與否。
[0046]因此，本發(fā)明提供了一種預測受試者中的成功懷孕的可能性的方法，該方法包括以下步驟:
[0047]a.采集尿液樣品；
[0048]b.確定乳酸菌菌種和葡萄球菌菌種占所述樣品中存在的細菌總量的百分比的量;
[0049]c.基于所述細菌之間的比率預測成功懷孕的可能性。
[0050]盡管優(yōu)選地，所述受試者正在經(jīng)歷或適宜于人工受精方法(例如IVF或ICSI)，但是該方法并不被限制到這種程度。本發(fā)明還能夠用于那些對自身以自然方式受孕具有多大可能性感興趣的受試者。在這個方面，值得注意的是，當樣品取自于男性受試者、年輕的女性或已經(jīng)懷孕的婦女(即受試者不會受孕)時，，該方法也能夠給出正確的預測:對于這些樣品，測試的結果顯示為陰性。當然，在未使用人工受精的情況下，如上計算的成功懷孕的可能性僅僅涉及如下的狀況:其中，受孕的可能性不受配偶不育的影響或不受女性受試者體內(nèi)的大范圍的生理異常(例如，子宮缺失、激素不平衡等)的影響。
[0051]優(yōu)選地，待檢測的乳酸菌種為卷曲乳酸菌。然而，還檢測其他乳酸菌種(例如詹氏乳酸菌(L.jensenii)、惰性乳酸菌(L.1ners)和加氏乳酸菌(L.gasseri))也可以是有用的。在一些婦女體內(nèi)遇到的菌種，且將這些菌種并入乳酸菌的組中增加了上述方法的預測能力。這對于葡萄球菌同樣適用，其中不僅遇到了金黃色葡萄球菌，還遇到了表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)和孔氏葡萄球菌(S.cohnii),且發(fā)現(xiàn)增加了預測能力。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中通過分子生物學測定法(例如PCR并且優(yōu)選qPCR)來進行細菌菌種的檢測。在這種測定法中，通過使用對待檢測的細菌具有特異性的引物進行擴增來檢測和定量該細菌。在乳酸菌的情況下，這意味著可使用對卷曲乳酸菌特異性的引物，但是優(yōu)選地，該引物也可識別如上所述的其它乳酸菌種。目前，最佳的檢測方法包括如在實施例2中使用的乳酸菌特異性的引物。
[0052]相似操作的方法也可適用于葡萄球菌種的檢測，其中應當主要檢測金黃色葡萄球菌，但是也可涵蓋表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和孔氏葡萄球菌的檢測。并且在該情況下，實施例2中示出的引物組給出了最佳的結果。
[0053]然而，應當理解的是，不應當使用檢測的乳酸菌和葡萄球菌的絕對比率。而是使用這些細菌相對于細菌總含量的百分比的比率。為了確定樣品中的細菌的總含量，優(yōu)選使用識別細菌16s rDNA的引物，這樣就得到了使用識別所有細菌中存在的16S rDNA的保守部分的引物的時機。在文獻中已經(jīng)描述了對細菌16s rDNA具有特異性并且因此能夠僅識別樣品中的細菌的引物組，在該樣品中存在來自其它生物體的生物材料。在維基百科中描述下列引物(http://en.wikipedia.0rg/wiki/16S_ribosomal_RNA):
[0054]引物名稱序列(5’-3’)
B27FAGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
U1492RGGT TAC CTT GTT ACG ACT T
928FTAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG
336RACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT
IlOOFYAA CGA GCG CAA CCC
[0055]
11OORGGG TTG CGC TCG TTG
337FGAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG
907RCCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
785FGGA TTA GAT ACC CTG GTA
805RGAC TAC CAG GGT ATC TAA TC
533FGTG CCA GCM GCC GCG GTA A
518RGTA TTA CCG CGG CTG CTG G
[0056]非常適用的引物組被稱為EUB引物，其中一些EUB引物是可商購的(例如EUBf933 和 EUB rl387, EUB8f 和 EUB536r, EUB341 和 EUB534 等)。同樣，基于 EUR 引物的用于檢測細菌16s rDNA的試劑盒也是可商購的(例如來自愛麗斯技術有限公司(Iristechnologies Int.),庫爾斯多夫(Cursdorf),德國的Onar?EUB 試劑盒)。
[0057]在本發(fā)明的另一實施方式中，通過光譜方法(例如質譜法、拉曼光譜法等)確定樣品中的細菌的量。優(yōu)選地，在測量細菌的量時，使用MALD1-T0F作為分析工具。
[0058]當確定總細菌的量及乳酸菌和葡萄球菌的量時，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中確定細菌的比率，并且從而根據(jù)下列公式能夠計算出成功懷孕的可能性:
[0059]Y = a* (%乳酸菌)_b* (%葡萄球菌)_c
[0060]其中
[0061]a 具有 0.025 ~0.051 的值;
[0062]b 具有 0.04 ~0.07 的值；
[0063]c 具有-1.10 至-0.66 的值；
[0064]%乳酸菌為以占細菌總量的百分比的形式表示乳酸菌細菌的量；
[0065]%葡萄球菌為以占細菌總量的百分比的形式表示葡萄球菌細菌的量；
[0066]以及其中Y代表成功的可能性。Y的值可通過公式而被轉換成在O (沒有成功的可能性)~I ( 一定成功)之間變動的可能性:
[0067]可能性=eY/(1+eY)
[0068]根據(jù)使用的常數(shù)，Y的值將在4.44(100 %乳酸菌，a = 0.051且c=-0.66)~-8.1 (100%葡萄球菌，b = 0.07且c = -1.1)之間變動。為了預測的懷孕與實際的懷孕之間進行比較，發(fā)現(xiàn)最好的截留值(cut-off value)為可能性=0.5。而等于或高于0.5的值Y預測為成功，并且低于0.5的值預測為失敗。根據(jù)該截留值，公式在第一次嘗試IVF/ICSI之后，在86%的婦女中正確地預測了懷孕；并且在I年內(nèi)多次嘗試之后，在92.3%的婦女中正確地預測了懷孕。因此，在7.7%的情況中，公式預測為失敗，而婦女在IVF/ICSI之后是受孕的(假陰性)。在3.8%的情況中，由于流產(chǎn)而未完成懷孕。在3.8%的情況中，公式錯誤預測了實際的活產(chǎn)。在公式了預測懷孕的25%的情況中，卻未實現(xiàn)繼續(xù)懷孕(假陽性)。
[0069]由于想要受孕且使用預測性測試來確定是否繼續(xù)進行IVF/ICSI的婦女將尤其不能接受假陰性預測，因此期望將假陰性預測從3.8%降低至O。在該情況下，截留值必須降低至0.04。然而，在該截留值處，公式預測所有的婦女都懷孕，這當然也并不是期望的。
[0070]為了最好地預測完整的懷孕，使用一公式，在該公式中，a具有0.03?0.051的值，而進一步優(yōu)選地b具有0.056?0.064的值。進一步優(yōu)選地，c具有-1.06?-1.03的值。而用于得到懷孕的可能性的截留優(yōu)選為0.5。
[0071]來自受試者的樣品優(yōu)選為尿液樣品，更優(yōu)選為中段尿液樣品。由于中段尿液樣品最好地代表了尿液中細菌菌群，所以其是優(yōu)選的。這是因為首次尿液沖洗尿道，并且將攜帶在尿道中聚居的細菌。
[0072]還可能對陰道樣品進行本發(fā)明的方法。由于在陰道中遇到相同類型的細菌，因此對陰道樣品可使用類似的比率且優(yōu)選使用類似的公式來預測成功懷孕的可能性是合理的。a，b和c的值可能需要進一步被優(yōu)化，但是這種優(yōu)化是本領域技術人員熟知的。
[0073]同樣，本發(fā)明的一部分為用于確定成功懷孕的可能性的試劑盒。這種試劑盒應當包括:用于測量樣品中的細菌總含量的構件；以及用于測量乳酸菌細菌和葡萄球菌細菌的含量的構件。此外這種試劑盒應包括基于上述限定的公式計算可能性的構件。這種用于計算可能性的構件優(yōu)選應包括處理器，該處理器能夠接收檢測到的細菌和細菌的具體的上述屬/菌種的總含量的值。然后該處理器將根據(jù)本發(fā)明的公式計算Y并且輸出成功懷孕的可能性。該輸出能夠以數(shù)值(從公式得到的實際Y的值)的形式，但是也可為可能性的指示:例如通過信號光源，該信號光源可為紅色(陰性)或綠色(陽性可能性)；或通過代表Y的值的色碼條，其中陰性值示為從暗紅色(強陰性)經(jīng)由淺紅色(中度陰性)至黃色(約為O)的梯度，并且陽性值示為從黃色(約O)經(jīng)由淺綠(中毒陽性)至深綠色(強陽性)的梯度。在這樣的情況下，受試者可接收預測的可靠性的視覺指示。在所有的應用中，可包括如下的選擇:其中以增加假陽性預測的數(shù)目為代價，降低可能性的截留值(標準設定為0.5)以減少假陰性預測的數(shù)目。當然，代表Y值的其它指示也應是可能的，并且技術人員在不脫離本發(fā)明的主旨的情況下能夠設計上述實施方式的變量。
[0074]實施例
[0075]患者的加入和組的劃分
[0076]在研究中納入了在2005和2006年訪問過鹿特丹的ErasmusM的IVF病房的98名婦女。在3年的研究期間，在一些情況中的多次嘗試之后，該98名婦女中的40名婦女(41%)受孕。在給出知情同意協(xié)議和如何進行中段尿液收集的說明之后，在第一次訪問期間，婦女遞交了中段尿液樣品并且回答了有關之前使用抗生素和之前的UTI的問題。她們接收了尿液容器和描述中段尿液收集的程序的文件。在婦女懷孕的第16周或對于未受孕的那些婦女植入胚胎后的可比較時間點，提醒她們收集第二樣品。尿液樣品在同一天被送回醫(yī)院，或被冷凍并且在稍后的日子被送回。在收集第二樣品之后，追蹤這些婦女最長達三年以收集懷孕的結果以及較晚懷孕的數(shù)據(jù)。
[0077]98名婦女中的16名并沒有回答問卷上的所有問題或并未送回完整無損的第二尿液樣品。因為我們的研究需要在兩個時間點的樣品，因此將該16名婦女從我們的發(fā)現(xiàn)性研究中排除掉。從剩下的82名婦女中，通過第一尿液樣品后的第一個IVF/ICSI周期受孕的第一批21名婦女被包括在發(fā)現(xiàn)性研究中。當收集第二樣品時(在植入胚胎后的16周)仍未懷孕的21名婦女被包括在未懷孕的婦女的組中。在納入周期完成之后，發(fā)現(xiàn)21名未懷孕的婦女中的I名婦女在她收集第二樣品時懷孕。她被重新劃分至懷孕組中。這樣得到懷孕組為η = 22，而未懷孕組為η = 20。在這些42名婦女中，通過廣譜16S rDNA分析法確定兩次尿液樣品中的細菌菌群。此外，關于懷孕和懷孕的結果，對這些婦女進行三年的臨床隨訪。在所有的42名婦女的第一尿液樣品中識別的細菌菌種被用于建立預測IVF/ICSI的結果(懷孕/未懷孕)的模型。將婦女受孕時發(fā)生的細菌菌群中的變化與UTI的主因中的變化進行比較。從分離的組中得到后者(參見下文)。
[0078]對于送回兩次尿液樣品并且完整完成問卷的剩下的40名婦女加上送回完整的第一樣品并且完成完整問卷的婦女，我們組成了獨立的檢驗組，η = 42。在該組中，我們利用qPCR測試驗證了得到的預測性模型，qPCR測試基于對包括在預測模型中的細菌具有特異性的引物。
[0079]需注意的是:與整組的98名婦女的41%相比，在我們發(fā)現(xiàn)性階段中由于我們選擇的方案而得到的懷孕成功率為22/42 = 52%。
[0080]在表1中示出了組的特征。
[0081]排除標準
[0082]排除在16周的研究期間使用抗生素或具有UTI的婦女。
[0083]后續(xù)的數(shù)據(jù)(3年的時間段)
[0084]在懷孕組的4名婦女中，懷孕因流產(chǎn)(3)或子宮內(nèi)死亡(IUD)而終止。在附加的程序之后，這4名婦女都在收集第二樣品之后的6個月內(nèi)成功懷孕。
[0085]在失敗的IVF組中，12名婦女從未受孕，7名婦女在收集第二樣品期間未懷孕而在其它時間點懷孕。其中:
[0086]患者6，在弟一樣品之后，懷孕〉1年，在弟二樣品之后〈I年；
[0087]患者10，在第一樣品之后I年內(nèi)懷孕(雙胞胎);
[0088]患者14，在弟一樣品之后I年內(nèi)懷孕；
[0089]患者19，在弟一樣品之后I年內(nèi)，流廣
[0090]患者58，在收集第一樣品的時間點附近發(fā)現(xiàn)自然懷孕。這樣導致IUD。隨后進行IVF并且在植入胚胎后的16周收集第二樣品。IVF失敗。該患者被劃分到用于測試第一次IVF/ICSI的結果以及測試由于懷孕而發(fā)生的變化的未懷孕組。為了完整性，被劃分到懷孕組的患者58中也進行了模型的建立。她被劃分到用于測試婦女是否能夠在I年內(nèi)受孕的懷孕組中。
[0091]患者78，在第一樣品和第二樣品之后，自然懷孕>1年，流產(chǎn)[0092]患者92，在第一樣品和第二樣品之后，懷孕(IVF) >1年，流產(chǎn)，然后在第一次樣品之后的2年，成功自然懷孕。
[0093]用于IVF/ICSI的成功的預測模型
[0094]將第一尿液樣品的細菌菌群的數(shù)據(jù)并入二項式回歸分析中以建立兩種模型。模型I預測第一次IVF/ICSI嘗試是否會實現(xiàn)懷孕。模型2預測婦女是否會在I年的IVF/ICSI嘗試(I至3次嘗試)期間受孕。對于該模型，在收集第一尿液樣品后的I年內(nèi)受孕/懷孕的患者10、14、19和58基于該模型被重新劃分到懷孕組，得到η = 26的懷孕組，而未懷孕組為η = 15?；颊?、78和92停留在I年內(nèi)未懷孕的組中，因為她們在收集第二樣品之后超過I年后才起始懷孕。預測模型被應用至在第16周收集的尿液樣品中?；趶V泛分析的模型被轉換成在獨立測試組中得到驗證的具體特異性的QPCR測試。
[0095]未懷孕和懷孕婦女中的細菌菌群和UTI原因
[0096]用DNA分析發(fā)現(xiàn)的細菌菌群代表了低量存在于未患有UTI的懷孕婦女/未懷孕婦女的尿路中的細菌。將該數(shù)據(jù)與去阿爾貝拉(Erbil)的婦產(chǎn)科醫(yī)院(Maternity Hospital)(庫爾德斯坦地區(qū)(Kurdistan Region),伊拉克)看病的婦女的尿液和陰道涂片培養(yǎng)物得到的懷孕/未懷孕婦女中的陰道感染和UTI的原因的數(shù)據(jù)相比較。在2009年間，得到共計599個尿液培養(yǎng)物結果(210個未懷孕，且389個懷孕)以及216個陰道涂片培養(yǎng)物結果(94個未懷孕，且122個懷孕)。
[0097]表1.兩組患者的特征
[0098]
【權利要求】
1.一種預測受試者成功懷孕的可能性的方法，所述方法包括以下步驟: a.采集尿液樣品； b.確定乳酸菌菌種和葡萄球菌菌種的量占所述樣品中存在的細菌總量的百分比； c.基于所述細菌之間的比率預測成功懷孕的可能性。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述受試者正在經(jīng)歷人工受精的方法或符合進行人工受精的方法的條件，所述人工受精的方法例如為IVF或ICSI。
3.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述乳酸菌種為卷曲乳酸菌。
4.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述葡萄球菌種為金黃色葡萄球菌。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述細菌的量的測量通過PCR，更優(yōu)選通過qPCR來進行。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，葡萄球菌通過利用引物5’-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3’ 和 5’ -GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3 ’ 來確定。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其中，乳酸菌通過利用引物5’ -GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3’ 和 5’ -AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3 ’ 來確定。
8.根據(jù)權利要求1至4所述的方法，其中，所述細菌的量的測量通過質譜分析法，更優(yōu)選通過MALD1-TOF質譜分析法來進行。
9.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述成功懷孕的可能性通過以下公式來確定: Y = 3*(%乳酸菌)_13*(%葡萄球菌)-(3， 其中， a具有0.025~0.051的值； b具有0.04~0.07的值； c具有-L 10~-0.66的值； %乳酸菌為以占細菌總量的百分比的形式表示的乳酸菌細菌的量； %葡萄球菌為以占細菌總量的百分比的形式表示的葡萄球菌細菌的量； 以及，其中Y代表成功的可能性。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中，a具有0.025~0.04的值。
11.根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其中，b具有0.04~0.06的值。
12.根據(jù)權利要求8至10中任一項所述的方法，其中，c具有-1.06~-0.9的值，更優(yōu)選具有-1.06~-L 01的值。
13.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述細菌在中段尿液樣品中檢測。
14.根據(jù)權利要求1至12中任一項所述的方法，其中，步驟a)為采集陰道樣品，例如陰道涂片。
15.一種用于預測成功懷孕的可能性的試劑盒，所述試劑盒包括: a.用于測量來自受試者的樣品中的細菌總含量的構件； b.用于測量乳酸菌細菌的含量的構件； c.用于測量葡萄球菌細菌的含量的構件； d.用于根據(jù)權利要求8至11中限定的公式來計算所述可能性的構件。
16.根據(jù)權利要求14所述的試劑盒，其中，所述用于測量乳酸菌細菌的含量的構件包括引物 5’ -GAITTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3’ 和 5’ -AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3’。
17.根據(jù)權利要求14或15所述的試劑盒，其中，所述用于測量葡萄球菌細菌的含量的構件包括引物5’ -GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3’和5， -GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3，。
18.根據(jù)權利要求14至16中任一項所述的試劑盒，其中，所述用于測量來自受試者的樣品中的細菌總含量的構件包括對細菌16s rDNA具有特異性的通用引物組。
19.根據(jù)權利要求17所述的試劑盒，其中，所述通用引物組包括至少一個正向EUB引物和至少一個反向EUB引物。
20.根據(jù)權利要求14至18中任一項所述的試劑盒，其中，所述用于計算所述可能性的構件包括處理器，所述處理器能夠接收測量的細菌值作為輸入，并且所述處理器根據(jù)權利要求8至11中任一項所限定的公式來計算所述可能性。
21.根據(jù)權利要求19所述的試劑盒，其中，所述處理器能夠將所述可能性輸出至信號構件，所述信號構 件能夠被使用所述試劑盒的人員讀出。
【文檔編號】C12Q1/68GK103930786SQ201180074181
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2011年8月12日 優(yōu)先權日:2011年8月12日
【發(fā)明者】迪爾克·揚·郭克, 約瑟夫·斯特凡努斯·伊麗莎白·萊文, 戴爾杉德·瑪瑪·馬格底德, 妮科爾·赫耶爾杰·瑪麗亞·貝克爾斯 申請人:鹿特丹伊拉斯謨大學醫(yī)療中心