L-甲硫氨酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用生物合成工藝和特定的酶促工藝制造L-甲硫氨酸的方法。更特別地，本發(fā)明涉及在甲硫醇(CH3SH)的存在下由L-甲硫氨酸前體通過酶轉化反應以高產率制造L-甲硫氨酸的方法。本發(fā)明的方法使得能夠選擇性制造L-甲硫氨酸，其可用在各種工業(yè)領域中，例如飼料和食品添加劑、用于醫(yī)療用品、藥物的原料等。
【專利說明】L-甲硫氨酸的制備方法
[0001]本發(fā)明涉及使用生物合成工藝和特定的酶促工藝制造L-甲硫氨酸的方法。更特別地，本發(fā)明涉及在甲硫醇(CH3SH)的存在下由L-甲硫氨酸前體通過酶轉化反應以高產率制造L-甲硫氨酸的方法。本發(fā)明的制造L-甲硫氨酸的方法是比現有技術已知的常規(guī)方法更環(huán)境友好的，且使得能夠選擇性制造L-甲硫氨酸，其可用在各種工業(yè)領域中，例如飼料和食品添加劑、用于醫(yī)療用品、藥物的原料等。
[0002]甲硫氨酸是人體的必須氨基酸之一，且已經廣泛地用作飼料和食品添加劑并進一步用作用于醫(yī)用溶液、醫(yī)療用品以及藥物的合成原料。甲硫氨酸作為如膽堿(卵磷脂)和肌酸這樣的化合物的前體且同時用作用于半胱氨酸和?；撬岬暮铣稍稀＜琢虬彼徇€可提供硫。
[0003]S-腺苷-L-甲硫氨酸源自甲硫氨酸，并在人體中提供甲基方面發(fā)揮一定的作用，而且還涉及在腦中各種神經遞質的合成。L-甲硫氨酸(L-Met)和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)抑制在肝臟和動脈中的脂肪積累，促進脂質代謝。其還改善在腦、心臟和腎臟中的血液循環(huán)，和因此用作用于減輕炎癥、肌肉疼痛和肝臟疾病的抗抑制劑(ant1-depressionagent)，尤其在由酒精造成的肝臟疾病中是有效的。
[0004]其還可用于促進有毒物質的消化、解毒和排泄以及重金屬如鉛的排泄。其具有對于骨和關節(jié)疾病的抗炎作用并促進關節(jié)恢復，且還作為頭發(fā)的必須營養(yǎng)素，由此防止掉發(fā)。
[0005]已知甲硫氨酸根據化學和/或生物合成制備，這已經是許多工作和研究的主題，主要目標在于提出更有效、更選擇性和更環(huán)境友好的制備方法。
[0006]在化學合成中，甲硫氨酸主要通過5_(β -甲基巰基乙基)乙內酰脲的水解制造?；瘜W合成的甲硫氨酸具有僅以L-型和D-型的混合形式制造的缺點。
[0007]在生物合成中，甲 硫氨酸通過使用在甲硫氨酸合成中涉及的蛋白質的方法制造。L-甲硫氨酸通過由多種基因如metA、metB、metC、metE和metH表達的酶的作用從高絲氨酸生物合成。特別地，metA是編碼作為甲硫氨酸生物合成必須的第一酶的高絲氨酸-O-琥珀酰基轉移酶的基因，且其將高絲氨酸轉化成O-琥珀?；?L-高絲氨酸。通過metB基因編碼的O-琥珀?；呓z氨酸裂合酶或胱硫醚-Y -合酶將O-琥珀?；?L-高絲氨酸轉化成胱硫醚。
[0008]通過metC基因編碼的胱硫醚-β -裂合酶將胱硫醚轉化成L-高半胱氨酸。MetE編碼鈷胺素非依賴性甲硫氨酸合酶且metH編碼鈷胺素依賴性甲硫氨酸合酶，這兩者將L-高半胱氨酸轉化成L-甲硫氨酸。此時，由metF編碼的5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶和由glyA編碼的絲氨酸羥甲基轉移酶一起工作以合成N(5)_甲基四氫葉酸，其提供L-甲硫氨酸合成必需的甲基。L-甲硫氨酸通過由上述酶的一系列有機反應合成。
[0009]通過常規(guī)生物方法制造的甲硫氨酸是L-型的，其具有優(yōu)點但是產量太小。這是因為甲硫氨酸的生物合成路線具有非常緊湊的(tight)反饋調節(jié)系統(tǒng)。一旦甲硫氨酸合成到一定水平，最終產物甲硫氨酸抑制metA基因的轉錄，所述metA基因編碼用于引發(fā)甲硫氨酸生物合成的第一蛋白質。metA基因本身的過表達不能增加甲硫氨酸的產量，因為metA基因在轉錄階段被甲硫氨酸抑制且在翻譯階段被細胞內蛋白酶降解。[0010]常規(guī)的甲硫氨酸生物合成方法使用胱硫醚合酶代謝路徑以制造甲硫氨酸，因此由 于硫化物毒性和副產物的產生，酶反應過程是效率低的。另外，甲硫氨酸合成路徑中的反饋 調節(jié)抑制甲硫氨酸的大量生產。
[0011]克服上述問題的制造L-甲硫氨酸的替代方法公開在以序號W02008/013432公開 的國際申請中。該替代方法由兩步法構成，其中通過發(fā)酵制造L-甲硫氨酸前體和將L-甲 硫氨酸前體通過酶選擇性地轉化為L-甲硫氨酸。
[0012]更準確地，W02008/013432公開了包括如下步驟的制造L-甲硫氨酸的方法：1)制 備產生L-甲硫氨酸前體的菌株并通過所述菌株的發(fā)酵制造L-甲硫氨酸前體；和2)使用所 述L-甲硫氨酸前體通過酶反應產生L-甲硫氨酸和有機酸。
[0013]步驟2)過程包括通過使用由以上產生L-甲硫氨酸前體的菌株產生的0-琥珀酰 基高絲氨酸或0-乙?；呓z氨酸以及甲硫醇作為底物使用具有胱硫醚合酶或0-琥珀?；?高絲氨酸硫化氫解酶或0-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶活性的酶或包含這些酶活性的菌株 通過酶反應產生L-甲硫氨酸和有機酸的過程。
[0014]W02008/013432提供對步驟2)的大體信息，其在于在甲硫醇的存在下通過酶反應 將L-甲硫氨酸前體轉化為L-甲硫氨酸。
[0015]即使L-甲硫氨酸的總產率是滿意的，但是仍然存在對如下的需要：甚至更加改善 L-甲硫氨酸的生物合成，尤其是改善L-甲硫氨酸前體與甲硫醇的酶促轉化步驟以特別地 以改善的產率獲得L-甲硫氨酸。
[0016]因此，本發(fā)明的第一目標是提供L-甲硫氨酸前體與甲硫醇的酶促轉化以改善的 產率獲得L-甲硫氨酸的改善的方法。
[0017]更特別地，本發(fā)明提供通過L-甲硫氨酸前體和甲硫醇的酶反應產生L-甲硫氨酸 的方法。
[0018]在本發(fā)明的方法中，L-甲硫氨酸前體可為現有技術中已知的任意前體，其能夠通 過與甲硫醇的酶反應轉化為L-甲硫氨酸，且例如W02008/013432中公開的。根據本發(fā)明的 優(yōu)選方面，通過使用作為底物積累的高絲氨酸、0-磷?；?高絲氨酸、0-琥珀?；呓z氨酸 或0-乙?；呓z氨酸，用于轉化L-甲硫氨酸的酶優(yōu)選選自胱硫醚合酶或0-琥珀?；呓z 氨酸硫化氫解酶或0-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶。
[0019]更優(yōu)選地，用在本發(fā)明的方法中的L-甲硫氨酸前體選自0-琥珀?；呓z氨酸 (0SH)和0-乙?；呓z氨酸（0AH)。還更優(yōu)選地，L-甲硫氨酸前體是0AH。
[0020]在本發(fā)明的方法中，當將0-乙?；呓z氨酸用作L-甲硫氨酸前體時，優(yōu)選地， 可使用優(yōu)選源自鉤端螺旋體屬菌種（Leptospira sp.)、色桿菌屬菌種（Chromobacterium sp.)、或生絲單胞菌屬菌種（Hyphomonas sp.)的胱硫醚_ Y _合酶或0_琥拍?；呓z 氨酸硫化氫解酶或0-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶（0AHS)，更優(yōu)選源自邁氏鉤端螺旋 體（Leptospira meyeri)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aurogenosa)、海王生絲單胞菌 (Hyphomonas Neptunium)或紫色色桿菌（Chromobacterium Violaceum)的胱硫醚-y-合 酶或0-琥珀?；呓z氨酸硫化氫解酶或0-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶（0AHS)。
[0021]本發(fā)明的酶反應過程可以如下流程表示：
[0022]0-琥珀?；?L-高絲氨酸+CH3SH —— L-甲硫氨酸+琥珀酸根
[0023]0-乙?；?L-高絲氨酸+CH3SH —— L-甲硫氨酸+乙酸根[0024]其中該反應是酶促反應且以甲硫醇(CH3SH)的特定壓力范圍操作。
[0025]在上述反應中，甲硫醇的CH3S-殘基被O-琥珀?；呓z氨酸或O-乙酰基高絲氨酸的琥珀酸根或乙酸根殘基取代以產生L-甲硫氨酸。根據本發(fā)明，將甲硫醇在精確的壓力范圍下加入，如本說明書中進一步解釋的。
[0026]在甲硫醇的存在下將L-甲硫氨酸前體轉化為L-甲硫氨酸的上述反應是酶促反應,例如W02008/013432中公開的。
[0027]W02008/013432提供了對可使用的酶的性質和制備的細節(jié)，所述酶是具有在甲硫醇的存在下將L-甲硫氨酸前體轉化為L-甲硫氨酸的合適的活性的酶。這樣的合適的酶可例如使用根據生物技術方法的基因表達制備。
[0028]作為非限制性實例，編碼具有上述酶活性的酶的基因序列可從美國的NCBI數據庫和日本的DNA資料庫(KEGG)獲得。
[0029]對于生物轉化反應，從所獲得的基因序列克隆基因，其隨后被引入表達載體中。將酶從重組菌株以活性形式表達。表達酶的菌株和被表達的酶兩者可直接用于所述反應。
[0030]從上述基因表達的酶或表達那些酶的微生物菌株可直接與積累有L-甲硫氨酸前體的發(fā)酵上清液或發(fā)酵液(部分地或不是部分地)混合以開始所述反應。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，可將積累在發(fā)酵溶液中的O-琥珀?；呓z氨酸或O-乙?；呓z氨酸通過源自假單胞菌屬菌種(Pseudomonas sp.)、色桿菌屬菌種、鉤端螺旋體屬菌種或生絲單胞菌屬菌種的胱硫醚-Y -合酶或O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶或O-琥珀?；呓z氨酸硫化氫解酶轉化成L-甲硫氨酸。
[0031]更優(yōu)選地，可將積累在發(fā)酵溶液中的O-琥珀酰基高絲氨酸通過源自銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)或紫色色桿菌的胱硫醚_ Y _合酶或O-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶或O-琥珀酰 基高絲氨酸硫化氫解酶轉化成甲硫氨酸。將積累在發(fā)酵溶液中的O-乙酰基高絲氨酸通過源自邁氏鉤端螺旋體、海王生絲單胞菌或紫色色桿菌的胱硫醚-Y -合酶或O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶或O-琥珀?；呓z氨酸硫化氫解酶轉化成甲硫氨酸。
[0032]將各基因在pCL-CJI載體(CJ，Korea)(用于大腸桿菌(E.coli)的表達載體)中表達，且從通過使用聲處理的細胞裂解而制備的酶溶液獲得被表達的蛋白質。將所述酶溶液加入到積累O-琥珀?；呓z氨酸或O-乙酰基高絲氨酸的發(fā)酵溶液中，且還向其加入甲硫醇以開始反應。
[0033]使用DTNB [5，5_二硫雙(2_硝基-苯甲酸，Sigma，USA]證實所述反應，且通過HPLC分析反應產物。在本發(fā)明中，通過甲硫醇分別與O-琥珀?；呓z氨酸和O-乙酰基高絲氨酸的反應，可在沒有單獨的(separate)制造過程的情況下額外獲得副產物例如琥珀酸或乙酸。
[0034]L-甲硫氨酸前體與CH3SH的酶促反應可通過如下流程說明:
[0035]
【權利要求】
1.L-甲硫氨酸前體與甲硫醇的酶促轉化以獲得L-甲硫氨酸的方法，其中在反應容器中在反應介質上方的甲硫醇分壓范圍為10kPA-180kPA、優(yōu)選51kPa-180kPa、更優(yōu)選51kPa-160kPa、還更優(yōu)選約80kPa_約160kPa、有利地約90kPa_約150kPa，例如CH3SH分壓為約100kPa_150kPa，在反應溫度下。
2.權利要求1的方法，其中所述反應溫度范圍為20°C-45°C、優(yōu)選25°C _40°C、還更優(yōu)選 30°C -40°C。
3.前述權利要求任一項的方法，其中所述L-甲硫氨酸前體為O-琥珀酰基高絲氨酸(OSHS)和O-乙?；呓z氨酸(OAHS)，且優(yōu)選為OAHS。
4.前述權利要求任一項的方法，其中用于所述酶促轉化的酶使用根據生物技術工藝的基因表達制備。
5.前述權利要求任一項的方法，其中用于所述酶促轉化的酶選自源自假單胞菌屬菌種(Pseudomonas sp.)、色桿菌屬菌種(Chromobacterium sp.)、鉤端螺旋體屬菌種(Leptospira sp.)、或生絲單胞菌屬菌種(Hyphomonas sp.)的胱硫醚_ Y _合酶或O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶或O-琥珀酰基高絲氨酸硫化氫解酶。
6.前述權利要求任一項的方法，其中反應的pH維持在約中性或稍微酸性的值，優(yōu)選反應介質的pH維持在6-7。
7.前述權利要求任一項的方法，其中加入輔酶，所述輔酶優(yōu)選為吡哆醛-5’-磷酸。
8.用于制備L-甲硫氨酸的方法，包括如下步驟: 1)制備產生L-甲硫氨酸前體的菌株且通過所述菌株的發(fā)酵產生L-甲硫氨酸前體； 2)根據權利要求1-7任一項的酶促轉化方法將所述L-甲硫氨酸前體轉化為L-甲硫氨`酸； 3)收集獲得的L-甲硫氨酸。
9.權利要求8的方法，其中所述產生L-甲硫氨酸前體的菌株是能夠積累L-甲硫氨酸前體的原核或真核微生物菌株。
10.權利要求9的方法,其中所述菌株選自埃希氏菌屬菌種(Escherichiasp.)、歐文氏菌屬菌種(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬菌種(Serratia sp.)、普羅威登斯菌屬菌種(Providencia sp.)、棒狀桿菌屬菌種(Coryne bacteria sp.)、假單胞菌屬菌種、鉤端螺旋體屬菌種、沙門氏菌屬菌種(Salmonellar sp.)、短桿菌屬菌種(Brevibacteria sp.)、生絲單胞菌屬菌種、色桿菌屬菌種和諾卡氏菌屬菌種(Norcardia sp.)微生物或真菌或酵母。
11.權利要求9或10的方法，其中所述菌株在包括多種碳源、氮源和痕量元素的培養(yǎng)基中獲得。
12.根據權利要求11的方法，其中所述碳源選自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素；脂肪例如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇例如甘油和乙醇；與有機酸如乙酸；以及它們的混合物。
【文檔編號】C12P13/12GK103764832SQ201180073229
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2011年9月2日 優(yōu)先權日:2011年9月2日
【發(fā)明者】G.弗雷米, P.巴里, 金素影, 孫晟光, 李相穆 申請人:阿克馬法國公司, Cj第一制糖株式會社