專利名稱：用于制備流感病毒的永久人細胞系的制作方法
用于制備流感病毒的永久人細胞系本發(fā)明涉及借助永久人羊膜細胞(Amniozytenzelle)制備基于流感病毒的疫苗的方法，以及永久人羊膜細胞在制備基于流感病毒的疫苗中的用途。接種疫苗是衛(wèi)生部門采取的最重要的措施以防止因每年的流感疫情引起的疾病。疫苗的成功使用取決于是否能從穩(wěn)定和容易處理的來源中盡可能快地獲得足夠大量的接種材料如殺死的病毒。疫苗的快速發(fā)展和它們的充足供應(yīng)對于與許多人和動物疾病的斗爭是至關(guān)重要的。由于疫苗生產(chǎn)的延誤和定量損失，在與疾病爆發(fā)抗?fàn)帟r很能會出現(xiàn)問題。因此，最近的努力是在細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)病毒以用作疫苗。到目前為止，所獲得的流感疫苗是在孵化的雞胚蛋中制備的。必須證實這些雞卵未被某些病毒和細菌污染。這些所謂的“無特異性病原(SPF) ”雞卵均可市售獲得。雖然已證實了雞卵非常適用于動物和人病毒的繁殖，但是雞卵在疫苗生產(chǎn)方面具有一些劣勢。因為生產(chǎn)每劑量的常規(guī)疫苗需要一個雞卵，所以在例如出現(xiàn)大規(guī)模流行病時，疫苗生產(chǎn)用的雞卵需求量則很高。鑒于雞卵的供應(yīng)有限，需要提前約一年的時間準(zhǔn)備足夠量的雞卵。此夕卜，還存在對雞而言高度致病性的流感亞型，因而在大規(guī)模流行病的情況下可能出現(xiàn)雞卵供應(yīng)短缺。另外，生產(chǎn)過程是非常昂貴和費時的。在雞卵中生產(chǎn)疫苗的另一個缺點是這些疫苗通常包含雞蛋清，在一些患者身上可能會出現(xiàn)過敏反應(yīng)。此外，不同于天然存在病毒的亞群的可能選擇需要備選的宿主細胞系統(tǒng)。相比雞卵，基于細胞培養(yǎng)的用于流感疫苗生產(chǎn)的細胞總是可以獲得的。它們可以深凍儲存，并且在任何需要的時候短時間解凍所需量以及進行繁殖。因此可以在任何需要的時間點開始疫苗的生產(chǎn)。在出人意料的高需求或意想不到的新病毒株大規(guī)模傳播的情況中，可以短期提供相應(yīng)的疫苗。借助細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)過程實現(xiàn)了在限定的受控條件下于封閉標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)中生產(chǎn)用作疫苗的病毒 。成品流感疫苗由于受控的生產(chǎn)方法而無需添加抗生素就可以獲得。由于實現(xiàn)了完全不依賴雞卵制備細胞培養(yǎng)-流感疫苗，如此制備的疫苗不包含蛋清，從而不會由于雞蛋清的不耐受而在患者中引起過敏反應(yīng)。目前主要有以下三個細胞系用于制備流感疫苗:人PER.C6細胞、狗腎細胞(MadinDarby Canine Kidney) (MDCK)和長尾猴-腎細胞(Vero)。此外，目前開發(fā)了鴨_視網(wǎng)膜-細胞系(AGE1.CR)和胚胎鳥類(embryonale Vogel)-干細胞系。在哺乳動物細胞中制備疫苗雖然可以替代基于雞卵制備疫苗，但是這些細胞的生長需要血清和/或附著在固定的載體上。所述這些加劇了在所述細胞中制備疫苗的難度并增加了成本，這是因為出于安全原因考慮必須完全分離血清，并且在固定載體上的生長是受限的，從而導(dǎo)致產(chǎn)量較小。在哺乳動物細胞中制備疫苗的一個優(yōu)勢在于，在細胞培養(yǎng)基中分離和復(fù)制病毒不會導(dǎo)致偏離臨床野生型的表型的傳代-依賴性選擇。因此病毒糖蛋白凝血素在自然形式中表達，從而具有改善的特異性和親和性，并因此在人中實現(xiàn)了細胞-介導(dǎo)的免疫力，其中病毒通過病毒糖蛋白凝血素實現(xiàn)了在將被感染的細胞上的附著并整合入細胞。因此，本發(fā)明的目的是提供改善的永久人細胞系用于制備基于流感病毒的疫苗。該目的通過權(quán)利要求書中限定的主題得以實現(xiàn)。
下列示意性示出闡述了本發(fā)明。

圖1A至G示意性示出了，于IOOml振蕩瓶中在293SFMI1-培養(yǎng)基中的永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5(.)、在PEM-培養(yǎng)基中的永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5(A)和在SMIF8-培養(yǎng)基中的永久犬腎細胞系MDCK.SUS2(狗腎細胞)( )的培養(yǎng)期間的不同參數(shù)的曲線。圖1A比較示意性示出了三個細胞系的活細胞數(shù)的曲線，圖1B示意性示出了細胞系的死細胞數(shù)的曲線以及圖1C示意性示出了細胞系的存活率的曲線。圖1D至G示意性示出了 PH-值(D)、葡萄糖濃度(亮標(biāo)示)和乳糖濃度(暗標(biāo)示)(E)、谷氨酰胺(Gln)濃度(亮標(biāo)示)和銨濃度(暗標(biāo)示)(F)和谷氨酸(Glu)濃度(亮標(biāo)示)和丙酮酸鹽濃度(暗標(biāo)示)(G)的曲線。圖2示出了柱形圖，其給出了在293SFMI1-和PEM-培養(yǎng)基中，流感-病毒株 A/PR/8/34 (HlNl)和 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)的 4 個傳代對 CAP-1D5-細胞的病毒滴度(Virustiter)，其作為TCID5tl-值測量?？s寫:A/PR293:流感-病毒株A/PR/8/34(HlNl)對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 培養(yǎng)基中；A/PR PEM:流感-病毒株A/PR/8/34 (HlNl)對 CAP-1D5-細胞，在 PEM 培養(yǎng)基中；A/Urug293:流感-病毒株 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 培養(yǎng)基中；A/Urug PEM:流感-病毒株 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)對 CAP-1D5-細胞，在 PEM JCID50-值是感染 50% 宿主細胞所需的病毒滴度(以病毒數(shù)/ml計)。圖3A至F示意性示出了在293SFMI1-(A，B)和PEM-培養(yǎng)基(C，D)中培養(yǎng)永久羊膜細胞CAP-1D5以及在SMIF8-培養(yǎng)基(E，F(xiàn))中培養(yǎng)永久犬腎細胞MDCK.SUS2時在細胞被流感病毒-病毒株A/PR/8/34感染后以log HA-(凝血素)單位/100 μ I表示的病毒顆粒(Virenpartikeln)量和活細胞數(shù)的曲線，其中使用了不同的病毒量，其以MOI (復(fù)合感染)值給出:Μ0Ι:0.0025(Λ) ；Μ0Ι:0.025 ( □ ) ;Μ0Ι: 0.25 (〇)。MOI (復(fù)合感染)反映了感染性顆粒對靶細胞的數(shù)目關(guān)系。圖4A至D示 意性示出了在IL的生物反應(yīng)器中于PEM-培養(yǎng)基中培養(yǎng)永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5時的不同參數(shù)，其中在114小時后通過流感病毒A/PR/8/34(適應(yīng)的(adaptiert))發(fā)生感染,其中以MOI給出病毒量為0.025。在圖4A中示意性示出了活細胞數(shù)(▲)、死細胞數(shù)(Λ)和細胞的存活率(▲)的曲線。圖4B示意性示出了培養(yǎng)基中的病毒顆粒數(shù)目(▲)以及谷氨酸鹽濃度(Λ )和丙酮酸鹽濃度(.)，其中病毒顆粒數(shù)目以log HA-(凝血素)單位/100 μ I給出。圖4C示意性示出了 pH-值(Λ)的曲線以及圖4D示意性示出了感染度(以TCID5cZml表示)。TCID5tl-值以病毒數(shù)/ml反映了感染50%宿主細胞所需的病毒滴度。圖5A和B示意性示出了柱狀圖，其反映了歷經(jīng)四次傳代(iiber4Passagen)的流感-病毒株 A/Brisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、豬流感(A/Swine (H1N2)Bakum/1832/OO)和馬流感(A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8))在 293SFMI1-和 PEM-培養(yǎng)基中對CAP-1D5-細胞所測量的病毒滴度，其表示為log HA-單位/100μ I㈧或TCID5tl-值(B)?？s寫:A/Bris293:流感-病毒株 A/Brisbane/59/2007 對 CAP-1D5-細胞，在293SFMII 培養(yǎng)基中；A/Bris PEM:流感-病毒株 A/fcisbane/59/2007 對 CAP-1D5-細胞，在PEM 培養(yǎng)基中；B/Flor293:流感-病毒株 B/Florida/4/2006 對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII培養(yǎng)基中；B/Flor PEM:流感-病毒株B/Florida/4/2006對CAP-1D5-細胞，在PEM培養(yǎng)基中；Schw293:流感-病毒株 A/Swine (HlN2)Bakum/1832/00 對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII中；Schw PEM:流感-病毒株 A/Swine(HlN2)Bakum/1832/00 對 CAP-1D5-細胞，在 PEM 培養(yǎng)基中；Pferd293:流感-病毒株 A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8)對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 培養(yǎng)基中；Pferd PEM:流感-病毒株 A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8)對CAP-1D5-細胞，在PEM培養(yǎng)基中；TCID5(1-值是以病毒數(shù)/ml計的感染50%宿主細胞所需的病毒滴度。圖6A和B示意性示出了在振蕩瓶中于100ml PEM-培養(yǎng)基中培養(yǎng)永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5時的活細胞數(shù)-濃度和pH-值的，其中開始細胞數(shù)為5x10s細胞/ml以及培養(yǎng)基另外包含4mM丙酮酸鹽( )或開始細胞數(shù)目為SxlO5細胞/ml以及培養(yǎng)基另外包含4mM丙酮酸鹽(▲)或開始細胞數(shù)目為SxlO5細胞/ml以及培養(yǎng)基另外包含IOmM丙酮酸鹽以及其他的氨基酸(籲)。圖7A至C示意性示出了測量為log HA-單位/100 μ I培養(yǎng)液的病毒滴度的曲線，其中CAP-1D5-細胞被經(jīng)適應(yīng)的流感病毒株A/PR/8/34感染。在感染前，或者培養(yǎng)基不改變(A)、或者用PEM-培養(yǎng)基進行1:2_稀釋或者培養(yǎng)基完全改變。圖7A示出了 CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液在培養(yǎng)基不改變時的病毒滴度的曲線，其中感染時使用的不同胰蛋白酶濃度為lxlO_4U/細胞( )、3x10_5U/細胞(▲)和5x10_5U/細胞(■)。圖7B示意性示出了用PEM-培養(yǎng)基進行1:2-稀釋的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液的病毒滴度的曲線，其中感染時使用的不同胰蛋白酶濃度為lxlO_4U/細胞( )、3x10_5U/細胞(▲)和5x10_5U/細胞(■)。圖7C示意性示出了培養(yǎng)基完全改變時的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液的病毒滴度的曲線，其中在感染時或者不使用胰蛋白酶(*)或者使用不同胰蛋白酶濃度為IxlO-4U/細胞(A)UxlO-5U/細胞( )、5xlO_5U/ 細胞(■)和 1x10、/ 細胞(X)。圖8A至F示意性示出了已被流感病毒A/PR/8/34、A/Brisbane/59/2007或B/Florida/4/2006感染的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液的病毒滴度，其中在感染前培養(yǎng)基改變(A至C)或培養(yǎng)基不改變(D至F)。用流感病毒株A/PR/8/34和B/Florida/4/2006實現(xiàn)感染，其中病毒量(以MO1-值表示)分別為0.25、0.025和0.0025。用流感病毒株A/Brisbane/59/2007實現(xiàn)感染，其中MO1-值分別為0.1,0.025和0.0025。MOI (復(fù)合感染)反映了感染性顆粒對靶細胞的數(shù)目關(guān)系。圖9A和B示意性示出了感染了經(jīng)適應(yīng)的流感病毒A/PR/8/34且在IL-容量的STR-(Sartorius) (B16, B26 和 MDCK)或振蕩瓶式反應(yīng)器(Wave Biotech 公司)(Wave)中培養(yǎng)的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液(B16，B26和Wave)和犬腎細胞-MDCK.SUS2培養(yǎng)液(MDCK)的活細胞數(shù)-濃度和病毒滴度的曲線(Verlauf)。在培養(yǎng)液B26和Wave的情況中，在感染前培養(yǎng)基發(fā)生改變。 圖1OA至C示意性示出了所測量的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液的病毒滴度(以logHA-單位/100 μ I表示)、活細胞數(shù)和pH-值的曲線，所述CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液感染了經(jīng)適應(yīng)的流感病毒A/PR/8/34且在振蕩瓶中于IOOmlPEM-培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在感染前，或者發(fā)生293SFMI1-培養(yǎng)基(□)或PEM-培養(yǎng)基( )的1:1_培養(yǎng)基改變(亮標(biāo)示)，或者發(fā)生293SFMI1-培養(yǎng)基(■)或PEM-培養(yǎng)基( )的培養(yǎng)基完全改變(暗標(biāo)示)。在此使用的術(shù)語“流感病毒”理解為正黏病毒(Orthomyxoviren)的成員，其可以感染人和動物。在本文中流感病毒區(qū)分為類型A、B和C。流感-A-病毒和流感-B-病毒歸為一類。流感-C-病毒由于其具有的7個基因片段而區(qū)別于流感-A-病毒和流感-B-病毒，流感-A-病毒和流感-B-病毒為8個基因片段。另外，流感-A-病毒和流感-B-病毒分別編碼凝血素(HA)和神經(jīng)氨酸苷酶(NA)，而流感-C-病毒則編碼結(jié)合了兩種性質(zhì)的表面蛋白，凝血素-酯酶-融合蛋白(HEF)。基于凝血素-(H1-H15)和神經(jīng)氨酸苷酶_(N1-N9)分子的序列，流感-A-病毒將進一步細分為亞型。在此使用的術(shù)語“流感病毒-蛋白”理解為蛋白或流感病毒的衍生物。流感病毒的衍生物通常為可以用作免疫目的的流感病毒的蛋白或其一部分。流感病毒蛋白或衍生物包括病毒包膜蛋白或其部分。具體地，流感病毒-蛋白包括流感-A-蛋白、流感-B-蛋白或流感-C-蛋白，例如凝血素(HA)、神經(jīng)氨酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白(Ml)和(M2)、聚合酶蛋白(PBl)、(PB2)和(PA)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)和(NS2)和其部分。流感病毒-蛋白的部分包括流感-A-蛋白、流感-B-蛋白或流感-C-蛋白的一種或多種表位。表位可以是⑶4+T-細胞-表位，其表示這樣的一種肽，該肽包含類MHC-類-1I的結(jié)合基序以及通過MHC-類-1I分子在抗原表現(xiàn)的細胞的表面上表現(xiàn)，或者是CD8+T-細胞-表位，其表示這樣的一種肽，該肽包含類MHC-類-1的結(jié)合基序(Bindemotif)以及通過MHC-類-1分子在抗原呈遞的細胞表面上表現(xiàn)。例如允許算法模型、MHC-結(jié)合試驗(Bindetest)、電腦模擬(insilico)抗原-鑒定方法和X射線晶體學(xué)方法允許鑒定可以連接多種MHC-分子的抗原。在此使用的術(shù)語“疫苗”理解為生物學(xué)或基因技術(shù)制備的抗原，其包括蛋白、蛋白-亞單位(Untereinheiten)、肽、糖類、脂類、核酸、死亡或減弱病毒,其在本文中可以涉及整個的病毒顆?；虿《绢w粒部分或它們的組合?？乖梢杂兄辽僖粋€表位例如T-細胞-表位和/或B-細胞-表位。所述抗原由免疫受體例如T-細胞-受體或B-細胞-受體識別。使用疫苗后將特異性激活針對某種病毒的免疫系統(tǒng)。這里利用了免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，當(dāng)存在病毒或它的特異抗原時將引起免疫響應(yīng)。這導(dǎo)致形成抗體和特異性T-輔助細胞，其可以針對各種疾病提供持久的保護，根據(jù)不同的病毒保護作用可以持續(xù)幾年或一輩子。疫苗包括活疫苗或死疫苗?；钜呙绨鐪p毒的但還具有繁殖能力的病毒，其不能致病。而死疫苗的病毒則已被殺死或它僅包含病毒的片段(抗原)。病毒的滅活(殺死)例如通過化學(xué)物質(zhì)例如甲醛、β-丙內(nèi)酯和補骨脂素(Psoralen)實現(xiàn)。病毒包膜被保存下來。也有類毒素疫苗，其僅包含病毒毒素的生物失活組分(類毒素)(例如破傷風(fēng)類毒素)，這也屬于死疫苗。具體地，死疫苗可以涉及片段疫苗(Spaltimpfstoff)，其包含病毒包膜蛋白的片段。病毒包膜的破壞或分裂可以例如通過清潔劑或強有機溶劑實現(xiàn)。另外還可以用化學(xué)物質(zhì)使病毒失活或殺死病毒。另外還屬于死疫苗的有亞單位疫苗(Untereinheitimpfstoffe),其包含病毒的具體成分，例如凝血素-蛋白和神經(jīng)氨酸苷酶-蛋白。在此使用的術(shù)語“基于流感病毒的疫苗(Influenzavirus-basierterImpfstoff) ”理解為所有的蛋白、肽或它們的部分，以及編碼流感病毒的這些蛋白、肽或它們的部分的核酸，以及流感病毒顆粒本身，重組流感病毒-蛋白，包括流感-包膜蛋白、亞病毒顆粒，病毒樣顆粒(VLP)，VLP的復(fù)合物，和/或它們的部分，其可以用于免疫目的對抗流
感。 在此使用的術(shù)語“輔劑”理解為可以調(diào)節(jié)抗原的免疫原性的物質(zhì)。輔劑例如礦物鹽、角鯊烯混合物、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝桿菌細胞壁制劑、確定的乳液、單磷酸類脂-A(Monophosphoryl-1ipid-A)、霉菌酸(Mykolsiiure)-衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂-毒素B的亞單位、聚磷腈(Polyphosphazene)和它的衍生物、免疫刺激復(fù)合物、細胞因子輔劑、MF59-輔劑、脂質(zhì)輔劑、粘膜輔劑、確定的細菌-外毒素、確定的寡核苷酸和PLG。
在此使用的術(shù)語“羊膜細胞”理解為在羊水中存在且能夠通過羊水穿刺得到的所有細胞。該細胞要么源于羊膜，要么源于與羊膜液接觸的胎組織。記載了基于形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分的三大類羊膜細胞:成纖維樣細胞(F-細胞)、上皮樣細胞(E-細胞)和羊水細胞(Amniotic Fluid Cells, AF-細胞)(Hohn 等人，Pediat.Res.8:746-754，1974)。AF-細胞是主導(dǎo)的細胞類型。在此使用的術(shù)語“永久細胞系”理解為這樣的細胞:該細胞在遺傳上被改變，從而能夠在適合的培養(yǎng)條件下在細胞培養(yǎng)液中永久持續(xù)生長。這種細胞也可稱為永生化細胞。在此使用的術(shù)語“原代細胞”理解為通過直接從生物體或組織提取所得到的并且經(jīng)培養(yǎng)(in Kultur)的細胞。原代細胞僅有非常有限的壽命。在此使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”理解為所有適合于將所述核酸引入到細胞中的方法。作為實例可指出經(jīng)典的磷酸鈣法、電穿孔、任何形式的脂質(zhì)體體系及這些方法的組合。在此使用的術(shù)語“CAP”理解為通過用腺病毒功能基因ElA和ElB永生化原代人羊膜細胞而產(chǎn)生的永久人羊膜細胞細胞系。在此使用的術(shù)語“CAP-T”理解為另外用含有SV40大T-抗原序列的核酸分子所穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CAP-細胞。本發(fā)明的主題涉及基于流感病毒的疫苗的制備方法，其包括以下步驟:(i)使流感病毒接觸永久人細胞，(ii)培養(yǎng)所述永久人細胞，(iii)實現(xiàn)流感病毒的表達，以及(iv)從培養(yǎng)基中分離所述流感病毒。在本發(fā)明方法中，在適合細胞生長的條件(例如溫度、培養(yǎng)基、pH-值)下培養(yǎng)永久人細胞。涉及溫度、培養(yǎng)基、PH-值和其他的生長參數(shù)的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可以通過一般的方法獲知。當(dāng)培養(yǎng)液實現(xiàn)了理想的生長密度(Wachstumsdichte)時，將流感病毒用于細胞感染。病毒需要幾天的時間在細胞的內(nèi)部進行繁殖。在該繁殖過程期間，大部分細胞死亡且病毒將釋放在培養(yǎng)基中。通過例如離心分離含病毒的溶液和細胞碎片。之后通過例如層析柱從培養(yǎng)基溶液中分離出病毒且體積得以減小。這之后，病毒可以通過例如化學(xué)方法被滅活。然后進行病毒裂解。經(jīng)過進一步的凈化和濃縮步驟，由此得到病毒株的抗原濃縮物。在一優(yōu)選的實施方案中，流感病毒株A/PR/8/34、A/Uruguay/716/2007、A/Brisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、豬流感(A/Swine (H1N2) Bakum/1832/OO)或馬流感(A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8))用于感染永久人細胞。在又一優(yōu)選的實施方案中，感染永久人細胞用的流感病毒預(yù)先在細胞上進行適應(yīng)性處理(adaptieren)，這里優(yōu)選以上所列出的流感病毒。這樣的適應(yīng)性處理優(yōu)選歷經(jīng)四次傳代實現(xiàn)。優(yōu)選在293SFMI1-培養(yǎng)基或PEM-培養(yǎng)基中實現(xiàn)流感病毒的適應(yīng)性。本發(fā)明的又一主題涉及基于流感病毒的疫苗的制備方法，其包括以下步驟:(i)使編碼流感病毒-蛋白的核酸分子接觸永久人細胞，
(ii)培養(yǎng)該永久人細胞，(iii)實現(xiàn)編碼流感-蛋白的核酸分子的復(fù)制和/或流感-蛋白的表達，以及(iv)從培養(yǎng)基中分離編碼流感-蛋白的核酸分子和/或流感病毒-蛋白。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中所使用的永久人細胞涉及永久人羊膜細胞。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，永久人細胞在振蕩瓶或生物反應(yīng)器、優(yōu)選STR-生物反應(yīng)器或Wave-生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。永久人細胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選在293SFMI1-培養(yǎng)基或PEM-培養(yǎng)基中培養(yǎng)。另外可以向培養(yǎng)基中加入丙酮酸鹽、谷氨酰胺、葡萄糖或其他的氨基酸。培養(yǎng)基優(yōu)選包含4mM或IOmM丙酮酸鹽以及其他的氨基酸。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方案中，培養(yǎng)時振蕩瓶中的永久人細胞的開始細胞數(shù)目為5xl05細胞/ml，更優(yōu)選8xl05細胞/ml。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方案中，感染時間點時的培養(yǎng)液的pH-值范圍為7.1至
7.8，更優(yōu)選為7.3至7.5，還更優(yōu)選為7.3至7.5。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方案中，在流感病毒感染永久人細胞之前完全改變培養(yǎng)基或用培養(yǎng)基進行1:2_稀釋。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，用于感染永久人細胞的流感病毒胰蛋白酶濃度為lxlO_4U/細胞、lxlO_5U/細胞、3x10_5U/細胞、5x10_5U/細胞或lxlO_6U/細胞。當(dāng)在感染永久人細胞之前培養(yǎng)基不改變時，流感病毒感染細胞時的胰蛋白酶濃度優(yōu)選為IxlO-4U/細胞。當(dāng)在感染永久人細胞之前用培養(yǎng)基進行了 1:2-稀釋時，流感病毒感染細胞時的胰蛋白酶濃度優(yōu)選為5xl(T5U/細胞。 當(dāng)在感染永久人細胞之前培養(yǎng)基完全改變時，流感病毒感染細胞時的胰蛋白酶濃度優(yōu)選為5X10_6U/細胞。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，用于感染永久人細胞的病毒量的范圍以MO1-(復(fù)合感染)值給出為0.001至0.3。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，用于感染永久人細胞的病毒量的范圍以MO1-(復(fù)合感染)值給出為0.25,0.1,0.06,0.025或0.0025。在用流感病毒A/PR/8/34感染永久人細胞且在感染之前培養(yǎng)基不改變時，優(yōu)選使用的病毒量、以MO1-值給出、為0.25，以及在用流感病毒A/Brisbane/59/2007感染永久人細胞且在感染之前培養(yǎng)基不改變時，優(yōu)選使用的病毒量、以MO1-值給出、為0.1。在用流感病毒A/PR/8/34感染永久人細胞且在感染之前培養(yǎng)基改變時，優(yōu)選使用的病毒量、以MO1-值給出、為0.1或0.25，以及在用流感病毒A/Brisbane/59/2007感染永久人細胞且在感染之前培養(yǎng)基改變時，優(yōu)選使用的病毒量、以MO1-值給出、為0.06或0.25，以及在用流感病毒B/Florida/4/2006感染永久人細胞且在感染之前培養(yǎng)基改變時，優(yōu)選使用的病毒量、以MO1-值給出、為0.1、0.025 或 0.0025。在一優(yōu)選實施方案中，在培養(yǎng)時的感染時間點，振蕩瓶中的細胞數(shù)范圍為IxlO6至6xl06細胞/ml。感染時間點時的細胞數(shù)優(yōu)選為2.3xl06細胞/ml、4.5xl06細胞/ml或5xl06細胞/ml。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，在感染時間點時的細胞數(shù)為4.5xl06細胞/ml且在感染前不改變培養(yǎng)基。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方案中，在感染時間點時的細胞數(shù)為
2.3xl06細胞/ml以及在感染前用新鮮的PEM-培養(yǎng)基進行1:2-稀釋。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方案中，在感染的時間點時的細胞數(shù)為5xl06細胞/ml且在感染前完全改變培養(yǎng)基。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方案中，永久人細胞在I升生物反應(yīng)器STR(Sartorius)中于包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸鹽的PEM-培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中開始細胞數(shù)為5xl05細胞/ml且用病毒量、以MO1-值給出、為0.025的流感病毒感染細胞數(shù)為2.1xlO6細胞/ml且在感染前培養(yǎng)基不改變。感染優(yōu)選在存在的胰蛋白酶的最終濃度為3xlO_5U/ml時實現(xiàn)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方案中,永久人細胞在I升生物反應(yīng)器STR(Sartorius)中于PEM-培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中開始細胞數(shù)為8xl05細胞/ml且用病毒量、以MO1-值給出、為0.025的流感病毒感染細胞且在感染前改變培養(yǎng)基。感染優(yōu)選在存在的胰蛋白酶的最終濃度為3X10_5U/ml時實現(xiàn)。在本發(fā)明的又一特別優(yōu)選實施方案中，永久人細胞在I升振蕩瓶式反應(yīng)器(WaveBiotech AG)中于包含4mM谷氨酰胺、4mM丙酮酸鹽和20mM葡萄糖的PEM-培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中開始細胞數(shù)為5xl05細胞/ml以及感染之前的細胞數(shù)為2.1xlO6細胞/ml且用病毒量、以MO1-值給出、為0.025的流感病毒感染細胞以及在感染前培養(yǎng)基不改變。感染優(yōu)選在存在的膜蛋白酶的最后濃度為3x10 5U/ml時實現(xiàn)。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，永久人細胞在振蕩瓶中于包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸鹽的PEM-培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中在存在的胰蛋白酶-濃度為1x10、/細胞時用病毒量、以MO1-值給出、為0.025的流感病毒感染細胞之前改變培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，永久人細胞在振蕩瓶中于包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸鹽的PEM-培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中在存在的胰蛋白酶-濃度為IxKT5U/細胞時用病毒量、以MO1-值給出、為0.025的流感病毒感染細胞之前進行1:1_培養(yǎng)基改變。在制備流感-蛋白和編碼流感-蛋白的核酸分子時，將用編碼流感-蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染所培養(yǎng)的人細胞，然后使用已知的方法分離和凈化流感病毒-蛋白或編碼流感_蛋白的核酸分子。在又一優(yōu)選的 實施方案中，在本發(fā)明方法中，在用病毒顆粒感染的時間點或用編碼流感病毒-蛋白或其部分的核酸分子的轉(zhuǎn)染時間點時，人細胞處于中間指數(shù)生長期(mittler exponentiell Wachstumsphase)和靜止生長期中或處于中間指數(shù)生長期和靜止生長期之間。細胞數(shù)目在時間上的典型生長曲線顯示為S形曲線。該曲線開始為所謂的停滯期(Iag-Phase)，之后為對數(shù)期或指數(shù)期以及平穩(wěn)期。中間指數(shù)生長期在本文中相應(yīng)于典型生長曲線的第一個轉(zhuǎn)折點，其中轉(zhuǎn)折點是生長曲線上的一個點，在這一點上曲線的形狀從凹轉(zhuǎn)變成凸或從凸轉(zhuǎn)變成凹。當(dāng)生長曲線達到平臺且因此細胞數(shù)目保持穩(wěn)定時開始了平穩(wěn)期。通過本發(fā)明方法制備的編碼流感-蛋白的核酸可以用于核酸-免疫作用或所謂的DNA-疫苗。在核酸-免疫作用中，接種免疫抗原，即誘發(fā)人體產(chǎn)生免疫響應(yīng)的抗原。這些免疫抗原將通過DNA或RNA進行編碼以及作為表達盒或表達載體存在或整合入病毒載體中，以誘導(dǎo)對基因產(chǎn)物的免疫響應(yīng)。DNA-疫苗可以以不同的給藥體系存在，例如，作為DNA或RNA,以線性或圓形質(zhì)粒或表達盒(Expressionskassetten)的形式,其中這些裝配了表達所需的元素，例如啟動子、聚腺苷酸化位點、復(fù)制起點等。在給藥DNA時,所述這些主要存在于包含輔劑或不包含輔劑的緩沖液中或連接納米顆粒或整合入包含輔劑的化合物或病毒或細菌載體中。DNA-疫苗不僅可以引起人的免疫性而且可以引起細胞-介導(dǎo)的免疫性。DNA-疫苗的一個優(yōu)勢在于抗原以它們的天然形式進行表達且因此引起改進的免疫作用。DNA-疫苗的另一優(yōu)勢在于與減毒的活疫苗不同，DNA-疫苗是非感染性的且可以不再是有毒的。以DNA或RNA形式連結(jié)在顆粒上的質(zhì)?；蚓€性DNA-片段的DNA-疫苗的給藥可以通過注射或借助基因槍實現(xiàn)。其中注射用的DNA-疫苗可以置于例如生理鹽水或緩沖生理鹽水中。通過本發(fā)明方法制備的編碼流感-蛋白的核酸、流感-蛋白和流感病毒可以用作對抗流感病毒_類型-A和/或-B和/或-C的疫苗。通過本發(fā)明方法制備的基于流感病毒的疫苗包括所有的蛋白、肽或它們的部分，以及編碼流感病毒的蛋白、肽或它們的部分的核酸，以及流感病毒顆粒本身、重組流感病毒-蛋白，其包括流感-包膜蛋白、亞病毒顆粒，病毒樣顆粒(VLP)，VLP的復(fù)合物，和/或它們的部分，其可以用于免疫目的對抗流感。通過本發(fā)明方法制備的流感-蛋白優(yōu)選涉及蛋白或流感病毒的衍生物，優(yōu)選流感病毒株 A/PR/8/34、A/Uruguay/716/2007、A/fcisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、豬流感(A/Swine (HlN2)Bakum/1832/00)·或馬流感(A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8))。通過常規(guī)方法分離和凈化通過本發(fā)明方法制備的編碼流感病毒-蛋白或它的部分的核酸且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。通過本發(fā)明方法制備的流感病毒-蛋白的分離和凈化借助本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實現(xiàn)。蛋白的制備首先取決于其來源。區(qū)別對待細胞內(nèi)和細胞外蛋白。當(dāng)?shù)鞍孜挥诩毎w的內(nèi)部時，則首先需要通過例如剪切力或滲透力(Osmolyse)破壞細胞。之后例如通過離心來分離不溶材料如細胞膜和細胞壁。以標(biāo)準(zhǔn)方式進行的離心用于分離細胞、細胞器和蛋白。就分離能力方面而言，更有效的方法是脈沖電泳(Pulselektrophorese)。在分離了其他的細胞成分之后還有必要分離多種大蛋白、肽和氨基酸。蛋白的分離可以通過一維或二維凝膠電泳或毛細管電泳實現(xiàn)。在氨基酸和肽領(lǐng)域，則使用例如色譜方法，如親和力_，離子交換(IEC)和反相色譜法(RPC)。脂質(zhì)的存在以及分離的必要性或蛋白酶的滅活不利于凈化作用。不必從細胞中提取出存在于細胞外基質(zhì)中的蛋白，但是在分離了所有的不溶成分之后，細胞外基質(zhì)中的蛋白則是非常稀釋的且其數(shù)量通常顯著低于細胞內(nèi)蛋白。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離和凈化通過本發(fā)明方法制備的流感病毒-顆粒。這些方法的實例例如密度梯度-差速-或區(qū)帶離心作用。本發(fā)明方法中所使用的永久人細胞通過原代人細胞的永生化作用產(chǎn)生。原代人細胞通過直接取自有機體或來自有機體和保存在培養(yǎng)液中的組織而獲得。優(yōu)選這樣的原代人細胞，其可以通過細胞-轉(zhuǎn)染因子進行表達從而很好地轉(zhuǎn)化至永久人細胞系，特別是羊膜細胞、胚胎視網(wǎng)膜細胞(embryonale Retinazellen)還有神經(jīng)細胞起源的胚胎細胞(embryonale Zellen neuronalen Ursprungs)。細胞-轉(zhuǎn)染因子可以是SV40的T-抗原(基因庫登錄編號(Acc.Nr.)J02400)、HPV的E6-和E7-基因產(chǎn)物(例如HPV16，基因庫登錄編號K02718)和人腺病毒的ElA-和ElB-基因產(chǎn)物(例如人腺病毒血清型_5，基因庫登錄編號X02996)。通過人腺病毒的El和ElA-和ElB-基因產(chǎn)物的核酸序列的表達轉(zhuǎn)染原代細胞以進行永生化作用。在通過自然獲得的HPV進行表達時，E6和E7可以由RNA-轉(zhuǎn)錄物表達。同樣的適用于天然存在的腺病毒的ElA和ElB的表達。細胞-轉(zhuǎn)染因子例如腺病毒El-功能基因作用于永生化作用或轉(zhuǎn)化且因此作用于細胞的長期可培養(yǎng)性(Kultivierbarkeit)。
細胞-轉(zhuǎn)染因子的表達可以在同源(homologen)啟動子或轉(zhuǎn)錄末端因子(Terminationselemente)的控制下實現(xiàn),例如自然ElA-啟動子和腺病毒ElA-功能基因的表達用的自然ElA-聚腺苷酸化位點。用于轉(zhuǎn)染的各病毒基因組的核酸分子片段例如用于轉(zhuǎn)染的腺病毒基因組的核酸分子片段包含所謂的功能基因，例如E1A、E1B。然而細胞-轉(zhuǎn)染因子的表達也可以在非同源(heteiOloger)、不是天然存在的具有所用編碼區(qū)域的啟動子或轉(zhuǎn)錄物末端因子的控制下實現(xiàn)。作為非同源啟動子可以是例如CMV-(巨細胞病毒(Cytomegalievirus)-)啟動子(Makrides, 9-26in:Makrides (Hrsg.), Gene Transferand Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)、EF-1 a -啟動子(Kim等，Gene91:217-223, 1990)、CAG-啟動子(人巨細胞極早期啟動子和具有內(nèi)含子的改性雞 β _Aktin 啟動子的混合啟動子(Hybridpromotor)) (Niwa 等，Genel08:193-199，1991)、人或鼠Pgk-(磷酸甘油酸激酶-)啟動子(Adra等，Gene60:65-74, 1987)、RSV-(勞氏肉瘤病毒-)啟動子(Makrides, 9_26in:Makrides (Hrsg.)，Gene Transfer and Expressionin Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)或 SV40-(猿猴病毒 40-)啟動子(Μakrides,9-26in:Makrides(Hrsg.), Gene Transfer and Expression in MammalianCells, Elsevier, Amsterdam, 2003)。作為聚腺苷酸化位點可以使用例如SV40大T-抗原(基因庫登錄編號J02400)的聚腺苷酸化序列或人G-CSF-(粒細胞集落刺激因子，granulocyte colony stimulating factor)基因(Mizushima und Nagata, Nuc1.AcidsRes.18:5322, 1990)的聚腺苷酸化序列。通過用含有編碼ElA和ElB的核酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)染原代人細胞，該細胞得以永生化。用于原代人細胞永生化的核酸分子含有ElA-和ElB-核酸序列，該核酸序列優(yōu)選源自人腺病毒，特別是人血清型5。在優(yōu)選的實施方式中，用于永生化的核酸分子，除編碼ElA和ElB的核酸序列外，還含有編碼腺病毒pIX-功能基因的核酸序列。該PlX-多肽，一種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，作為轉(zhuǎn)錄激活物作用于各種病毒和細胞啟動子例如胸苷激酶啟動子和β_珠蛋白-啟動子。如果重組多肽的編碼序列在上述啟動子的控制下時，在細胞中額外表達的PlX-多肽的轉(zhuǎn)錄激活作用可以在本發(fā)明制備的細胞系中提高重組多肽的表達速率。作為實例的序列可見基因庫登錄編號Χ02996中。特別地，核酸分子包括人腺病毒血清型-5的核苷酸I至4344、505至3522或核苷酸505至4079。

在一優(yōu)選實施方案中，用于永生化原代細胞具體是羊膜細胞的核酸分子包含腺病毒血清型5核苷酸序列的核苷酸505至核苷酸4079。在又一特別優(yōu)選的實施方案中，用于永生化原代細胞具體是羊膜細胞的核酸分子包含腺病毒血清型-5-核苷酸序列的核苷酸505至核苷酸3522。在又一特別優(yōu)選的實施方案中，用于永生化原代細胞具體是羊膜細胞的核酸分子包含腺病毒血清型-5-核苷酸序列的核苷酸I至核苷酸4344，其相應(yīng)于ΗΕΚ293-細胞中的腺病毒DNA(Louis等，Virology233:423-429，1997)。另外，永生化的人細胞可以表達病毒復(fù)制因子。這些復(fù)制因子可以結(jié)合至通過轉(zhuǎn)染引入的核酸分子的復(fù)制起點(ori，“復(fù)制的起點”)且由此開始了附加型核酸分子的復(fù)制。細胞中的核酸分子的附加型復(fù)制，特別是質(zhì)粒-DNA的附加型復(fù)制使得被轉(zhuǎn)染的核酸分子的拷貝數(shù)目大大增加且從而增強了在該分子上編碼的重組多肽的表達及其經(jīng)若干細胞分裂的接收。這樣的病毒復(fù)制因子是例如猿猴病毒40 (SV40)的T-抗原，其在結(jié)合在核酸分子上的稱作SV40-復(fù)制起點(SV40ori,復(fù)制的起點)序列上以后，例如質(zhì)粒-DNA，開始其復(fù)制。艾伯斯坦_巴爾_病毒(Ebstein-Barr-Virus)蛋白EBNA-1 (艾伯斯坦巴爾病毒核抗原-1)識別稱作ori_P的復(fù)制起點和催化攜帶or1-P的核酸分子的染色體外復(fù)制。猿猴病毒40(SV40)的T-抗原不僅用作復(fù)制因子激活復(fù)制，而且也對一些病毒和細胞基因的轉(zhuǎn)錄起激活的作用(Brady，Johnand Khoury, George, 1985, Molecular and Cellular Biology, Vol.5, N0.6, p.1391tol399)
o在本發(fā)明方法中使用的永生化人細胞特別是永生化人羊膜細胞。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明方法中使用的永生化人細胞表達了 SV40的大T-抗原或艾伯斯坦-巴爾-病毒(EBV)核抗原-1 (EBNA-1)。在一特別優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明方法中使用的永生化人羊膜-細胞表達了 SV40的大T-抗原或艾伯斯坦-巴爾-病毒(EBV)核抗原-1 (EBNA-1)。在又一特別優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明方法中使用的永生化人細胞，特別是羊膜-細胞在CAG-、RSV-或CMV-啟動子的控制下表達了 SV40的大T-抗原。在本發(fā)明方法中使用的永久人羊膜細胞具體記載在專利EP1230354和EP1948789中。在一特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的永久人羊膜細胞涉及CAP或CAP-T。

在CAP-細胞的情況中，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代羊膜細胞，該質(zhì)粒包含鼠Pgk啟動子、包含Ad5-序列nt.505-3522的總El-區(qū)、SV40的3’接頭(Splei β )_和聚腺苷酸化信號和Ad5 (nt.3485-4079)的pIX-區(qū)。這些質(zhì)粒已詳細記載在ΕΡ1948789中。為了制備CAP-T-細胞，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAP-細胞，該質(zhì)粒包含SV40的T-抗原的表達盒(側(cè)接有SV40的內(nèi)含子(flankiert von einem Intron aus SV40))和聚腺苷酸化位點。另外，質(zhì)?？梢园珻AG-啟動子(包含CMV-增強子和雞β-Aktin啟動子的混合啟動子)(Niwa等人，Genel08:193-199，1991)、RSV-啟動子(源自勞氏肉瘤病毒的啟動子)(基因庫登錄編號DQ075935)或CMV-啟動子(人巨細胞病毒早期啟動子)(SEQ IDNO:5) ο為了生成穩(wěn)定的細胞系，質(zhì)粒包含具有泛素啟動子(Ubiquitinpromotor) (pUB/Bsd, Invitrogen#V512-20)的滅菌素(Blasticidin)-表達盒。另外，在本發(fā)明提供的方法中，人細胞，特別是羊膜細胞，可以在懸浮液中生長。此夕卜，在本發(fā)明方法中，人細胞，特別是羊膜細胞，可以在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明的又一主題是永久人細胞，特別是羊膜細胞，在制備基于流感病毒的疫苗中的用途。在一優(yōu)選實施方案中，用于制備基于流感病毒的疫苗的永久人羊膜細胞涉及CAP-或 CAP-T-細胞。通過本發(fā)明方法制備的基于流感病毒的疫苗可以是流感病毒和/或流感病毒-蛋白或編碼流感-蛋白的核酸分子。疫苗可以腸胃外注射給藥。這里分為皮內(nèi)的、皮下的或肌內(nèi)的注射。皮內(nèi)注射可以通過疫苗接種槍(Impfpistole)或刺血針實現(xiàn)。肌內(nèi)注射可以在上臂、大腿或臀部肌肉處實現(xiàn)。另外，疫苗可以口服或經(jīng)鼻給藥。疫苗可以例如給藥于人和動物。通過本發(fā)明方法制備的基于流感病毒的疫苗可以不僅通過主動免疫而且通過被動免疫賦予對抗一種或多種流感病毒的抵抗力。在主動免疫時，疫苗在使用之后用于特異激活人和動物針對確定的病毒的免疫系統(tǒng)。這里利用免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，在存在病毒或其特異病原時引起免疫響應(yīng)。這導(dǎo)致形成抗體和特異T-輔助細胞，其可以針對各種疾病提供持久的保護，根據(jù)不同的病毒保護作用可以持續(xù)幾年或一輩子。
通過本發(fā)明方法制備的基于流感病毒的疫苗可以例如涉及活疫苗或死疫苗?；钜呙绨鐪p毒的但還具有繁殖能力的病毒，其不能致病。而死疫苗的病毒則已被殺死或它僅包含病毒的片段(抗原)。病毒的滅活(殺死)例如通過化學(xué)物質(zhì)/物質(zhì)組合例如甲醛、丙內(nèi)酯和補骨脂素實現(xiàn)。病毒包膜被保存下來。也有類毒素疫苗，其僅包含病毒毒素的生物失活組分(類毒素)(例如破傷風(fēng)類毒素)，這也屬于死疫苗。具體地，死疫苗可以涉及片段疫苗(Spaltimpfstoff)，其包含病毒包膜蛋白的片段。病毒包膜的破壞(分裂)可以例如通過清潔劑或強有機溶劑實現(xiàn)。另外還可以用化學(xué)物質(zhì)使病毒失活(殺死)病毒。另外還屬于死疫苗的有亞單位疫苗(Untereinheitimpfstoffe),其包含特定的病毒成分，例如凝血素-和神經(jīng)氨酸苷酶-蛋白。在被動免疫時，通過本發(fā)明方法制備的基于流感病毒的疫苗向已經(jīng)獲得被誘發(fā)的抗血清的宿主(例如哺乳動物)給藥，以及向感染了至少一種流感病毒的接受者給藥。另外，向疫苗中加入一種或多種添加劑，如穩(wěn)定劑、中和劑、載體和保存劑，用于給藥。此外，甲醒、硫柳萊(Thiomersal)、磷酸招、Azeton和苯酹也屬于這些物質(zhì)。另外,可以向疫苗中加入輔劑以強化疫苗的效用。這些所謂的輔劑本身應(yīng)該盡可能不具有藥效且具體地用作助溶劑(Usungsvermittler)、乳液或它們的混合物。輔劑是例如礦物鹽、角鯊烯混合物、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝桿菌細胞壁制劑、特定的乳液、單磷酸類脂-A、霉菌酸(Mykolsaure)-衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂-毒素B的亞單位、聚磷腈和它的衍生物、免疫刺激復(fù)合物、細胞因子輔劑、MF59-輔劑、脂質(zhì)輔劑、粘膜輔劑、確定的細菌-外毒素、確定的寡核苷酸和PLG。下文實施例闡述了本發(fā)明，并且并不理解為限制性的。如果沒有另外注明，則使用的是分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如Sambrook等，1989，Molecular cloning:A LaboratoryManual2.Auflagej Col d Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork中所記載的。實施例1:永久羊臘細朐細朐系CAP-1D5在PEM-或293SFMI1-培養(yǎng)某中的培養(yǎng)試驗永久羊膜細胞系CAP-1D5在IOOml不含血清的293SFMI1-培養(yǎng)基(Invitrogen)或PEM-培養(yǎng)基(Invitrogen)中于37° C、8%C02和IOOrpm時進行培養(yǎng)。作為對照，在IOOml振蕩瓶中于IOOml不含血清的SMIF8-培養(yǎng)基中使用永久犬腎細胞系MDCK.SUS2 (Madin DarbyCanine Kidney,在懸浮液中適應(yīng)生長)(Lohr 等人,Vaccine, 2010, 28 (38): 6256-64)。在時間點O (=培養(yǎng)的開始點)以及分別在24小時的時間間隔上測定活細胞數(shù)、死細胞數(shù)、細胞系的存活率以及PH-值、培養(yǎng)基中的葡萄糖、乳糖、谷氨酰胺、銨、谷氨酸以及丙酮酸鹽的濃度(生物化學(xué)多參數(shù)分析系統(tǒng))(Lohr等，Vaccine，2009, 27 (37)，4975-4982 ；Genzel 等，Appl Microbiol Biotechnol.，2010，88(2):461-75)。永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5在293SFMI1-以及PEM-培養(yǎng)基中的活細胞數(shù)以及MDCK.SUS2-細胞的活細胞數(shù)從培養(yǎng)開始時候每毫升培養(yǎng)液約2xl05細胞就顯示了相似的曲線以及在168小時后實現(xiàn)的活細胞數(shù)為約每毫升2xl06細胞。MDCK.SUS2-細胞的活細胞數(shù)從192小時起減小至每毫升9xl05細胞且至生長曲線開始后的240小時保持穩(wěn)定。在293SFMI1-培養(yǎng)基中的永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5的活細胞數(shù)在216小時時才減小至每毫升培養(yǎng)液2xl05細胞的初始值，而在PEM培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞的活細胞數(shù)保持穩(wěn)定為每毫升培養(yǎng)液約2.5xl06細胞直到240小時，且在312小時后才達到2xl05細胞的活細胞數(shù)的初始值。在293SFMI1-培養(yǎng)基和PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞的存活率以及MDCK.SUS2-細胞的存活率在生長曲線開始時和直到168小時時在80%和90%之間。在PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞的存活率至240小時保持為80%，之后減小且在312小時后顯示為10%。在293SFMI1-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞的存活率在168小時后就緩慢減小以及在216小時后顯示為約10%。MDCK.SUS2-細胞的存活率在168小時后連續(xù)減小且在240小時后達到約45%。MDCK.SUS2-細胞的培養(yǎng)液的pH-值保持超過240小時的相對穩(wěn)定，其介于7.7和
7.6之間。而在293SFMI1-培養(yǎng)基以及PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞的培養(yǎng)液的pH-值(開始時為7.4)在240小時(293SFMI1-培養(yǎng)基)和312小時(PEM-培養(yǎng)基)后持續(xù)減小至 pH6.4。在CAP-1D5-細胞的各培養(yǎng)液的293SFMI1-培養(yǎng)基和PEM-培養(yǎng)基中的乳糖-濃度從小于5mM的開始濃度直到240小時增加至30 - 35mM。在MDCK.SUS2-細胞的培養(yǎng)液中，乳糖-濃度以較小強度增加，但是240小時時達到與CAP-1D5-細胞的培養(yǎng)液類似的值。在293SFMI1-培養(yǎng)基和PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞的培養(yǎng)液以及MDCK.SUS2-細胞的培養(yǎng)液的葡萄糖-濃度從培養(yǎng)開始時的20至25mM減小至小于10禮，其中在293SFMI1-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液顯示了最強的降低。在293SFMI1-培養(yǎng)基以及PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液中的銨-濃度的增加顯示了非常相似的曲線(從〈0.5增加至4-5mM)。而在MDCK.SUS2-細胞的培養(yǎng)液中的銨-濃度顯著更強地增加(至7mM)。在293SFMI1-培養(yǎng)基以及PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液中的谷氨酰胺 -濃度的減小的曲線也是非常相似的，其中在PEM-培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液顯示了最強的降低。MDCK.SUS2-細胞培養(yǎng)液顯示了最大的谷氨酸-濃度且該濃度僅少量增加。在PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞培養(yǎng)液中的谷氨酸-濃度在培養(yǎng)開始時高于在293SFMI1-培養(yǎng)基中的濃度且持續(xù)增加。在MDCK.SUS2-細胞的培養(yǎng)液中的丙酮酸鹽-濃度自144小時起減小至O。而在PEM-培養(yǎng)基和293SFMI1-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞的培養(yǎng)液中的丙酮酸鹽在48小時時就消耗了。因此顯示了 CAP-1D5-細胞在PEM-培養(yǎng)基中比在293SFMI1-培養(yǎng)基中更好地生長，PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞顯示了最強的葡萄糖消耗和最強的乳糖-形成。自192小時起的葡萄糖限制可以解釋為在PEM-培養(yǎng)基中的CAP-1D5-細胞的細胞數(shù)的突降(Einbruch)。為了優(yōu)化CAP-1D5-細胞在PEM-培養(yǎng)基或293SFMI1-培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件，PH-值的穩(wěn)定、丙酮酸鹽和谷氨酰胺的添加以及葡萄糖可以是相關(guān)的。實施例2:用未經(jīng)話應(yīng)的病毒的病毒感染針對用未經(jīng)適應(yīng)的病毒進行的感染試驗，羊膜細胞系CAP-1D5在55ml不含血清的293SFMI1-培養(yǎng)基(Invitrogen)和 PEM-培養(yǎng)基(Invitrogen)中于 37。C、8%C02、IOOrpm時在振蕩瓶中培養(yǎng)。犬腎細胞系MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney,在懸浮液中適應(yīng))用作對照。分別列在表I中的細胞密度用病毒B/Florida/4/2006 (NIBSC, The NationalInstitute for Biological Standards and Control)或 A/PR/8/34 (HlNl)(RKI, Robert-Koch-1nstitut)進行感染，其中培養(yǎng)基不改變以及加入5xlO_6U/mL胰蛋白酶。所生成的病毒顆粒量通過滴定凝血素(HA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進行的凝血素測試)確定(表示為 log HA-單位 /100 μ I ;表 I) (Kalbfuss 等，2008 ；Biologicals36 (3): 145-61)。在表I中還列出了該時間點上的各培養(yǎng)基的pH-值。表1:通過非適應(yīng)性病毒在培養(yǎng)基不改變時進行的病毒感染試驗的概況在Ohpi*時的活細
權(quán)利要求
1.基于流感病毒的疫苗的制備方法，其包括: a)使流感病毒接觸永久人羊膜細胞， b)培養(yǎng)所述永久人羊膜細胞， c)實現(xiàn)流感病毒的表達，以及 d)從培養(yǎng)基中分離所述流感病毒。
2.基于流感病毒的疫苗的制備方法，其包括: a)使編碼流感病毒-蛋白的核酸分子接觸永久人羊膜細胞， b)培養(yǎng)所述永久人羊膜細胞， c)實現(xiàn)編碼流感病毒-蛋白的核酸分子的復(fù)制和/或流感病毒-蛋白的表達，以及 d)從培養(yǎng)基中分離編碼流感-蛋白的核酸分子和/或流感病毒-蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中所述永久人羊膜細胞在與流感病毒或編碼流感病毒-蛋白的核酸分子進行接觸的時間點處于指數(shù)生長期和靜止生長期中或處于指數(shù)生長期和靜止生長期之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中在步驟d)中從所述培養(yǎng)基中分離出所述流感病毒通過密度梯度-差速-離心或區(qū)帶離心實現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中在步驟d)中從所述培養(yǎng)基中分離所述流感病毒-蛋白通過電泳法或色譜法實現(xiàn)。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中所述永久人羊膜細胞表達腺病毒基因產(chǎn)物ElA和E1B。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中所述腺病毒基因產(chǎn)物ElA和ElB包括人腺病毒血清型-5的核苷酸I至4344、505至3522或核苷酸505至4079。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中所述永久人羊膜細胞表達腺病毒基因產(chǎn)物pIX。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中在接觸流感病毒或編碼流感病毒-蛋白的核酸分子之前完全改變培養(yǎng)基或用培養(yǎng)基進行1:2的稀釋。
10.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中在接觸流感病毒或編碼流感病毒-蛋白的核酸分子時加入的胰蛋白酶濃度為IXlO-4U/細胞、I X IO-5U/ 細胞、3 X IO-5U/ 細胞、5 X IO-5U/ 細胞或 I X KT6U/ 細胞。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項所述的基于流感病毒的疫苗的制備方法，其中在接觸流感病毒時使用的病毒量，以MO1-值給出，在0.001至0.3的范圍。
12.永久人羊膜細胞在制備基于流感病毒的疫苗中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述永久人羊膜細胞表達腺病毒基因產(chǎn)物ElA和E1B。
14.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，其中所述永久人羊膜細胞表達腺病毒基因產(chǎn)物pIX。
15.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述腺病毒基因產(chǎn)物ElA和ElB包括人腺病毒血清型-5的核苷酸I至4344、505至3522或核苷酸505至4079。
全文摘要
本發(fā)明涉及借助永久人羊膜細胞制備基于流感病毒的疫苗的方法，以及永久人羊膜細胞在制備基于流感病毒的疫苗中的用途。
文檔編號C12N7/02GK103168100SQ201180050018
公開日2013年6月19日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者G.希德納 申請人:塞維克制藥有限責(zé)任公司