專利名稱：全細(xì)胞生物催化劑的制作方法
全細(xì)胞生物催化劑本發(fā)明涉及包含以下的核酸分子:(I)編碼信號(hào)肽的區(qū)段、(2)包含異源氧化還原因子再生多肽或其變體的區(qū)段、(3)任選的編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的區(qū)段、(4)編碼跨膜接頭的區(qū)段、和(5)編碼自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(autotransporter)或其變體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的區(qū)段。所有已知酶的大約四分之一是氧化還原酶。對(duì)這一組酶已經(jīng)開發(fā)了寬范圍的應(yīng)用，包括手性化合物諸如醇類、醛類和氨基酸的合成，聚合物的產(chǎn)生和改性，用于最為多樣的應(yīng)用的生物傳感器的產(chǎn)生，和有害物質(zhì)的降解。氧化還原酶的特征在于，它們不僅包括至少一條多肽鏈，而且包括一個(gè)或多個(gè)氧化還原反應(yīng)性基團(tuán)，其可以是一個(gè)或多個(gè)氧化還原反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈或輔基。氧化還原酶的底物包括代謝產(chǎn)物和氧化還原因子。不同于酶的輔基，這些氧化還原因子底物不作為催化劑起作用，而是以化學(xué)計(jì)量的量參與反應(yīng)，并與其他底物一起進(jìn)入化學(xué)反應(yīng)。由于氧化還原因子通常比其他有機(jī)底物昂貴得多的事實(shí)，使用氧化還原酶的工業(yè)合成的可行性受到限制，由于需要提供合適的還原因子或氧化因子。為了解決這一問題，科學(xué)家們已經(jīng)建議使用氧化還原因子再生酶。例如，已經(jīng)提出使用甲酸脫氫酶(FDH)和NADH氧化酶或使用葡萄糖脫氫酶(GDH)來再生NADH或NADPH。將這樣的酶固定在合適的載體上用于多個(gè)催化循環(huán)應(yīng)當(dāng)是可能的，以避免不得不重復(fù)地純化大量的多肽。不幸地，氧化還原因 子再生酶通常是不穩(wěn)定的，尤其是當(dāng)處于固定化酶的形式時(shí)。Sanjust等(1997)將來自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的NADH氧化酶固定在多種載體上，并比較了可溶性和固定化酶的動(dòng)力學(xué)特性。發(fā)現(xiàn)，固定化酶具有比可溶性酶低的熱穩(wěn)定性。Hmnmel和Riebel (2003)描述了使用來自短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的可溶性、純化的NADH氧化酶用于再生NADH氧化酶。他們證明，該酶具有朝向快速氧化失活的趨勢，很可能是因?yàn)榈鞍状呋行闹写嬖趯?duì)氧化敏感的半胱氨酸殘基。因此，還原劑(ImM DTT或巰基乙醇)的使用被描述為對(duì)于維持該酶的催化能力是重要的。Ahmed和 Claiborne (1992)從糞鏈球菌(Streptococcus faecalis) 10C1 純化了含 FAD 的 NADH氧化酶并教導(dǎo)，2mM DTT的存在對(duì)于穩(wěn)定全氧化酶(holo_oxidase)是必需的。El-Zahab等(2004)描述，并由Lee和Ping (2007)證實(shí)，將氧化還原因子再生酶例如葡萄糖脫氫酶(GDH)固定在固態(tài)載體上，狹義地固定在納米孔石英玻璃上。然而，他們沒有描述所述酶如何能夠被穩(wěn)定。因此本發(fā)明的目的是提供具有氧化還原因子再生活性的劑，其中活性的來源不僅對(duì)于底物分子是容易接近的，而且可被容易地?cái)U(kuò)增、回收和再生，使得多個(gè)催化步驟是可能的，而不需要重復(fù)地產(chǎn)生新鮮的劑。本發(fā)明的另一目的是提供一種劑，其本身或在存在可能失活性的化學(xué)物諸如抑制性金屬離子時(shí)或在酸性或堿性PH，具有氧化還原因子再生活性和在動(dòng)力學(xué)、熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)存能力和穩(wěn)定性方面比對(duì)應(yīng)的酶的原始形式更佳的特性。本發(fā)明的特殊目的是提供一種劑，其在存在氧或氧釋放劑時(shí)或在氧化條件下表現(xiàn)穩(wěn)定的氧化還原因子再生活性，其穩(wěn)定性比對(duì)應(yīng)的酶的原始形式更佳。本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，使用自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)，能夠在全細(xì)胞的表面上表達(dá)氧化還原因子再生酶，且這些酶自身在存在氧和不同溫度和條件時(shí)是令人驚訝地穩(wěn)定的。而且，本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，能夠在多種條件中在多種溶液和緩沖液中培養(yǎng)氧化還原因子再生酶并在相當(dāng)長的時(shí)間保持穩(wěn)定。自主展示(autodisplay)是在細(xì)菌表面上呈遞重組蛋白的精細(xì)工具。這一表達(dá)系統(tǒng)是基于屬于V型分泌系統(tǒng)的自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白家族的分泌機(jī)制。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑由向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和向細(xì)胞外空間分泌蛋白二者形成(Jose和Meyer，2007)。自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為前體蛋白被合成，其滿足向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)的所有結(jié)構(gòu)要求(JoSe，2006)。它們被合成為帶有N末端信號(hào)肽，這是Sec途徑典型的，這使得跨過內(nèi)膜成為可能。一旦在周質(zhì)之內(nèi)，截短信號(hào)肽之后，前體的C末端部分折疊進(jìn)入外膜作為孔蛋白樣結(jié)構(gòu)，即所謂的￠-桶。經(jīng)過這個(gè)孔，N末端結(jié)合的載客結(jié)構(gòu)域(passenger domain)移位到表面(Jose等,2002)。在那里其可以被切割_通過自動(dòng)蛋白水解或另外的蛋白酶-或能夠經(jīng)由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域保持錨定在胞外被膜(cell envelope)上。用重組蛋白代替天然的載客導(dǎo)致重組蛋白的表面移位(surface translocation)。為此，必須使用遺傳工程技術(shù)構(gòu)建由信號(hào)肽、重組載客、￠-桶和其間的接頭區(qū)域組成的非天然的前體，接頭區(qū)域是不受限制地接近表面所需的。以這種方式，AIDA-1自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)成功地被用于多種載客結(jié)構(gòu)域的有效表面展示(Henderson等,2004)。利用自主展示系統(tǒng)，已經(jīng)觀察到活性酶上亞基的自締合，例如對(duì)于二聚酶山梨糖醇脫氫酶(JoSe，2002 Jose和von Schwichow,2004) 具體地，自主展示技術(shù)是在大腸桿菌(E.coli)和其他革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜表面上表達(dá)某些蛋白的方法，其中自主展示系統(tǒng)基于自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的天然分泌機(jī)制(A.Banerjee等(2002))。重組載客蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)可簡單地通過使用常規(guī)遺傳工程技術(shù)在讀碼框中在自主展示載體的信號(hào)肽與移位結(jié)構(gòu)域之間插入其編碼序列來進(jìn)行。信號(hào)肽可以從霍亂毒素的亞基獲得，且其可以與非天然啟動(dòng)子聯(lián)合。從而，將要經(jīng)歷跨外膜的移位的載客蛋白作為與另一蛋白的重組融合蛋白，稱為自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，被表達(dá)在大腸桿菌的外膜上(AIDA-1)(J0Se，2006)。自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C末端部分在大腸桿菌的外膜中形成孔蛋白樣結(jié)構(gòu)(￠-桶)。這種孔蛋白樣結(jié)構(gòu)使得重組載客蛋白能夠被移位到大腸桿菌的外膜表面(Jose,1995，2006，2007)。固定氧化還原輔因子再生多肽的概念追溯到1974年，當(dāng)時(shí)Sarborsky和Ogletree描述了經(jīng)由活化其碳水化合物殘基來固定葡萄糖氧化酶。自主展示系統(tǒng)的概念由Jose等(1995)首次描述，也已經(jīng)被公知超過15年。盡管如此，就我們所知，使用自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)來固定氧化還原因子再生酶沒有被現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)或提出。本發(fā)明的目的通過獨(dú)立權(quán)利要求的目的來解決。優(yōu)選的實(shí)施方案可見于從屬權(quán)利要求。根據(jù)第一方面，本發(fā)明的目的如下解決，其還是第一方面的第一實(shí)施方案:一種核酸分子，包含(I)編碼信號(hào)肽的區(qū)段、(2)包含異源氧化還原因子再生多肽或其變體的區(qū)段、(3)任選的編碼蛋白 酶識(shí)別位點(diǎn)的區(qū)段、(4)編碼跨膜接頭的區(qū)段、和(5)編碼自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其變體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的區(qū)段。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子被有功能地連接于表達(dá)調(diào)節(jié)序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)節(jié)序列”是指能夠調(diào)節(jié)核酸分子的表達(dá)水平的核酸序列，核酸分子優(yōu)選地在表達(dá)調(diào)節(jié)序列下游。表達(dá)調(diào)節(jié)序列可以是例如啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉適于調(diào)節(jié)表達(dá)的序列和用于有功能地將這些序列與核酸分子連接的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子是重組質(zhì)粒的部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:1或其變體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“異源的”是指使用遺傳工程技術(shù)，例如通過將表達(dá)調(diào)節(jié)序列和通常不處于這一表達(dá)調(diào)節(jié)序列控制下的待表達(dá)序列連接在一起，或通過使用具有相對(duì)于原始序列的點(diǎn)突變的序列而構(gòu)建的核酸。即使構(gòu)建體的僅一個(gè)區(qū)段被稱為異源的，這因而暗示整個(gè)構(gòu)建體是異源的。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉遺傳工程技術(shù)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“異源的”是指連接于表達(dá)調(diào)節(jié)序列的編碼多肽的核酸，和/或與表達(dá)調(diào)節(jié)序列來源于不同的生物體且待表達(dá)的融合的序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文與氧化還原因子再生多肽關(guān)聯(lián)使用的術(shù)語“異源的”表示，編碼該氧化還原因子再生多肽的核酸區(qū)段與至少一個(gè)其他區(qū)段從不同的生物體獲得或取得，至少一個(gè)其他區(qū)段諸如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域或表達(dá)調(diào)節(jié)序列或跨膜接頭。例如，如果氧化還原因子再生多肽從短乳桿菌獲得，而所有其他序列從大腸桿菌獲得，則氧化還原因子再生多肽是異源的。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“異源的”表示，稱為異源的核酸序列來源于不同于用于表達(dá)或擴(kuò)增這一核酸序列的宿主或預(yù)期宿主的生物體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“信號(hào)肽”是指具有如果多肽被表達(dá)在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，將其移位到細(xì)胞的特定區(qū)室、優(yōu)選地不同于細(xì)胞質(zhì)的區(qū)室的作用的氨基酸序列，信號(hào)肽優(yōu)選地在多肽的N末端。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，且信號(hào)肽具有將正在形成或完成的多肽移位到革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)或外膜中的作用。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)”是指多肽中的特定氨基酸序列基序，其中這一序列基序以蛋白酶結(jié)合并裂解多肽這樣一種方式被所述蛋白酶特異性地識(shí)別。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“跨膜接頭”是指用作連接自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域與氧化還原因子再生多肽但足夠地柔性以允許該氧化還原因子再生多肽的獨(dú)立折疊和/或轉(zhuǎn)運(yùn)的柔性多肽區(qū)段。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語“自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域”是指如果核酸分子表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的核糖體被合成，優(yōu)選地在細(xì)菌胞質(zhì)中被合成，并被向細(xì)胞外膜移位，優(yōu)選地向外膜的被暴露于細(xì)胞周圍環(huán)境的一側(cè)移位的話，可用于獲得核酸分子表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域具有將所述表達(dá)產(chǎn)物定位于外膜的外表面的作用。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域是位于細(xì)胞外膜上的蛋白，且編碼NADH氧化酶的區(qū)段是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域、環(huán)或某一其他部分的一部分或與其融合，從而NADH氧化酶被展示在細(xì)胞表面上。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域是可用于在細(xì)胞表面上展示多肽的系統(tǒng)的蛋白。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的AIDA-1型的自主展示系統(tǒng)、還稱為自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸或核酸序列的變體例如通過名稱或保藏號(hào)或甚至通過術(shù)語“的變體”在本申請(qǐng)中被明確地提到，或例如通過功能描述在本發(fā)明的上下文中被隱含地提到。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文 使用的術(shù)語“變體”包括與用作參考的氨基酸60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的氨基酸或核
酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語“變體”包括，就氨基酸序列而言，具有相對(duì)于參考序列的一個(gè)保守氨基酸置換或多個(gè)保守氨基酸置換的那些氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語氨基酸序列或核酸序列的“變體”包括氨基酸序列或核酸序列的活性區(qū)段和/或片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“活性區(qū)段”是指比全長的氨基酸或核酸序列短，但仍然具有其必需生物活性、例如作為NADH氧化酶的生物活性的至少一部分的氨基酸序列或核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語核酸的“變體”包括互補(bǔ)鏈的核酸，其-優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下-與參考核酸雜交。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格度可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，且通常是作為探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的函數(shù)的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算值。一般，較長的探針要求較高的溫度用來完全退火，而較短的探針要求較低的溫度。雜交一般取決于當(dāng)互補(bǔ)的鏈處在具有低于所述鏈的解鏈溫度的溫度的環(huán)境中時(shí)變性的DNA復(fù)性的能力。探針與可雜交序列之間期望的同源性程度越高，可施加的相對(duì)溫度越高。因此其遵循以下:較高的相對(duì)溫度趨向于使得反應(yīng)條件更加嚴(yán)格，而較低溫度減少這一嚴(yán)格度。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格度的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)和解釋可見于Ausubel等(1995)中。在 另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語核酸或氨基酸的“變體”是指至少達(dá)到一定程度地具有與參考核酸或氨基酸相同的生物活性和/或功能的核酸或氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語核酸序列的“變體”是指編碼與參考氨基酸序列相似的氨基酸序列的另一核酸序列。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“氧化還原因子”是指具有氧化還原反應(yīng)性即，在生理?xiàng)l件下能夠被氧化或還原的有機(jī)化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原因子不包括任何氧化還原反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原因子是自由的氧化還原因子，即，其不被共價(jià)結(jié)合于肽構(gòu)架(peptide frame)或肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原因子具有不多于0.85 ( S卩，最高0.6V)、0.5,0.4、
0.2,0,-0.U-0.15、-0.2,-0.25、-0.3或-0.4V的標(biāo)準(zhǔn)還原電勢。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原因子具有從-0.325至-0.2V的標(biāo)準(zhǔn)還原電勢。在非常尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原因子具有從-0.35至-0.3的標(biāo)準(zhǔn)還原電勢。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“氧化還原因子再生多肽”是指催化氧化還原因子的再生的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“再生氧化還原因子”是指還原被氧化的氧化還原因子的能力，氧化還原因子以其還原形式在化學(xué)合成中用作還原劑，或是指氧化被還原的氧化還原因子的能力，氧化還原因子以其氧化形式在化學(xué)合成中用作氧化劑。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“再生氧化還原因子”是指恢復(fù)氧化還原因子之前的氧化還原狀態(tài)，優(yōu)選地恢復(fù)其中氧化還原因子可用于目標(biāo)合成的狀態(tài)，尤其優(yōu)選被氧化還原酶催化的合成，其中氧化還原因子用作底物。例如，反應(yīng)中消耗的NAD+可通過氧化NADH為NAD+而再生。在本發(fā)明第一方面的第二實(shí)施方案中，其也代表第一實(shí)施方案的實(shí)施方案，被氧化還原因子再生多肽再生的氧化還原因子選自包括以下的組:NADH、NADPH、FADH2、血紅素、金屬離子、谷胱甘肽、吡咯并喹啉-醌(PQQ)、磷酸吡哆醛、焦磷酸硫胺素和抗壞血酸。金屬離子包括但不限于，F(xiàn)e、Cu、Zn、N1、Co、Mn、Cr和Mg離子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述氧化還原因子的每一種具有氧化形式和還原形式二者或相應(yīng)的共軛氧化還原對(duì)的形式，例如在氧化還原因子NADH的情形中NADH和NAD+ 二者，即使僅明確地提到一種形式。在本發(fā)明第一方面的第三實(shí)施方案中，其也代表本發(fā)明的第一和第二實(shí)施方案的實(shí)施方案，氧化還原因子再生多肽包括一種或多種黃素輔因子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“黃素輔因子”是指基于異咯嗪環(huán)系統(tǒng)的氧化還原反應(yīng)性輔因子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，黃素輔因子選自包括以下的組:以其氧化和還原形式二者的核黃素、黃素單核苷酸(FMN)和黃素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)。在本發(fā)明第一方面的第四實(shí)施方案中，其也代表第一至第三實(shí)施方案的實(shí)施方案，氧化還原因子再生多肽選自包括以下的組:NADH氧化酶、甲酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶。在本發(fā)明第一方面的第五實(shí)施方案中，其也代表第一至第四實(shí)施方案的實(shí)施方案，氧化還原因子再生多肽選自包括以下的組:來自乳桿菌屬(Lactobacillus)、棲熱菌屬(Thermus)、短桿菌屬(Brevibacterium)和鏈球菌屬(Streptococcus)的 NADH 氧化酶,優(yōu)選短乳桿菌的NADH氧化酶，和其變體。在本發(fā)明第一方面的第六實(shí)施方案中，其也代表第一至第五實(shí)施方案的實(shí)施方案，自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域選自包括以下的組:Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal> SphBl> AspA/Nalp、VacA、AIDA-1> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA> AutA> Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、Esp1、EaaA、EaaC、萬日咳桿菌粘附素(pertactin)、BrkA> Tef、Vag8 、PmpD> Pmp20、Pmp21、AgAl 蛋白酶、App> Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE> EstA、Lip-1、McaP> BabA> SabA> AlpA、Aae> NanB 和其變體。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域”，包括在細(xì)胞表面上展示不同于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽、尤其是氧化還原因子再生多肽的結(jié)構(gòu)域，其中所述蛋白已被插入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或與其融合。優(yōu)選地氧化還原因子再生多肽與自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域融合。根據(jù)本發(fā)明的自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域可以是任何自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域，且優(yōu)選地能夠形成￠-桶結(jié)構(gòu)?！?桶結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述和￠-桶自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的優(yōu)選實(shí)例公開于WO 97/35022中，并通過引用形成本說明書的部分。Henderson等(2004)描述具有適合的自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(概述在Henderson等,2004的表I中提供)。Henderson等(2004)的公開文件通過引用形成本說明書的部分。例如，自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域可選自:Ssp (P09489,粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens))、Ssp-hl (BAA33455,粘質(zhì)沙雷氏菌)、Ssp-h2 (BAA11383,粘質(zhì)沙雷氏菌)、PspA (BAA36466,熒光假單胞菌(P.fluorescens))、PspB (BAA36467,熒光假單胞菌)、Ssal (AAA80490,溶血巴斯德氏菌(P.haemolytica))、SphBl (CAC44081,百日咳博德特氏菌(B.pertussis))、AspA/NalP(AAN71715，腦膜炎奈氏球菌(N.meningitidis))、VacA(Q48247,幽門螺桿菌(H.pylori))、AIDA-1 (Q03155，大腸桿菌)、IcsA(AAA26547，弗氏志賀氏菌(S.flexneri))、MisL(AAD16954，腸沙門氏菌(S.enterica))、TibA (AAD41751，大腸桿菌)、Ag43 (P39180，大腸桿菌)、ShdA(AAD25110，腸沙門氏菌)、AutA(CAB89117，腦膜炎奈氏球菌)、Tsh (154632，大腸桿菌)、3印么(CAC05786，弗氏志賀氏菌)、EspC(AAC44731，大腸桿菌)、EspP (CAA66144,大腸桿菌)、Pet(AAC26634,大腸桿菌)、Pic (AAD23953，大腸桿菌)、SigA(AAF67320,弗氏志賀氏菌)、Sat (AAG30168,大腸桿菌)、Vat (AA021903,大腸桿菌)、EpeA(AAL18821,大腸桿菌)、EatA(AA017297,大腸桿菌)、EspI (CAC39286,大腸桿菌)、EaaA(AAF63237,大腸桿菌)、EaaC(AAF63038，大腸桿菌)、百日咳桿菌粘附素(P14283，百日咳博德特氏菌)、BrkA (AAA51646，百日咳博德特氏菌)、Tef (AAQ82668，百日咳博德特氏菌)、Vag8 (AAC31247,百日咳博德特氏菌)、PmpD (084818，沙眼衣原體(C.trachomatis))、Pmp20(Q9Z812，肺炎衣原體(C.pneumoniae))、Pmp21 (Q9Z6U5，肺炎衣原體)、IgAl 蛋白酶(NP_283693，腦膜炎奈氏球菌)、App(CAC14670，腦膜炎奈氏球菌)、IgAl蛋白酶(P45386，流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae))、Hap (P45387,流感嗜血桿菌)、rOmpA(Pl5921,立氏立克次氏體(R.rickettsii))、r0mpB(Q53047，立氏立克次氏體)、ApeE (AAC38796，腸沙門氏菌)、EstA(AAB61674,綠膿假單胞菌(P.aeruginosa))、Lip-1 (P40601,發(fā)光致病桿菌(X.luminescens))、McaP (AAP97134,粘膜炎微球菌(M.catarrhal is))、BabA (AAC38081,幽門螺桿菌)、SabA (AAD06240,幽門螺桿菌)、AlpA (CAB05386,幽門螺桿菌)、Aae (AAP21063,伴放線放線桿菌(A.actinomycetemcomitans))、NanB (AAG35309,溶血巴斯德氏菌)、和這些自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變體。對(duì)于自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的實(shí)例的每一種，適合的GenBank保藏號(hào)和可從中獲得自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的物種的實(shí)例在括號(hào)中提供。自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地是大腸桿菌的AIDA-1蛋白或其變體，例如由Niewert等(2001)描述的那些。AIDA自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)連接于來自已對(duì)其診斷為水腫病和所謂斷奶后(postweaning)的豬的大腸桿菌分離株中的F18和Stx2e。以上提供的自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列的變體可例如通過改變不屬于跨膜區(qū)段的P -桶的環(huán)結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列來獲得。任選地編碼表面環(huán)的核酸可完全缺失。此外，保守氨基酸置換可在兩親性3-片層結(jié)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行，即，將一種親水氨基酸置換為另一種親水氨基酸和/或?qū)⒁环N疏水氨基酸置換為另一種疏水氨基酸。優(yōu)選地變體尤其是在3-片層結(jié)構(gòu)的區(qū)域中具有在氨基酸水平上與自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)天然存在序列至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性。在本發(fā)明第一方面的第七實(shí)施方案中，其也代表第一至第六實(shí)施方案的實(shí)施方案，氧化還原因子再生多肽是氧敏感的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“氧敏感的”表示，相應(yīng)的多肽在氧存在、優(yōu) 選地正常濃度(即，大氣中存在的濃度)的氧存在下，經(jīng)歷快速的失活。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“氧敏感的”表示，相應(yīng)的多肽在溶液和其他相中暴露于如同大氣中的濃度或條件下的氧至少30分鐘時(shí)，喪失其活性(優(yōu)選地就其keat而言)的至少10 %、20 %、30 %、40 %、優(yōu)選地50 %、非常尤其優(yōu)選地80 %。在另一實(shí)施方案中，氧化還原因子再生多肽是可溶性多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“可溶性多肽”是指在其天然環(huán)境中未結(jié)合于膜的多肽。例如，短乳桿菌的NADH氧化酶，一種胞質(zhì)蛋白，是可溶性多肽。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原因子再生多肽是膜結(jié)合的多肽，即，共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合或附加于細(xì)胞膜或膜內(nèi)在蛋白的多肽。例如，呼吸鏈的復(fù)合體IV是膜結(jié)合的多肽。根據(jù)第二方面，本發(fā)明的目的由根據(jù)本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案的核酸分子編碼的多肽解決。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽包括SEQ ID NO:2或其變體。根據(jù)第三方面，本發(fā)明的目的以在其表面上表達(dá)根據(jù)第二方面的多肽或已經(jīng)使用根據(jù)本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案的核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞解決。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“細(xì)胞”與術(shù)語“宿主細(xì)胞”可互換地使用，是指能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞還可稱為“全細(xì)胞催化劑或生物催化劑”。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞或宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，優(yōu)選革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，非常尤其優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。在另一示例性實(shí)施方案中，細(xì)胞是真核細(xì)胞。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞或宿主細(xì)胞是原核生物的孢子。根據(jù)第四方面，本發(fā)明的目的以可從根據(jù)本發(fā)明第三方面的細(xì)胞獲得的膜級(jí)分(membrane fraction)角軍決。細(xì)菌細(xì)胞包括多個(gè)區(qū)室，它們被疏水性膜彼此分隔。革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞具有質(zhì)膜，其對(duì)胞質(zhì)即細(xì)胞的內(nèi)部定界。質(zhì)膜被肽聚糖層圍繞。與之相比，革蘭氏陰性細(xì)菌除了質(zhì)膜以外，具有稱為外膜的另一個(gè)膜。本文使用的術(shù)語“表面”優(yōu)選地是指微生物暴露于周圍環(huán)境的層，其中周圍環(huán)境是例如用于培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞的液體培養(yǎng)基。在非常尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的 多肽在革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的外膜外側(cè)上表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽在革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的外膜內(nèi)側(cè)上表達(dá)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽在原生質(zhì)球的外側(cè)上表達(dá)，其中原生質(zhì)球是已經(jīng)從其去除外膜的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉能夠用于產(chǎn)生原生質(zhì)球的方法。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽在革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的外側(cè)上表達(dá)。如此，在本文使用術(shù)語“在表面上展示”和“在表面上表達(dá)”時(shí)，它們是同義的。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，可互換使用的兩個(gè)術(shù)語膜級(jí)分或膜制備物，包括根據(jù)本發(fā)明第一方面的氧化還原因子再生多肽，優(yōu)選地處于催化活性狀態(tài)。本文使用的術(shù)語“膜級(jí)分”和“膜制備物”優(yōu)選地是指富集膜組成部分、優(yōu)選地革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的組成部分的產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用于產(chǎn)生膜制備物的程序和方法。例如，可從培養(yǎng)物收獲細(xì)菌細(xì)胞并將其裂解，例如通過凍融循環(huán)、超聲處理、在裂解緩沖液中重懸或類似方法，隨后差異離心，以分離細(xì)胞的膜級(jí)分。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜制備物是外膜的制備物，即，其中相對(duì)于其他膜和區(qū)室的組成部分諸如胞質(zhì)、內(nèi)膜和周質(zhì)，富集外膜組成部分的制備物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用于分離或富集外膜或其組成部分的程序和方法，例如溶菌酶處理細(xì)菌細(xì)胞，隨后是離心步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜級(jí)分可以是處理的膜級(jí)分，即，膜級(jí)分的內(nèi)容物或特性已經(jīng)被改變，例如通過純化膜級(jí)分的蛋白組成部分或通過增溶膜級(jí)分和/或在小囊泡中吸收膜級(jí)分的組成部分。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜級(jí)分可被固定-例如在容器表面或柱上。根據(jù)第五方面，本發(fā)明的目的以一種再生氧化還原因子的方法解決，所述方法包括以下步驟:a)提供根據(jù)本發(fā)明第二方面的多肽、根據(jù)第四方面的膜制備物或根據(jù)第三方面的細(xì)胞，和b)將根據(jù)第二方面的多肽、根據(jù)第四方面的膜制備物或根據(jù)第三方面的細(xì)胞與氧化還原因子再生多肽的至少一種底物接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a)和/或步驟b)在還原劑不存在時(shí)和/或在氧化環(huán)境中發(fā)生。根據(jù)第六方面，本發(fā)明的目的使用根據(jù)第三方面的細(xì)胞或根據(jù)第四方面的膜級(jí)分或根據(jù)第二方面的多肽以再生氧化還原因子來解決。根據(jù)第七方面，本發(fā)明的目的通過使用根據(jù)第三方面的細(xì)胞、根據(jù)第四方面的膜制備物和根據(jù)本發(fā)明第二方面的多肽以調(diào)整水溶液的氧化還原環(huán)境、優(yōu)選地通過將所述水溶液脫氧來解決。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“調(diào)整水溶液的氧化還原環(huán)境”是指直接作用于水溶液中的氧化還原條件，即，該溶液氧化或還原化合物的能力的任何措施。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“將水溶液脫氧”是指可用于降低所述溶液中氧濃度的任何措施。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用于測量水溶液的氧濃度的方法，諸如，例如，使用氧電極。根據(jù)第八方面，本發(fā)明的目的以一種產(chǎn)生在其表面上展示氧化還原因子再生多肽的細(xì)胞的方法解決，所述方法包括:(a)將根據(jù)本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案的核酸引入細(xì)胞,和b)任選地將所述細(xì)胞與一種或多種氧化還原反應(yīng)性輔基接觸。根據(jù)第九方面，本發(fā)明的目的以一種產(chǎn)生氧化還原因子依賴性多肽的產(chǎn)物的方法解決，所述方法包括以下步驟:a)提供氧化還原因子依賴性酶，和(b)在根據(jù)第三方面的細(xì)胞、根據(jù)第四方面的膜制備物和根據(jù)本發(fā)明第二方面的多肽存在下，將所述氧化還原因子依賴性多肽與一種或多種其底物接觸，從而根據(jù)第二方面的多肽再生氧化還原因子依賴性多肽所依賴的氧化還原因子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語“氧化還原因子依賴性多肽”是指具有生物活性、優(yōu)選地酶活性的需要氧化還原因子作為輔因子、輔基、或優(yōu)選地底物的多肽。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的目的用如下組合物解決:包含根據(jù)第三方面的細(xì)胞、根據(jù)第四方面的膜制備物和根據(jù)本發(fā)明第二方面的多肽以及氧化還原因子依賴性多肽和氧化還原因子的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，氧化還原因子依賴性多肽使用自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)展示，即，其表達(dá)由包括以下的核酸帶來:(I)編碼信號(hào)肽的區(qū)段、⑵包含優(yōu)選為異源的氧化還原因子再生多肽或其變體的區(qū)段、(3)任選的編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的區(qū)段、
(4)編碼跨膜接頭的區(qū)段、和(5)編碼自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其變體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的區(qū)段。本發(fā)明由以下附圖和實(shí)施例進(jìn)一步闡述，其不應(yīng)理解為限制，從其可看到本發(fā)明的進(jìn)一步的特征、實(shí)施方案、方面和益處。

圖1顯示質(zhì)粒pAT-NOx的限制性圖譜。圖2顯示SDS- 凝膠，其顯示大腸桿菌外膜中的NADH氧化酶并通過全細(xì)胞消化顯示了 NADH氧化酶的定向(orientation)。M)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1)大腸桿菌UT5600 (DE3) ；2)大腸桿菌UT5600(DE3) pAT-NOx，未誘導(dǎo)的；3)大腸桿菌UT5600 (DE3)pAT_N0x，誘導(dǎo)的；4)大腸桿菌UT5600(DE3)pAT-NOx，誘導(dǎo)的，以蛋白酶K消化；5)大腸桿菌UT5600 (DE3)pAT-NOx，誘導(dǎo)的，以胰蛋白酶消化。圖3顯示在使用A)大腸桿菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每種情形中誘導(dǎo)Ih后)的NADH氧化酶測定后上清液的吸收譜。圖4顯示在使用A)大腸桿菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每種情形中誘導(dǎo)4h后)的NADH氧化酶測定后上清液的吸收譜。圖5顯示在使用A)大腸桿菌UT5600 (DE3)pAT-NOx和B)大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NOx (在每種情形中誘導(dǎo)20h后)的NADH氧化酶測定后上清液的吸收譜。圖6顯示使用在M9培養(yǎng)基中生長后的大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NOx在微量滴定板上進(jìn)行的NADH氧化酶測定的結(jié)果。該圖顯示在340nm消光(extinction)隨著時(shí)間的減少。圖7顯示已經(jīng)在+8°C儲(chǔ)存多于7周的NOX全細(xì)胞生物催化劑的結(jié)果?；钚詼y定以儲(chǔ)存前的細(xì)胞[A]和已經(jīng)儲(chǔ)存一周[B]、兩周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的細(xì)胞進(jìn)行。圖8顯示已經(jīng)在_18°C儲(chǔ)存多于7周的NOX全細(xì)胞生物催化劑的結(jié)果?；钚詼y定以儲(chǔ)存前的細(xì)胞[A]和已經(jīng)儲(chǔ)存一周[B]、兩周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的細(xì)胞進(jìn)行。圖9顯示已經(jīng)在_70°C儲(chǔ)存多于7周的NOX全細(xì)胞生物催化劑的結(jié)果?；钚詼y定以儲(chǔ)存前的細(xì)胞[A]和已經(jīng)儲(chǔ)存一周[B]、兩周[C]、三周[D]、四周[E]、五周[F]、六周[G]和七周[H]的細(xì)胞進(jìn)行。圖10顯示為了穩(wěn)定性測定已經(jīng)儲(chǔ)存多于七周的樣品中細(xì)胞計(jì)數(shù)的確定。該圖顯示在_18°C儲(chǔ)存的樣品中細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少(■)，以及在+8°C儲(chǔ)存的樣品( )和在-70°C儲(chǔ)存的樣品(▲)中細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少。對(duì)于確定細(xì)胞計(jì)數(shù)，從儲(chǔ)存的部分樣品中取出50 yl，用于準(zhǔn)備系列稀釋液。將50ml的10_9和10,稀釋液的每一種鋪板在含30mg/l卡那霉素的LB-瓊脂平板上。在37°C培養(yǎng)平板過夜，次日對(duì)菌落計(jì)數(shù)?；诰湫纬蓡挝坏臄?shù)目計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù)/ml。圖11顯示周期性地重復(fù)五次的測定中NOX全細(xì)胞生物催化劑的再循環(huán)能力。 =宿主菌株大腸桿菌BL21 (DE3)，■=大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NOx。狹義地，顯示了第一 [A]、第二 [B]、第三[C]、第四[D]和第五[E]循環(huán)中NADH濃度的減少的光度確定。圖12顯示使用生物催化劑大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NOx再生NAD+，狹義地顯示全細(xì)胞生物催化劑大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NOx ( ■)、和再生系統(tǒng)( )中的NADH轉(zhuǎn)化。大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NifAf( A )用作對(duì)照。NADH的消光在340nm監(jiān)測。細(xì)胞的消光在590nm監(jiān)測。通過計(jì)算E34tl-E59tl的差來進(jìn)行評(píng)價(jià)。ALDH60mU，細(xì)胞0D1，反應(yīng)以200 u M NADH開始。圖13顯示NAD+的再生，狹義地顯示隨著時(shí)間作為在340nm的消光的函數(shù)的NADH的濃度，尤其是在ALDH反應(yīng) 期間或使用大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-Nox的ALDH反應(yīng)期間的NADH濃度。NADH濃度通過相對(duì)于細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算商數(shù)E34(l/E59(l來標(biāo)準(zhǔn)化。ALDH30mU，大腸桿菌 BL21 (DE3) pAT-NOx 0D5，大腸桿菌 BL21 (DE3) OD I，反應(yīng)以 400 u MNAD+ 開始。
實(shí)施例通過在絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白激酶K存在時(shí)培養(yǎng)細(xì)菌，檢測載客、在這種情形中是NADH氧化酶的表面定位是可能的。由于其尺寸，胰蛋白酶和蛋白酶K不能穿過大腸桿菌的外膜，在這些蛋白酶存在時(shí)培養(yǎng)全細(xì)胞具有的效果是，只有位于外膜表面上的蛋白被消化。因此，表面上的載客被消化，而整合在膜中的蛋白組成部分被保護(hù)不受酶攻擊，從而保持完整。這可通過SDS-PAGE證實(shí)。酶的定向基于全細(xì)胞消化來評(píng)價(jià)。圖2顯示以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后大腸桿菌菌株UT5600 (DE3) pAT-Nox的分離的外膜以及全細(xì)胞消化后分離的外膜。以IPTG誘導(dǎo)后，外膜中能夠檢測到約IOOkDa的預(yù)計(jì)的融合蛋白(泳道3)。以胰蛋白酶消化全細(xì)胞導(dǎo)致與代表0mpF/C和OmpA的初始粗略相等強(qiáng)度的條帶相比,相應(yīng)條帶的強(qiáng)度減少，從而證實(shí)該蛋白朝向膜的外側(cè)(泳道4和5)。這能夠證實(shí)NADH氧化酶被使用自主展示系統(tǒng)展示在大腸桿菌的表面上。實(shí)施例2:建立用于監(jiān)測NADH氧化酶活性的生長和試驗(yàn)條件NADH氧化酶的活性以光度測定來確定。NADH顯示兩個(gè)消光最大值，即在波長260nm和340nm,而NAD+僅在260nm顯不一個(gè)最大值。這一差異可用于以光度學(xué)方法監(jiān)測NADH向NAD+的氧化。向使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基或緩沖液加入FAD，以允許酶的適當(dāng)折疊以及FAD的獲取。NOX生物催化劑的培養(yǎng)對(duì)20ml LB培養(yǎng)基(15 U g/ml卡那霉素)接種10 U I相應(yīng)菌株的甘油培養(yǎng)物并在37°C和200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)過夜。對(duì)于建立主要培養(yǎng)物(main culture)，對(duì)100ml LB培養(yǎng)基(15 u g/ml卡那霉素、IOii M EDTAUOmM巰基乙醇)接種2.5ml過夜培養(yǎng)物。在OD578 = 0.6時(shí)，以ImM IPTG誘導(dǎo)50ml培養(yǎng)物。在NADH氧化酶的情形，另外加入10 y M FAD。在30°C和200轉(zhuǎn)/分鐘誘導(dǎo)培養(yǎng)物lh、4h或20h。未誘導(dǎo)另一半培養(yǎng)物，但除此以外以與被誘導(dǎo)的培養(yǎng)物完全相同的方式處理。為NADH氧化酶測定準(zhǔn)備細(xì)胞在誘導(dǎo)后，首先在冰上儲(chǔ)存細(xì)胞15分鐘，然后通過以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心IOmin分離為沉淀。在20ml0.1M磷酸鉀緩沖液，pH7.5，IOii M FAD中洗滌沉淀兩次。然后以同樣的緩沖液調(diào)整細(xì)胞的OD到50。NADH氧化酶測定用于檢測NADH氧化酶活性的測定以Iml樣品進(jìn)行，其包含0.1M硫酸鉀緩沖液，PH7.5、ImM DTT和IOOyM NADH作為底物。最終OD578為I的細(xì)胞用在測定中。在室溫培養(yǎng)一小時(shí)后，通過離心從樣品去除細(xì)胞。在200和400nm之間的波長記錄上清液的光譜。首先，對(duì)于兩種菌株，誘導(dǎo)NADH氧化酶基因的表達(dá)lh。圖3中的UV譜顯示，在這些條件下檢測酶活性是不可能的，因?yàn)镹ADH已被缺少該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞氧化，這導(dǎo)致在340nm的消光最大值的消失。加入的酶被細(xì)胞獲取，或被細(xì)胞分泌的酶轉(zhuǎn)化。兩種作用都能夠由細(xì)胞在指數(shù) 生長期展示的高代謝率來解釋，如對(duì)本文的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的。為了使得細(xì)胞進(jìn)入靜止生長期并從而將其基礎(chǔ)代謝降到最低，首先將表達(dá)的誘導(dǎo)延長到4h。發(fā)現(xiàn)，加入的NADH再次被宿主細(xì)胞氧化(圖4)。然而，包含pAT-Nox的細(xì)胞的NADH氧化活性超過缺少該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞的活性。而且，可檢測到未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的細(xì)胞之間的定量差異。延長誘導(dǎo)時(shí)間到20h后，不再能夠檢測到NADH被缺少該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞氧化，這可以從以下事實(shí)觀察到:在無細(xì)胞的陰性對(duì)照的情形中，NADH的消光最大值如此前一樣存在，如圖5所示。對(duì)于這些所謂的“靜息細(xì)胞”(處于靜止期的細(xì)胞)，現(xiàn)在有可能檢測加入的NADH被位于表面上的NADH氧化酶的氧化。大腸桿菌BL21 (DE3)與大腸桿菌UT5600 (DE3)之間的許多差異是明顯的。在大腸桿菌BL21 (DE)pAT-Nox的情形，未誘導(dǎo)的細(xì)胞將供應(yīng)的NADH的大約一半轉(zhuǎn)化為NAD+，而誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化所有可獲得的NADH。未誘導(dǎo)的細(xì)胞的活性可以以下基礎(chǔ)來解釋:用于表達(dá)NADH氧化酶的17系統(tǒng)不是“鈍的(denSe)”，g卩，T7-啟動(dòng)子的阻遏是不完全的，其甚至在未誘導(dǎo)的狀態(tài)下導(dǎo)致基因被T7-聚合酶的低表達(dá)。與之相t匕，大腸桿菌UT5600(DE3)在未誘導(dǎo)的狀態(tài)顯示無活性，但誘導(dǎo)的細(xì)胞僅轉(zhuǎn)化大約一半的NADH。這些結(jié)果證明，利用自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)，能夠在大腸桿菌表面上以其活性形式表達(dá)短乳桿菌的黃素蛋白-NADH氧化酶。隨后在脫輔酶(apoenzyme)中摻入FAD表現(xiàn)為正確地繼續(xù)并僅要求添加FAD。迄今的所有測量是定性性質(zhì)的，是為了建立測定和為了尋找允許監(jiān)測酶活性的條件。對(duì)于通過測量NADH隨著時(shí)間的氧化來定量監(jiān)測酶活性，將光學(xué)測定轉(zhuǎn)移到微量滴定板，從而允許平行地觀察盡可能多的樣品。在基本培養(yǎng)基(M9)中培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)IOml M9培養(yǎng)基(15 ii g/ml卡那霉素)接種相應(yīng)菌株的20 ill甘油培養(yǎng)物并在37°C和200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)過夜。將全部過夜培養(yǎng)物用于接種主要培養(yǎng)物，即160mlM9 (15 u g/ml卡那霉素)。培養(yǎng)物初始生長7h后，向培養(yǎng)物的一半加入ImM IPTG和0.2%乳糖作為碳源。另外，對(duì)于NADH氧化酶加入10 ii M FAD。誘導(dǎo)在30°C和200轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行16h。未向另一半培養(yǎng)物加入IPTG，但除此以外這些培養(yǎng)物以完全相同的方式處理。為活性測定準(zhǔn)備細(xì)胞在誘導(dǎo)后，首先在冰上儲(chǔ)存細(xì)胞15分鐘，然后通過以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心IOmin分離為沉淀。在20ml0.1M磷酸鉀緩沖液，pH7.5，IOii M FAD中洗滌沉淀兩次。然后以同樣的緩沖液調(diào)整細(xì)胞到OD578 = 10。微量滴定板上的NADH氧化酶測定96孔微量滴定板的NADH氧化酶測定以0.1M磷酸鉀緩沖液中每孔240 U I樣品進(jìn)行。使用的細(xì)胞的量使得測定中實(shí)現(xiàn)OD578為I。為了開始反應(yīng)，加入200 ii M NADH0在室溫培養(yǎng)0、3、7、15、30、45或60分鐘后，在340nm觀察微量滴定板中的測定(Mithras,BertholdTechnologies) 0為了避免細(xì)胞沉淀，在測量消光之前搖動(dòng)板。在緩沖液中具有相應(yīng)OD的細(xì)胞懸液用作參考?；谝幌盗性囼?yàn)，能夠優(yōu)化NADH氧化酶全細(xì)胞催化劑的產(chǎn)生，從而i)活性更高，ii)誘導(dǎo)的與未誘導(dǎo)的細(xì)胞之間的差異增加，和iii)對(duì)于無意義對(duì)照，僅存在低活性。尤其是，發(fā)現(xiàn)用于測量NADH氧化酶的培養(yǎng)物必須處于最佳狀態(tài)。圖6顯示在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行的NADH氧化酶測定的結(jié)果，如在“方法”部分描述的。與生長和試驗(yàn)條件有關(guān)的多種因素影響這一改進(jìn)的酶活性。著眼于以更大規(guī)模使用，已經(jīng)改良了細(xì)胞的生長，從而代替復(fù)合LB培養(yǎng)基，使用限定的M9培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)期間，加入乳糖作為碳源，在OD578為約0.35較早地誘導(dǎo)細(xì)胞。較晚地誘導(dǎo)，通常在0.6，具有的結(jié)果是必須在M9培養(yǎng)基中過度長的生長，這導(dǎo)致自發(fā)的細(xì)胞裂解，具有的影響是無意義對(duì)照和未誘導(dǎo)的對(duì)照二者氧化作為底物供應(yīng)的NADH。這很可能是因?yàn)橛捎诩?xì)胞裂解而釋放的酶。現(xiàn)在進(jìn)行NADH氧化酶測定，并如上所述地在微量滴定板中直接在細(xì)胞懸液中觀察。這使得操作更簡單并且數(shù)據(jù)更可重現(xiàn)。然而，確定酶活性的絕對(duì)值是不可能的。以光度方法確定的酶活性根據(jù)Beer-Lambert法則計(jì)算。為了能夠適用這一等式,必須已知比色杯或96-孔板的層厚度。在目前的試驗(yàn)設(shè)置中不能確定這一參數(shù)。因此以光度計(jì)確定NADH氧化酶的活性，使用具有確定的層厚度Icm的比色杯。從而能夠適用Beer-Lambert法則。在30°C的溫度,發(fā)現(xiàn)LB培養(yǎng)基中的活性為12.23mU/ml。在30°C M9培養(yǎng)基中的活性略高，為16.38mU/ml。在Hummel等(2003)的研究中，以簡單方式純化的酶的活性為10-15U/mg。實(shí)施例3:試驗(yàn)NADH氧化酶全細(xì)胞催化劑的穩(wěn)定性和儲(chǔ)存能力

對(duì)于研究NADH氧化酶全細(xì)胞催化劑的儲(chǔ)存能力和穩(wěn)定性，將誘導(dǎo)的細(xì)胞儲(chǔ)存在冷藏室中8°C或冷凍室中-18°C或_70°C。每周通過NADH氧化酶測定以一式三份樣品檢查這些細(xì)胞。
在誘導(dǎo)基因表達(dá)后，將打算儲(chǔ)存的細(xì)胞用磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.5)洗滌兩次，在這一緩沖液中調(diào)整到OD578 = 10，分為部分的樣品并在+8°C置于儲(chǔ)存八周。如果細(xì)胞將要在-18°C或_70°C儲(chǔ)存，向冷凍緩沖液中加入20%甘油。對(duì)于活性測定，將200-1i I樣品中的細(xì)胞用前述緩沖液稀釋到OD578 = 1，然后加入0.2mM NADH以開始反應(yīng)。通過在入max=340nm測量消光的減少在一式三份的樣品中監(jiān)測NADH向NAD的氧化。為了考慮到儲(chǔ)存期間發(fā)生的細(xì)胞裂解的效應(yīng)，以與全細(xì)胞生物催化劑BL21 (DE3) pAT-NOX相同的方式儲(chǔ)存宿主菌株大腸桿菌BL21 (DE3)并經(jīng)歷相同類型的活性測定。圖7中的圖顯示在8°C儲(chǔ)存不同時(shí)間的細(xì)胞懸液中NADH濃度的減少。如預(yù)計(jì)的，用作對(duì)照的宿主菌株大腸桿菌BL21(DE3)在儲(chǔ)存前不顯示任何NADH活性。然而，對(duì)于這些宿主細(xì)胞，儲(chǔ)存剛一周后，該測定中觀察到NADH濃度的明顯減少，并且儲(chǔ)存時(shí)間越長這一減少變得更顯著。這一推測的NADH氧化酶活性可由細(xì)菌細(xì)胞的裂解來解釋，這基于當(dāng)細(xì)胞在8°C儲(chǔ)存時(shí)經(jīng)歷開始得相對(duì)快速。在冷藏室中這一溫度儲(chǔ)存的細(xì)胞在數(shù)天后已經(jīng)顯示溶液中粘度增加，且不能被完全重懸。這一粘度增加可歸因于細(xì)胞裂解期間染色體DNA的釋放。此外，由于細(xì)胞裂解，釋放了酶，其顯然氧化了測定中用作底物的NADH。這一效應(yīng)還可在儲(chǔ)存NADH氧化酶全細(xì)胞催化劑大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NOX和隨后的活性測定的情形中觀察到。當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間增加時(shí)，在冷藏室中細(xì)胞裂解帶來的NADH氧化將超過儲(chǔ)存前測量的催化劑活性。因此不能建議在冷藏室中保存NADH氧化酶全細(xì)胞催化劑。當(dāng)細(xì)胞在_18°C儲(chǔ)存時(shí)，情況是不同的(圖8)。對(duì)于用作陰性對(duì)照的宿主細(xì)胞，在臥式冷凍柜中_18°C儲(chǔ)存后沒有所導(dǎo)致的NADH氧化,而NADH氧化酶全細(xì)胞催化劑即使在8周后仍然展示NADH氧化酶活性，其-在正態(tài)分布的背景下-與初始活性相當(dāng)。全細(xì)胞生物催化劑在-70°C儲(chǔ)存7周后，沒有觀察到活性的顯著減少(圖9)。在這種情形中還能夠排除宿主細(xì)胞的裂解。因此建議在_70°C儲(chǔ)存全細(xì)胞生物催化劑。同時(shí)，與生物催化劑的活性平行地確定活細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示在圖10。儲(chǔ)存在+8°C時(shí)，在前四周內(nèi)活細(xì)胞計(jì)數(shù)減少三個(gè)數(shù)量級(jí)。儲(chǔ)存持續(xù)另外三周時(shí)，此時(shí)活細(xì)胞計(jì)數(shù)保持相對(duì)恒定。這種曲線形狀也 在_18°C或-70°C儲(chǔ)存生物催化劑時(shí)觀察到。然而，在這種情形中，前四周期間活細(xì)胞計(jì)數(shù)減少僅兩個(gè)數(shù)量級(jí)?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)的減少與生物催化劑在七周的時(shí)間段內(nèi)的活性不相關(guān)?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)隨著在-18°C或-70°C儲(chǔ)存減少,但活性保持粗略地恒定。然而，這一試驗(yàn)顯示，在臥式冷凍柜(_18°C或-70°C)中儲(chǔ)存比在冷藏室中+8°C儲(chǔ)存更好。實(shí)施例4:全細(xì)胞生物催化劑的再循環(huán)能力的研究經(jīng)30分鐘的時(shí)間段以5個(gè)循環(huán)確定全細(xì)胞催化劑大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NOx有關(guān)轉(zhuǎn)化NADH的再循環(huán)能力。對(duì)于這一測定，在誘導(dǎo)基因表達(dá)后，將細(xì)胞用磷酸鉀緩沖液(0.lM，pH7.5)洗滌兩次，且在這一緩沖液中重懸到最終OD578為10。對(duì)于確定活性，在微量滴定板中將200-1i I樣品中的細(xì)胞用前述緩沖液稀釋到OD578為1，然后加入0.2mM NADH以開始反應(yīng)。通過在入_ = 340nm測量消光的減少在一式三份樣品中監(jiān)測NADH向NAD的氧化。對(duì)于再循環(huán)，完成反應(yīng)后將細(xì)胞離心下來并重懸在160ul磷酸鉀緩沖液中。再次地，力口A0.2mM NADH以開始反應(yīng)，并以光度學(xué)方法監(jiān)測氧化。這一程序重復(fù)共5個(gè)循環(huán)。為了考慮到處理期間可能發(fā)生的細(xì)胞裂解的影響，對(duì)作為陰性對(duì)照的宿主菌株大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行與全細(xì)胞生物催化劑BL21 (DE3)相同的測定。
缺少生物催化劑的宿主細(xì)胞用作對(duì)照。如可從圖11觀察到的，宿主細(xì)胞不轉(zhuǎn)化任何NADH。在第一循環(huán)中(A)，全細(xì)胞生物催化劑在30分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化幾乎100%的存在的NADH。在進(jìn)一步的循環(huán)中，轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化率減少。在最后一個(gè)循環(huán)中(第5循環(huán)，D)，培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化不到30%的NADH。細(xì)菌懸液的離心可能導(dǎo)致隨后的循環(huán)中活性減少。離心力代表對(duì)細(xì)胞和尤其是對(duì)其表面上表達(dá)的分子的機(jī)械應(yīng)力。實(shí)施例5:使用全細(xì)胞生物催化劑大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NOx再生NADH為NAD+進(jìn)行這一試驗(yàn)以研究全細(xì)胞生物催化劑大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NOx是否能用作NAD+還原酶的再生系統(tǒng)。這使用包括全細(xì)胞生物催化劑和NAD+還原酶即醛脫氫酶(ALDH)的系統(tǒng)來試驗(yàn)。ALDH屬于氧化醛類為相應(yīng)的羧酸并從而還原NAD+為NADH的一組酶。以光度學(xué)方法監(jiān)測NADH濃度。如可從圖12觀察到的，如預(yù)計(jì)的，包含全細(xì)胞生物催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pAT-Nox的樣品中的NADH濃度連續(xù)減少。與之相比,如果向生物催化劑加入重組酶ALDH，則在NAD+與NADH之間建立平衡，因?yàn)楸籄LDH連續(xù)還原為NADH的NAD+被生物催化劑大腸桿菌BL22(DE3)pAT-NOx再生。因此這一系統(tǒng)處于平衡。大腸桿菌BL21 (DE3)-NitAf用作所謂的無意義對(duì)照。這些細(xì)胞在其表面上展示來自糞產(chǎn)堿菌(A.faecalis)的腈水解酶，其不能氧化NADH，如也可從圖12觀察到的。圖13在圖的上半部顯示，由ALDH介導(dǎo)的NADH增加。關(guān)于加入生物催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pAT-Nox以再生NAD+，已經(jīng)向這一反應(yīng)加入宿主菌株大腸桿菌BL21 (DE3)，從而能夠相對(duì)于細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化NADH濃度(確定為在340nm的消光)。向ALDH反應(yīng)加入生物催化劑大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NOx后，不能觀察到NADH隨著時(shí)間的進(jìn)一步增加，因?yàn)橛葾LDH形成的NADH連續(xù)地被再氧化為NAD+。因此這一系統(tǒng)處于平衡。原始資料的細(xì)節(jié)就本文參考多種現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)來說，這些文獻(xiàn)通過引用以其全文形成本說明書的部分。提到的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的完整目錄細(xì)節(jié)在以下提供:
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在說明書、序列表、權(quán)利要求書和/或附圖中公開的本發(fā)明的特征對(duì)于以其多種形式實(shí)施本發(fā)明可以·單獨(dú)和以任何組合在法律上相關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種核酸分子，包含以下組成部分: (1)編碼信號(hào)肽的區(qū)段， (2)包含異源氧化還原因子再生多肽的區(qū)段， (3)任選的編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的區(qū)段， (4)編碼跨膜接頭的區(qū)段，和 (5)編碼自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其變體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的區(qū)段。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中由所述氧化還原因子再生多肽再生的所述氧化還原因子選自包括以下的組:NADH、NADPH、FADH2、血紅素、金屬離子、谷胱甘肽、吡咯并喹啉-醌、磷酸吡哆醛、焦磷酸硫胺素和抗壞血酸。
3.如權(quán)利要求1或2之一所述的核酸分子，其中所述氧化還原因子再生多肽包括一種或多種黃素輔因子。
4.如權(quán)利要求1至3之一所述的核酸分子，其中所述氧化還原因子再生多肽選自包括以下的組:NADH氧化酶、甲酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸分子，其中所述氧化還原因子再生多肽選自包括以下的組:短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、短桿菌屬(Brevibacterium)物種KU139和幾鏈球菌(Streptococcus faecalis)的NADH氧化酶,優(yōu)選地短乳桿菌的NADH氧化酶,和其變體。
6.如權(quán)利要求1 至5之一所述的核酸分子，其中所述自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域選自包括以下的組:Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal、SphBl、AspA/Nalp、VacA、AIDA-1> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA> AutA> Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、Esp1、EaaA、EaaC、百日咳桿菌粘附素、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、AgA I 蛋白酶、App、Hap、r OmpA、r OmpB、Ap eE、Es tA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、AI pA、Aae、NanB、和其變體。
7.如權(quán)利要求1至6之一所述的核酸分子，其中所述氧化還原因子再生多肽是氧敏感的。
8.一種多肽，由權(quán)利要求1至7之一所述的核酸分子編碼。
9.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)權(quán)利要求8所述的多肽或已經(jīng)被使用權(quán)利要求1至7之一所述的核酸分子轉(zhuǎn)化。
10.一種膜級(jí)分，所述膜級(jí)分是從權(quán)利要求9所述的細(xì)胞可獲得的。
11.一種再生氧化還原因子的方法，包括以下步驟: (a)提供權(quán)利要求8所述的多肽、權(quán)利要求10所述的膜制備物或權(quán)利要求9所述的細(xì)胞， (b)將權(quán)利要求8所述的多肽、權(quán)利要求10所述的膜制備物或權(quán)利要求9所述的細(xì)胞與氧化還原因子再生多肽的一種或多種底物接觸， 其中所述一種或多種底物包括所述氧化還原因子。
12.權(quán)利要求9所述的細(xì)胞或權(quán)利要求10所述的膜制備物或權(quán)利要求8所述的多肽用于再生氧化還原因子的用途。
13.權(quán)利要求9所述的細(xì)胞、權(quán)利要求10所述的膜制備物和權(quán)利要求8所述的多肽用于調(diào)整水溶液的氧化還原環(huán)境的用途，優(yōu)選地是通過將所述水溶液脫氧。
14.一種產(chǎn)生在其表面上展示氧化還原因子再生多肽的細(xì)胞的方法，包括以下步驟: (a)將權(quán)利要求1至7之一所述的核酸引入細(xì)胞， (b)任選地將所述細(xì)胞與一種或多種氧化還原反應(yīng)性輔基接觸。
15.一種產(chǎn)生氧化還原因子依賴性酶的產(chǎn)物的方法，包括以下步驟: (a)提供氧化還原因子依賴性酶， (b)提供權(quán)利要求9所述的細(xì)胞、權(quán)利要求10所述的膜制備物或權(quán)利要求8所述的多肽，和 (c)在權(quán)利要求9所述的細(xì)胞、權(quán)利要求10所述的膜制備物或權(quán)利要求8所述的多肽存在下，將所述氧化還原因子依賴性酶與一種或多種其底物接觸， 其中權(quán)利要求9所述的細(xì)胞、權(quán)利要求10所述的膜制備物或權(quán)利要求8所述的多肽包括再生所述氧 化還原因子依賴性多肽所依賴的氧化還原因子的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含編碼信號(hào)肽的區(qū)段、包含異源氧化還原因子再生多肽的區(qū)段、任選地編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的區(qū)段、編碼跨膜接頭的區(qū)段、和編碼自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其變體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的區(qū)段的核酸分子。該核酸分子使得能夠表達(dá)氧化還原因子再生酶。
文檔編號(hào)C12N9/02GK103140583SQ201180041285
公開日2013年6月5日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者約阿希姆·喬斯, 魯斯·馬斯, 伊娃·克拉嫩 申請(qǐng)人:齊魯斯專利I投資有限及兩合公司