專利名稱：由生物質(zhì)制造纖維二糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由甜菜和其它含有纖維素的生物質(zhì)酶法制造纖維二糖的方法。纖維二糖是由經(jīng)β-1，4鍵連接的兩分子葡萄糖組成的二糖。本發(fā)明的方法允許纖維二糖的經(jīng)濟(jì)制造和高產(chǎn)率。
背景技術(shù)：
纖維二糖是食物、動(dòng)物飼料、化學(xué)品、化妝品和制藥產(chǎn)業(yè)中的有價(jià)值成分?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)和生化方法由聚合纖維素或者由二糖比如蔗糖制造纖維二糖。當(dāng)使用纖維素原料時(shí)，可以通過(guò)化學(xué)酸解或者通過(guò)酶解來(lái)制備纖維二糖。在化學(xué)水解過(guò)程中，使纖維素進(jìn)行酸比如硫酸或冰醋酸處理以制造纖維二糖八乙酸酯，其隨后通過(guò)化學(xué)去乙?；晦D(zhuǎn)化成纖維二糖(Pereira等人，(1988):Methods Enzymol., 160, 26)。在酶解過(guò)程中，通過(guò)纖維素水解酶的處理來(lái)由含纖維素的原料制造纖維二糖(Taniguchi (1989, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 63，1133)。酶法可導(dǎo)致較高的產(chǎn)率，并且與化學(xué)方法相比，其不需要毒性試劑，也不涉及廢料處理問(wèn)題。當(dāng)將木漿或紙漿用于酶催化的纖維二糖制造時(shí)，可以應(yīng)用物化預(yù)處理，其可包括在存在或不存在堿或酸催化劑比如硫酸的情況下的水熱處理(US4908311、JP2006204294)。這些物化預(yù)處理使底物的結(jié)晶度指數(shù)降低，這增加了纖維素酶作用于底物的纖維素部分的傾向，從而保證更高的產(chǎn)物產(chǎn)率(JP2006204294)。然而，高溫(> 120°C )和/或高酸濃度(>l%w/v)預(yù)處理導(dǎo)致降低酶解活性并限制產(chǎn)物產(chǎn)率的抑制性化合物的形成(Palmqvist andHahn- Hagerdal (2000), Bioresource Technology, 74, pp.25-33)。除了物化方法外，還可以應(yīng)用機(jī)械(B卩，洗滌、碾磨、篩分、干燥)和酶促預(yù)處理來(lái)從復(fù)合生物質(zhì)比如甜菜渣中去除不想要的生物質(zhì)組分，比如果膠和半纖維素(Bonnin, E.等人，(2000) Carb.Poly., 41, pp.143-151, M icard, V.等人，(1997) Lebensmitt.Wiss.U.Technol.30, pp.284-291)。在這些過(guò)程中，應(yīng)用纖維素副活性(side-activities)非常低的果膠酶制劑來(lái)選擇性地溶解和去除非纖維素組分。隨后，可以使剩余的纖維素富集的固相與纖維素酶制劑接觸以獲得纖維二糖。可用于纖維二糖制造的商用纖維素酶制劑是具有水解酶活性的復(fù)合混合物。這些活性可以分組為內(nèi)切纖維素酶(例如，內(nèi)切葡聚糖酶)、外切纖維素酶(例如，纖維二糖水解酶)以及二糖和寡糖水解酶(例如，葡萄糖苷酶，也經(jīng)常被稱為纖維二糖酶)。盡管內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶從聚合纖維素鏈中釋放寡糖和二糖(纖維二糖)，但β -葡萄糖苷酶(beta-葡萄糖苷酶，BGL)將這些產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成葡萄糖單體。因此，為了最佳地制造纖維二糖，BGL活性是不期望的。大多數(shù)纖維素酶制劑含有β_葡萄糖苷酶活性，這會(huì)使纖維二糖降解成葡萄糖。該葡萄糖苷酶活性可以通過(guò)添加抑制劑比如D-葡糖酸內(nèi)酯而被抑制(Reese 等人，1971, Carbohydrate Research, 18, 381-388)。盡管可以通過(guò)添加抑制劑比如D-葡糖酸內(nèi)酯而原位(in-situ)實(shí)現(xiàn)BGL活性抑制(Bonnin 等人，(2000), Carbohydr.Polymers41, pp.143-151),但通常通過(guò)層析方式來(lái)實(shí)現(xiàn)BGL從酶復(fù)合物中的去除。可使用天然或加工過(guò)的纖維素(Tanaka，M.(2000), The Bull, of Okayama Univer.0f Sc1.36，pp.217-223; Homma 等人，(1992), J.Chem.Engineer, of Japan25, pp.288-93)或幾丁質(zhì)(Homma 等人，(1993), Biotechnol.andBioengineer.41，pp.405-410)作為層析樹脂，其允許內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶的選擇
性保留。已經(jīng)將葡萄糖氧化酶用于從蛋白中去除葡萄糖(Sisak等人,2006，Enzyme andMicrobial Technology, 39, 1002-1007),從而從含甘露糖的混合物中(Mislovicova 等人，2009，Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 60, 45-49)并從葡聚糖寡糖中(Mislovicova 等人，2009，Process Biochemistry, 42, 704-709)去除葡萄糖。出于葡萄糖氧化的目的，需要分子氧或數(shù)種氧化劑，比如人工的釕或鋨復(fù)合物(Ivanova等 Α 2003, Biochem.Moscow, 68 (4), 407-415 ；ffohlfahrt 等人，2004，Mol.Cel1.Biochem., 260, 69-83)。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，通過(guò)在45 55°C于50 200mM的pH為4.5 5.5的緩沖液中以I 20%w/w干物質(zhì)的酶與底物比添加纖維素酶2 600小時(shí)來(lái)從纖維素底物中釋放出纖維二糖(Micard 等人，(1997), Lebensm.-Wiss.u.-Technol.30, pp.284-291，Micard等人，2000，Vanderghem 等人，(2009)，Appl.Biochem.Biotechnol.DOI10.1007/S12010-009-8724-7)。纖維二糖產(chǎn)率受纖維二糖水解酶(CBH)的催化效率的限制，該纖維二糖水解酶被終產(chǎn)物纖維二糖顯著抑制(Ki 0.3mM)。已經(jīng)描述了為提高纖維二糖產(chǎn)率的工藝選擇，其中以適時(shí)間隔從反應(yīng)混合物中去除含纖維二糖的液相。該工藝被描述為以分批(batch)、補(bǔ)料分批(fed-batch)或連續(xù)模式運(yùn)行(Micard 等人，(1997)，Lebensm.-Wiss.u.-Technol.30, pp.284-291，Bonnin 等人，(2000), Polymers41, pp.143-151，Vanderghem等人，(2009)，Appl.Biochem.Biotechnol.DOI10.1007/sl2010-009-8724_7，Homma 等人，(1993),Biotechnol.and Bioengineer.41, pp.405-410, ；Tanaka, Μ.(2000), The Bull, ofOkayama Univer.0f Sc1.36，pp.217-223)。就初始纖維素成為期望的產(chǎn)物而言，已經(jīng)描述了 2 40%w/w之間的纖維二糖產(chǎn)率。描述的酶解方法的纖維二糖選擇性在60 85%w/w之間(Micard 等人，(1997)，Lebensm.-Wiss.u.-Technol.30，pp.284-291 ；W09203565)o為了純化纖維二糖，除了其它雜質(zhì)之外，還需要將副產(chǎn)物葡萄糖從纖維二糖中分離出來(lái)?？赏ㄟ^(guò)使溶液通過(guò)固定化酵母柱，在此葡萄糖被酵母選擇性地代謝，從而去除葡萄糖。之后回收纖維二糖(US4，908，311)。還可通過(guò)將溶液冷卻至(TC或之下使纖維二糖沉淀來(lái)回收纖維二糖?；蛘?，可以添加有機(jī)溶劑來(lái)沉淀纖維二糖。可通過(guò)在強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換器上分餾隨后反復(fù)結(jié)晶來(lái)進(jìn)行纖維二糖的脫鹽和脫色。已知的用于由纖維素酶法制造纖維二糖的方法利用含有低纖維素含量(2 7%w/V干物質(zhì))的原料流(例如，紙制漿廢水)。結(jié)果，由酶促反應(yīng)得到的纖維二糖濃度比較低。從經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)出發(fā)，酶促降解任意給定量的纖維素所需的比較大的容器和濃縮所得纖維二糖溶液的任選需求效率很低。已知的用于由纖維素酶法制造纖維二糖的方法還需要高達(dá)10%酶/底物w/w的高酶用量方案。因此，從經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)出發(fā)，理想的是減少所需的酶。
纖維二糖可以用作聚合物的構(gòu)造塊，用作食物成分，比如用作動(dòng)物飼料添加劑，比如用作益生(pre-biotic)添加劑，用作化妝品添加劑或成分，或者用于抗炎性藥物制劑中(Briton 等人，(2003) Ann.New York.Acad.Sc1.pp.750-54 ;Briton 等人，(2003)Hemijsk Industrija57，pp.622-625，US5219842 ;Kurita 等人，(2003)，Poly.Chem.Ed.18，pp.365—370)。待解決的問(wèn)題從經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)出發(fā)，酶成本和纖維二糖產(chǎn)物產(chǎn)率是酶促纖維二糖制造方法的重要參數(shù)。因此，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供用于制造纖維二糖的經(jīng)濟(jì)方法，其包括由含有纖維素的材料酶促降解纖維素。本發(fā)明要解決的問(wèn)題還包括提供用于制造高濃度的纖維二糖的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種由含有纖維素的材料制造纖維二糖的經(jīng)濟(jì)上高效的方法，其中可實(shí)現(xiàn)高底物產(chǎn)率。本發(fā)明還提供由含有纖維素的材料制造纖維二糖的經(jīng)濟(jì)上高效的方法，其中使用低酶/底物。具體而言，本發(fā)明涵蓋用于制造纖維二糖的方法，包括以下步驟:c)在 7.5 50% (w/w)、優(yōu)選在 10 25% (w/w)、且更優(yōu)選在 12 20% (w/w)的干物質(zhì)含量下使含有纖維素的材料進(jìn)行纖維素酶處理，以及d)將c)中獲得的含有纖維二糖的液相與固相分離。用于制造纖維二糖的底物是含有纖維素的材料。許多含有纖維素的材料是適用于本發(fā)明方法的底物，具體是微晶纖維`素、來(lái)自造紙業(yè)的漂白和未漂白紙漿、organocell漿料、紙、紙板、硬紙板、木材、木片、樹皮、小麥和其它糧食秸桿、玉米秸桿、甘蔗渣、甜菜渣、馬鈴薯皮、蔬菜殘余物或果漿。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用作本發(fā)明方法中底物的含有纖維素的材料是或者包括甜菜渣。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)以下步驟進(jìn)行上述方法:使含有纖維素的材料進(jìn)行如下處理，該處理產(chǎn)生含有果膠、半纖維素和/或其降解產(chǎn)物的液相以及含有纖維素的固相；以及將所得固相與液相分離并使其進(jìn)行上述的纖維素酶處理。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在存在酶制劑的情況下進(jìn)行上述的酶處理，該酶制劑包括至少一種類型的表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽。優(yōu)選的是使用的纖維素酶組合物表現(xiàn)出降低的或最低的β_葡萄糖苷酶活性。用于獲得這樣的纖維素酶組合物有多種方式是可行的，包括但不限于:從缺乏表現(xiàn)出β_葡萄糖苷酶活性的酶的有機(jī)體中獲得纖維素酶組合物，去除任何表現(xiàn)出β -葡萄糖苷酶活性的多肽，抑制任何表現(xiàn)出葡萄糖苷酶活性的多肽。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)上述方法獲得的含有纖維二糖的液相進(jìn)行進(jìn)一步的后處理(work-up)步驟，其包括:任選地濃縮纖維二糖溶液，以及由(任選濃縮的)纖維二糖溶液進(jìn)一步純化纖維二糖?？梢岳缤ㄟ^(guò)一種或多種以下方式純化纖維二糖:纖維二糖結(jié)晶、層析、納濾、經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀、或使用微生物，其中優(yōu)選結(jié)晶?？梢栽谌コ欣w維二糖的液相之后進(jìn)行含有纖維二糖的液相的去除。然而，在可選的實(shí)施方式中，也可以與去除含有纖維二糖的液相并行地進(jìn)行含有纖維二糖的液相的去除。就本發(fā)明的意義而言，還可以去除可存在于含有纖維二糖的液相中的任何葡萄糖。葡萄糖去除的優(yōu)選方式是將其氧化成葡糖酸。然后可通過(guò)一種或多種下列方式去除葡糖酸:離子交換層析、沉淀、電滲析，其中優(yōu)選離子交換層析。


圖1:以纖維素底物百分比呈現(xiàn)的在水解步驟中去除降解纖維二糖的酶活性之后的混合物中的纖維二糖和葡萄糖的產(chǎn)率圖2:取決于干物質(zhì)含量的水解后纖維二糖濃度圖3:在不同的E/S比率下由甜菜渣制造纖維二糖圖4:由不同的纖維素材料制造纖維二糖圖5:水解甜菜渣之后的纖維二糖產(chǎn)率圖6:葡萄糖氧化酶的底物特異性測(cè)試圖7:葡萄糖氧化酶活性引起葡萄糖濃度降低圖8:通過(guò)離子交換層析將葡糖酸與纖維二糖分離
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供由含有纖維素的材料制造纖維二糖的經(jīng)濟(jì)上高效的方法，其中可實(shí)現(xiàn)高底物產(chǎn)率。本發(fā)明還提供由含有纖維素的材料制造纖維二糖的經(jīng)濟(jì)上高效的方法，其中使用低酶/底物。底物:用于制造纖維二糖的底物是含有纖維素的材料。許多含有纖維素的材料是適用于本發(fā)明方法的底物，具體是微晶纖維素、來(lái)自造紙業(yè)的漂白和未漂白紙漿、organocell漿料、紙、紙板、硬紙板、木材、木片、樹皮、小麥和其它糧食秸桿、玉米秸桿、甘蔗渣、甜菜渣、馬鈴薯皮、蔬菜殘余物或果漿。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，相關(guān)的底物含有顯著較大的無(wú)定形纖維素與結(jié)晶纖維素的比率。進(jìn)行下述酶解步驟的含有纖維素的材料相對(duì)于纖維素總量?jī)?yōu)選含有50%或更高的無(wú)定形纖維素，并且該材料優(yōu)選是或者包括果漿或蔬菜殘余物，或者是甜菜生物質(zhì)，或者更優(yōu)選地是或包括甜菜渣。優(yōu)選的是相對(duì)于纖維素總量為50%或更高的無(wú)定形纖維素含量(《/ )，且特別優(yōu)選的是在進(jìn)行酶解步驟的含有纖維素的材料中無(wú)定形纖維素含量為60 99% (w/w)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在酶解之前通過(guò)物化方式處理含有纖維素的底物。物化處理可以是酸處理或熱處理或其任意組合，從而使底物中的部分或全部結(jié)晶纖維素部分無(wú)定形。在優(yōu)選實(shí)施方式中，含有纖維素的底物是任意形式的甜菜、蔬菜或水果生物質(zhì)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，底物是甜菜渣，或蔬菜殘余物，或果漿殘余物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，用作本發(fā)明方法中底物的含有纖維素的材料是或者包括甜菜渣。“甜菜渣”是指從甜菜(甜菜，Beta vulgaris)提取部分或所有蔗糖之后的殘余生物質(zhì)材料?？稍谔崛≈笮迈r地使用甜菜渣，經(jīng)過(guò)或 不經(jīng)過(guò)壓制。新鮮的甜菜渣通常具有19 29%w/w的干物質(zhì)含量。也可在干燥之后使用甜菜渣，經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)造粒。干燥的甜菜渣通常具有85 90%w/w的干物質(zhì)含量。底物可以是纖維素材料或木質(zhì)纖維素材料。材料可以是新鮮的(例如，新鮮的甜菜渣、來(lái)自造紙廠的濕纖維素)、或干燥的(例如，干燥的稻草、干燥的甜菜渣、木材、紙)或者是任意其它形式，包括任意形式的保存材料。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，底物是新鮮的甜菜渣、青貯的甜菜渣、干燥的甜菜渣或干燥并造粒的甜菜渣。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，甜菜渣是底物并且以高干物質(zhì)含量在升高的溫度下用酸處理。通過(guò)使用輸送帶或螺旋輸送機(jī)實(shí)現(xiàn)將這種材料運(yùn)輸入或運(yùn)輸出預(yù)處理反應(yīng)器的處理?？梢酝ㄟ^(guò)使用特殊種類的攪拌裝置比如錨式攪拌器或分段式螺旋攪拌器來(lái)進(jìn)行混合，這些裝置確保均勻的動(dòng)力輸入以及溫度和添加物質(zhì)的均勻分布。底物中包括的纖維素水解成纖維二糖:本發(fā)明涵蓋用于制造纖維二糖的方法，包括以下步驟:c)在 7.5 50% (w/w)、優(yōu)選在 10 25% (w/w)、且更優(yōu)選在 12 20% (w/w)的干物質(zhì)含量下使含有纖維素的材料進(jìn)行纖維素酶處理，以及d)將c)中獲得的含有纖維二糖的液相與固相分離?？梢允褂没谀さ姆椒?、或者在對(duì)流裝置中(counter-flow setup)、或者以其任意組合以多種方式例如分批、反復(fù)分批(repeated batch)、連續(xù)、半連續(xù)的方式進(jìn)行水解。這表明，在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述方法的步驟c )和d)重復(fù)多次，其中在后續(xù)的循環(huán)中向固相添加新鮮的水相，且任選地不添加纖維素酶或不添加包括表現(xiàn)出纖維素酶活性的多肽的酶制劑。下面詳細(xì)給 出酶組合物及其各種優(yōu)選的實(shí)施方式。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，同時(shí)進(jìn)行上述方法的步驟c)和d)。實(shí)施該實(shí)施方式的技術(shù)方式是例如，通過(guò)使用膜反應(yīng)器結(jié)構(gòu)經(jīng)液相去除纖維二糖。發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用膜反應(yīng)器結(jié)構(gòu)，時(shí)空產(chǎn)率顯著改進(jìn)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用膜，其在反應(yīng)器中保持固相但允許溶解的組分比如纖維二糖和其它物質(zhì)通過(guò)膜。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用微濾膜或超濾膜。通?？墒褂贸瑸V來(lái)保持?jǐn)?shù)個(gè)納米或更大尺寸的顆粒，而采用孔徑在0.05 10微米(μπι)之間的多孔膜的微濾能夠以Pm尺寸范圍來(lái)分離顆粒。超濾膜通常能夠保持油、月旨、蠟、樹脂、以及固體比如沙、研磨殘余物和金屬氫氧化物。然而，使用超濾膜通常不能保持可溶組分比如鹽和低分子有機(jī)物質(zhì)。典型的超濾膜具有500D 50kDa，或30kDa
3.5kDa的截留(cut-off)。因此，微濾膜和超濾膜兩者均適用于該分離工序。其實(shí)例在以下實(shí)施例10中給出。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，在工序過(guò)程中向膜反應(yīng)器中添加額外的水相比如水或緩沖液。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，膜反應(yīng)器中的容積保持在恒定水平。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，在水解過(guò)程中添加額外的干物質(zhì)，即額外的含有纖維素的固體。這些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中的兩個(gè)或三個(gè)可以相互組合。當(dāng)在水解過(guò)程中添加額外的含有纖維素的固體時(shí)，在水解過(guò)程中水解步驟中的干物質(zhì)含量保持恒定或隨時(shí)間升高。此外，平均的纖維二糖濃度增加，這對(duì)于纖維二糖下游加工而言被認(rèn)為是有益的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用膜反應(yīng)器結(jié)構(gòu)，其包括粗膜、截留在500D 50kDa之間的超濾膜的組合，優(yōu)選隨后進(jìn)行納濾步驟。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，超濾膜具有3.5kD 30kDa的截留。使用納濾步驟來(lái)濃縮纖維二糖。因此，在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，同時(shí)進(jìn)行上述方法的步驟c)和d)。這可以通過(guò)用新鮮的水相連續(xù)替換含有纖維二糖的液相來(lái)完成。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用反復(fù)分批方法，干物質(zhì)含量在7.5 50%(w/w)之間,優(yōu)選在10 25% (w/w)之間，且更優(yōu)選在12 20% (w/w)之間，并且酶-底物比在0.05 1%酶d.m底物(w/w)之間。這允許短的循環(huán)時(shí)間和高的總體產(chǎn)率。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用膜反應(yīng)器，其能夠連續(xù)去除含有纖維二糖的液相。膜優(yōu)選為粗膜、截留在500D 50kDa之間的超濾膜的組合，隨后進(jìn)行納濾步驟。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，超濾膜具有3.5kD 30kD的截留。使用納濾步驟來(lái)濃縮纖維二糖。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了超濾膜和納濾膜之外，還使用微濾膜，以改進(jìn)產(chǎn)物流的凈化。上述方法允許高效地再循環(huán)纖維素酶、簡(jiǎn)單地回收纖維二糖。其還允許使用較小的反應(yīng)器尺寸來(lái)處理任意給定量 的含有纖維素的材料，且其允許高效地再利用工藝水。各個(gè)這些優(yōu)點(diǎn)以及其組合使得纖維二糖制造方法具有改進(jìn)的經(jīng)濟(jì)特性。酶鉬合物 可以使用酶制劑或酶組合物來(lái)執(zhí)行用于纖維二糖制造的上述步驟b)的纖維素酶處理。該酶制劑優(yōu)選包括至少一種具有纖維二糖水解酶活性(EC3.2.1.91，CBH)的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述方法的步驟c)中的酶/底物比為0.01 0.5%，優(yōu)選為0.05 0.1%。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維素酶制劑還含有至少一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性(EC3.2.1.4，EG)的多肽，以將聚合底物纖維素分解成更小的片段，其更易受由纖維二糖水解酶活性引起的水解。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，纖維素酶制劑來(lái)源于真菌發(fā)酵，例如，來(lái)源于真菌比如木霉屬(Trichoderma)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、籃狀菌屬(Talaromyces sp.)或青霉屬(Penicillium sp.)的培養(yǎng)上清。這些纖維素酶制劑，除了含有纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91，CBH)和內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4，EG)之外，還經(jīng)常含有將纖維二糖水解成葡萄糖的β - (beta-)葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21，BGL)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，上述方法中用于降解含有纖維素的材料的纖維素酶制劑表現(xiàn)出降低的葡萄糖苷酶活性。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述方法中使用的纖維素酶制劑源自缺乏表現(xiàn)出顯著β -葡萄糖苷酶活性的酶的有機(jī)體，并且優(yōu)選源自其中至少一個(gè)且更優(yōu)選所有的編碼表現(xiàn)出β-葡萄糖苷酶活性的多肽的基因都被刪除或被致功能障礙。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，原始纖維素酶制劑含有β_葡萄糖苷酶活性，但通過(guò)將原始纖維素酶制劑加入選自含有纖維素、含有幾丁質(zhì)和含有殼聚糖的材料的吸附材料中隨后洗滌該吸附材料，使β_葡萄糖苷酶活性最小化或消除，這樣得到其中β_葡萄糖苷酶活性最小化或消除的含有β_葡萄糖苷酶活性的纖維素酶制劑。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，吸附材料是下述方法的步驟a)中獲得的含有纖維素的固相。簡(jiǎn)而言之，所述步驟a)包括使含有纖維素的材料進(jìn)行處理，該處理產(chǎn)生含有果膠、半纖維素和/或其降解產(chǎn)物的液相以及含有纖維素的固相。
在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)使纖維素酶制劑通過(guò)甜菜渣而使β_葡萄糖苷酶活性被去除或降低，這使得對(duì)于指定底物的纖維素酶(CBH，EG)活性被選擇性地保留，而β -葡萄糖苷酶活性被去除或降低，最小化或消除。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用β_葡萄糖苷酶活性不足的菌株來(lái)制造纖維素酶制劑。β -葡萄糖苷酶缺陷表達(dá)菌株可以通過(guò)常規(guī)的誘變和選擇而產(chǎn)生，或者通過(guò)選擇性分子生物學(xué)和特異敲除菌株的生成而產(chǎn)生。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述方法中的包括表現(xiàn)出纖維素酶活性的多肽的酶制劑包括來(lái)自以下纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)的至少一種纖維二糖水解酶:屬于糖基水解酶的第6家族或第7家族的糖基水解酶。糖基水解酶家族是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且已被Henrissat等人(1998，F(xiàn)EBS Lett.425(2):352-354)分類。特別優(yōu)選的是屬于纖維二糖水解酶1、纖維二糖水解酶II之一的表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽。更優(yōu)選的是以下表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽:來(lái)自里氏木霉(Trichoderma reesei)的CBHI(SEQ ID N0.1)，來(lái)自里氏木霉的CBHII (SEQ ID N0.2)，表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性且與SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2具有70%或更多、優(yōu)選80%或更多、且更優(yōu)選90%或更多一致性的多肽。特別優(yōu)選的是，由缺乏可測(cè)量的β_葡萄糖苷酶活性的重組酵母或真菌表達(dá)宿主的分泌而產(chǎn)生表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，由缺乏表現(xiàn)出任何可測(cè)量的β -葡萄糖苷酶活性的酶的有機(jī)體產(chǎn)生纖維素酶制劑。優(yōu)選地，使用如下的有機(jī)體，其中至少一個(gè)、更優(yōu)選所有的編碼表現(xiàn)出可測(cè)量的β_葡萄糖苷酶活性的多肽的基因被刪除或被致功能障礙。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用里氏木霉菌株，其中一個(gè)或多個(gè)編碼表現(xiàn)出β_葡萄糖苷酶活性的多肽的基因被刪除或被致功能障礙。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用里氏木霉菌株，其中至少基因bgll (E.C.3.2.1.21)被刪除或被致功能障礙。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用一種重組纖維素酶或多種重組纖維素酶，其由不表現(xiàn)出任何可檢測(cè)的BGL活性的表達(dá)宿主異源表達(dá)。優(yōu)選地，至少一個(gè)編碼以下纖維二糖水解酶中的一種的基 因通過(guò)重組DNA技術(shù)被克隆到表達(dá)宿主中:屬于糖基水解酶的第6家族或第7家族的糖基水解酶(Henrissat等人，1998，F(xiàn)EBS Lett.425(2): 352-354)。特別優(yōu)選的是屬于纖維二糖水解酶1、纖維二糖水解酶II之一的表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽。更優(yōu)選的是以下表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽:來(lái)自里氏木霉的CBHI (SEQID N0.1)，來(lái)自里氏木霉的CBHII (SEQ ID N0.2)，表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性且與SEQ IDN0.1或SEQ ID N0.2具有70%或更多、優(yōu)選80%或更多、且更優(yōu)選90%或更多一致性的多肽。優(yōu)選由缺乏可測(cè)量的葡萄糖苷酶活性的重組酵母或真菌表達(dá)宿主的分泌而產(chǎn)生纖維二糖水解酶。這樣的有機(jī)體的非限制性列舉包括畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，纖維素酶制劑含有β_葡萄糖苷酶活性，但具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽的酶活性因添加抑制劑比如D-葡糖酸內(nèi)酯而受到抑制?？梢韵蚍磻?yīng)中添加D-葡糖酸內(nèi)酯或者可以通過(guò)酶葡萄糖氧化酶和氧來(lái)由葡萄糖原位產(chǎn)生D-葡糖酸內(nèi)酯。D-葡糖酸內(nèi)酯可以自發(fā)分解并形成葡糖酸(Guisepp1-Elie等人,2009，Journalof Molecular Catalysis B:Enzymatic, 58，118-123)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，連續(xù)地原位形成D-葡糖酸內(nèi)酯，因此在反應(yīng)的全部時(shí)間內(nèi)都存在D-葡糖酸內(nèi)酯盡管其可能分解。除了抑制作用，葡萄糖氧化成D-葡糖酸內(nèi)酯以及后續(xù)的自發(fā)降解成葡糖酸還有利于之后通過(guò)例如離子交換層析或電滲析來(lái)進(jìn)行纖維二糖的純化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將葡萄糖氧化酶固定到活性碳上而使形成的對(duì)葡萄糖氧化酶具有損害作用的副產(chǎn)物過(guò)氧化氫的濃度最小化，該活性碳對(duì)過(guò)氧化氫分解有強(qiáng)催化作用。這具有額外的優(yōu)點(diǎn)，即，一半量的所消耗分子氧得以回收。在本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方式中，向反應(yīng)器中加入過(guò)氧化氫酶或活性碳。過(guò)氧化氫酶或活性碳催化過(guò)氧化氫分解成水和分子氧。為此，通過(guò)向水解反應(yīng)器中供應(yīng)過(guò)氧化氫還可以原位產(chǎn)生分子氧，避免了復(fù)雜的空氣或氧通風(fēng)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)使用葡萄糖氧化酶(GOX)將副產(chǎn)物葡萄糖從經(jīng)可選酶法制造的纖維二糖中去除?？蛇x方法是通過(guò)使用磷酸化酶由淀粉(MasayukiSuzuki, Kyoko Kanedaj Yukiko Nakai，Motomitsu Kitaoka 和 Hajime Taniguchij NewBiotechnology Volume26，Issues3_4，310ctober2009，Pagesl37_142)或由鹿糖(US5077205，1991)而酶法制造纖維二糖。其它可選方法在高濃度的葡萄糖下利用β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)移酶活性(Murray P, Aro N，Collins C，Grassick A，Penttila.Mj SaloheimoM，Tuohy Μ., Protein Expr Purif.2004Dec;38 (2):248-57)。包括表現(xiàn)出纖維素酶活性的多肽的酶混合物可以具有不同的細(xì)菌、植物、酵母或真菌來(lái)源，比如，來(lái)自細(xì)菌來(lái)源，如芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、埃希氏菌屬(Escherichia sp.)，或者來(lái)自酵母來(lái)源，如來(lái)自畢赤酵母屬(Pichia sp.)、酵母屬(Saccharomyces sp.)、假絲酵母(Candidasp.)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、耶羅維亞酵母屬(Yarrowia sp.)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces sp.)或者來(lái)自其它真菌來(lái)源，如來(lái)自枝頂孢屬(Acremonium sp.)、曲霉屬(Aspergillus sp.)、短梗霉屬(Aureobasidiurn sp.)、隱球菌屬(Cryptococcussp.)、Filibasidium 屬、德刀菌屬(`Fusarium sp.)、腐質(zhì)霉屬(Humicola sp.)、青霉菌屬(Penecillium sp.)、籃狀菌屬(Talaromyces sp.)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus sp.)或木霉屬(Trichoderma sp.)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，包括表現(xiàn)出纖維素酶活性的多肽的酶制劑源自木霉屬，更具體地，源自里氏木霉、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiaturn)或綠色木霉(Trichodermaviride)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述纖維素酶制劑源自里氏木霉。纖維素酶制劑在其天然宿主中產(chǎn)生，比如源自細(xì)菌、植物、酵母或真菌，或者該酶由宿主有機(jī)體異源表達(dá)。這些重組表達(dá)宿主可以是細(xì)菌、酵母或真菌菌株，例如，大腸桿菌(Escherichia col i )、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)、假單抱菌屬(Pseudomonas sp.)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、安格斯畢赤酵母(Pichiaangusta)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、漢遜酵母屬(Hansenula sp.)、耶羅維亞酵母屬(Yarrowia sp.)、里氏木霉、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、或青霉屬。為調(diào)節(jié)反應(yīng)中的底物干物質(zhì)含量，優(yōu)選通過(guò)IR-balance確定各生物質(zhì)的干質(zhì)量。為關(guān)于底物干物質(zhì)含量調(diào)節(jié)酶用量方案，使用Bradford比色方法(Bradford, Μ.Μ.(1976), Anal.Biochem.72，pp.248-254)通過(guò)測(cè)量各酶原液的總蛋白含量來(lái)確定酶濃度。關(guān)于線性標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定蛋白濃度，其中該線性標(biāo)準(zhǔn)曲線使用牛血清白蛋白作為校準(zhǔn)基準(zhǔn)而得到。固體的含有纖維素的底物任選地在固液分離之后與纖維素酶制劑在一種或多種以下條件下一起孵育:恒定溫度、恒定pH、恒定壓力、干物質(zhì)含量和酶-底物比。因此，在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維素材料與纖維素酶制劑在10 80°C和3.0
9.0的pH以及0.01 3%w/w d.m.底物的酶-底物比下一起孵育0.1 24小時(shí)。使用纖維素酶制劑的蛋白含量和底物的干物質(zhì)含量來(lái)調(diào)節(jié)酶-底物w/w比率。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，含有纖維素的材料與纖維素酶制劑在40 60°C在4.5
5.5的pH下(干物質(zhì)含量為2 20%，且酶-底物比為0.05 l%w/w d.m底物)一起孵育0.5 6小時(shí)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，含有纖維素的材料與纖維素酶制劑在45 55°C在4.5
5.0的pH下(干物質(zhì)(d.m.)含量為7.5 15%，且酶-底物比為0.05 0.l%w/w d.m.底物)一起孵育2 6小時(shí)。

水解之前的底物處理:在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選底物在酶解之前被進(jìn)一步處理。處理目的是在后續(xù)的水解步驟中提供更好的纖維素可得性(availab i I i ty )。處理可以是化學(xué)、物理或酶處理或其組合。處理可以是以下處理的任一種:酸處理(通過(guò)添加無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸)，堿處理(通過(guò)添加無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿)，施加溫度、或壓力，或應(yīng)用有機(jī)溶劑工序(通過(guò)添加有機(jī)溶劑)，使用離子液體，或水熱預(yù)處理(施加或不施加壓力)，或凍融循環(huán)，或添加任何催化劑(均質(zhì)的或非均質(zhì)的)，或添加一種或多種酶活性，或上述的任意組合。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，處理結(jié)合物理和化學(xué)(即，物化)處理。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合酸處理加熱底物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，甜菜渣是底物并且以高干物質(zhì)含量在升高的溫度下用酸處理。如上所述，可以使用基于膜的方法、或者在對(duì)流裝置中、或以其任意組合以多種方式例如分批、反復(fù)分批、連續(xù)、半連續(xù)的方式進(jìn)行水解。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，干物質(zhì)含量在
7.5 50%w/w之間。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，干物質(zhì)含量在10 25%w/w之間。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，干物質(zhì)含量在12 20%w/w之間。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合溫度和壓力使用酸處理含有纖維素的底物，其中酸可以是任意無(wú)機(jī)或有機(jī)酸，溫度在80 210°C的范圍內(nèi)，并且壓力在0.5 100巴之間。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，溫度在95 135°C之間。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合溫度和壓力使用酸處理含有纖維素的底物，其中酸是硫酸(H2SO4)、亞硫酸(H2SO3)、鹽酸(HCl)、碳酸(H2CO3)或二氧化碳(CO2)、硝酸(HNO3)或亞硝酸(ΗΝ02)。結(jié)合酸使用的溫度在80 150°C的范圍內(nèi)，并且施加壓力在I 10巴內(nèi)。在實(shí)施方式中，溫度在80 210°C的范圍內(nèi)并且施加的壓力在0.5 100巴內(nèi)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，溫度在95 135°C之間。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，向底物添加硫酸且在95 135°C的溫度下以20 25%w/w的干物質(zhì)含量處理底物。硫酸用量?jī)?yōu)選在0.1 l%w/w (硫酸/底物)之間。處理使底物中的部分或全部非纖維素材料可溶。由此，處理后的部分非纖維素材料處于液相中，而大部分的纖維素處于固相中。從底物中分離非纖維素材料在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在產(chǎn)生纖維二糖的水解步驟之前將部分或全部的可溶非纖維素材料去除。非纖維素材料可包括半纖維素、果膠、半纖維素和果膠的水解產(chǎn)物、木質(zhì)素、礦物鹽、有機(jī)酸、醇、寡糖、蔗糖和/或其它可溶性糖。因此，本發(fā)明還涵蓋用于制造纖維二糖的方法，包括以下步驟:a)使含有纖維素的材料進(jìn)行如下處理，該處理產(chǎn)生含有果膠、半纖維素和/或其降解產(chǎn)物的液相以及含有纖維素的固相；b)將a)中獲得的固相與液相分離；c)使b)中得到的固相進(jìn)行纖維素酶處理，其中a)中得到的固相的干物質(zhì)含量為7.5 25% (w/w)，優(yōu)選為10 20% (w/w)，從而提供固相和含有纖維二糖的液相；d)將c)中獲得的含有纖維二糖的液相與固相分離。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在步驟a)的處理過(guò)程中干物質(zhì)含量在7.5 50% (w/w)之間，優(yōu)選在10 30% (w/w)之間。本發(fā)明的作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜锸翘鸩嗽以?5 135°C的溫度下以20 25%w/w的干物質(zhì)含量使用酸處理底物時(shí)，使大部分非纖維素材料可溶，而大部分纖維素保持不可溶。甜菜渣的非纖維素材料包括果膠(聚半乳糖醛酸)和半纖維素(半乳醣阿拉伯聚糖)，包括單體半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和/或木糖。通常通過(guò)上述處理使至少80%w/w的果膠和半纖維素部分可溶，而至少80%w/w的纖維素保持在固相中。通過(guò)固液分離去除底物中經(jīng)處理步驟而致可溶的部分?？赏ㄟ^(guò)連續(xù)或不連續(xù)離心、壓濾或帶壓方法來(lái)執(zhí)行固液分離。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在分離步驟之前添加果膠酶和阿拉伯糖酶。優(yōu)選地，在20 60°C的溫度下與這些酶一起孵育10分鐘至12小時(shí)的時(shí)間。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，在分離步驟之前添加果膠酶和阿拉伯糖酶，并在30 50°C的溫度下孵育10分鐘至4小時(shí)的時(shí)間。優(yōu)選地，通過(guò)培養(yǎng)以下微生物中的一種來(lái)產(chǎn)生果膠酶和阿拉伯糖酶:黑曲霉、臭青霉(Penicillium foetidus)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用分離后的液相作為增值產(chǎn)品源。其含有聚合物比如果膠、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、鼠李半乳糖醒酸聚糖(rhamnogalacturonan)、木聚糖、以及這些聚合物的寡聚形式和單體?？梢砸约兓问交蛘咦鳛榛旌衔锸褂镁酆衔?例如，在飼料或食物用途中作為增稠劑、表面活性劑、乳化劑)。此外，液相含有各種量(糖和糖酸的總含量為O 100%)的上述聚合物的單體糖和糖衍生物，例如，半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖和果糖。單體糖和糖酸可以 在純化為純物質(zhì)后直接使用，或者以各種混合物的形式使用。它們可在化學(xué)或生化轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生糖酸(例如，葡糖酸、半乳糖酸、阿拉伯糖酸、木糖酸、鼠李糖酸)、糖二酸(例如，半乳糖二酸、葡糖二酸、阿拉伯糖二酸、木糖二酸、鼠李糖二酸)、糖醇(例如，木糖醇、阿糖醇、半乳糖醇、鼠李糖醇)、糠醛、羥甲基糠醛、呋喃二羧酸及其衍生物之后被用作增值產(chǎn)品源。通過(guò)酶處理、通過(guò)均相和/或通過(guò)多相催化來(lái)完成轉(zhuǎn)化步驟。處理步驟后去除液相對(duì)該方法有益，因?yàn)槠淅缤ㄟ^(guò)去除抑制物質(zhì)而提高了纖維素酶的纖維素酶解效率。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于由含有纖維素的材料制造纖維二糖的方法，其中在水解步驟之后去除液相。纖維二糖后處理和鈍化可對(duì)通過(guò)上述方法得到的含有纖維二糖的液相進(jìn)行收集和濃縮。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)上述方法的步驟d)的含有纖維二糖的液相中所含有的纖維二糖進(jìn)行進(jìn)一步的步驟e)，其包括:任選地濃縮纖維二糖溶液，并進(jìn)一步由(任選濃縮的)纖維二糖溶液純化纖維二糖，優(yōu)選純化至至少50%的純度，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少90% (w/w),且最優(yōu)選至少99% (w/w)的純度。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中， 步驟e)包括以下中的一者或多者:纖維二糖結(jié)晶、層析、納濾、經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀、或使用微生物，其中優(yōu)選結(jié)晶?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)濃縮，例如，通過(guò)蒸發(fā)水分，通過(guò)膜技術(shù)，或者通過(guò)萃取將水分移到另一液相中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)膜技術(shù)使用超濾、微濾和納濾來(lái)去除水分，使纖維二糖從0.1% 1.5% (w/w)的濃度濃縮到高達(dá)20% (w/w)的濃度。在此之后,可使用薄膜蒸發(fā)器進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮步驟，以將纖維二糖從10% (w/w)濃縮到高達(dá)40% (w/w)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)膜技術(shù)使用超濾、微濾和納濾來(lái)去除水分，使纖維二糖從0.1% 1.5% (w/w)的濃度濃縮到高達(dá)10% (w/w),隨后使用薄膜蒸發(fā)器進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮步驟，以將纖維二糖從10% (w/w)濃縮到高達(dá)25% (w/w)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)薄膜蒸發(fā)器濃縮含有纖維二糖的液體，使纖維二糖從0.1%濃縮到高達(dá)40% (w/w)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)薄膜蒸發(fā)器濃縮含有纖維二糖的液體，使纖維二糖從0.1%濃縮到高達(dá)25% (w/w)。濃縮后的液體含有50 95%w/w纖維二糖(相對(duì)于糖類總量)、I 40%w/w葡萄糖以及少量的比如阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、果糖和其它雜質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)例如結(jié)晶、層析、納濾、經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀、或者使用微生物來(lái)進(jìn)一步純化纖維二糖，其中優(yōu)選結(jié)晶。所得液體可具有褐色。因此，任選地在方法中增加脫色步驟，該步驟去除部分或全部的有色物質(zhì)。優(yōu)選通過(guò)將雜質(zhì)吸附到吸附劑材料，優(yōu)選吸附到木炭、離子交換樹脂或膨潤(rùn)土來(lái)進(jìn)行該步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)層析步驟使用向吸附材料(其是膨潤(rùn)土或包括膨潤(rùn)土)的吸附來(lái)進(jìn)行此步驟。由包括纖維素和葡萄糖的組合物純化纖維二糖的方法本發(fā)明還包括用于由包括纖維二糖和葡萄糖的組合物純化纖維二糖的方法，包括通過(guò)在葡萄糖氧化酶(GOX)和氧的存在下進(jìn)行葡萄糖氧化而將葡萄糖氧化成葡糖酸的步驟。在該方法中，通過(guò)使用葡萄糖氧化酶(GOX)(以及任選地，過(guò)氧化氫酶或活性碳)將葡萄糖氧化成葡糖酸來(lái)從纖維二糖中去除副產(chǎn)物葡萄糖。出于去除產(chǎn)物H2O2并避免產(chǎn)物纖維二糖的非特異性氧化的目的，添加過(guò)氧化氫酶或活性碳。因此，通過(guò)葡萄糖氧化來(lái)將通過(guò)上述方法得到的含有纖維二糖的液相中的葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡糖酸，葡萄糖氧化優(yōu)選在葡萄糖氧化酶(GOX)和氧的存在下進(jìn)行。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)以下一種或數(shù)種方式來(lái)將通過(guò)上述方法得到的葡糖酸從含有纖維二糖的液相中去除:離子交換層析、沉淀、電滲析，其中優(yōu)選離子交換層析。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過(guò)離子交換層析來(lái)將葡糖酸從反應(yīng)混合物中去除。在可選的實(shí)施方式中，存在于液相中的葡萄糖可以原位轉(zhuǎn)化成D-葡糖酸內(nèi)酯。然后可使用D-葡糖酸內(nèi)酯來(lái)抑制任何表現(xiàn)出β -葡萄糖苷酶活性的多肽的活性?？梢砸匀缦路绞綄?shí)施根據(jù)本發(fā)明的獲得纖維二糖的方法，即任何具有β -葡萄糖苷酶活性的多肽的酶活性受到抑制劑(優(yōu)選為D-葡糖酸內(nèi)酯)的抑制，其中D-葡糖酸內(nèi)酯優(yōu)選根據(jù)上述的葡萄糖氧化方法由液相中所包括的葡萄糖原位產(chǎn)生。許多其它單糖也可被GOX氧化，盡管特異活性很低，且隨后被去除。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在30 60°C和5 50g/l葡萄糖和其它單糖的底物濃度下使用固定化的熱穩(wěn)定性葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化氫酶或活性碳和氧來(lái)將葡萄糖氧化成葡糖酸。之后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)離子交換層析來(lái)去除葡糖酸。例如通過(guò)用酸洗脫，可從離子交換中回收葡糖酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)沉淀、或通過(guò)使用陰離子選擇性膜的電滲析來(lái)去除葡糖酸。為了提高纖維二糖的純度，可以使用能夠處理葡萄糖、其它單體糖和糖酸但不能破壞纖維二糖中的β -糖苷鍵并因此不能消化纖維二糖的微生物(例如，細(xì)菌、酵母、真菌)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所用的微生物是酵母(例如，釀酒酵母、克魯維酵母菌屬、裂殖酵母菌屬)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，將釀酒酵母用于該工藝步驟。用于純化纖維二糖的另一選擇包括纖維二糖的選擇性結(jié)晶，以便純化產(chǎn)物并產(chǎn)生易儲(chǔ)存的產(chǎn)物。用于產(chǎn)物的最終制備和存儲(chǔ)的方法不限于任何特定的一種，并且可包括濃縮方法中的結(jié)晶、噴霧干燥、鼓式干燥、擠壓技術(shù)和簡(jiǎn)單的水分蒸發(fā)。產(chǎn)物可作為無(wú)定形粉末，以結(jié)晶形式或作為纖維二糖漿液使用。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)上述方法得到的纖維二糖被進(jìn)一步純化至高于99%(w/w)的純度。使用通過(guò)本發(fā)明方法能得到的纖維二糖制劑通過(guò)本發(fā)明方法能得到的纖維二糖制劑可以用作食物成分、動(dòng)物飼料添加劑、化妝品成分。纖維二糖制劑可以以抗炎藥物制劑進(jìn)行使用。制造的纖維二糖可以用于多種用途，例如，作為益生物質(zhì)用于飼料和食物用途，作為低卡成分用于食物中，作為構(gòu)造塊用于聚合物、用于有機(jī)合成，作為添加劑用于聚合物，作為活性藥物成分用于治療用途，作為構(gòu)造塊用于聚合物，或者用于化妝品用途。在一個(gè)實(shí)施方式 中，纖維二糖被用作改進(jìn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品的飼料添加劑。該飼料可以用于飼養(yǎng)豬、小豬、小牛、牛和/或家禽比如雞和火雞。通常以動(dòng)物飼料組合物中纖維二糖的干物質(zhì)含量為0.01 l%w/w的濃度使用纖維二糖。在該實(shí)施方式的優(yōu)選變形中，以0.05 0.5%w/w的濃度使用纖維二糖。在該實(shí)施方式的更優(yōu)選變形中，以.05 0.2%w/w的濃度使用纖維二糖。在另一個(gè)實(shí)施方式中，含有50 90% (w/w)纖維二糖和5 50葡糖酸(w/w)的組合產(chǎn)物被用作動(dòng)物飼料成分，纖維二糖濃度為0.05 1.0%w/w,更優(yōu)選為0.05 0.5%w/w，且更優(yōu)選為0.05 0.2%w/w。優(yōu)選地，向動(dòng)物飼料制劑中以0.01 1% (w/w)的用量，優(yōu)選以0.05 0.2% (w/w)的用量，添加纖維二糖制劑。纖維二糖制劑可對(duì)動(dòng)物的腸道菌群具有益生作用。添加纖維二糖可以提高動(dòng)物的整體健康狀態(tài)。而且，該添加可以引起飼料攝取增加和/或體重增力口。動(dòng)物飼料優(yōu)選被用作豬、魚、牛和/或家禽的飼料，更優(yōu)選用作豬和家禽的飼料。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，纖維二糖制劑被用作食物成分。食物用途包括烘烤、飲料以及巧克力、糖和糖果中的成分。在烘烤和糖果用途中，纖維二糖用作具有低熱值和低甜度但改進(jìn)食品的香味(例如，通過(guò)形成美拉德產(chǎn)物)的成分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維二糖制劑與甜味劑比如木糖醇、麥芽糖醇和/或甜葉菊一起添加到糕餅或餅干的面團(tuán)配方中，并且其中面團(tuán)中的蔗糖用量降低。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，添加纖維二糖引起與不降低蔗糖用量時(shí)可比較的面團(tuán)特性。這樣的面團(tuán)特性為以下中的一種或多種:棕色、香味形成、口感。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及上述的纖維二糖制劑在食物組合物中的用途，其對(duì)食物提供益生性作用，從而改進(jìn)攝取食物的人的整體健康狀態(tài)(具體是通過(guò)改進(jìn)腸道菌群)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，纖維二糖制劑被進(jìn)一步純化至高于99% (w/w)的純度。該纖維二糖組合物意在用于在治療炎癥性腸病(比如，潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、膠原性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎和/或貝塞綜合征沖有效的口服藥物組合物。通過(guò)本發(fā)明方法能得到的葡糖酸可以用于例如食物或飼料工業(yè)中，作為防腐劑，作為化妝品添加劑，用于有機(jī)合成。在另一優(yōu)選 的實(shí)施方式中，通過(guò)本發(fā)明方法能得到的包括葡糖酸和纖維二糖的混合物被用作飼料工業(yè)中的組合產(chǎn)物，結(jié)合了纖維二糖的有益作用和有機(jī)酸的益處。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明包括用于制造纖維二糖的方法，其可以被實(shí)施為包括以下步驟:a)使含有纖維素的材料進(jìn)行如下處理，該處理產(chǎn)生含有果膠、半纖維素和/或其降解產(chǎn)物的液相以及含有纖維素的固相；b)將a)中獲得的固相與液相分離；c)使b)中得到的固相進(jìn)行纖維素酶處理，其中b)中得到的固相的干物質(zhì)含量為
7.5 25% (w/w)，優(yōu)選為10 20% (w/w)，從而提供固相和含有纖維二糖的液相；d)將c)中獲得的含有纖維二糖的液相與固相分離。處理a)可以是化學(xué)、物理或酶處理或其組合。該處理使底物中的部分或全部非纖維素材料可溶。由此，在該處理之后，部分的非纖維素材料處于液相中而大部分纖維素處于固相中。可以通過(guò)任意適用于固液分離的方法來(lái)實(shí)施分離步驟b )，例如，篩分、過(guò)濾等。本發(fā)明的作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)b)中得到的固相的干物質(zhì)含量為7.5 25% (w/w)，優(yōu)選為
10 20% (w/w)時(shí)，可以有效地進(jìn)行酶解步驟C)。步驟c)的纖維素酶處理可以是使用單一類型的多肽或包括至少一種纖維素酶的酶組合物進(jìn)行的處理。優(yōu)選包括纖維二糖水解酶活性的酶或酶組合物。步驟c)中使用的酶或酶組合物可以從天然或重組來(lái)源獲得。優(yōu)選地，步驟c)的酶或酶組合物表現(xiàn)出降低的或最小的葡萄糖苷酶活性。獲得此酶(組合物)的方法包括從表現(xiàn)出最小β_葡萄糖苷酶活性的有機(jī)物獲得此酶(組合物)、通過(guò)添加抑制劑比如D-葡糖酸內(nèi)酯來(lái)抑制任何可測(cè)量的β -葡萄糖苷酶活性、或者通過(guò)使酶組合物經(jīng)過(guò)選自含有纖維素、含有幾丁質(zhì)和含有殼聚糖的材料的吸附材料而去除任何表現(xiàn)出可測(cè)量的β_葡萄糖苷酶活性的多肽。通常，任何表現(xiàn)出可測(cè)量的β_葡萄糖苷酶活性的多肽不與此種材料強(qiáng)烈地結(jié)合，因而被洗脫，而期望的酶保持對(duì)吸附材料的結(jié)合。優(yōu)選的是該步驟中使用的吸附材料是待水解的含有纖維素的材料。特別優(yōu)選的是吸附材料是在以下步驟a)中得到的含有纖維素的固相。通常，吸附過(guò)程比水解過(guò)程快得多。可以通過(guò)任意適用于固液分離的方法來(lái)將含有纖維二糖的液相與固相分離，比如任意類型的過(guò)濾，優(yōu)選納濾、超濾或微濾。含有纖維二糖的液相可以由新鮮的或再循環(huán)的水相替換?？梢匀コ欣w維二糖的液相，同時(shí)添加新的水相，但也可以順序地執(zhí)行這些步驟。上述方法的步驟c)和d)可以同時(shí)進(jìn)行。這可以例如使用如上所述的膜反應(yīng)器結(jié)構(gòu)通過(guò)連續(xù)地用新鮮水相替換含有纖維二糖的液相來(lái)完成。

本發(fā)明還涉及從水相中去除葡萄糖的方法，包括在氧的存在下使用葡萄糖氧化酶(GOX)(以及任選地，過(guò)氧化氫酶或活性碳)來(lái)將葡萄糖氧化成D-葡糖酸內(nèi)酯。過(guò)氧化氫酶對(duì)于去除產(chǎn)物H2O2和避免產(chǎn)物纖維二糖的非特異性氧化是必需的?？梢酝ㄟ^(guò)沉淀或離子交換層析將源自D-葡糖酸內(nèi)酯的水解的葡糖酸從反應(yīng)混合物中去除?？梢栽恍纬蒁-葡糖酸內(nèi)酯；之后可以使用D-葡糖酸內(nèi)酯作為任意表現(xiàn)出可測(cè)量的β-葡萄糖苷酶活性的多肽的抑制劑，如上所述。還可以任選地對(duì)得到的含有纖維二糖的液相進(jìn)行濃縮并且例如通過(guò)結(jié)晶來(lái)由(任選濃縮的)液相進(jìn)一步純化纖維二糖。通過(guò)本發(fā)明方法得到的產(chǎn)物也是本發(fā)明的固有組分?？梢允褂卯a(chǎn)品，例如，作為食品添加劑，例如，作為益生性食品添加劑。本發(fā)明還涉產(chǎn)物在治療疾病比如炎性疾病中的用途。定義術(shù)語(yǔ)“甜菜生物質(zhì)”是指包括外皮和內(nèi)漿的甜菜的完整且未處理的根組織。干組織通常含有80% (w/w)的可溶蔗糖，而甜菜渣主要由聚合糖和果膠組成，其包括通常7%的果膠(主要是聚半乳糖醛酸(polygalacturan))、通常7%的纖維素和通常7%的主要是阿拉伯聚糖形式的半纖維素。術(shù)語(yǔ)“果膠富集生物質(zhì)”是指未處理的或處理過(guò)的水果植物組織和蔬菜組織，其由聚合糖和果膠組成，包括I 50%果膠、I 80%纖維素和I 80%半纖維素。術(shù)語(yǔ)“干物質(zhì)(d.m.)”是指在從新鮮組織中去除水分之后例如通過(guò)使用IR-balance確定的質(zhì)量與生物質(zhì)之比。術(shù)語(yǔ)“聚合底物”是指由以線性或部分分支的分子結(jié)構(gòu)共價(jià)鍵合的特定的單體成分或有限類的限定單體成分組成的物質(zhì)。實(shí)例是原木質(zhì)纖維素原料的不可溶部分，其可含有顯著量的此種聚合底物，比如纖維素、木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖醒酸木聚糖(glucoronoxylan)、葡甘露聚糖和木葡聚糖。
術(shù)語(yǔ)酶的“酶活性”是指在酶用作蛋白催化劑的合適條件下的催化活性。對(duì)于能夠降解聚合或人工底物的酶，“酶活性”是指酶將特定的聚合或人工底物轉(zhuǎn)化成特定的寡聚或單體產(chǎn)物的活性。術(shù)語(yǔ)“纖維素酶”是指表現(xiàn)出纖維素酶活性的多肽。術(shù)語(yǔ)“纖維素酶制劑”是指包括至少一種表現(xiàn)出纖維素酶活性的多肽的纖維素酶或組合物。在本說(shuō)明書的上下文中，術(shù)語(yǔ)“酶制劑”與“纖維素酶制劑”同義地使用。纖維素酶制劑優(yōu)選包括至少一種具有纖維二糖水解酶活性(EC3.2.1.91，CBH)的多肽。術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶”或“CBH” (E.C.3.2.1.91)是指催化聚合纖維素水解成纖維二糖和其它β-D-葡萄糖低聚物的酶。術(shù)語(yǔ)葡萄糖苷酶”或“beta-葡萄糖苷酶”或“BGL” (E.C.3.2.1.21)是指將纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和其它β -D-葡萄糖低聚物催化成相應(yīng)的葡萄糖單體的酶。術(shù)語(yǔ)“膜反應(yīng)器結(jié)構(gòu)”是指反應(yīng)器和一個(gè)或多個(gè)與反應(yīng)器連接的外部膜模塊的組合，或者是指具有一個(gè)或多個(gè)浸沒(méi)的膜模塊的反應(yīng)器。實(shí)施例實(shí)施例1:甜菜渣的預(yù)處理將224.7g干燥的甜菜渣(89%w/w干物質(zhì)含量)與535ml水和240.4mll%的H2SO4混合，并在135°C于壓力下孵育I小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾分離固相和液相。將固相用于纖維二糖制造。實(shí)施例2:通過(guò)將纖維素酶吸附到`底物上隨后進(jìn)行洗滌步驟來(lái)去除降解纖維二糖的酶活性將460g干物質(zhì)含量為16.5%w/w的預(yù)處理的甜菜渣(參見(jiàn)實(shí)施例1)與750mg來(lái)自里氏木霉的纖維素酶制劑在室溫下接觸5分鐘。為了去除降解纖維二糖的酶活性，通過(guò)過(guò)濾去除液相。隨后添加50mM乙酸緩沖液(pH5.0)以將反應(yīng)調(diào)節(jié)到相同的干物質(zhì)含量(16.5%w/w)。將混合物在50°C孵育48小時(shí)，隨后進(jìn)行相分離步驟。通過(guò)HPLC在BioRadAminex HPX87-H柱上確定液相中葡萄糖和纖維二糖的量。從纖維素制劑中去除β-葡萄糖苷酶活性的數(shù)據(jù)示于圖1中。實(shí)施例3:在不同干物質(zhì)因素下液相中的纖維二糖濃度將460g預(yù)處理的甜菜洛(參見(jiàn)實(shí)施例1)與(i) 750mg, (ii) 375mg,和(iii) 75mg來(lái)自里氏木霉的纖維素酶制劑在室溫下接觸5分鐘。根據(jù)實(shí)施例2中描述的步驟來(lái)去除降解纖維二糖的活性。將50mM乙酸緩沖液(pH5.0)添加到固體部分中，以分別達(dá)到(i) 15%，
(ii)7.5%和(iii)2.5%的干物質(zhì)含量w/w。將混合物在50°C下孵育I小時(shí)，隨后進(jìn)行相分離步驟。如實(shí)施例2中所描述通過(guò)HPLC確定液相中葡萄糖和纖維二糖的量。與底物干物質(zhì)含量相關(guān)的纖維二糖濃度的數(shù)據(jù)示于圖2中。實(shí)施例4:在不同的酶/底物(E/S)比率下由甜菜渣制造纖維二糖將460g預(yù)處理的甜菜渣(參見(jiàn)實(shí)施例1)與(i)75mg，(ii)37.5mg，和(iii)7.5mg來(lái)自里氏木霉的纖維素酶制劑在室溫下接觸5分鐘。根據(jù)實(shí)施例2中描述的步驟來(lái)去除降解纖維二糖的活性。將50mM乙酸緩沖液(pH5.0)添加到固體部分中，以達(dá)到15%的干物質(zhì)含量w/w。將混合物在50°C下孵育，并在不同的時(shí)間點(diǎn)采集液相的代表性樣品。如實(shí)施例2中所描述通過(guò)HPLC確定樣品中葡萄糖和纖維二糖的量。與酶-底物比相關(guān)的纖維二糖制造示于圖3中。實(shí)施例5:由不同的纖維素材料制造纖維二糖如實(shí)施例2所示處理460g預(yù)處理的(參見(jiàn)實(shí)施例1)或未處理的甜菜渣和Avicel，以去除降解纖維二糖的活性。向固體部分添加乙酸緩沖液以達(dá)到2.5%的干物質(zhì)含量，且將混合物在50°C下孵育I小時(shí)。如實(shí)施例2中所描述通過(guò)HPLC確定液相中葡萄糖和纖維二糖的量。由不同的纖維素原料得到的纖維二糖產(chǎn)率示于圖4中。實(shí)施例6:由甜菜渣制造纖維二糖如實(shí)施例2所示對(duì)460g預(yù)處理的甜菜渣(參見(jiàn)實(shí)施例1)進(jìn)行處理。向固體部分添加50mM乙酸緩沖液(pH5.0)以達(dá)到7.5%的干物質(zhì)含量w/w。將混合物在50°C下孵育I小時(shí)，隨后進(jìn)行固/液相分離步驟。液相分離、添加緩沖液至相同的干物質(zhì)含量、隨后進(jìn)行孵育的過(guò)程重復(fù)六次。如實(shí)施例2中所描述通過(guò)HPLC確定各步驟的特定液體部分中的葡萄糖和纖維二糖的量。由甜菜渣制造葡萄糖和纖維二糖示于圖5中。實(shí)施例7 =GOX底物特異性使用以下檢定來(lái)評(píng)估葡萄糖氧化酶的底物特異性:將各測(cè)試糖類溶于IOOmMNa-乙酸緩沖液(pH5.5)中，得到的最終糖濃度為100mM。終溶液含有25U/mL辣根過(guò)氧化物酶和1禮2，2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。通過(guò)添加0.lU/mL葡萄糖氧化酶來(lái)開(kāi)始反應(yīng)。反應(yīng)在搖動(dòng)的24孔微滴定板中進(jìn)行。各孔容積為500 μ L。所有條件一式三份進(jìn)行測(cè)試。在405nm 處檢測(cè)到吸光度增加。使用H2O2的校正曲線來(lái)計(jì)算活性。所有試劑都得自Sigma-Aldrich (Deisenhofen,Germany)并且是分析級(jí)。GOX底物特異性示于圖6中。實(shí)施例8:通過(guò)葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡糖酸將葡萄糖氧化酶固定到包被有聚乙烯亞胺和戊二醛的玻璃珠上。向IOOmL含有25mM葡萄糖、150mM纖維二糖和70，000U過(guò)氧化氫酶的IOOmM Na-乙酸緩沖液中添加20mg總活性為100U的這些玻璃珠。在反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)，其中反應(yīng)器持續(xù)用空氣通風(fēng)，通風(fēng)速率為lL/min。采集等分試樣并使用HPLC對(duì)葡萄糖濃度進(jìn)行定量。通過(guò)葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡糖酸的數(shù)據(jù)示于圖7中。實(shí)施例9:通過(guò)離子交換層析分離葡萄糖和葡糖酸將根據(jù)實(shí)施例8制備的30mL纖維二糖/葡糖酸混合物施加到75mL裝有AMBERLITEIRA67 (Rohm and Haas，Germany)的玻璃柱。柱子用H2O洗滌并用IM碳酸銨洗脫。如實(shí)施例2所描述通過(guò)HPLC確定各部分中葡糖酸和纖維二糖的量。葡萄糖與葡糖酸的HPLC分離數(shù)據(jù)示于圖8中。實(shí)施例10:使用超濾結(jié)合步驟c)和d)設(shè)置:向水解反應(yīng)器中添加約5kg預(yù)處理的甜菜渣，該水解反應(yīng)器與截留為
10.000道爾頓的超濾膜單元連接。加入酶和水以將干物質(zhì)含量調(diào)節(jié)為9%。溫度恒定保持在約45°C。在加入酶之后開(kāi)啟泵。平均而言，約3m3/h的水解混懸液被泵入到膜單元中?？缒涸?.7 1.5巴之間。將截留物泵回到反應(yīng)器中，收集滲透物。連續(xù)測(cè)量滲透物質(zhì)量并通過(guò)HPLC分析其纖維二糖含量。為保持水解反應(yīng)器中的容積恒定，添加水。九小時(shí)之后，通過(guò)將泵關(guān)閉并通過(guò)將混懸液冷卻至4°C來(lái)停止水解。
結(jié)果:滲透物中纖維二糖與葡萄糖的平均比率大于5比I。存在于甜菜渣中的94%纖維素被轉(zhuǎn)化，纖維二糖的產(chǎn) 率為79%。
權(quán)利要求
1.一種用于制造纖維二糖的方法，包括以下步驟:a)使含有纖維素的材料進(jìn)行酸處理，所述酸處理產(chǎn)生液相和含有纖維素的固相，其中步驟a)過(guò)程中的干物質(zhì)含量在7.5 50% (w/w)之間；b)將a)中得到的固相與液相分離；c)使b)中得到的固相在7.5 50% (w/w)的干物質(zhì)含量下進(jìn)行纖維素酶處理，其中在包括至少一種表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽的酶制劑的存在下進(jìn)行所述纖維素酶處理，從而提供固相和含有纖維二糖的液相，以及d)將在c)中得到的所述含有纖維二糖的液相與固相分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于制造纖維二糖的方法，其中在步驟c)中，b)中得到的固相的干物質(zhì)含量在12 20% (w/w)之間。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中進(jìn)行步驟c)的含有纖維素的材料相對(duì)于纖維素的總量含有50%或更多的無(wú)定形纖維素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中步驟a)的所述處理過(guò)程中的干物質(zhì)含量在10 30%之間。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中步驟c)中的酶/底物比為0.01 0.1。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶制劑源自缺乏表現(xiàn)出顯著β-葡萄糖苷酶活性的酶的有機(jī)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2 5中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中所述纖維素酶制劑含有β-葡萄糖苷酶活性，并且其中向 待進(jìn)行步驟c)的含有纖維素的材料添加所述纖維素酶制劑，隨后洗滌所述材料，使得固相中的β -葡萄糖苷酶活性最小化或被消除。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 6中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中所述纖維素酶制劑包括至少一種來(lái)自下列纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)的表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽:糖基水解酶GH6組的纖維二糖水解酶或糖基水解酶GH7組的纖維二糖水解酶，或者表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性且與SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2中的任一者具有70%或更多的一致性的多肽，并且/或者其中表現(xiàn)出纖維二糖水解酶活性的多肽通過(guò)缺乏可測(cè)β-葡萄糖苷酶活性的重組酵母或真菌表達(dá)宿主的分泌而產(chǎn)生。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中步驟d)的含有纖維二糖的液相中所含的纖維二糖進(jìn)行進(jìn)一步的步驟e)，其包括:任選地濃縮纖維二糖溶液，并由所述(任選濃縮的)纖維二糖溶液進(jìn)一步純化所述纖維二糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中步驟e)包括以下的一者或多者:纖維二糖結(jié)晶、層析、納濾、微濾、超濾、經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀、或者使用微生物。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中步驟C)和d)重復(fù)多次，其中向后續(xù)循環(huán)中的固相添加新鮮水相。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)連續(xù)地用新鮮水相替換所述含有纖維二糖的液相來(lái)同時(shí)進(jìn)行步驟c)和d)。
13.一種用于由包括纖維二糖和葡萄糖的組合物純化纖維二糖的方法，包括在葡萄糖氧化酶(GOX)和氧的存在下通過(guò)葡萄糖氧化來(lái)轉(zhuǎn)化葡萄糖的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求1 12中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)權(quán)利要求14所述的方法將所述含有纖維二糖的液相中的葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡糖酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中通過(guò)一種或數(shù)種以下方法來(lái)從所述含有纖維二糖的液相中去除通過(guò)權(quán)利要求14所述的方法得到的葡糖酸:離子交換層析、沉淀、電滲析。
16.根據(jù)權(quán)利要求1 5中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其中任何具有β-葡萄糖苷酶活性的多肽的酶活性被抑制劑抑制。
17.—種纖維二糖制劑，其能通過(guò)權(quán)利要求1 16中的一項(xiàng)或多項(xiàng)得到。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的纖維二糖制劑作為食物成分、動(dòng)物飼料添加劑、化妝品成分的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中以0.0l 1% (w/w)的用量向動(dòng)物飼料制劑中添加所述纖維二糖制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中所述纖維二糖制劑與甜味劑比如木糖醇、麥芽糖醇和/或甜葉菊組合添加到糕餅或餅干面團(tuán)配方中，并且其中所述配方中的蔗糖用量降低。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的纖維二糖制劑在治療哺乳動(dòng)物中的炎癥性腸病比如潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn病、膠原性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎和/或Behget綜合征的方法中 的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由甜菜和其它含有纖維素的生物質(zhì)酶法制造纖維二糖的方法。纖維二糖是由經(jīng)β-1,4鍵連接的兩分子葡萄糖組成的二糖。本發(fā)明的方法允許纖維二糖的經(jīng)濟(jì)制造和高產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明的用于制造纖維二糖的方法包括以下步驟使含有纖維素的材料在7.5～50%(w/w)，優(yōu)選10～25%(w/w)，且更優(yōu)選12～20%(w/w)的干物質(zhì)含量下進(jìn)行纖維素酶處理，隨后將含有纖維二糖的液相與固相分離。
文檔編號(hào)C12P19/12GK103080330SQ201180041329
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者A.科爾, T.布呂克, J.格拉赫, M.扎夫熱爾, L.呂歇爾, M.克勞斯 申請(qǐng)人:南方化學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)有限公司