專利名稱：異源蛋白質(zhì)的植物基制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)總體而言涉及異源蛋白質(zhì)的植物基制備，更具體而言，涉及異源蛋白質(zhì)的在植物體中制備。2.相關(guān)技術(shù)的說(shuō)明

諸如乙醇之類的生物燃料是由葡萄糖發(fā)酵得到的，并且生物質(zhì)中的纖維素是這種糖的潛在來(lái)源。然而，需要一組協(xié)同作用的酶來(lái)將纖維素降解為葡萄糖。通常，這些酶是通過(guò)真菌細(xì)胞培養(yǎng)制備的，這種真菌細(xì)胞培養(yǎng)需要高的資金成本以及大量的生物反應(yīng)器。因此，需要更有效的酶制備系統(tǒng)，該系統(tǒng)需要較少的資金成本、消耗較少的能量，并釋放較少的二氧化碳。發(fā)明概述本公開(kāi)的組合物和方法通過(guò)促進(jìn)異源蛋白質(zhì)的高產(chǎn)率、低成本的在植物體中制備(例如纖維素酶)而解決了這種需要。在植物體中制備細(xì)胞壁降解酶可以減輕對(duì)昂貴且能量密集型的制備生物質(zhì)發(fā)酵所用的純化纖維素酶的需要，并由此幫助降低制備成本且改善生物燃料制造方法的能量平衡。具體而言，本公開(kāi)提供了植物病毒基系統(tǒng)，其能夠瞬時(shí)在植物體中表達(dá)異源蛋白質(zhì)，例如纖維素酶。本公開(kāi)進(jìn)一步提供了使用此類植物病毒基表達(dá)系統(tǒng)來(lái)在植物中制備高產(chǎn)率異源蛋白質(zhì)的方法。本公開(kāi)的一個(gè)方面提供了能夠表達(dá)異源蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞，其中所述的植物細(xì)胞包括被多于I種質(zhì)粒編碼的完整的病毒擴(kuò)增子。擴(kuò)增子包括多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段。擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼所關(guān)注的異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增子包括至少2種質(zhì)粒，其中第一質(zhì)粒不同于第二質(zhì)粒。第一質(zhì)粒包括至少一個(gè)含有核酸序列的擴(kuò)增子節(jié)段，其中所述的核酸序列編碼了異源蛋白質(zhì)，并且第二質(zhì)粒包括至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段。在一些實(shí)施方案中，病毒擴(kuò)增子為黃瓜花葉病毒組擴(kuò)增子，并且在具體的實(shí)施方案中，擴(kuò)增子為黃瓜花葉病毒(CMV)擴(kuò)增子。
在一些實(shí)施方案在紅，病毒擴(kuò)增子為通過(guò)2種質(zhì)粒編碼的二份系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一質(zhì)粒包括CMV RNA3擴(kuò)增子節(jié)段，其中RNA3包括編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二質(zhì)粒包括CMV RNAl和RNA2擴(kuò)增子節(jié)段。在一些具體的實(shí)施方案中，第二質(zhì)粒包括啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列響應(yīng)于化學(xué)誘導(dǎo)劑并且可操作地與編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸序列連接。在一些具體的實(shí)施方案中，化學(xué)誘導(dǎo)劑為雌二醇或甲氧蟲(chóng)酰肼。在一些具體的實(shí)施方案中，病毒蛋白質(zhì)為復(fù)制酶或復(fù)制酶亞單元。在一些具體的實(shí)施方案中，第二質(zhì)粒包括卡那霉素選擇標(biāo)志物，并且第一質(zhì)粒不包括卡那霉素選擇標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，病毒擴(kuò)增子為通過(guò)3種質(zhì)粒編碼的三份系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一質(zhì)粒包括CMV RNA3擴(kuò)增子節(jié)段，其中RNA3包括編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二質(zhì)粒包括CMV RNAl擴(kuò)增子節(jié)段，并且第三質(zhì)粒包括CMVRNA2擴(kuò)增子節(jié)段。本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供了能夠表達(dá)異源蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞，其中所述的植物細(xì)胞包括完整的病毒擴(kuò)增子 ，該完整的病毒擴(kuò)增子包括得自多于一個(gè)的病毒亞組的擴(kuò)增子節(jié)段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒擴(kuò)增子為CMV擴(kuò)增子，擴(kuò)增子節(jié)段RNA3得自CMV亞組II的菌株，并且擴(kuò)增子節(jié)段RNAl和RNA2得自CMV亞組I的菌株，例如California亞組I的菌株。在一些實(shí)施方案中，CMV RNA3擴(kuò)增子節(jié)段包括RNA4節(jié)段，該RNA4節(jié)段具有經(jīng)修飾的5’-引導(dǎo)序列，與相應(yīng)的野生型RNA5’-引導(dǎo)序列相比，經(jīng)修飾的5’-引導(dǎo)序列包含更多的限制性酶切位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)為分泌的蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)為GFP或RFP。在其他實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)為能夠修飾、降解或分解植物細(xì)胞壁的酶。在一些具體的實(shí)施方案中，所述的酶在> 30°C的溫度下具有最佳的活性。在一些具體的實(shí)施方案中，所述的酶為纖維素酶。在一些具體的實(shí)施方案中，纖維素酶為內(nèi)切葡聚糖酶、夕卜切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶為得自解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolyticus)的El β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶。在一些實(shí)施方案中，包括編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列的擴(kuò)增子節(jié)段進(jìn)一步包括與編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列可操作地連接的CaM35S啟動(dòng)子。植物細(xì)胞可以形成細(xì)胞培養(yǎng)物、切除的植物組織或完整植物的一部分。在一些實(shí)施方案中，植物細(xì)胞為煙草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，植物細(xì)胞為煙草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，植物細(xì)胞還包括編碼基因沉默抑制子的cDNA。在一些實(shí)施方案中，基因沉默抑制子為RNA-沉默抑制子(RSS)。在一些實(shí)施方案中，RSS為輔助成分蛋白酶HC-Pix)。在一些實(shí)施方案中，基因沉默抑制子得自番茄茂密矮小病毒(TBSV)或煙草蝕刻病毒(TEV)。在一些實(shí)施方案中，與野生型植物細(xì)胞相比，所述的植物細(xì)胞為表達(dá)高水平的基因沉默抑制子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，病毒擴(kuò)增子可以在植物體中復(fù)制并系統(tǒng)性地移動(dòng)。在一些具體的實(shí)施方案中，植物包括包括編碼突變形式的CMV 3a移動(dòng)蛋白的cDNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變形式的CMV3a移動(dòng)蛋白包括C-末端33個(gè)氨基酸的刪除。本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供了通過(guò)以下過(guò)程制備異源蛋白質(zhì)的方法:i)將植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織與細(xì)菌細(xì)胞相接觸，這種細(xì)菌細(xì)胞包括完整的病毒擴(kuò)增子，其中擴(kuò)增子包括多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，并且擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄；ii)在植物細(xì)胞中允許足夠的時(shí)間來(lái)制備異源蛋白質(zhì)；以及iii)收獲至少0.5毫克異源蛋白質(zhì)/千克鮮重的植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織。在一些實(shí)施方案中，至少0.5毫克為至少
1.0毫克。在一些實(shí)施方案中，至少1.0毫克為至少1.5毫克。在一些實(shí)施方案中，至少1.5毫克為至少2.0毫克。在一些實(shí)施方案中，至少2.0毫克為至少3.0毫克。在一些實(shí)施方案中，至少3.0毫克為至少4.0毫克。本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供了通過(guò)以下過(guò)程制備異源蛋白質(zhì)的方法:i)將植物細(xì)胞與至少一種植物激素相接觸；ii)將植物細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞相接觸，該細(xì)菌細(xì)胞包括完整的病毒擴(kuò)增子，其中擴(kuò)增子包括多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，并且該擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄；iii)在植物細(xì)胞中允許足夠的時(shí)間來(lái)制備異源蛋白質(zhì)；以及iv)收獲由植物細(xì)胞制備的異源蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，至少一種植物激素為至少兩種植物激素。在一些實(shí)施方案中，至少一種植物激素選自茉莉酸、赤霉素A3、吲哚乙酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、激動(dòng)素和水楊酸。本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供了通過(guò)以下過(guò)程制備異源蛋白質(zhì)的方法:i)以機(jī)械方式創(chuàng)傷植物或切除的植物組織；ii)將植物或切除的植物組織與細(xì)菌細(xì)胞相接觸，該細(xì)菌細(xì)胞包括完整的病毒擴(kuò)增子，其中擴(kuò)增子包括多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，其中該擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄；iii`)在植物細(xì)胞中允許足夠的時(shí)間來(lái)制備異源蛋白質(zhì)；以及iv)收獲由植物細(xì)胞制備的異源蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，植物或切除的植物組織通過(guò)使用刷子壓制植物或切除的植物組織而以機(jī)械方式受到創(chuàng)傷。本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供了通過(guò)以下過(guò)程制備異源蛋白質(zhì)的方法:i)在第一溫度下將植物細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞相接觸，其中細(xì)菌細(xì)胞包括完整的病毒擴(kuò)增子，并且該擴(kuò)增子包括多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段并且能夠擴(kuò)增編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄；ii)在第二溫度下將植物細(xì)胞溫育足夠的時(shí)間，從而在植物細(xì)胞中制備異源蛋白質(zhì)；以及iii)收獲由植物細(xì)胞制備的異源蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，第一溫度為20°C，并且第二溫度為26°C或30°C。在一些實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織中瞬時(shí)制備。在一些實(shí)施方案中，接觸植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織是通過(guò)加壓過(guò)濾或真空過(guò)濾實(shí)施的。在一些實(shí)施方案中，4天為在植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織中制備異源蛋白質(zhì)的足夠的時(shí)間。在其他實(shí)施方案中，6天為足夠的時(shí)間。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二細(xì)菌細(xì)胞為根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述的方法包括將細(xì)菌細(xì)胞與化學(xué)誘導(dǎo)劑相接觸的額外步驟。在一些實(shí)施方案中，所述的方法包括將植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織與第二種細(xì)菌細(xì)胞相接觸的額外步驟，其中所述的細(xì)菌細(xì)胞包括編碼基因沉默抑制子或病毒外殼蛋白質(zhì)的重組核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述的方法包括原位活化異源蛋白質(zhì)的額外步驟，其中蛋白質(zhì)的活化使得植物細(xì)胞壁被降解。在一些實(shí)施方案中，所述的方法包括通過(guò)離質(zhì)體洗滌來(lái)除去植物或切除的植物組織離質(zhì)體的可溶性成分的額外步驟。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描繪了通過(guò)DNA 2.0，Inc合成的基因的示意圖。RAMY 3D SP編碼了得自大米α淀粉酶的信號(hào)肽。El為得自解纖維熱酸菌的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶El。El_cd編碼了 El催化結(jié)構(gòu)域。El-1ink編碼了 El連接體結(jié)構(gòu)域。El_cbd編碼了 El纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PFT-6His編碼了肽融合標(biāo)記，6個(gè)聚組氨酸標(biāo)簽。終止密碼子和限制性酶切位點(diǎn)(Xhol，PstI, HindIII和SpeI)已經(jīng)加入到側(cè)翼區(qū)域。圖2描繪了得自β -1,4-內(nèi)切葡聚糖酶翻譯產(chǎn)物的所預(yù)計(jì)的氨基酸序列。圖3描繪了 pDP0701載體的圖譜。圖4描繪了 pDP07.0202a 二元載體的圖譜。圖5描繪了在得自煙草植物(煙草本塞姆氏)的各種組織樣品中制備的內(nèi)切葡聚糖酶的量。對(duì)照#1和#2為使用緩沖液但不含細(xì)菌滲透的兩種不同的煙草植物。試驗(yàn)#1和#2為使用懸浮在緩沖液中的土壤桿菌滲透的兩種不同的煙草植物。檢測(cè)同一葉片的不同區(qū)域之間和試驗(yàn)植物#1的葉片之間的變化性。檢測(cè)試驗(yàn)植物#1和#2之間的植物與植物的變化性。圖6描繪了在煙草植物中內(nèi)切葡聚糖酶的瞬時(shí)表達(dá)。在一定時(shí)間內(nèi)，監(jiān)測(cè)在滲透的完整植物以及儲(chǔ)存在不同環(huán)境下的所收獲的葉片中的內(nèi)切葡聚糖酶的量。熱是指最大溫度> 30°C。冷是指最大溫度< 30°C。光是指16/8h的光/暗循環(huán)。暗是指24h黑暗。

圖7描繪了得自的內(nèi)切葡聚糖酶的經(jīng)修飾的基因。得自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子有助于構(gòu)成性轉(zhuǎn)錄。圖8描繪了將其Ti質(zhì)粒的特定節(jié)段轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中的土壤桿菌屬。圖9描繪了水解纖維素鏈中的β -1，4_糖苷鍵(箭頭)的內(nèi)切葡聚糖酶。圖10描繪了內(nèi)切葡聚糖酶活性的最佳條件。圖11描繪了真空滲透如何將土壤桿菌和植物細(xì)胞結(jié)合在一起。將葉片組織浸潰在土壤桿菌的懸浮液中，并將真空推入到室中。氣泡由葉組織中出現(xiàn)，并升至表面。釋放真空，并且包含土壤桿菌的液體淹沒(méi)了組織，從而使細(xì)菌與植物細(xì)胞直接接觸。圖12描繪了用于滲透完整植物(左側(cè))或者分離的葉片(右側(cè))的實(shí)驗(yàn)室-級(jí)
的真空室。圖13描繪了在使用土壤桿菌滲透之后分離葉片的第4天(左側(cè))、第6天(中間)和第9天(右側(cè))。圖14描繪了包括RNAl、RNA2、RNA3和RNA4的CMV va表達(dá)系統(tǒng)。圖15A和15B描繪了兩份可誘導(dǎo)系統(tǒng)載體:(A)pDUR2XLRl和(B)pB301_RNA3的載體圖譜。圖16A、16B 和 16C 描繪了三份復(fù)制系統(tǒng)載體:(A) pCB301_RNAl、(B) pCB301-RNA2和(C)pCB301-RNA3的載體圖譜。圖17描繪了經(jīng)修飾的RNA4前導(dǎo)序列。使用經(jīng)修飾的RNA4前導(dǎo)序列來(lái)增強(qiáng)CMV外殼蛋白質(zhì)和其他插入序列(GFP，內(nèi)切葡聚糖酶)的表達(dá)。圖18A、18B和18C描繪了在用于三份復(fù)制的植物中的癥狀。(A)描繪了煙草本塞姆氏；(B)描繪了小糖南瓜；和(C)描繪了美洲南瓜小果。圖19描繪了解纖維熱酸菌內(nèi)切葡聚糖酶(El)的特征。
圖20描繪了使用缺乏基因沉默抑制子的二份和三份載體系統(tǒng)的內(nèi)切葡聚糖酶(El)表達(dá)對(duì)照(RT-PCR)。示出了用于酶活性測(cè)試的結(jié)果(以mg/kg計(jì))。W是指野生型，2、6和8是指特定的前導(dǎo)序列。結(jié)果是使用非轉(zhuǎn)基因煙草本塞姆氏植物但使用非共表達(dá)的沉默抑制子蛋白質(zhì)而獲得的。圖21描繪了使用RT-PCR，在HcPro-煙草本塞姆氏中使用二份和三份載體系統(tǒng)的內(nèi)切葡聚糖酶(El)的表達(dá)。結(jié)果是使用通過(guò)轉(zhuǎn)基因煙草本塞姆氏植物表達(dá)的HC-Pix)沉默抑制子而獲得的。圖22描繪了改善El表達(dá)的其他方法。圖23以概略的方式描繪了在具有反式CP或RNA4的滲透和上部葉中三份復(fù)制El表達(dá)。圖24描繪了經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列(A)以及它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)(B)。(A)與野生型RNA4前導(dǎo)序列相比，經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列包含額外的序列，該序列包括額外的限制性酶切位點(diǎn)。(B)示出了野生型和經(jīng)修飾的RNA4構(gòu)建體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。共有的結(jié)構(gòu)莖和環(huán)元件被突出。圖25描繪了用于復(fù)制三份擴(kuò)增子的結(jié)果，其影響了糖南瓜、南瓜小果和煙草本塞姆氏植物。植物受到系統(tǒng)性的影響，并在滲透之后的2周時(shí)，在上方系統(tǒng)葉片中，顯示出退氯斑癥狀。圖26描繪了 El催化的反應(yīng)。底物MUC被切割成纖維二糖和熒光團(tuán)MU，可以監(jiān)測(cè)一定時(shí)間內(nèi)它們的濃度。當(dāng)在65°C和135μΜ MUC下運(yùn)行時(shí)，該反應(yīng)用作用于植物提取物和酵母培養(yǎng)物的El活性測(cè)定。圖27描繪了在不同的反應(yīng)溫度(50，65，80和93 °C )下用于El活性的Lineweaver-Burke圖。活性的單位(V)為μ M MU/min,并且底物濃度的單位為μ M MUC0圖28描繪了針對(duì)底物濃度繪制的活性數(shù)據(jù)。線條表示具有根據(jù)試驗(yàn)衍生的參數(shù)的 Michaelis-Menten 等式。圖29描繪了 JA(茉莉酸)對(duì)El表達(dá)的影響。如圖所示，與不具有JA的對(duì)照葉片相比，在滲透溶液中加入250 μ M JA在第6天會(huì)將El的表達(dá)水平增大3.5倍。圖30描繪了 2種不同植物激素的組合的影響，所述的植物激素包括茉莉酸(JA)、赤霉素A3 (GA)、吲哚乙酸(IAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)、激動(dòng)素(CK)和水楊酸(SA)。圖31描繪了在葉片溫育過(guò)程中不同溫度概況的影響。在滲透之后，在不同的天數(shù)，將葉片溫育的溫度由20°C變?yōu)?0°C，并保持2天。與對(duì)照相比，溫度4或溫度5概況得到了最高的表達(dá)情況。在溫育的后期階段增加溫育的溫度會(huì)增加El的制備。圖32描繪了葉片溫育溫度的兩相最優(yōu)組合。每個(gè)柱都表達(dá)單獨(dú)的葉片。溫育溫度在第2天由20°C升至26°C，并在26°C下保持接下來(lái)的4天。圖33描繪了機(jī)械創(chuàng)傷處理對(duì)向日葵葉片的效力。使用刷子對(duì)植物葉片多次壓制，然后經(jīng)過(guò)真空滲透。示出了在具有創(chuàng)傷處理和不具有創(chuàng)傷處理之間的直接比較。圖34描繪了在由3種無(wú)關(guān)的煙草本塞姆氏葉片(經(jīng)滲透從而瞬時(shí)表達(dá)El)得到的勻化產(chǎn)物提取物(HE ;藍(lán)柱)和離質(zhì)體洗液(AWF ;紫柱)中A)純度、B)濃度和C)產(chǎn)率的值的比較。各值僅用于第一次得到的AWF。圖下方的表表示AWF的值除以HE的值的比值。圖35描繪了 通過(guò)離質(zhì)體洗滌5種不同蛋白質(zhì)而得到的重組蛋白質(zhì)回收物與通過(guò)勻化產(chǎn)物提取所獲得物質(zhì)的效力的比較。如在美國(guó)專利N0.7034128中所報(bào)道的那樣，在煙草(N.tabacum)中生長(zhǎng)的且大規(guī)?；厥盏?種重組蛋白質(zhì)的Large Scale Biology Corp.(LSB)結(jié)果顯示與作為獨(dú)立的試驗(yàn)系列的一部分所得到的小試規(guī)模的結(jié)果相近。在該系列中，每個(gè)樣品5次收集離質(zhì)體洗液(AWF)，這與LSB數(shù)據(jù)的僅收集I次相反，并將數(shù)據(jù)取平均值或者總計(jì)在一起。由獨(dú)立的試驗(yàn)系列所提供的數(shù)據(jù)是所得到的最好結(jié)果的代表。圖36描繪了在經(jīng)歷5次連續(xù)的離質(zhì)體洗滌從而除去分泌的El之后瞬時(shí)表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶El的煙草本塞姆氏葉片。由于AWF體積不夠，所以不能對(duì)第二次獲得的AWF進(jìn)行活性測(cè)試。圖37描繪了在每mg總可溶性蛋白質(zhì)(TSP)的離質(zhì)體洗液(AWF)和勻化產(chǎn)物提取物(HE)中，El和MDH活性的相關(guān)級(jí)份。將各級(jí)份的最高活性任意地設(shè)定為100%以用于各次比較。使用PH5.5的El收獲緩沖液(0.1M NaCl，0.05M乙酸，0.1 % Tween 80或0.01%Silwet L77)作為滲透緩沖液從而回收離質(zhì)體洗液，或者用于獲得勻化產(chǎn)物提取物。測(cè)定各樣品中El以及蘋(píng)果酸酶(MDH)(細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物)的活性。各樣品為合并的AWF，其是通過(guò)由同一葉片上切除的4塊葉盤離心而收集得到的。圖38描繪了通過(guò)勻化作用和離子體洗液回收而回收的El內(nèi)切葡聚糖酶的比較。發(fā)明詳述以下說(shuō)明列出了多個(gè)示例性的構(gòu)造、參數(shù)等。但是，應(yīng)該意識(shí)到此類說(shuō)明無(wú)意于限定本發(fā)明的范圍，而是作為示例性實(shí)施方案的說(shuō)明而提供的。1.異源蛋白質(zhì)的選擇解纖維熱酸菌為生活在高溫、酸性環(huán)境(例如黃石國(guó)家公園的熱泉)下的嗜熱細(xì)菌。由嗜熱有機(jī)體得到的酶通常在>30°C的溫度下具有最佳活性。由這種有機(jī)體選擇β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶El作為異源蛋白質(zhì)的優(yōu)選實(shí)施方案，因?yàn)樗龅拿杆饫w維素的能力在環(huán)境溫度下被抑制，這樣該基因的在植物體中表達(dá)不會(huì)改變植物的顯型。所述的酶在高溫及低PH下活性最強(qiáng)。El內(nèi)切葡聚糖酶在大約80°C和pH5.5下具有最佳的活性，其中所述的PH為植物細(xì)胞離質(zhì)體的大致pH。El的序列得自NIH Entrez跨數(shù)據(jù)庫(kù)檢索(編號(hào)P54583)。成熟蛋白質(zhì)(不具有天然分泌信號(hào)肽)由521個(gè)氨基酸構(gòu)成，其估測(cè)分子量為56477Da。所述的蛋白質(zhì)由催化結(jié)構(gòu)域(El_cd， 40.3kDa)和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(El-cbd, 10.8kDa)構(gòu)成,它們通過(guò)連接體區(qū)域連接(El-link, 5.4kDa)。41個(gè)氨基酸的信號(hào)肽被得自水稻α-淀粉酶(Ramy3D SP)的25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽替代，從而有利于蛋白質(zhì)由植物細(xì)胞分泌到離質(zhì)體中。2.密碼子優(yōu)化，基因合成使用得自KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的針對(duì)所述這種植物的密碼子使用表來(lái)對(duì)纖維熱酸菌β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶El的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以用于在煙草本塞姆氏中表達(dá)。將聚組氨酸標(biāo)簽加入到蛋白質(zhì)的C-末端，從而允許通過(guò)金屬親和層析而快速純化。加入合適的限制性酶切位點(diǎn)，從而允許插入我們其他的表達(dá)盒。整體1566bp DNA片段是通過(guò)外部公司(DNA 2.0, Inc.，Menlo Park, CA)化學(xué)合成的(圖1)。3.克隆到二元表達(dá)載體中編碼了得自解纖維熱酸菌的β- 1，4_內(nèi)切葡聚糖酶El的化學(xué)合成El基因由DNA
2.0在載體pj 210:11772中提供。圖2所示的552aa蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域包含與N-末端融合的25aa Ramy3D信號(hào)肽以及在C-末端的6aa組氨酸標(biāo)簽。
4.克隆到35S表達(dá)載體中(用于構(gòu)成性表達(dá))使用限制性內(nèi)切核酸酶XhoI和HindIII分別在位置1198和2872處消化包含El的載體PJ 210:11772，從而產(chǎn)生1674bp片段，該片段被定向克隆到穿梭載體pDEO0.0113中，由此建立質(zhì)粒PDP0701。在35S啟動(dòng)子的下游且在ocs3’調(diào)節(jié)序列的上游克隆El編碼區(qū)域，從而建立E135S表 達(dá)盒。pDP0701(圖3)中的El表達(dá)盒通過(guò)使用內(nèi)切核酸酶AscI消化而被切除，并插入到二元載體PDU97.1005中，從而建立載體消化的pDP07.0202a (圖4)。5.包含35S表達(dá)盒的重組土壤桿菌屬菌株的建立將二元質(zhì)粒pDP07.0202a電穿孔進(jìn)入到以下兩種土壤桿菌屬菌株(EHA105pCH32和C58C1)中，從而得到可以在植物系統(tǒng)中用于瞬時(shí)表達(dá)El蛋白質(zhì)的兩種重組根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)菌株。 6.在煙草本塞姆氏中使用瞬時(shí)農(nóng)桿菌真空滲透法來(lái)制備重組纖維素酶在瞬時(shí)表達(dá)研究中，使用了具有構(gòu)成性CaMV35S啟動(dòng)子的重組EHA105pCH32 土壤桿囷I的囷株。在該表達(dá)系統(tǒng)中，在強(qiáng)35S構(gòu)成性啟動(dòng)子的控制下制備El轉(zhuǎn)錄物。將所述的細(xì)菌菌株在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，并用于感染4周大的煙草(煙草本塞姆氏)植物。感染可以在基因沉默抑制子的存在或缺乏下發(fā)生。將4周大的煙草本塞姆氏植物的葉片進(jìn)行真空滲透。4周后，收獲植物組織，勻化，提取并進(jìn)行酶活性的測(cè)試。結(jié)果概括于圖5中。4天后表達(dá)的酶的最少量為大約Img纖維素酶/kg植物細(xì)胞鮮重。在pH5.5及65°C下，與圖5中所示的酶量相應(yīng)的活性為40000至52000nmolMU/min/kg植物組織鮮重。本試驗(yàn)證實(shí)了一個(gè)原理的證明，S卩，根癌土壤桿菌可以用于瞬時(shí)(且快速)在植物組織內(nèi)制備功能性內(nèi)切葡聚糖酶。在不同的組織以及不同的植物之間觀察變化性，但是通常產(chǎn)率為Img酶/kg植物鮮重。使用這種方法，在使用這種用于制備不同蛋白質(zhì)(人AAT)的構(gòu)成性啟動(dòng)子的情況下觀察到相似的結(jié)果(Sudarshana et al.Plant Biotech J.4:551-559 (2006))。但是，當(dāng)使用病毒擴(kuò)增的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)AAT時(shí)，產(chǎn)率增大70倍，這樣可預(yù)計(jì)的是當(dāng)使用病毒擴(kuò)增子表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，可以觀察到制備率制備率大幅改善。此外，活性測(cè)試用于顯示根癌土壤桿菌本身不會(huì)制備所述的酶，植物組織可以。此外，證明在C-末端的組氨酸標(biāo)簽的rEl不會(huì)消除活性。因此，本文所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案為通過(guò)瞬時(shí)農(nóng)桿菌真空滲透法到植物組織中來(lái)功能性地制備rEl。此外，證明可以在切除的植物組織(例如收獲的煙草本塞姆氏葉片)中以甚至稍微高的表達(dá)水平來(lái)制備功能性重組El (圖6)。在這些瞬時(shí)表達(dá)的研究中，EHA 105pCH32 土壤桿菌I菌株與構(gòu)成性CaMV 35S啟動(dòng)子一起使用。在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)這些細(xì)菌菌株，并用于感染4周大的煙草(煙草本塞姆氏)植物。對(duì)4周大的煙草本塞姆氏植物的葉片進(jìn)行真空滲透。4天后，收獲植物組織，勻化，提取并測(cè)試酶活性。將經(jīng)滲透的植物和葉片儲(chǔ)存在各種條件下，以確定它們對(duì)酶產(chǎn)率的影響。將完整的植物儲(chǔ)存在熱的溫室(每日高溫> 30°C，每日14小時(shí)光照)。為了保持收獲的葉片存活，將它們儲(chǔ)存在恒溫22°C的潮濕的容器中，并防止光照。為了對(duì)植物和葉片之間進(jìn)行有效的比較，在 25°C下，在每日光照16小時(shí)的條件下，將一些植物和葉片在室內(nèi)彼此相鄰儲(chǔ)存。將葉片儲(chǔ)存在具有透明覆蓋物的潮濕的容器中，從而允許照明。在4天和6天溫育之后，測(cè)試完整植物和收獲葉片的酶活性。在6天后所表達(dá)的平均酶量為大約2.6mg纖維素酶/kg植物細(xì)胞鮮重。根據(jù)所報(bào)道的天然El的特異活性，將活性測(cè)試轉(zhuǎn)化為表達(dá)水平(mg El/kg植物組織鮮重)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，纖維素酶的在植物體中活化允許在葉片組織內(nèi)原位降解纖維素。在具體的實(shí)施方案中，纖維素的活化可以包括將溫度升高至30°C以上。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，纖維素酶的活化可以包括將溫度升高至纖維素酶具有最佳酶活性的大致溫度。盡管這種El實(shí)施方案涉及在使用構(gòu)成性表達(dá)系統(tǒng)(CaMV 35S啟動(dòng)子)的煙草本塞姆氏中，rEl的瞬時(shí)農(nóng)桿菌真空滲透法的具體實(shí)例，但是所述的方法可以用于制備任何異源蛋白質(zhì)。通常，本公開(kāi)的異源蛋白質(zhì)可以包括非酶類的蛋白質(zhì)，例如綠色或紅色熒光蛋白質(zhì)GFP或RFP ;或者病毒外殼蛋白質(zhì)，例如CMV外殼蛋白質(zhì)(CP)。備選地，異源蛋白質(zhì)可以包括酶，例如能夠修飾、降解或分解植物細(xì)胞壁的酶。例如，酶可以包括纖維素降解酶，包括但不限于其他內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶和木聚糖酶。此外，多種酶可以在使用共滲透的同一宿主植物中表達(dá)，不同的宿主植物可以用于蛋白質(zhì)的制備，并且可以使用不同的啟動(dòng)子、質(zhì)粒和表達(dá)系統(tǒng)。異源蛋白質(zhì)可以選自多種有機(jī)體，包括但不限于解纖維熱酸菌。通常，編碼本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)的核酸序列可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化。短語(yǔ)“密碼子優(yōu)化”是指適于在結(jié)構(gòu)基因或其片段中使用的DNA核苷酸的選擇，其中所述的結(jié)構(gòu)基因或其片段接近于所關(guān)注的植物中的密碼子使用情況。因此，優(yōu)化的基因或核酸序列是指這樣的基因，其中天然的或天然形成的基因的核苷酸序列已經(jīng)被修飾，以便在植物中使用統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)選的或統(tǒng)計(jì)學(xué)有利的密碼子。通常在DNA水平下檢測(cè)核苷酸序列，并使用任何合適的方法(例如在 Sardana et al 中所述,Plant Cell Reports 15,677-81 (1996))測(cè)定為了在植物物種中進(jìn)行表達(dá)而優(yōu)化的編碼區(qū)域。7.用于制備異源蛋白質(zhì)的病毒擴(kuò)增子基表達(dá)系統(tǒng)就本公開(kāi)的目的而言，術(shù)語(yǔ)“病毒擴(kuò)增子”用于描述在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增核酸序列的轉(zhuǎn)錄所需的最少的非宿主細(xì)胞的基因材料，其中所述的核酸序列編碼了異源蛋白質(zhì)，并啟動(dòng)其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。病毒擴(kuò)增子可以由多個(gè)節(jié)段構(gòu)成，例如染色體的黃瓜花葉病毒組RNA節(jié)段RNAl、RNA2或RNA3?？梢栽趩我毁|(zhì)?；蚨噘|(zhì)粒(例如2種或種3質(zhì)粒)上編碼病毒擴(kuò)增子。在任何給定的病毒擴(kuò)增子中，可以選擇單個(gè)的擴(kuò)增子節(jié)段，并與不同的病毒家族或亞組再結(jié)合，例如黃瓜花葉病毒(CMV)的亞組I和II?？梢杂扇魏沃参锊《具x擇病毒擴(kuò)增子，包括植物病毒的雀麥花葉病毒科及其6個(gè)屬:苜猜花葉病毒屬，例如紫花苜猜鑲嵌病毒(Alfalfa Mosaic Virus) ;Anulavirus,例如天竺葵曲葉病毒(Pelargonium Zonate Spot Virus) ;Bromovirus,例如花葉病毒(BromeMosaic Virus);黃瓜病毒，例如黃瓜花葉病毒；Ilarvirus,例如煙草條紋病毒(TobaccoStreak Virus);以及油橄欖潛隱病毒,例如橄欖潛隱病毒(Olive Latent Virus) 2。
包含得自一個(gè)CMV亞組的擴(kuò)增子節(jié)段的重組CMV擴(kuò)增子用于增加CMV外殼蛋白質(zhì)和異源基因(蛋白質(zhì))在CMV病毒擴(kuò)增子(CMVva)系統(tǒng)中表達(dá)(圖14)。通過(guò)使用用于CMV分離物Q的特定CMV基因組節(jié)段來(lái)研發(fā)原始的CMVva系統(tǒng)，其中所述的CMV分離物Q命名為分類學(xué)CMV亞組II。CMV的文獻(xiàn)顯示CMV亞組I分離物更普通，并且在植物中通常更具有攻擊性，表明它們復(fù)制達(dá)到較高的水平。由于CMV具有3個(gè)染色體節(jié)段(RNA1、RNA2和RNA3)，并且由于這些節(jié)段在某些情況下可以混合從而建立新的重配株CMV毒株，所以CaliforniaCMV亞組I毒株用于建立與所有3個(gè)染色體節(jié)段相應(yīng)的完整的cDNA。因此，通過(guò)將CMV亞組I擴(kuò)增子節(jié)段RNAl和RNA2與CMV亞組II擴(kuò)增子節(jié)段RNA3混合在一起來(lái)建立重組病毒擴(kuò)增子。節(jié)段RNAl和RNA2編碼了復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)和宿主防御蛋白質(zhì)2b (沉默抑制子)。擴(kuò)增子節(jié)段RNA3編碼了 3a移動(dòng)蛋白和衣殼蛋白。但是，亞組II RNA3節(jié)段經(jīng)修飾用于異源基因(蛋白質(zhì))的插入和表達(dá)。當(dāng)重組CMV擴(kuò)增子在煙草本塞姆氏植物中用于農(nóng)桿菌真空滲透法和蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)，迄今為止重組CMV擴(kuò)增子得到了更高水平的3種蛋白質(zhì)。它們?yōu)镃MV外殼蛋白質(zhì)、GFP和內(nèi)切葡聚糖酶El (內(nèi)切葡聚糖酶El通過(guò)免疫印跡分析來(lái)評(píng)估并就酶活性進(jìn)行評(píng)估)。特別就本文所述的編碼CMV的質(zhì)粒和RNA而言，在PCT公開(kāi)W02008/036424 (2008年3月27日公開(kāi))中描述了使用單份表達(dá)系統(tǒng)(基于編碼CMV擴(kuò)增子的單一質(zhì)粒)的早先的著作，所述的文獻(xiàn)以引用方式并入本文。備選地，可以使用二份或三份表達(dá)系統(tǒng)來(lái)編碼病毒擴(kuò)增子，例如CMV擴(kuò)增子。在二份系統(tǒng)中，在2種不同的質(zhì)粒上編碼了擴(kuò)增子節(jié)段，例如CMVRNA1、RNA2和RNA3，在三份系統(tǒng)中，在3種不同的質(zhì)粒上編碼了所述的階段(圖15和16)。在單、二或三份表達(dá)系統(tǒng)中的擴(kuò)增子節(jié)段可以被修飾。例如，擴(kuò)增子節(jié)段可以包括響應(yīng)于化學(xué)誘導(dǎo)劑的啟動(dòng)子序列，其中所述的化學(xué)誘導(dǎo)劑例如為雌二醇或甲氧蟲(chóng)酰肼。諸如CMV RNA3片段RNA4之類的擴(kuò)增子節(jié)段在它們與野生型序列相關(guān)的前導(dǎo)序列中可以進(jìn)一步包括額外的限制性酶切位點(diǎn)(圖17和35)。諸如CMV RNA3之類的擴(kuò)增子節(jié)段可以通過(guò)使用包含異源蛋白質(zhì)的核酸序列替代編碼病毒蛋白質(zhì)(例如CMV外殼蛋白質(zhì))的核酸序列而進(jìn)一步被修飾。此外，病毒擴(kuò)增子序列可以編碼病毒蛋白質(zhì)突變體，例如移動(dòng)蛋白(MP)的突變體。具體而言，CMV3a移動(dòng)蛋白的刪除33個(gè)氨基酸的突變體用于幫助擴(kuò)增子復(fù)制和病毒擴(kuò)增子在煙草本塞姆氏植物中的系統(tǒng)性細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)，并使蛋白質(zhì)表達(dá)的產(chǎn)率增加(圖22)。使用病毒擴(kuò)增子基表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備異源蛋白質(zhì)的方法總體而言，使用 病毒擴(kuò)增子基表達(dá)系統(tǒng)使異源蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中表達(dá)包括以下步驟:i)使植物細(xì)胞與包含人工病毒擴(kuò)增子的細(xì)菌細(xì)胞(例如根癌土壤桿菌)相接觸；ii)允許足夠的時(shí)間(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14天)來(lái)在植物細(xì)胞中制備異源蛋白質(zhì)；以及iii)收獲所述的蛋白質(zhì)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)桿菌真空滲透法方案(例如加壓滲透或真空滲透)，可以將植物細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞相接觸。植物細(xì)胞可以選自植物，包括煙草(例如煙草本塞姆氏)、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果。所述的植物細(xì)胞可以為得自部分植物細(xì)胞培養(yǎng)物的分離的細(xì)胞，或者它們可以形成完整植物的一部分或者切除的植物組織，例如植物葉片。本公開(kāi)描述了使用病毒擴(kuò)增子基表達(dá)系統(tǒng)來(lái)增加異源蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法。這些方法可以包括抑制異源基因沉默，有利于擴(kuò)增子復(fù)制和細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)，植物組織的機(jī)械創(chuàng)傷，植物激素處理，以及葉片溫育溫度的優(yōu)化(圖20-22、25和29-37)。例如，解纖維熱酸菌內(nèi)切葡聚糖酶El與基因沉默抑制子HC-Pix)共表達(dá)顯示出會(huì)顯著促進(jìn)El在煙草本塞姆氏細(xì)胞中的表達(dá)(圖23和24)。為了進(jìn)行細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)以及系統(tǒng)性的蛋白質(zhì)的表達(dá)，CMV需要MP (3a移動(dòng)蛋白)和CP (衣殼蛋白)，這二者均由RNA3編碼。當(dāng)MP缺乏C-末端的33個(gè)氨基酸時(shí)，CMV感染甚至可以在不具有CP的情況下在植物中進(jìn)行細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)。因此，異源蛋白質(zhì)與病毒外殼蛋白質(zhì)或移動(dòng)蛋白刪除突變體共表達(dá)可以通過(guò)有利于擴(kuò)增子的復(fù)制、細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)、以及異源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)性表達(dá)來(lái)促進(jìn)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖22)。通常，諸如HC-PioXP或MP突變體之類的蛋白質(zhì)與異源蛋白質(zhì)共表達(dá)可以通過(guò)使用包含質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞對(duì)制備異源蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞進(jìn)行農(nóng)桿菌真空滲透法而取得，其中所述的質(zhì)粒編碼HC-Pio、CP或MP突變體蛋白質(zhì)。備選地，制備異源蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞可以為構(gòu)成性表達(dá)HC-Pio、CP或MP的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。通過(guò)使用刷子在農(nóng)桿菌真空滲透法之前即刻重復(fù)地壓制所述的組織來(lái)以機(jī)械方式創(chuàng)傷煙草本塞姆氏組織顯示出內(nèi)切葡聚糖酶El的表達(dá)增加的結(jié)果(圖29)。其他試驗(yàn)顯示使用植物激素在農(nóng)桿菌真空滲透法之前即刻處理植物或切除的植物組織會(huì)增加El的表達(dá)(圖30)。諸如茉莉酸(JA)、赤霉素A3 (GA)、吲哚乙酸(IAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激動(dòng)素(CK)和水楊酸(SA)之類的植物激素可以單獨(dú)施加，或者至少兩種植物激素結(jié)合施加(圖30-35)。優(yōu)化葉片溫育溫度顯示出El內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)增加的結(jié)果(圖31-32)?？梢詫赜龝r(shí)期分為土壤桿菌屬感染階段和蛋白質(zhì)制備階段，并且可以對(duì)這兩個(gè)階段分別優(yōu)化溫育溫度。土壤桿菌屬感染階段可以為在將土壤桿菌屬與葉片相接觸之后的1、2、3、4或5天的時(shí)期。在土壤桿菌屬感染階段的溫育溫度可以為15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25°C。蛋白質(zhì)制備階段可以為在土壤桿菌屬感染階段之后的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13天的時(shí)期。蛋白質(zhì)制備溫度可以為26，27，28，29，30，31，32，33，34或35°C。通常，本文所述的CMV擴(kuò)增子基表達(dá)系統(tǒng)顯示出蛋白質(zhì)產(chǎn)率為大約0.5，1.0, 1.5，
2.0，2.5，3.0，3.5 和 4.0mg El/kg 植物組織鮮重(圖 20-21 和 34-35)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大約”是指所述值在可接受范圍內(nèi)的近似值。優(yōu)選的是，所述的范圍為所述值+/-10%。圖14-39公開(kāi)了多種病毒擴(kuò)增子系統(tǒng)、RNA種類和上文所述的結(jié)果。示出El構(gòu)建體的結(jié)果的圖顯示包含未經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列的El構(gòu)建體與高的表達(dá)水平一致，特別是在三份復(fù)制系統(tǒng)中。該結(jié)果可 能是由于CMV優(yōu)選被復(fù)制酶絡(luò)合物識(shí)別的其本身的野生型RNA3。此外，包含亞組I復(fù)制酶絡(luò)合物的重組的CMV擴(kuò)增子得到了比亞組II復(fù)制酶絡(luò)合物更好的El的表達(dá)。
實(shí)施例下文所述的實(shí)施例使用了以下材料和方法:材料和方法植物和照片:煙草(煙草本塞姆氏)種子在堆肥中發(fā)芽并在溫室中生長(zhǎng)。在試驗(yàn)中使用3周大的植物。使用裝配有Tiffen Deep Yellow 15濾光鏡的Cannon G6數(shù)碼相機(jī)對(duì)植物進(jìn)行拍照。使用手持式長(zhǎng)波UV燈來(lái)照明植物。植物的感染:對(duì)9天大的南瓜小果(Cucurbita pepo L.cv.Green Bush)、小糖南瓜和煙草本塞姆氏的完全發(fā)育的子葉進(jìn)行測(cè)試，觀察其是否可以系統(tǒng)性地移動(dòng)。首先，使用研杵在50mM NaH2PO4(pH 7.0)中研磨感染的煙草本塞姆氏葉片，并通過(guò)使用金剛砂粉末(Carborandum grit 300,BDH,UK)作為研磨料溫和地摩擦子葉的上表面而對(duì)植物進(jìn)行機(jī)械接種。農(nóng)桿菌真空滲透法:使用電穿孔儀(BIO-RAD)將由E.coli培養(yǎng)物純化得到的二元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌菌株GV3101和EHA105中。當(dāng)使用GV3101時(shí)，將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞平板接種到包含正大霉素(25^/πι1)、卡那霉素(SOyg/ml)和利福平(lOyg/ml)的Luria-Bertani平板中，或者當(dāng)使用EHA105時(shí)，將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞平板接種到包含利福平(10 μ g/ml),正大霉素(20yg/ml)和四環(huán)素(10yg/ml)的Luria-Bertani平板中。就農(nóng)桿菌真空滲透法而言，將單個(gè)菌落接種與5ml L-MESA 10培養(yǎng)基(100ml LB培養(yǎng)液，2ml0.5MMES (pH5.7), 20 μ I 0.1M乙酰丁香酮)中，并生長(zhǎng)至0D600為大約L O。通過(guò)在3500xg下離心10分鐘來(lái)收獲細(xì)胞，并再次懸浮于農(nóng)桿菌注射培養(yǎng)基(50ml無(wú)菌dH20，0.5mllM MgCl2,Iml IM MES (pH5.7)，50 μ I 0.1M乙酰丁香酮)中，將所得物在室溫下平衡，以用于超過(guò)3hr的預(yù)滲透。當(dāng)混合的土壤桿菌培養(yǎng)物滲透到植物中時(shí)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中單獨(dú)制備細(xì)菌培養(yǎng)物，并在滲透之前即刻結(jié)合在一起。包含經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列的表達(dá)載體的制備，其中所述的經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列用于CP、E1和GFP基因:用于表達(dá)3個(gè)CMV基因組RNA(用于復(fù)制)的土壤桿菌屬基基因傳遞系統(tǒng)以及所有4個(gè)CMV編碼的蛋白質(zhì)被研發(fā)。pQA表達(dá)載體包含EcoR1-Pst 1-Eco R1-HindIII限制性酶切位點(diǎn)。所述的前導(dǎo)序列通過(guò)PCR引物標(biāo)簽而被修飾，從而包括額外的限制性位點(diǎn)，并且所述的表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)Pfu聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物的平端連接而被插入到微型二元載體PCB301 (Xiang 1999)的Sma I限制性位點(diǎn)中。該表達(dá)系統(tǒng)包括RK2復(fù)制起點(diǎn)，賦予細(xì)菌以卡那霉素抗性的nptIII基因，以及右側(cè)和左側(cè)的T-DNA邊界。所有的構(gòu)建體都是經(jīng)證實(shí)的序列并通過(guò)使用特異抗體的免疫印跡在植物中被測(cè)定表達(dá)了外殼蛋白質(zhì)。表達(dá)克隆子2、6和8都是根據(jù)它們優(yōu)異的蛋白質(zhì)表達(dá)特征來(lái)選擇的，并且選擇野生型前導(dǎo)序列構(gòu)建體作為對(duì)照。包含GFP和El但不包含外殼蛋白質(zhì)(CP)序列的RNA3表達(dá)構(gòu)建體按照以下方式制備。簡(jiǎn)言之，使用引物對(duì)載體的骨架進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所述的引物被設(shè)計(jì)用于分別與CPORF正向引物(載體骨架的5’末端)的正向下游序列以及CP ORF反向引物(骨架的3’末端)的正向上游退火。載體骨架和Pfu聚合酶擴(kuò)增的GFP和El片段通過(guò)平端連接而連接。此外，二元表達(dá)系 統(tǒng)的亞組I和II RNAl和RNA2構(gòu)建體通過(guò)載體骨架和插入物的平端連接而制備。使用35ST正向和35SP反向引物組來(lái)制備載體骨架。接著，將亞組I和II RNAl和RNA2進(jìn)行pfu聚合酶擴(kuò)增和連接。所有構(gòu)建體的序列都被證實(shí)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè):使用Zuker的網(wǎng)絡(luò)基程序來(lái)預(yù)測(cè)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)(Zuker 2000)。RNA提取和實(shí)時(shí)RT-PCR:在滲透后的第5天，由滲透的葉片以及非滲透的葉片收獲用于RNA和蛋白質(zhì)提取的樣品。使用RNeasy試劑盒(Qiagen)，根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)來(lái)提取RNA，并在37°C下使用不含RNase的DNaseI處理20min。在DNaseI鈍化后，使用隨機(jī)六聚體和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶,按照制造商提供的手冊(cè)所述(Invitrogen),使用總計(jì)500ng的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用7500 ABI程序，使用針對(duì)各種RNA的基因特異引物組來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR，并進(jìn)行分析。25 μ I PCR 包括 5μ I RT 產(chǎn)物，2XSYBR PCR Master Mix (AppliedBiosystems), 400nM基因特異引物。在標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增條件下，在ABI Prism 7500 SequenceDetection系統(tǒng)(Applied Biosystems)中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。對(duì)各種基因進(jìn)行解鏈曲線分析。使用Tukey-Kramer檢驗(yàn),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P = 0.05。在95°C下,將反應(yīng)物在96孔板中溫育5min，然后在95°C、15s以及60°C、Imin下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所有的反應(yīng)都運(yùn)行3個(gè)重復(fù)。閾值循環(huán)(Ct)被定義為熒光通過(guò)固定的閾值時(shí)的分級(jí)循環(huán)數(shù)。蛋白質(zhì)的提取和免疫印跡:通過(guò)兩次施加30s的珠磨式組織研磨器，將蛋白質(zhì)由葉片提取到蛋白質(zhì)提取緩沖液(IOOmM Tris-HCKpH 8.0), IOmM EDTA, 5mM DTT, 150mMNaCl，0.1% Triton X-100，IX蛋白酶抑制劑(Roche))中。在將細(xì)胞提取物在12000rpm下離心20min而除去所有的細(xì)胞碎片之后,使用Bradford Protein Assay試劑盒(BIO-RAD,USA)以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的濃度。由葉片提取蛋白質(zhì)，并進(jìn)行SDS-PAGE分析(12%聚丙烯酰胺凝膠)。將分級(jí)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜(Hybond-C ；Amersham Pharmacia Biotech)上，以 1: 2500 稀釋與兔抗-CP 多克隆抗體、然后與山羊抗兔IgG-堿性磷酸酶綴合物(I ；2500)溫育。洗滌后，加入紫色底物溶液(BIO-RAD)，并使用蒸餾水使所述的反應(yīng)猝滅。內(nèi)切葡聚糖酶的活性測(cè)試:內(nèi)切葡聚糖酶(El)切割甲基傘形酮標(biāo)記的纖維二糖苷(MUC)，從而釋放甲基傘形酮(MU)。可以測(cè)量MU熒光來(lái)確定El的活性。使用相對(duì)熒光讀數(shù)為0.024至3.0 μ M的MU溶液來(lái)建立線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋包含El的樣品，使得所釋放的MU的濃度落入標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)。60 μ I等分的稀釋上清液加入到540 μ I乙酸鹽緩沖液(200mM乙酸鹽，pH 5.5，IOOmM NaCl)和200 μ I底物(500 μ M MUC)中。在時(shí)間零點(diǎn)和30分鐘之后取樣200 μ I反應(yīng)物，并加入到800 μ I終止緩沖液(150mM甘氨酸，pH 10)。使用VersaFluor熒光計(jì)(Bio-Rad)測(cè)量一定時(shí)間內(nèi)熒光的變化。熒光被轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚?，并且文獻(xiàn)中所報(bào)道的特異活性用于接近畢赤酵母上清液的濃度。實(shí)施例1用于在植物體中蛋白質(zhì)表達(dá)的二份和三份黃瓜花葉病毒(CMV)基表達(dá)載體本實(shí)施例描述了用于在植物中瞬時(shí)高產(chǎn)率地制備異源蛋白質(zhì)的農(nóng)桿菌真空滲透法基方法。通過(guò)使用CMV擴(kuò)增子基表達(dá)系統(tǒng)得到異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。該CMV擴(kuò)增子是通過(guò)2個(gè)或3質(zhì)粒編碼的，并且包含得自I個(gè)或2個(gè)病毒亞組的擴(kuò)增子節(jié)段。高效表達(dá)GFP、RFP和外殼蛋白質(zhì)的二份`和三份系統(tǒng)首先，制備二份和三份構(gòu)建體來(lái)在植物中制得CMV基異源蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。在二份和三份系統(tǒng)中測(cè)定RFP和GFP的表達(dá)，從而證實(shí)三份系統(tǒng)可以用于在植物中制備多種異源蛋白質(zhì)。所有這3個(gè)基因組節(jié)段均包括35S啟動(dòng)子，并且擴(kuò)增終止子序列，然后使用平端連接而連接到PCB301中，證實(shí)所述的序列。對(duì)于二份系統(tǒng)而言，將包含RNA3的二元載體與PDU97XLR1R2混合在一起，并使用混合物來(lái)滲透煙草本塞姆氏。就GFP的表達(dá)而言，使用恰好由ORF的下游起始的正向引物和恰好在ORF之前起始的反向引物由RNA3除去外殼蛋白質(zhì)區(qū)域。使用特異引物擴(kuò)增GFP序列，并將其與RNA3載體產(chǎn)物連接。就RFP而言，使用相同的克隆方法。使用包含所有3種RNA1、RNA2和RNA3構(gòu)建體的混合物轉(zhuǎn)染土壤桿菌。在二份表達(dá)系統(tǒng)的情況下，在滲透后16小時(shí)，使用卷棉子施加雌二醇。滲透后5天，收獲滲透的葉片，并提取總蛋白質(zhì)。在GFP和RFP的情況下，二份和三份系統(tǒng)都良好地工作。如通過(guò)使用RFP濾波器組在顯微鏡下觀察到的紅色所示，RFP極好地進(jìn)行在植物體中表達(dá)。在UV光下檢測(cè)GFP表達(dá)。三份系統(tǒng)顯示出即使不高于二份系統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達(dá)，也與其相似。在滲透后5天分析所有的葉片組織。經(jīng)修飾的RNAl的前導(dǎo)序列會(huì)增加外殼蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和RNA的水平為了簡(jiǎn)化擴(kuò)增子的克隆，將3種CMV擴(kuò)增子節(jié)段RNA1、RNA2和RNA3分離到不同的質(zhì)粒中，并在外殼蛋白質(zhì)(即，被其他所關(guān)注的基因替代的外殼蛋白質(zhì)基因)的上游區(qū)域和前導(dǎo)序列的下游區(qū)域引入多個(gè)額外的限制性序列(圖24)。然后，制備多個(gè)構(gòu)建體，其包含用于外殼蛋白質(zhì)表達(dá)的RNA4的不同前導(dǎo)序列。圖24不出了構(gòu)建體的多個(gè)前導(dǎo)序列，包括野生型前導(dǎo)序列。與野生型前導(dǎo)序列相比，經(jīng)修飾的序列具有額外的序列，包含有利于將異源基因插入到RNA4亞基因組啟動(dòng)子的下游區(qū)域的限制性酶切位點(diǎn)(圖24A，斜體和下劃線表示)。根據(jù)RNAfold計(jì)算機(jī)程序，經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列仍包含二級(jí)莖和環(huán)的結(jié)構(gòu)(圖24B)。然后，將這些構(gòu)建體用于農(nóng)桿菌真空滲透法。在多個(gè)不同植物中測(cè)定蛋白質(zhì)的表達(dá)，包括煙草(煙草本塞姆氏)、小糖南瓜和美洲南瓜小果。已知南瓜對(duì)CMV感染敏感。因?yàn)樗龅闹参锔缓瑺I(yíng)養(yǎng)，所以預(yù)計(jì)會(huì)支持高水平的表達(dá)。最后，使用滲透的葉片的汁液接種難關(guān)子葉，并經(jīng)常檢查CMV感染的癥狀，例如葉片上的斑點(diǎn)的形成。當(dāng)使用三份表達(dá)系統(tǒng)(包含所有3種擴(kuò)增子節(jié)段RNA1、RNA2和RNA3)時(shí)，在接種后的第7天在系統(tǒng)葉片上觀察到特征性的癥狀(圖25)。與三份系統(tǒng)相反，包含刪除的RNAl的5’ 46bp的二份系統(tǒng)不能在南瓜中進(jìn)行系統(tǒng)性地移動(dòng)，或者在南瓜葉片上引起癥狀斑點(diǎn)的形成。這些結(jié)果證明三份系統(tǒng)可以在植物體中復(fù)制，并在其宿主中系統(tǒng)性地移動(dòng)和展開(kāi)。這些是三分系統(tǒng)超過(guò)任何其他系統(tǒng)的重要有優(yōu)點(diǎn)，包括CMViva單份系統(tǒng)。CMViva單份系統(tǒng)的最大優(yōu)點(diǎn)在于所有3種RNA成分均由同一質(zhì)粒編碼，并在農(nóng)桿菌感染后將在同一細(xì)胞中定位并表達(dá)。但是，CMViva單份系統(tǒng)包含RNAl刪除，病毒粒子不能復(fù)制并且蛋白質(zhì)的表達(dá)取決于雌二醇的誘導(dǎo)?？傊_(kāi)的三份系統(tǒng)高 效地在植物中表達(dá)異源蛋白質(zhì)，包括CMV外殼蛋白質(zhì)、GFP和RFP。此夕卜，三份系統(tǒng)在南瓜中會(huì)系統(tǒng)性地移動(dòng)。qPCR和免疫印跡分析證明包含經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列的RNA4構(gòu)建體表達(dá)了比野生型RNA4更高水平的外殼蛋白質(zhì)。在二份或三份表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)概況是相似的。與二份或三份系統(tǒng)相比，包括CMViva和Q123的單份系統(tǒng)在植物體中制備了稍高的外殼蛋白質(zhì)。為了確定前導(dǎo)序列對(duì)RNA水平的影響，實(shí)施實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)定量滲透植物中RNA的水平。使用對(duì)于健康對(duì)照的相對(duì)Ct值，相對(duì)野生型RNA4前導(dǎo)序列構(gòu)建體來(lái)評(píng)估RNA1、RNA2、RNA3以及包括RNA4的RNA3的水平。在二份系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)包含經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列的構(gòu)建體與相應(yīng)的野生型構(gòu)建體相比，RNA3和RNA4的水平更高，因此解釋了較高的蛋白質(zhì)表達(dá)。有趣的是，就RNAl和RNA2表達(dá)的相對(duì)水平而言，與其中缺乏RNA3的試驗(yàn)相比，包含所有3種成分RNA1、RNA2和RNA3的試驗(yàn)都產(chǎn)生了較高的RNA水平。這種趨勢(shì)在三份系統(tǒng)中是特別明顯的。不管是使用突變體還是使用野生型前導(dǎo)序列，RNA3的表達(dá)水平均高于RNAl或RNA2的表達(dá)水平。在三份系統(tǒng)中，與由包含經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列的RNA構(gòu)建體所產(chǎn)生的外殼蛋白質(zhì)RNA水平相比，包含所有3種RNA的野生型構(gòu)建體均產(chǎn)生了較高的外殼蛋白質(zhì)RNA水平。該結(jié)果由蛋白質(zhì)的表達(dá)水平所反映。為了估測(cè)除了外殼蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，制備GFP克隆子，其包含與之前外殼蛋白質(zhì)表達(dá)所用的相同的前導(dǎo)序列。使用與之前所述的相同的方法，使用GFP構(gòu)建體滲透植物，并在滲透后的第6天和第10天在UV光下檢測(cè)熒光。通過(guò)經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列驅(qū)動(dòng)的GFP的表達(dá)產(chǎn)生了比野生型前導(dǎo)構(gòu)建體稍高的熒光強(qiáng)度。相比之下，三份系統(tǒng)表達(dá)了與二份系統(tǒng)相似或者甚至稍高水平的GFP。使用二份和三份表達(dá)系統(tǒng)的在植物體中內(nèi)切葡聚糖酶(El)的表達(dá)接著，使用所述的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備內(nèi)切葡聚糖酶E1，其為纖維素降解酶。所選擇的特定的內(nèi)切葡聚糖酶是由嗜熱細(xì)菌解纖維熱酸菌天然制備的。該細(xì)菌在例如黃石國(guó)家公園的熱泉中發(fā)現(xiàn)。所述細(xì)菌的酶在高溫和低PH下活性最高。成熟的蛋白質(zhì)包含521個(gè)氨基酸，分子量為56.5，并且等電點(diǎn)為5.5。最初的359個(gè)氨基酸形成了催化結(jié)構(gòu)域。存在大約57個(gè)氨基酸的連接體區(qū)域，其將催化結(jié)構(gòu)域與碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接，并且其本身跨越了 C-末端105個(gè)氨基酸。由于內(nèi)切葡聚糖酶通過(guò)其碳水化合物結(jié)構(gòu)域附著在植物組織上，所以在蛋白質(zhì)提取和純化過(guò)程中所述的酶不能由細(xì)胞碎片完全回收。El內(nèi)切葡聚糖酶在二份和三份蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。在這兩種情況下，使用沉默抑制子HC-Pro共滲透二份和三份表達(dá)構(gòu)建體。通常，在二份和三份表達(dá)系統(tǒng)中，El構(gòu)建體的經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列在酶活性方面增加了產(chǎn)率(圖20-21)。增強(qiáng)CMVva的復(fù)制能力CMV具有極廣泛的宿主范圍；它感染超過(guò)1000種植物，并且CMV分離物已經(jīng)由全世界回收得到。將CMV毒株分為兩個(gè)亞組I和II。之前所述的CMV表達(dá)系統(tǒng)是基于亞組II毒株。亞組I毒株更普通，并且通常顯示出比亞組II毒株更嚴(yán)重的癥狀，可能是由于病毒復(fù)制的水平更高。此外，與亞組II相比，亞組I毒株編碼了更強(qiáng)版本的2b沉默抑制子蛋白質(zhì)。由于這種特點(diǎn)，研發(fā)了亞組I CMVva三份系統(tǒng)。首先，測(cè)定亞組I RNAl和RNA2是否有利于之前研發(fā)的亞組II RNA3的表達(dá)。估測(cè)GFP的表達(dá)情況，并使用亞組I與亞組II復(fù)制酶成分觀察到GFP的表達(dá)高很多。然后，測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)情況，并發(fā)現(xiàn)與亞組II復(fù)制酶系統(tǒng)相比，亞組I復(fù)制酶使得蛋白質(zhì)的表達(dá)高很多。病毒二份和三份擴(kuò)增子系統(tǒng)(使用了重新排布的亞組I和II節(jié)段)的示例性結(jié)果示于圖20和21中。在典型的試驗(yàn)中，與編碼亞組II復(fù)制酶的病毒擴(kuò)增子系統(tǒng)相比，編碼亞組I復(fù)制酶的重新排布的病毒擴(kuò)增子系統(tǒng)產(chǎn)生了更高的蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性水平。具有細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)能力的CMVva
就細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)而言，CMV需要MP (3a移動(dòng)蛋白)和CP (衣殼蛋白)，它們二者均由RNA3編碼。當(dāng)MP缺少C-末端的33個(gè)氨基酸時(shí)，CMV感染甚至可以在不具有CP的條件下在植物中進(jìn)行細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)。之前所述的CMVa表達(dá)系統(tǒng)缺乏細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)(這是由于CP基因被所關(guān)注的產(chǎn)物基因取代)，因此所需的蛋白質(zhì)僅在初始感染的細(xì)胞中表達(dá)。為了重建細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)能力，生成刪除33aa的MP突變體，該突變體仍通過(guò)CP編碼區(qū)域表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶。當(dāng)使用三份CMVva表達(dá)系統(tǒng)滲透這些構(gòu)建體時(shí)，得到了較高水平表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶，這可通過(guò)免疫印跡和酶活性測(cè)試確定。接著，針對(duì)刪除33個(gè)氨基酸的MP突變體會(huì)促進(jìn)在在植物體中蛋白質(zhì)表達(dá)中產(chǎn)率額外增加的能力來(lái)測(cè)定該突變體。在亞組I復(fù)制酶存在下進(jìn)行表達(dá)時(shí)，包含野生型前導(dǎo)序列的GFP構(gòu)建體在UV光下會(huì)制備強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)與MP刪除突變體結(jié)合時(shí)，與野生型MP結(jié)合的情況相比，包含經(jīng)修飾的前導(dǎo)序列的構(gòu)建體#6在亞組I復(fù)制酶的存在下會(huì)產(chǎn)生水平高很多的GFP的表達(dá)。此外，使用亞組I復(fù)制酶和MP刪除突變體還會(huì)強(qiáng)烈地增加植物中El的表達(dá)，這可通過(guò)酶活性測(cè)量確定。當(dāng)將亞組I復(fù)制酶絡(luò)合物26與刪除33個(gè)氨基酸的MP突變體結(jié)合使用時(shí)，在植物體中取得了最高的El活性水平。發(fā)現(xiàn)當(dāng)野生型MP與亞組I復(fù)制酶結(jié)合使用時(shí)，其不會(huì)良好地表達(dá)。相反，發(fā)現(xiàn)MP刪除突變體與亞組I或II復(fù)制酶相結(jié)合會(huì)良好地表達(dá)。綜上，本實(shí)施例證明了 CMV擴(kuò)增子基蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以高效地制備多種異源蛋白質(zhì)，包括解纖維熱酸菌內(nèi)切葡聚糖酶El。CMV擴(kuò)增子可以分為二份或三份表達(dá)系統(tǒng)，其中CMV擴(kuò)增子節(jié)段RNA1、RNA2和RNA3分布在2個(gè)或3個(gè)不同的質(zhì)粒上。CMV亞組I節(jié)段RNAl和RNA2與CMV亞組節(jié)段RNA3使得蛋白質(zhì)表達(dá)的產(chǎn)率增加。在一些情況下，RNA4前導(dǎo)序列的優(yōu)化使得蛋白質(zhì)和RNA的表達(dá)水平得到改善。重要的是，CMV3a移動(dòng)蛋白刪除突變體的表達(dá)有利于復(fù)制、CMV擴(kuò)增子的細(xì)胞與細(xì)胞間的移動(dòng)以及異源蛋白質(zhì)(例如GFP或El)的系統(tǒng)性表達(dá)。顯示CMV擴(kuò)增子基的表達(dá)系統(tǒng)會(huì)使異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)率為至多大約4mg蛋白質(zhì)/kg植物組織鮮重。實(shí)施例2內(nèi)切葡聚糖酶(El)蛋白質(zhì)在畢赤酵母(Pichia pastoris)用作標(biāo)準(zhǔn)品的制備和表征本實(shí)施例證明畢赤酵母制備的El可以用作用于估測(cè)植物制備的El的特異活性和產(chǎn)率的標(biāo)準(zhǔn)品。確定經(jīng)純化的內(nèi)切葡聚糖酶的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在畢赤酵母中制備E1，并通過(guò)IMAC (固定化金屬親和層析)純化。針對(duì)圖26所示的特異反應(yīng)確定參數(shù)。El將底物(MUC)切割成纖維二糖和熒光團(tuán)(MU)，可以在一定時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)其濃度。當(dāng)在65°C和135 μ M底物下運(yùn)行時(shí)，這為用于在植物提取物和酵母培養(yǎng)物中針對(duì)El進(jìn)行活性測(cè)試的反應(yīng)。在這組試驗(yàn)中，改變底物的濃度來(lái)確定在不同溫度下的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。用于展示Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)的反應(yīng)的速率示于等式I中。速率取決于催化速率(kcat)，酶的總濃度(ET)，歸并為Michaelis-Menten常數(shù)的吸附/解吸附速率(Km)以及底物濃度(S)。在高底物濃度下(S > > Km)，所述的速率接近最大，并且kcatET通常寫(xiě)為Vmax。
權(quán)利要求
1.一種能夠表達(dá)異源蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞包含: 病毒擴(kuò)增子，其中所述的擴(kuò)增子包含多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，該擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，所述的擴(kuò)增子包含: 1.包含至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段的第一質(zhì)粒，其中所述的至少一個(gè)節(jié)段包含編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列；以及 .包含至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段的第二質(zhì)粒； 其中所述的第一質(zhì)粒不同于所述的第二質(zhì)粒。
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的擴(kuò)增子包含第三質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒包含至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，其中所述的第三質(zhì)粒不同于所述的第一質(zhì)粒和所述的第二質(zhì)粒。
3.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的第一質(zhì)粒包含至少一個(gè)不被所述的第二質(zhì)粒所包含的擴(kuò)增子節(jié)段。
4.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的第二質(zhì)粒包含至少一個(gè)不被所述的第二質(zhì)粒所包含的擴(kuò)增子節(jié)段。
5.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的第一質(zhì)粒包含卡那霉素選擇標(biāo)志物基因，并且所述的第二質(zhì)粒不包含所述的卡那霉素選擇標(biāo)志物基因。
6.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的病毒擴(kuò)增子為黃瓜花葉病毒組擴(kuò)增子。
7.權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其中所述的黃瓜花葉病毒組擴(kuò)增子為CMV擴(kuò)增子。
8.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞 ，其中所述的第一質(zhì)粒的至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段為CMVRNA3。
9.權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其中所述的CMVRNA3包含片段RNA4，其中所述的RNA4包含經(jīng)修飾的5’ -前導(dǎo)序列，與野生型RNA4 5’ -前導(dǎo)序列相比，所述的經(jīng)修飾的5’ -前導(dǎo)序列具有更多的限制性酶切位點(diǎn)。
10.權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其中所述的第二質(zhì)粒的至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段為CMVRNAI,并且所述的第三質(zhì)粒的至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段為CMVRNA2。
11.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的第二質(zhì)粒的至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段為2個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段。
12.權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中所述的2個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段為CMVRNAl和CMV RNA2。
13.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞， 其中所述的第一質(zhì)粒的所述的至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段得自第一個(gè)病毒亞組；以及 其中所述的第二質(zhì)粒的所述的至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段得自第二個(gè)病毒亞組。
14.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞， 其中在所述的第二質(zhì)粒上的至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段包含響應(yīng)于化學(xué)誘導(dǎo)劑的啟動(dòng)子序列；以及 其中所述的啟動(dòng)子序列與編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸序列可操作地連接。
15.權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，其中所述的化學(xué)誘導(dǎo)劑為雌二醇或甲氧蟲(chóng)酰肼。
16.權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，其中所述的病毒蛋白質(zhì)為復(fù)制酶或復(fù)制酶亞單元。
17.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化。
18.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的異源蛋白質(zhì)為分泌蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的異源蛋白質(zhì)為GFP或RFP。
20.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的異源蛋白質(zhì)為能夠修飾、降解或分解植物細(xì)胞壁的酶。
21.權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述的酶在>30°C的溫度下具有最佳的活性。
22.權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其中所述的酶為纖維素酶。
23.權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其中所述的纖維素酶為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。
24.權(quán)利要求23所述的細(xì)胞，其中所述的內(nèi)切葡聚糖酶為得自解纖維熱酸菌的ΕΙβ-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶。
25.權(quán)利要求23所述的細(xì)胞，其中所述的木聚糖酶得自解纖維熱酸菌。
26.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的擴(kuò)增子節(jié)段包含編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列，所述的擴(kuò)增子節(jié)段進(jìn)一步包含與編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列可操作地連接的CaM 35S啟動(dòng)子。
27.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼基因沉默抑制子的cDNA。
28.權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其中所述的基因沉默抑制子為Hc-Ρι 。
29.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼病毒外殼蛋白質(zhì)的cDNA。
30.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼突變體形式的所述的CMV3a移動(dòng)蛋白的cDNA。
31.權(quán)利要求 30所述的細(xì)胞，其中所述的突變體形式的所述的CMV3a移動(dòng)蛋白包含C-末端33個(gè)氨基酸的刪除。
32.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述的第一質(zhì)粒和所述的第二質(zhì)粒為T-DNA質(zhì)粒。
33.一種能夠表達(dá)異源蛋白質(zhì)的植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞包含: 病毒擴(kuò)增子，其中所述的擴(kuò)增子包含多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，該擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，所述的擴(kuò)增子包含: 1.得自第一病毒亞組的第一擴(kuò)增子節(jié)段；以及 .得自第二病毒亞組的第二擴(kuò)增子節(jié)段； 其中所述的第一或第二擴(kuò)增子節(jié)段包含編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列。
34.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的病毒擴(kuò)增子進(jìn)一步包含第三擴(kuò)增子節(jié)段，其中所述的第三擴(kuò)增子節(jié)段得自所述的第一或第二病毒亞組。
35.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的病毒擴(kuò)增子在單一質(zhì)粒上編碼。
36.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的病毒擴(kuò)增子由兩種質(zhì)粒編碼，其中所述的第一質(zhì)粒包含得自第一病毒亞組的兩個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，并且所述的第二質(zhì)粒包含得自第二病毒亞組的一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段。
37.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的病毒擴(kuò)增子由三種質(zhì)粒編碼，其中所述的第一質(zhì)粒包含得自第一病毒亞組的一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，并且所述的第二和第三質(zhì)粒均包含得自第二病毒亞組的一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段。
38.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的病毒擴(kuò)增子為黃瓜花葉病毒組擴(kuò)增子。
39.權(quán)利要求38所述的細(xì)胞，其中所述的病毒擴(kuò)增子為CMV擴(kuò)增子。
40.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的第一擴(kuò)增子節(jié)段為得自CMV亞組II的RNA3。
41.權(quán)利要求40所述的細(xì)胞，其中RNA3包含片段RNA4，其中所述的RNA4包含經(jīng)修飾的5’ -前導(dǎo)序列，與野生型RNA4 5’ -前導(dǎo)序列相比，所述的經(jīng)修飾的5’ -前導(dǎo)序列具有更多的限制性酶切位點(diǎn)。
42.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的第二擴(kuò)增子節(jié)段為得自CMV亞組I的RNAl或RNA2。
43.權(quán)利要求42所述的細(xì)胞，其中所述的CMV亞組I為California亞組I。
44.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化。
45.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的異源蛋白質(zhì)為分泌蛋白質(zhì)。
46.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的異源蛋白質(zhì)為GFP或RFP。
47.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的異源蛋白質(zhì)為能夠修飾、降解或分解植物細(xì)胞壁的酶。
48.權(quán)利要求47所述的細(xì)胞，其中所述的酶在>30°C的溫度下具有最佳的活性。
49.權(quán)利要求47所述的細(xì)胞，其中所述的酶為纖維素酶。
50.權(quán)利要求49所述的細(xì)胞，其中所述的纖維素酶為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶或木聚糖酶。
51.權(quán)利要求50所述的細(xì)胞，其中所述的內(nèi)切葡聚糖酶為得自解纖維熱酸菌的ΕΙβ-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶。
52.權(quán)利要求50所述的細(xì)胞，其中所述的木聚糖酶得自解纖維熱酸菌。
53.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的擴(kuò)增子節(jié)段包含編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列，所述的擴(kuò)增子節(jié)段進(jìn)一步包含與編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列可操作地連接的CaM 35S啟動(dòng)子。
54.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼基因沉默抑制子的cDNA。
55.權(quán)利要求54所述的細(xì)胞，其中所述的基因沉默抑制子為Hc-Pro。
56.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼突變體形式的所述的CMV3a移動(dòng)蛋白的cDNA。
57.權(quán)利要求56所述的細(xì)胞，其中所述的突變體形式的所述的CMV3a移動(dòng)蛋白包含C-末端33個(gè)氨基酸的刪除。
58.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞，其中所述的病毒擴(kuò)增子能夠在植物體中復(fù)制并系統(tǒng)性地移動(dòng)。
59.權(quán)利要求33所述的細(xì)胞， 其中至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段包含響應(yīng)于化學(xué)誘導(dǎo)劑的啟動(dòng)子序列；以及 其中所述的啟動(dòng)子序列與編碼病毒蛋白質(zhì)的核酸序列可操作地連接。
60.權(quán)利要求59所述的細(xì)胞，其中所述的化學(xué)誘導(dǎo)劑為雌二醇或甲氧蟲(chóng)酰肼。
61.權(quán)利要求59所述的細(xì)胞，其中所述的病毒蛋白質(zhì)為復(fù)制酶或復(fù)制酶亞單元。
62.一種用于制備異源蛋白質(zhì)的方法，該方法包括: 1.將植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織與細(xì)菌細(xì)胞相接觸，所述的細(xì)菌細(xì)胞包含: 完整的病毒擴(kuò)增子，其中所述的擴(kuò)增子包含多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，該擴(kuò)增子節(jié)段能夠擴(kuò)增編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄； .允許足夠的時(shí)間，從而在所述的植物細(xì)胞中制備所述的異源蛋白質(zhì)；以及 ii1.收獲至少2.0mg異源蛋白質(zhì)/kg鮮重的所述的植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織。
63.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述的至少2.0mg異源蛋白質(zhì)/kg鮮重的所述的植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織為至少3.0mg異源蛋白質(zhì)/kg鮮重的所述的植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織。
64.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述的至少2.0mg異源蛋白質(zhì)/kg鮮重的所述的植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織為至少4.0mg異源蛋白質(zhì)/kg鮮重的所述的植物細(xì)胞、植物或切除的植物組織。
65.一種用于制備異源蛋白質(zhì)的方法，該方法包括: 1.將植物細(xì)胞與至少一種植物激素相接觸； .將所述的植物細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞相接觸，所述的細(xì)菌細(xì)胞包含: 完整的病毒擴(kuò)增子，其中所述的擴(kuò)增子包含多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，該擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄； ii1.允許足夠的時(shí)間，從而在所述的植物細(xì)胞中制備所述的異源蛋白質(zhì)；以及 iv.收獲由所述的植物細(xì)胞制備的所述的異源蛋白質(zhì)。
66.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的至少一種植物激素為至少兩種植物激素。
67.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的至少一種植物激素選自茉莉酸、赤霉素A3、吲哚乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、激動(dòng)素和水楊酸。
68.權(quán)利要求65所述的方法，其中與野生型植物細(xì)胞相比，所述的植物細(xì)胞為表達(dá)高水平基因沉默抑制子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
69.權(quán)利要求65 所述的方法，進(jìn)一步包含將所述的植物細(xì)胞與第二細(xì)菌細(xì)胞相接觸，其中所述的第二細(xì)菌細(xì)胞包含編碼基因沉默抑制子的重組核酸序列。
70.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞包含基因組DNA，并且所述的病毒擴(kuò)增子在所述的植物基因組DNA中穩(wěn)定地整合。
71.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的異源蛋白質(zhì)在所述的植物細(xì)胞中瞬時(shí)制備。
72.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞由植物、切除的植物組織或植物細(xì)胞培養(yǎng)物所包含。
73.權(quán)利要求65所述的方法，進(jìn)一步包含通過(guò)離質(zhì)體洗滌而除去所述的植物或切除的植物組織離質(zhì)體的可溶性成分。
74.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞為煙草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物細(xì)胞。
75.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的煙草植物細(xì)胞為煙草本塞姆氏細(xì)胞。
76.一種用于制備異源蛋白質(zhì)的方法，該方法包括: 1.機(jī)械創(chuàng)傷植物或切除的植物組織； .將所述的植物或切除的植物組織與細(xì)菌細(xì)胞相接觸，所述的細(xì)菌細(xì)胞包含: 完整的病毒擴(kuò)增子，其中所述的擴(kuò)增子包含多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，該擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄； ii1.允許足夠的時(shí)間，從而在所述的植物細(xì)胞中制備所述的異源蛋白質(zhì)；以及 iv.收獲由所述的植物細(xì)胞制備的所述的異源蛋白質(zhì)。
77.權(quán)利要求76所述的方法，其中機(jī)械創(chuàng)傷所述的植物或切除的植物組織包含使用刷子壓制所述的植物或切除的植物組織。
78.權(quán)利要求76所述的方法，其中所述的植物或切除的植物組織為轉(zhuǎn)基因植物或切除的植物組織，與野生型植物或切除的植物組織相比，所述的轉(zhuǎn)基因植物或切除的植物組織表達(dá)高水平的基因沉默抑制子。
79.權(quán)利要求76所述的方法，其中所述的異源蛋白質(zhì)在所述的植物細(xì)胞中瞬時(shí)制備。
80.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中步驟ii)是通過(guò)加壓滲透或真空滲透實(shí)施的。
81.權(quán)利要求76所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞形成植物、切除的植物組織或植物細(xì)胞培養(yǎng)物的一部分。
82.權(quán)利要求76所述的方法，進(jìn)一步包括通過(guò)離質(zhì)體洗滌來(lái)除去所述的植物或切除的植物組織離質(zhì)體的可溶性成分。
83.權(quán)利要求76所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞為煙草、柳枝稷、芒草、向日葵、糖南瓜或南瓜小果的植物細(xì)胞。
84.權(quán)利要求76所述的方法，其中所述的煙草植物細(xì)胞為煙草本塞姆氏細(xì)胞。
85.權(quán)利要求76所述的方法，進(jìn)一步包括將所述的植物或切除的植物組織與第二種細(xì)菌細(xì)胞相接觸，其中所述的第二種細(xì)菌細(xì)胞包含編碼基因沉默抑制子的重組核酸序列。
86.權(quán)利要求69或85所述的方法，其中所述的基因沉默抑制子為HC-Pix)。
87.權(quán)利要求69或85所述的方法，其中所述的基因沉默抑制子衍生自番茄茂密矮小病毒或煙草蝕刻病毒。
88.權(quán)利要求77所述的方法，進(jìn)一步包括將所述的植物或切除的植物組織與第二細(xì)菌細(xì)胞相接觸，其中所述的第二細(xì)菌細(xì)胞包含編碼病毒外殼蛋白質(zhì)的重組核酸序列。
89.權(quán)利要求88所述的方法，其中所述的病毒外殼蛋白質(zhì)為CMV外殼蛋白質(zhì)。
90.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒擴(kuò)增子包含單一質(zhì)粒。
91.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒擴(kuò)增子包含: 包含至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段的第一質(zhì)粒，其中所述的至少一個(gè)節(jié)段包含編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列；以及 包含至少一個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段的第二質(zhì)粒； 其中所述的第一質(zhì)粒不同于所述的第二質(zhì)粒。
92.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒擴(kuò)增子包含3種質(zhì)粒。
93.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中所述的病毒擴(kuò)增子包含: 得自第一病毒亞組的第一擴(kuò)增子節(jié)段；以及 得自第二病毒亞組的第二擴(kuò)增子節(jié)段， 其中所述的第一或第二擴(kuò)增子節(jié)段包含編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列。
94.權(quán)利要求65或76所述的方法，進(jìn)一步包括將所述的植物細(xì)胞與化學(xué)誘導(dǎo)劑相接觸。
95.權(quán)利要求94所述的方法，其中所述的化學(xué)誘導(dǎo)劑為雌二醇或甲氧蟲(chóng)酰肼。
96.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中所述的異源蛋白質(zhì)為能夠修飾、降解或分解植物細(xì)胞壁的酶。
97.權(quán)利要求65或76所述的方法，進(jìn)一步包括原位活化的所述的異源蛋白質(zhì)，由此蛋白質(zhì)活化使得植物細(xì)胞壁被降解。
98.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中所述的第一和第二細(xì)菌細(xì)胞為根癌土壤桿菌細(xì)胞。
99.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞包含基因組DNA，并且所述的病毒擴(kuò)增子在所述的植物基因組DNA中穩(wěn)定地整合。
100.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中4天為在所述的植物細(xì)胞中制備所述的異源蛋白質(zhì)的足夠的時(shí)間。
101.權(quán)利要求65或76所述的方法，其中6天為在所述的植物細(xì)胞中制備所述的異源蛋白質(zhì)的足夠的時(shí)間。
102.一種用于制備異源蛋白質(zhì)的方法，該方法包括: .1.將所述的植物細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞在第一溫度下相接處， 其中所述的細(xì)菌細(xì)胞包含完整的病毒擴(kuò)增子， 所述的擴(kuò)增子包含多個(gè)擴(kuò)增子節(jié)段，該擴(kuò)增子能夠擴(kuò)增編碼所述的異源蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)錄； .在第二溫度下將所述的植物細(xì)胞溫育足夠的時(shí)間，從而在所述的植物細(xì)胞中制備所述的異源蛋白質(zhì)；以及 ii1.收獲由所述的植物細(xì)胞制備的所述的異源蛋白質(zhì)。
103.權(quán)利要求102所述的方法， 其中所述的第一溫度為20°C，并且所述的第二溫度為.26°C或 30°C。
104.一種能夠表達(dá)木聚糖酶的植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞包含: .1.編碼由解纖維熱酸菌得到的木聚糖酶的密碼子優(yōu)化的核酸序列， .與所述的優(yōu)化的核酸序列可操作地連接的CaM 35S啟動(dòng)子，以及 ii1.編碼所述的基因沉默抑制子Hc-Pio的核酸序列。
全文摘要
本文描述了病毒擴(kuò)增子基蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)以及通過(guò)農(nóng)桿菌真空滲透法來(lái)制備異源蛋白質(zhì)的方法，其中所述的異源蛋白質(zhì)例如為酶。所述的方法涉及使用編碼異源蛋白質(zhì)的Ti質(zhì)粒來(lái)制備土壤桿菌屬，使用該土壤桿菌屬來(lái)感染植物細(xì)胞，允許異源蛋白質(zhì)表達(dá)，以及由植物細(xì)胞回收異源蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所制備的蛋白質(zhì)為內(nèi)切葡聚糖酶。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103180447SQ201180041076
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者M·黃, B·E·林登穆斯, K·A·麥克唐納, A·M·丹德卡爾, B·W·?？? S-k·鄭, N·J·金斯伯里 申請(qǐng)人:加州大學(xué)評(píng)議會(huì)