專利名稱：生產(chǎn)脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明至少部分地涉及采用經(jīng)改造的細(xì)胞或微生物將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體(例如脂肪酸或脂肪酸衍生物，如三酰甘油)的領(lǐng)域。聯(lián)邦政府資助研究 導(dǎo)致本文所公開發(fā)明的某些方面的研究(至少部分)由能源部資助69106899支持。美國政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
可持續(xù)生產(chǎn)的生物燃料是化石燃料的替代品，并且可以有助于緩解對易于得到的化石燃料儲備的消耗，同時避免與化石燃料相關(guān)的污染和溫室氣體排放，從而以可持續(xù)的方式滿足對負(fù)擔(dān)得起的能源的日益增長的需求。然而，現(xiàn)有生產(chǎn)方法的若干缺點妨礙了廣泛實施生物燃料生產(chǎn)，例如生產(chǎn)生物燃料的植物與糧食作物競爭有農(nóng)業(yè)價值的土地面積，或者使用僅有限供應(yīng)的工業(yè)物質(zhì)作為碳源。

發(fā)明內(nèi)容
對化石燃料之可持續(xù)性和可再生性的日益增加的關(guān)注使得開發(fā)了不同來源的多種替代性生物燃料，包括由微生物(如細(xì)菌或酵母)從可再生資源合成的脂質(zhì)。可用作生物燃料或生物燃料前體的脂質(zhì)包括例如脂肪酸及其衍生物(例如，三酰甘油)。微生物合成的生物燃料或生物燃料前體的經(jīng)濟(jì)可行性依賴于使用具有包括多個有利特性之組合的表型的適合微生物，所述有利特性例如允許將碳有效轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的代謝、高的生物質(zhì)形成率、生物燃料或生物燃料前體的高產(chǎn)率、生物燃料或生物燃料前體的高水平細(xì)胞內(nèi)積累或分泌、對原料(碳源和相關(guān)物質(zhì))和所合成產(chǎn)物(例如，脂肪酸或三酰甘油)的良好耐受以及生物燃料或生物燃料前體的穩(wěn)定性(例如在低碳源濃度下)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)率(每克底物(例如葡萄糖)所產(chǎn)生的油的克數(shù))尤為重要。通常用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物不符合足夠允許以工業(yè)規(guī)模經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)生物燃料的所需表型。本發(fā)明的一些方面涉及在微生物中改造所需特性以生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體。雖然自二十世紀(jì)三十年代和二十世紀(jì)四十年代起，已研究了微生物中的脂質(zhì)和脂肪酸代謝(參見，例如 Woodbine, M. 1959, Microbial fat !Microorganisms as potential fatproducers. Prog. Ind. Microbiol. I : 181),但是,盡管在遺傳改造微生物或優(yōu)化生產(chǎn)過程的條件方面作出了諸多努力，在微生物中改造與生物燃料生產(chǎn)相關(guān)的期望表型方面的進(jìn)展仍然很小。到目前為止，遺傳改造工作主要集中在操作脂肪酸合成通路上游或其中的基因靶標(biāo)和優(yōu)化發(fā)酵或培養(yǎng)條件(例如，通過用脂肪酸補充生長培養(yǎng)基)。遺傳改造微生物的一個主要障礙是缺少靶微生物中(例如產(chǎn)油(oleaginous)酵母中)關(guān)鍵代謝通路調(diào)節(jié)因子的基因組信息和注釋。因此，在用于生產(chǎn)生物燃料的微生物中仍然缺少控制將碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的功能鑒定和注釋。本發(fā)明的一些方面涉及將產(chǎn)油酵母解脂耶氏酵母(Y. Iipolytica)鑒定為用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物。本發(fā)明的一些方面涉及發(fā)現(xiàn)微生物中脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本發(fā)明的一些方面涉及發(fā)現(xiàn)硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)作為微生物中碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本發(fā)明的一些方面涉及編碼微生物中脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的分離的核酸。本發(fā)明的一些方面提供了編碼產(chǎn)油微生物的脂肪酸代謝之關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(例如，SCD基因產(chǎn)物)的分離的核酸。本發(fā)明的一些方面涉及操作脂肪酸代謝調(diào)節(jié)因子的活性(例如，通過遺傳操作)來改造用于生產(chǎn)生物燃料的微生物。本發(fā)明的一些方面涉及改造用于生產(chǎn)生物燃料或生物 燃料前體的分離的微生物。本發(fā)明的一些方面涉及針對將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體進(jìn)行優(yōu)化的分離的微生物，例如，包含活性增加的SCD基因產(chǎn)物的產(chǎn)油微生物。本發(fā)明的一些方面涉及改造用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物培養(yǎng)物。本發(fā)明的一些方面涉及使用改造用于生產(chǎn)生物燃料的微生物將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的方法。本發(fā)明的一些方面涉及使用改造用于生產(chǎn)生物燃料的微生物將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的生物反應(yīng)器。本發(fā)明的一些方面提供了使用經(jīng)改造微生物至少部分地將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的方法。本發(fā)明的一些方面涉及分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其包含提高選自血紅蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶(malic enzyme)、ACC、SCD、FAAl、ACS、ACS2、FATl、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、?；o酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因的一種或更多種基因的表達(dá)的遺傳修飾，和/或降低選自JNK2和△-12去飽和酶的基因的表達(dá)的遺傳修飾。在一些實施方案中，分離的產(chǎn)油細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(a)包含在合適的同源或異源啟動子的控制下編碼基因產(chǎn)物的核酸的表達(dá)盒；(b)包含在異源啟動子的控制下編碼靶向基因產(chǎn)物的干擾RNA的核酸的表達(dá)盒；和/或(c)插入細(xì)胞基因組的核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含提高或降低基因產(chǎn)物表達(dá)的核酸序列。在一些實施方案中，異源啟動子是誘導(dǎo)型或組成型啟動子。在一些實施方案中，核酸構(gòu)建體抑制或破壞(disrupt)編碼基因產(chǎn)物的天然基因的天然調(diào)節(jié)，導(dǎo)致天然基因的過表達(dá)。在一些實施方案中，核酸構(gòu)建體抑制或消除天然基因的表達(dá)。在一些實施方案中，由缺失、破壞、突變和/或替換調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的一部分來介導(dǎo)天然基因的天然調(diào)節(jié)的抑制或破壞，或者由缺失、破壞、突變和/或替換天然基因的編碼序列或調(diào)節(jié)天然基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的一部分來介導(dǎo)天然基因表達(dá)的抑制或消除。在一些實施方案中，由組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)靶向JNK2和/或A-12去飽和酶基因產(chǎn)物且抑制所述基因表達(dá)的核酸來介導(dǎo)JNK2和/或A-12去飽和酶基因表達(dá)的降低。在一些實施方案中，靶向JNK2和/或A-12去飽和酶基因轉(zhuǎn)錄本的核酸通過RNAi途徑抑制轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。在一些實施方案中，靶向JNK2和/或A-12去飽和酶轉(zhuǎn)錄本的核酸是siRNA, shRNA或micro RNA。在一些實施方案中，通過在微生物中敲除野生型基因(例如，通過核酸構(gòu)建體(如靶向性載體)與基因組JNK2或A-12去飽和酶基因座的同源重組)從而破壞野生型基因的表達(dá)來降低JNK2和/或A-12去飽和酶的表達(dá)。在一些實施方案中，將核酸構(gòu)建體插入細(xì)胞的基因組中。在一些實施方案中，基因產(chǎn)物表達(dá)的提高的或降低賦予細(xì)胞將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸、脂肪酸衍生和/或TAG的有利表型。在一些實施方案中，有利表型是改變的脂肪酸譜、改變的三酰甘油譜、增加的脂肪酸和/或三酰甘油合成率、增加的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率、細(xì)胞中增加的三酰甘油積累和增強的對滲透壓的耐受、增加的增殖速率、增加的細(xì)胞體積和/或細(xì)胞對濃度為致死和/或抑制其相同類型細(xì)胞的未經(jīng)修飾細(xì)胞之增殖的物質(zhì)增強的耐受。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞的改變的脂肪酸譜或改變的三酰甘油譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少2倍。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞的改變的脂肪酸譜或改變的三酰甘油譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少2. 5倍。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞的改變的脂肪酸譜或改變的三酰甘油譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少5倍。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞的改變的脂肪酸譜或改變的三酰甘油譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少6. 5倍。在一些實施方案中，細(xì)胞在對未經(jīng)修飾細(xì)胞致死的滲透壓條件下存活。在一些實施方案中，細(xì)胞在滲透壓水平為未經(jīng)修飾細(xì)胞所耐受之最高水平的200%的條件下存活。在一些實施方案中，細(xì)胞在滲透壓水平為未經(jīng)修飾細(xì)胞 所耐受的最高水平的300%的條件下存活。在一些實施方案中，細(xì)胞在滲透壓水平為未經(jīng)修飾細(xì)胞所耐受的最高水平的400%的條件下存活。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖速率增加為至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少25倍或至少30倍。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞的體積增加為至少2倍。在一些實施方案中，細(xì)胞耐受濃度為致死和/或抑制相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞增殖的物質(zhì)。在一些實施方案中，所述物質(zhì)是可發(fā)酵糖，所述濃度為至少80g/l、至少100g/l、至少150g/l、至少200g/l、至少300g/l。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞的脂肪酸或三酰甘油的合成率增加為至少5倍或至少10倍。在一些實施方案中，細(xì)胞以至少約20g/g、至少約25g/g或至少約30g/g的轉(zhuǎn)化率將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或三酰甘油。在一些實施方案中，細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。在一些實施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在一些實施方案中，細(xì)胞是產(chǎn)油酵母細(xì)胞。在一些實施方案中，細(xì)胞是解脂耶氏酵母細(xì)胞。本發(fā)明的一些方面涉及培養(yǎng)物，其包含分離的產(chǎn)油細(xì)胞和碳水化合物源，所述產(chǎn)油細(xì)胞包含提高選自血紅蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、?；o酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因的一種或更多種基因的表達(dá)的遺傳修飾，和/或降低JNK2和/或A-12去飽和酶基因產(chǎn)物的表達(dá)的遺傳修飾。在一些實施方案中，分離的產(chǎn)油細(xì)胞是本文所提供的經(jīng)改造微生物。在一些實施方案中，所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖。在一些實施方案中，所述碳水化合物源是單糖(monomericsugar) o在一些實施方案中,所述碳水化合物源是葡萄糖和甘油。在一些實施方案中，所述碳水化合物源未經(jīng)滅菌。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)物保持在未滅菌條件下。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)物不包含對分離的產(chǎn)油細(xì)胞有選擇性的抗生素或抗增殖劑。在一些實施方案中，所述碳水化合物源來自植物或藻類生物質(zhì)。在一些實施方案中，所述碳水化合物源來自纖維素、半纖維素、淀粉、甘油或其衍生物。在一些實施方案中，所述的培養(yǎng)物還包含纖維素或半纖維素水解酶。在一些實施方案中，生物質(zhì)或纖維素或半纖維素在熱水或稀酸或氨纖維膨脹處理中預(yù)處理，利用水解酶預(yù)處理，蒸汽預(yù)處理和/或石灰預(yù)處理。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)物包含濃度為對未經(jīng)修飾野生型、與分離的產(chǎn)油細(xì)胞細(xì)胞類型相同的未經(jīng)修飾細(xì)胞致死的物質(zhì)。在一些實施方案中，所述物質(zhì)是在預(yù)處理碳水化合物源(如乙酸類(acetate)、糠醛或芳族化合物)期間產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。在一些實施方案中，所述物質(zhì)是碳水化合物源。在一些實施方案中，所述物質(zhì)是可發(fā)酵糖。在一些實施方案中，所述物質(zhì)是單糖。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)物包含濃度為至少80g/l、至少100g/l、至少150g/l、至少200g/l、至少250g/l或至少300g/l的可發(fā)酵糖。本發(fā)明的一些方面涉及一種方法，其包括使碳水化合物源與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸，以及在適于使細(xì)胞至少部分地將所述碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或三酰甘油的條件下孵育與所述細(xì)胞接觸的碳水化合物源，所述細(xì)胞包含提高選自血紅蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶、ACC、SCD、FAAU ACS, ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、?；o酶 A 合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因產(chǎn)物的一種或更多種基因的表達(dá)的遺傳修飾，和/或降低JNK2和/或△-12去飽和酶基因表達(dá)的遺傳修飾。在一些實施方案中，所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞是本文所提供的經(jīng)改造微生物。在一些實施方案中，所述碳水化合物源是糖(如葡萄糖、木糖·等)或來自植物或藻類生物質(zhì)的淀粉。在一些實施方案中，所述碳水化合物源來自纖維素或半纖維素。在一些實施方案中，在纖維素或半纖維素水解酶的存在下，使所述碳水化合物源與所述細(xì)胞接觸。在一些實施方案中，在55°C于每克生物質(zhì)約15IU纖維素或半纖維水解酶的存在下，使所述碳水化合物源與所述細(xì)胞接觸48小時。在一些實施方案中，用熱水或稀釋酸或氨纖維膨脹處理和/或水解酶預(yù)處理生物質(zhì)或纖維素或半纖維素。在一些實施方案中，與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的碳水化合物源包含濃度對與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞細(xì)胞類型相同的未經(jīng)修飾細(xì)胞為致死濃度的物質(zhì)。在一些實施方案中，所述物質(zhì)是在預(yù)處理碳水化合物源(例如乙酸類)期間產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。在一些實施方案中，所述物質(zhì)是所述碳水化合物源。在一些實施方案中，碳水化合物源是可發(fā)酵糖，與產(chǎn)油細(xì)胞接觸之后所述可發(fā)酵糖的濃度為至少80g/l、至少100g/l、至少200g/l或至少300g/l。在一些實施方案中，在未滅菌條件下使碳水化合物源與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸。在一些實施方案中，在非滅菌條件下孵育與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的碳水化合物源。在一些實施方案中，在開放反應(yīng)器中孵育與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的碳水化合物源。在一些實施方案中，在補料分批過程(fed batchprocess)中使碳水化合物源與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸并孵育以將所述碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或三酰甘油。在一些實施方案中，在連續(xù)過程中使碳水化合物源與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸并孵育以將所述碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或三酰甘油。在一些實施方案中，通過溶劑萃取從與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的碳水化合物源萃取脂肪酸或三酰甘油。在一些實施方案中，所述溶劑萃取是溶劑己烷萃取。在一些實施方案中，將脂肪酸或三酰甘油從與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的碳水化合物源中分離，然后通過酯交換反應(yīng)(transesterification)精煉。本發(fā)明的一些方面涉及一種方法，其包括通過提高選自血紅蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS 和 AMPK 基因產(chǎn)物的一種或更多種基因產(chǎn)物的表達(dá)，和/或降低JNK2和/或A-12去飽和酶基因的表達(dá)來改變脂肪酸譜、三酰甘油譜、脂肪酸合成率(fatty acid synthesis rate)、三酰甘油合成率、細(xì)胞中脂肪酸衍生物積累的程度、脂肪酸衍生物的分泌率(rate of fatty acid derivativesecretion)、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物轉(zhuǎn)化的速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物轉(zhuǎn)化的有效產(chǎn)率、對滲透壓的耐受、增殖速率、細(xì)胞體積或細(xì)胞對用于碳水化合物源向脂肪酸或三酰甘油的轉(zhuǎn)化中的有毒物質(zhì)的耐受。在一些實施方案中，改變所述脂肪酸譜、所述三酰甘油譜、所述脂肪酸合成率、所述三酰甘油合成率、細(xì)胞中脂肪酸衍生物積累程度或細(xì)胞的脂肪酸衍生物分泌率是增加由細(xì)胞合成、積累或分泌的脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的量。在一些實施方案中，改變細(xì)胞的碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物轉(zhuǎn)化的效率是將轉(zhuǎn)化效率增加為至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。在一些實施方案中，脂肪酸衍生物是三酰甘油。在一些實施方案中，改變細(xì)胞對滲透壓的耐受或?qū)τ卸疚镔|(zhì)的耐受是賦予對相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞為致死水平的滲透壓或有毒物質(zhì)的耐受。在一些實施方案中，改變增殖速率是將所述增殖速率增加為至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍。在一些實施方案中，改變所述細(xì)胞體積是將所述細(xì)胞體積增加為至少2倍。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在一些實施方案中，所述酵母是產(chǎn)油酵母。在一些實施方案中，所述產(chǎn)油酵母是解脂耶氏酵母。本發(fā)明的一些方面涉及分離的核酸分子，其包含a)編碼SEQ ID NO :1(解脂耶氏酵母SCD)的核苷酸序列,或b)與a)的核苷酸序列有至少85%的同一丨丨生的核苷酸序列。在一些實施方案中，編碼SEQ ID NO: I的核苷酸序列是SEQ ID NO :2。在一些實施方案中， 核苷酸序列與SEQ ID NO :2的核苷酸序列有至少85%的同一丨丨生。在一些實施方案中，核苷酸序列與SEQ ID NO :2的核苷酸序列有至少90%的同一丨丨生。在一些實施方案中，核苷酸序列與SEQ ID NO :2的核苷酸序列有至少95%的同一丨丨生。在一些實施方案中，核苷酸序列與SEQ ID NO :2的核苷酸序列有至少97. 5%的同一性。在一些實施方案中，核苷酸序列與SEQID NO 2的核苷酸序列有至少99%的同一性。在一些實施方案中，提供了核酸構(gòu)建體，其包含如本文所述的分離的核酸分子(例如本段所述的分離的核酸分子)和異源的分離的啟動子。在一些實施方案中，啟動子是組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。在一些實施方案中，所述組成型啟動子是翻譯延伸因子(Translation Elongation Factor,TEF)啟動子。在一些實施方案中，所述誘導(dǎo)型啟動子是藥物誘導(dǎo)型啟動子。在一些實施方案中，分離的核酸分子包含經(jīng)修飾S⑶啟動子。在一些實施方案中，修飾是完全或部分缺失和/或突變野生型S⑶啟動子序列，導(dǎo)致對應(yīng)答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的所述SCD啟動子的反饋抑制的破壞。在一些實施方案中，所述修飾是將異源序列插入野生型SCD啟動子區(qū)，任選地結(jié)合完全或部分缺失和/或突變野生型SCD啟動子序列，導(dǎo)致對應(yīng)答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的所述SCD啟動子的反饋抑制的破壞。本發(fā)明的一些方面涉及載體，其包含表達(dá)盒，例如本文中所提到的任意表達(dá)盒。本發(fā)明的一些方面涉及包含如本文所述的表達(dá)盒或如本文所述載體的至少一部分的細(xì)胞。在一些情況下，本申請的主題可以涉及相關(guān)產(chǎn)物、特定問題的可替選解決方案和/或單個系統(tǒng)或制品的多種不同的用途。本發(fā)明的其它優(yōu)點、特征和用途將通過本發(fā)明非限制性實施方案的以下詳述并結(jié)合附圖而變得明顯。在本說明書與通過引用并入的文件包含相矛盾的公開內(nèi)容的情況下，應(yīng)當(dāng)以本說明書為準(zhǔn)。


圖I :解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)的脂肪酸譜。A)在搖瓶實驗中，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基中的解脂耶氏酵母對數(shù)期培養(yǎng)物的總游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)。B)在穩(wěn)定生長期期間,在相同條件下測定相同培養(yǎng)物中的總FFA。C)在穩(wěn)定期期間，測定相同培養(yǎng)物中的總脂質(zhì)(FFA和酯化脂肪酸)。圖2 :分析解脂耶氏酵母的總脂質(zhì)。A)在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型解脂耶氏酵母菌株直至72小時穩(wěn)定期培養(yǎng)物，并在搖瓶實驗中使用GC-MS測定總脂質(zhì)。B)測定培養(yǎng)至穩(wěn)定期(72小時)且在半組成型啟動子控制下過表達(dá)SCD(天然A9去飽和酶)的突變菌株中的總脂質(zhì)。C)用尼羅紅對培養(yǎng)至穩(wěn)定期的野生型菌株進(jìn)行染色的共聚焦顯微鏡觀察。D)用尼羅紅對培養(yǎng)至穩(wěn)定期的突變菌株進(jìn)行染色并用共聚焦顯微鏡進(jìn)行分析。圖3 :在搖瓶中，解脂耶氏酵母突變體-I (過表達(dá)細(xì)胞色素B、血紅蛋白、Glutl和A 9-去飽和酶(S⑶)，(D9，■))和野生型(LS， )對純葡萄糖的葡萄糖消耗。與野生型解脂耶氏酵母相比，解脂耶氏酵母突變體-I表現(xiàn)出更快的葡萄糖消耗特性和與野生型中所觀察到的不完全消耗相比的完全葡萄糖消耗。 圖4:A)在72小時內(nèi)，玉米秸桿水解產(chǎn)物(Hz)中解脂耶氏酵母突變體I (過表達(dá)細(xì)胞色素B、血紅蛋白、Glutl和A 9-去飽和酶(S⑶))和突變體2 (過表達(dá)細(xì)胞色素B、血紅蛋白和Glutl)的糖消耗。B)在數(shù)小時內(nèi)，玉米秸桿Hz中突變體I和突變體2的油的產(chǎn)生。圖5 比較野生型和經(jīng)改造微生物的生長特性。YL-eng :過表達(dá)A 9_去飽和酶(S⑶)的突變解脂耶氏酵母。YL-wild:野生型解脂耶氏酵母。在含有濃度為250g/l的糖的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。野生型細(xì)胞不能在這些條件下生長，而突變細(xì)胞能夠耐受高水平的糖并生長良好，表明在使用突變菌株的方法中可以獲得較高的生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)率。Y軸OD值。X軸以小時表示的時間。圖6 :過表達(dá)A 9-去飽和酶(SCD)的解脂耶氏酵母突變體的糖消耗和生長特性。在含有160g/l糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，監(jiān)測培養(yǎng)物的OD和糖消耗。突變細(xì)胞在48小時內(nèi)消耗了所供應(yīng)的糖，并在分批補充糖之后繼續(xù)生長。該圖示出用于補料分批操作和半連續(xù)生物燃料生產(chǎn)方法的一個實施方案。圖7 :經(jīng)改造解脂耶氏酵母(過表達(dá)A 9-去飽和酶(S⑶)、細(xì)胞色素B和血紅蛋白)的脂質(zhì)廣生。圖8 :培養(yǎng)72小時后，突變菌株(過表達(dá)A 9_去飽和酶(SOT)、細(xì)胞色素B和血紅蛋白；每組中左側(cè)的柱)和野生型解脂耶氏酵母菌株(每組中右側(cè)的柱)的脂肪酸譜。圖9 :與野生型解脂耶氏酵母相比的不同突變解脂耶氏酵母菌株的生長動力學(xué)。CB :細(xì)胞色素B過表達(dá)體；D9 :S⑶過表達(dá)體。圖10 :在不同葡萄糖水平下，與野生型解脂耶氏酵母相比的不同突變解脂耶氏酵母菌株的生長動力學(xué)。Wild :野生型解脂耶氏酵母；C18 :過表達(dá)A9-去飽和酶(S⑶)的突變解脂耶氏酵母。圖11 :突變(過表達(dá)A9-去飽和酶(S⑶))和野生型解脂耶氏酵母的生長和脂質(zhì)生產(chǎn)動力學(xué)。圖12 :PYLEX1，用于解脂耶氏酵母中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的表達(dá)載體(A)。為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的該載體可以包含選擇標(biāo)記或來自解脂耶氏酵母URA3基因的缺陷型URA3標(biāo)記，其允許互補尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型，如由LE DALL等，Curr. Genet.，26，38-44 (1994)所述的URA3d標(biāo)記。用于調(diào)控表達(dá)的序列如在耶氏酵母中有活性的啟動子和終止子序列。在一些實施方案中，該載體包含誘導(dǎo)型或組成型啟動子。在一些實施方案中，可以在微生物中從PYLEXI過表達(dá)基因，例如，通過將目的構(gòu)建體(如在啟動子的控制下的S⑶cDNA)克隆入pYLEXl。顯示了在TEF啟動子控制下的細(xì)胞色素B和血紅蛋白cDNA的示例性克隆(B，C)。圖13 :在藻類生物質(zhì)上培養(yǎng)經(jīng)改造微生物。獲得干燥的藻類并進(jìn)行高壓處理以裂解細(xì)胞和使淀粉膠化。用a-淀粉酶酶促處理經(jīng)高壓處理的細(xì)胞以釋放葡萄糖。用我們的含有A 9-去飽和酶和細(xì)胞色素、Glutl以及血紅蛋白的突變酵母細(xì)胞接種所得培養(yǎng)基。圖中示出耶氏酵母突變體在沒有任何添加物的發(fā)酵培養(yǎng)基中的強生長。細(xì)胞在4-5天內(nèi)達(dá)到0D43。這表明突變酵母的生長沒有被抑制。圖14 :培養(yǎng)于藻類水解產(chǎn)物中的酵母細(xì)胞的顯微鏡觀察。在圖13所述條件下培 養(yǎng)細(xì)胞。收獲細(xì)胞并用尼羅紅染色以鑒定油。酵母細(xì)胞內(nèi)的微滴表示油。圖15 :培養(yǎng)于粗制甘油中的酵母細(xì)胞的顯微鏡觀察。收獲細(xì)胞并用尼羅紅染色以鑒定油。酵母細(xì)胞內(nèi)的微滴表示油。圖16 :用于產(chǎn)生A 12-去飽和酶敲除菌株的包含A 12-去飽和酶基因側(cè)翼區(qū)域和抗生素抗性序列的△ 12-去飽和酶敲除構(gòu)建體的示意結(jié)構(gòu)。圖17 :經(jīng)改造微生物在3%乙酸類(84小時時添加2%甘油)中的生長。詳述介紹鑒于化石燃料資源的減少，大量研究工作致力于開發(fā)可再生的替代品。一種有前景的方法是改造微生物以從可再生碳源生產(chǎn)生物燃料(例如生物柴油或生物柴油前體如三酰甘油)，例如通過使用產(chǎn)生脂肪酸或脂肪酸衍生物的微生物Microalgae as araw material for biofuels production(Gouveia L, Oliveira A C. J Ind MicrobiolBiotechnol. 2009Feb ；36(2) :269-74)。雖然該發(fā)明的一些方面涉及使用光合微生物(如藻類)生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體，但光合微生物的使用產(chǎn)生了一系列技術(shù)挑戰(zhàn)(Cadoret JP,Bernard 0. J Lipid biofuel production with microalgae potential andchallenges Soc Biol. 2008 ；202(3) :201-11)。研究工作的焦點轉(zhuǎn)向改造微生物以在暗發(fā)酵過程中將可再生碳源(如來自生物質(zhì)的可發(fā)酵糖(例如葡萄糖或來自玉米或甘蔗的糖)或者不可發(fā)酵碳水化合物聚合物(例如纖維素或半纖維素))轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體。經(jīng)濟(jì)上可行地生產(chǎn)生物燃料需要(i)鑒定合適的微生物，和(ii)在微生物中改造出需要和/或期望的表型，該表型可包含多種特性。這種表型中的此類需要和/或期望的特性的實例包括但不限于快速且有效的生物質(zhì)生產(chǎn)，超出不期望微生物的生長優(yōu)勢，有效地、理想地接近理論地碳水化合物到油的轉(zhuǎn)化率,和對底物及終產(chǎn)物的高耐受。這些特性中的一些是以工業(yè)規(guī)模經(jīng)濟(jì)上可行地生產(chǎn)基于微生物的生物燃料的先決條件。理想地,經(jīng)改造微生物應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出有利特性的組合，其賦予允許以可規(guī)模化的、成本節(jié)約的方式將豐富的碳源有效轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的表型。生物燃料或生物燃料前體的微生物生產(chǎn)本發(fā)明的一些方面涉及微生物介導(dǎo)的生物燃料或生物燃料前體的生產(chǎn)。術(shù)語“生物燃料”是指來自生物來源(如活細(xì)胞、微生物、真菌或植物)的燃料。該術(shù)語包括例如直接從生物來源得到的燃料(例如通過常規(guī)提取、蒸餾或精煉方法)和通過加工得自生物來源的生物燃料前體產(chǎn)生的燃料(例如通過化學(xué)修飾如酯交換方法)?？芍苯拥玫降纳锶剂系睦邮谴?如乙醇、丙醇和丁醇)、脂肪以及油。通過加工生物燃料前體(例如，脂質(zhì))得到的生物燃料的例子是生物柴油(例如，通過脂質(zhì)的酯交換反應(yīng)產(chǎn)生)和綠色柴油/經(jīng)修飾的油燃料(例如，通過油的氫化產(chǎn)生)。生物柴油也稱為脂肪酸甲(或乙)酯，它是目前經(jīng)濟(jì)上最重要的生物燃料之一，并且可以通過脂質(zhì)的酯交換反應(yīng)以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，在酯交換反應(yīng)中，氫氧化鈉和甲醇(或乙醇)與脂質(zhì)(例如三酰甘油)反應(yīng)以產(chǎn)生生物柴油和甘油。用于以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)生物柴油的原料包括動物脂肪、植物油、棕櫚油、大麻、大豆、油菜籽、亞麻、向日葵和含油藻類。在另一些方法中，微生物將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料前體如脂質(zhì)，然后其被提取并進(jìn)一步加工以產(chǎn)生生物燃料。術(shù)語“生物質(zhì)”是指由活細(xì)胞或生物(如微生物)生長和/或繁殖產(chǎn)生的物質(zhì)。生物質(zhì)可以包括細(xì)胞、微生物和/或細(xì)胞內(nèi)內(nèi)含物(例如細(xì)胞脂肪酸和TAG)以及細(xì)胞外物質(zhì)。細(xì)胞外物質(zhì)包括但不限于由細(xì)胞分泌的化合物例如分泌的脂肪酸或TAG。用于生產(chǎn)生物燃料的生物質(zhì)的重要類型是藻類生物質(zhì)和來自植物的生物質(zhì)，例如玉米秸桿和木纖維。在一些實施方案中，用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前 體的生物質(zhì)可以包括來自植物的糖，例如來自甘蔗或玉米的糖。本發(fā)明的一些方面涉及鑒定、改造和開發(fā)用于經(jīng)濟(jì)上可行地工業(yè)規(guī)模生物柴油生產(chǎn)的脂質(zhì)的微生物源，這些在之前均未被報道過。術(shù)語“脂質(zhì)”是指脂肪酸及其衍生物。因此，脂質(zhì)的例子包括脂肪酸(FA，飽和和未飽和兩者)；甘油酯或甘油脂質(zhì)，也稱為?；视腿绺视蛦熙?單酰甘油)、甘油二酯(二酰甘油)、甘油三酯(三酰甘油、TAG或天然脂肪)；磷酸甘油酯(甘油磷脂)；非甘油酯(鞘脂、固醇脂，包括膽固醇和類固醇激素、孕戊烯醇脂包括萜類、脂肪醇、蠟和聚酮)；以及復(fù)合脂質(zhì)衍生物(連接糖的脂質(zhì)或糖脂和連接蛋白質(zhì)的脂質(zhì))。脂質(zhì)是活細(xì)胞和微生物質(zhì)膜的重要部分。一些細(xì)胞和微生物還產(chǎn)生脂質(zhì)以儲存能量，例如以脂質(zhì)微滴中的三酰甘油的形式。本發(fā)明的一些方面涉及根據(jù)微生物的合適脂質(zhì)代謝鑒定用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物。術(shù)語“脂質(zhì)代謝”是指涉及脂質(zhì)的產(chǎn)生或降解的分子過程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去飽和、TAG合成、TAG儲存和TAG降解是作為細(xì)胞脂質(zhì)代謝的一部分的過程的例子。因此，術(shù)語“脂肪酸代謝”是指涉及脂肪酸的合成、產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化或降解的所有細(xì)胞或有機過程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、TAG合成及TAG降解是作為細(xì)胞脂肪酸代謝的一部分的過程的例子。術(shù)語“三酰甘油”(TAG，有時也稱為甘油三酯)是指這樣的分子其包含通過酯鍵與三個脂肪酸分子(脂肪族一元羧酸)共價連接的一分子甘油，每個脂肪酸連接于甘油分子的三個羥基(OH)之一。由于三酰甘油的還原、無水性質(zhì)，所以它是代謝能量的高濃縮儲存形式，并且是適合用于生物柴油生產(chǎn)的原料。許多細(xì)胞和生物以脂肪酸和脂肪酸衍生物(如TAG)的形式儲存代謝能量。脂肪酸及其衍生物(如TAG)提供了儲存代謝能量的理想形式。包含于C-C鍵中的能量可以通過￠-氧化有效地釋放，￠-氧化是形式上相當(dāng)于脂肪酸生物合成的逆轉(zhuǎn)的反應(yīng)，但是其由構(gòu)成不同分子途徑的不同酶介導(dǎo)和調(diào)節(jié)。微生物可以從外部供應(yīng)，內(nèi)源轉(zhuǎn)化和從頭合成來產(chǎn)生脂肪酸。本發(fā)明的一些方面涉及根據(jù)微生物從外部供給的碳源有效合成并儲存脂肪酸或脂肪酸衍生物的能力來鑒定用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物。
一種用于生物燃料生產(chǎn)的微生物本發(fā)明的一些方面涉及鑒定用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的以工業(yè)規(guī)模將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的適合微生物。迄今為止尚未鑒定允許以工業(yè)規(guī)模經(jīng)濟(jì)上可行地從碳水化合物源生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物。本發(fā)明的一些方面涉及根據(jù)解脂耶氏酵母有利的堿代謝(base metabolism)來將產(chǎn)油酵母解脂耶氏酵母鑒定為生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的生物。解脂耶氏酵母是非致病性產(chǎn)油酵母，其可以利用多種碳源包括有機酸、烴和多種脂肪和油。術(shù)語“產(chǎn)油”是指可以積累其細(xì)胞干重的多于20%的脂質(zhì)的微生物(參見 C. Ratledge 等，Microbial routes to lipids. Biochem Soc Trans. 1989Dec ；17 (6) 1139-41)。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，解脂耶氏酵母是用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物，因為解脂耶氏酵母是能夠同化碳水化合物(例如葡萄糖)或甘油作為唯一碳源的專性需氧微生物，并且與其它酵母菌株相比，解脂耶氏酵母中葡萄糖至脂肪酸和三酰甘油(TAG)的轉(zhuǎn)化較高且脂質(zhì)儲存能力較高。參見例如Beopoulos A, Cescut J, Haddouche R, Uribelarrea JL, Molina-Jouve C, Nicaud JM, Yarrowia lipolytica as a model forbio-oil production. Prog Lipid Res. 2009Nov ；48 (6) :375_87。此外，解脂耶氏酵母是研究更為深入的“非常規(guī)”酵母物種之一，并且最近完成了解脂耶氏酵母的基因組測序，包括線粒體DNA測序。Kerscher S,Durstewitz G, Casaregola S,Gaillardin C,Brandt U. ,Th ecomplete mitoch ondrial genome of Yarrowia lipolytica. Comp Funct Genomics. 2001 ；2(2) :80-90。即使尚未完成基因組序列的功能注釋，基因組序列數(shù)據(jù)的可得性也更方便了遺傳操作。參見，例如 Sokolova L, Wittig I, B arth HD, Schigger H, Brutschy B,Brandt U. , LILBID—mass spectrometry of protein complexes from blue-nativegels,a sensitive top-down proteomic approach. Proteomics.網(wǎng)上公開 2010 Feb 1，PMID :20127694。在野生型解脂耶氏酵母中，在穩(wěn)定生長期啟動從碳源的脂肪酸和TAG合成，表明存在控制脂質(zhì)代謝的嚴(yán)密調(diào)節(jié)機制。該調(diào)節(jié)機制控制可以被合成和儲存的脂質(zhì)的量，其顯著限制了原料到脂質(zhì)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。因此，野生型解脂耶氏酵母的代謝參數(shù)不適于經(jīng)濟(jì)上可行地以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體。一種微生物脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子本發(fā)明的一些方面涉及出乎意料地發(fā)現(xiàn)(i)飽和脂肪酸通過反饋回路抑制脂肪酸的從頭合成和TAG儲存，和(ii)在適于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物(例如解脂耶氏酵母)中過表達(dá)SCD、A 9-去飽和酶足以克制脂肪酸合成和TAG儲存的該反饋抑制，引起脂肪酸和/或TAG合成、儲存的顯著增加。本發(fā)明的一些方面涉及出乎意料的發(fā)現(xiàn)，除使脂肪酸和/或TAG的合成和儲存增加以外，在微生物中過表達(dá)S⑶還賦予微生物(例如，解脂耶氏酵母)生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的有利表型，其包括但不限于(i) TAG儲存途徑的超活化，(ii)生長優(yōu)勢，(iii)持續(xù)的油生產(chǎn)，(iv)對培養(yǎng)基中碳水化合物源物質(zhì)(例如，葡萄糖和另一些糖)的耐受增強，(V)脂肪酸譜改變，例如，利于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的飽和與不飽和脂肪酸的比率變化。本發(fā)明的SCD是產(chǎn)油微生物中脂肪酸代謝和TAG合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的發(fā)現(xiàn)對于旨在借助經(jīng)改造細(xì)胞將可再生碳源轉(zhuǎn)化成生物燃料或生物燃料前體的方法具有重要意義。基于本發(fā)明的一些方面，現(xiàn)在可以改變微生物(例如產(chǎn)油酵母如解脂耶氏酵母)的脂肪酸和/或TAG譜，該改變賦予以工業(yè)規(guī)模將碳水化合物轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的極理想表型，如顯著增加脂肪酸合成、TAG合成、脂肪酸和TAG、生物質(zhì)產(chǎn)量以及增強對培養(yǎng)基中高濃度底物、產(chǎn)物和/或毒素的耐受。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，根據(jù)本文所提供的方法改變微生物中的脂質(zhì)或脂肪酸代謝(例如通過單獨過表達(dá)SCD或與本文所提供的其它遺傳或非遺傳修飾組合)允許產(chǎn)生針對生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)過程進(jìn)行了優(yōu)化的微生物。本發(fā)明的一些方面涉及經(jīng)改造微生物中的脂肪酸代謝，引起微生物中脂肪酸和脂肪酸衍生物合成速率和積累增加。
天然脂肪酸分子通常具有4至28個碳原子的無分支的脂肪族鏈或尾。如果脂肪族鏈的所有碳原子均通過C-C單鍵連接，則脂肪酸被稱為“飽和的”，或者如果兩個或更多個碳原子通過C-C雙鍵連接，則脂肪酸被稱為“不飽和的”。不飽和脂肪酸在膜流動性、細(xì)胞活性、代謝、控制基因轉(zhuǎn)錄的核事件的調(diào)節(jié)中扮演重要角色。酵母中脂肪酸譜主要由C16和C18脂肪酸(例如棕櫚酸(C16)、棕櫚油酸(C16)、硬脂酸(C18)和油酸(C18))組成。棕櫚酸是具有16個碳原子的脂肪族鏈的無支鏈飽和脂肪酸(碳原子/不飽和鍵16. 0)。硬脂酸是具有18個碳原子的脂肪族鏈的無支鏈飽和脂肪酸(18. 0)。棕櫚油酸是16個碳原子的脂肪族鏈的單不飽和脂肪酸(16. I)。油酸是18個碳原子的脂肪族鏈的單不飽和脂肪酸(18. I)。酵母中少數(shù)脂肪酸種類包括C14和C26脂肪酸，它們在蛋白質(zhì)修飾中有重要功能或分別作為鞘脂和GPI錨的組分。脂肪酸的從頭合成使用大量代謝物、乙?；o酶A、ATP和NADPH，從而與依賴于這些化合物的其它細(xì)胞過程有競爭。NADPH為脂肪酸延長循環(huán)中的兩個還原步驟所需，這將脂肪酸合成與細(xì)胞的代謝狀態(tài)關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致脂肪酸合成被限制到細(xì)胞有高能量負(fù)荷的條件(由增加的ATP/AMP比率、升高的還原當(dāng)量和升高的乙?；o酶A儲備指示)下。脂肪酸代謝中涉及幾乎所有亞細(xì)胞器，表明需要在多個水平進(jìn)行調(diào)節(jié)以維持脂肪酸穩(wěn)態(tài)。大多數(shù)生物(包括酵母)能夠從多種碳源從頭合成脂肪酸。在起始步驟中，通過由乙酰輔酶A羧化酶(ACC ;在酵母中的由ACCl和HFAl編碼)向丙二酰輔酶A添加CO2來羧化乙酰輔酶A。生物素是該反應(yīng)中的重要輔因子，并通過生物素載脂蛋白連接酶(在酵母中由BPL1/ACC2編碼)與ACC載脂蛋白(apoprotein)共價連接。ACC是三功能酶，帶有生物素羧基載體蛋白(BCCP)結(jié)構(gòu)域、生物素羧化酶(BC)結(jié)構(gòu)域和羧基轉(zhuǎn)移酶(CT)結(jié)構(gòu)域。在大多數(shù)細(xì)菌中，這些結(jié)構(gòu)域表達(dá)為單獨的多肽并裝配成異復(fù)合物。相反，真核ACC(包括線粒體ACC變體(酵母中的Hfal))在單個多肽上帶有這些功能。由ACC產(chǎn)生的丙二酰輔酶A在由脂肪酸合酶、FAS和延長酶催化的循環(huán)系列反應(yīng)中作為兩個碳的供體。在酵母中，胞漿脂肪酸合成中所涉及的單獨功能分別表現(xiàn)為一個或兩個不同多肽鏈上的分離結(jié)構(gòu)域。酵母胞漿脂肪酸合酶(FAS)是由兩個亞基FaslW亞基)和Fas2(a亞基)構(gòu)成的復(fù)合物，其組織為六聚a 60 6復(fù)合物。Fasl帶有乙?；D(zhuǎn)移酶、烯酰基還原酶、脫水酶和丙二?；貦磅＾D(zhuǎn)移酶活性。Fas2包含?；d體蛋白、3-酮基還原酶、3-酮基合酶和磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶活性。酵母線粒體的脂肪酸合成通過類型II FAS系統(tǒng)進(jìn)行，其在不同多肽上帶有單獨的酶促活性Acpl,攜帶磷酸泛酰巰基乙胺基團(tuán)輔基(prosthetic phosphopantetheinegroup)的酰基載體蛋白；Ceml, ^ -酮?；?ACP合酶；0arl, 3-氧代酰基_[?；d體蛋白質(zhì)]還原酶；Htd2,3-p5基?；?硫酯脫水酶；Etrl,烯?；?ACP還原酶。Ppt2的功能是磷酸泛酰巰基乙胺蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶，其催化磷酸泛酰巰基乙胺輔基與apoACP的連接。脂肪酸從頭合成的直接產(chǎn)物是飽和脂肪酸。已知在真核生物(包括酵母)中，飽和脂肪酸是不飽和脂肪酸的前體。不飽和脂肪酸一般由特異性酶(稱為去飽和酶)通過飽和脂肪酸中C-C單鍵的去飽和而產(chǎn)生?？刂骑柡椭舅徂D(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸的調(diào)控機制尚未完全理解。在真核生物中，不飽和脂肪酸在膜流動性、細(xì)胞活性、代謝和控制基因轉(zhuǎn)錄的 核事件的調(diào)節(jié)中扮演重要角色。通常，約80%的酵母脂肪酸是單不飽和的，意指它們在其脂肪族鏈中包含一個不飽和鍵。單不飽和脂肪酸生物合成中的一個至關(guān)重要的步驟是在A9位(碳9和10之間)引入第一順式雙鍵。由硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD，也稱為A9-去飽和酶)催化該氧化反應(yīng)。雖然雙鍵的插入發(fā)生于幾種不同的其中具有亞甲基的脂肪酰輔酶A底物，但是優(yōu)選的SCD的底物是分別轉(zhuǎn)化為棕櫚油酰(16. I)輔酶A和油酰(18. I)輔酶A的棕櫚酰(16. 0)輔酶 A 和硬脂酰(18. 0)輔酶 A (Ntambi，J. Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。在1990年于釀酒酵母(S. cerevisiae)中將硬脂酰輔酶A去飽和酶基因鑒定為 OleUStukey JE 等，J Biol Chem.，1990，265 (33) :20144-9)。在 1994 年，通過從人脂肪組織分離0. 76kb的部分cDNA部分地表征了人硬脂酰輔酶A去飽和酶基因(Li等，Int. J. Cancer, 1994，57，50348-352)。在1999年該基因被完全表征，并且發(fā)現(xiàn)多腺苷酸化位點的替選使用產(chǎn)生3. 9kb和5. 2kb的兩種轉(zhuǎn)錄本(Zhang等，Biochem. J.，1999,340,255-264)。在釀酒酵母中，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)駐留和基本A 9-去飽和酶Olel催化脂肪酸的單去飽和(Martin CE, Oh CS, Jiang Y, Regulation of long chain unsaturated fatty acidsyntnesis in yeast. . Biochim Biophys Acta. 2007Mar ; 1771 (3) :271-85. Epub 2006 Jul13)。本發(fā)明的一些方面(至少部分)涉及鑒定本文所述的解脂耶氏酵母中釀酒酵母Olel的同系物SCD。以下示出解脂耶氏酵母SCD的代表性序列的非限制性例子> gi I 0548053 | ref | XP_501496. 11 YAL10C05951p [解脂耶氏酵母]MVKNVDQVDLSQVDTIASGRDVNYKVKYTSGVKMSQGAYDDKGRHISEQPFTWANWHQHINWLNFILVIALPLSSFAAAPFVSFNWKTAAFAVGYYMCTGLGITAGYHRMWAHRAYKAALPVRIILALFGGGAVEGSIRffffASSHRVHHRffTDSNKDpYDARKGFffFSHFGNMLLVpNpKNKGRTDISDLNNDffVVRLQHKYYVYVLVFMAIVLpTLVCGFGWGDWKGGLVYAGIMRYTFVQQVTFCVNSLAHWIGEQpFDDRRTPRDHALTALVTFGEGYHNFHHEFpSDYRNALIWYQYDpTKWLIWTLKQVGLAffDLQTFSQNAIEQGLVQQRQKKLDKWRNNLNWGIPIEQLpVIEFEEFQEQAKTRDLVLISGIVHDVSAFVEHHPGGKALIMSAVGKDGTAVFNGGVYRHSNAGHNLLATMRVSVIRGGMEVEVWKTAQNEKKDQNIVSDESGNRIHRAGLQATRVENPGMSGMAA (SEQ ID NO 1)> gi I 50548052 | ref | XM_501496. I 解脂耶氏酵母 YALI0C0595lp (YALIOCO595Ig)mRNA,完整 cdsATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGTCGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAACTACAAGGTCAAGTACACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGGGCCGCCACA
TTTCCGAGCAGCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCACCAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCTCTGTCGTCCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAGACCGCCGCGTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGTCTCGGTATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATCGAGCCTACAAGGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCTTGCTCTGTTTGGAGGAGGAGCTGTCGAGGGCTCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAGTCCACCACCGATGGACCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCCCGAAAGGGATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTGCCCAACCCCAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAACAACGACTGGGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTACGTT
TACGTTCTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTTGGCTGGGGCGACTGGAAGGGAGGTCTTGTCTACGCCGGTATCATGCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACTCCCTTGCCCACTGGATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTCCCCGAGACCACGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGGCTACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCCCTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCAAGTGGCTCATCTGGACCCTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAGAACGCCATCGAGCAGGGTCTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCTGGACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCAGCTGCCTGTCATTGAGTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGACCCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACGTGTCTGCCTTTGTCGAGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGCCGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTCTTCAACGGAGGTGTCTACCGACACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTTCGGTCATTCGAGGCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCCCAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGAAACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCGGGTCGAGAACCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG (SEQ ID NO :2)硬脂酰輔酶A去飽和酶或S⑶在其由輔酶A酯化的脂肪酸底物的A9-C處引入雙鍵。該活性影響飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸(例如硬脂酸與油酸)的比率。硬脂酸是SCD的主要底物，但是其它鏈長度脂肪酸也可以由SCD加工。認(rèn)為人體中的硬脂酰輔酶A去飽和酶是脂肪生成酶，這不僅是由于它在單不飽和脂肪酸的生物合成中的重要角色，還由于其通過膳食和胰島素進(jìn)行調(diào)節(jié)的模式(Ntambi，Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。因此，硬脂酰輔酶A去飽和酶的調(diào)節(jié)在生理上相當(dāng)重要并且其活性對飲食變化、激素失調(diào)、發(fā)育過程、溫度變化、金屬、醇、過氧化物酶體增殖子和酚類化合物敏感(Ntambi，Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。動物模型在通過多聚不飽和脂肪酸(PUFA)調(diào)節(jié)硬脂酰輔酶A去飽和酶的研究中非常有用。例如，在清瘦和肥胖Zucker大鼠(Jones等)的脂肪組織中觀察到，當(dāng)對兩組均飼喂與對照膳食相比PUFA含量高的膳食時，硬脂酰輔酶A去飽和酶mRNA減少了 75 %(Jones等，Am. J. Physiol.，1996，271，E44-49)。用組織培養(yǎng)系統(tǒng)獲得了類似的結(jié)果。在鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞系中，花生四烯酸、亞麻油酸、亞麻酸和二十碳五烯酸以劑量依賴的方式使硬脂酰輔酶A去飽和酶的表達(dá)降低(Sessler等，J. Biol. Chem.，1996，271，29854-29858)。對不同組織中PUFA調(diào)節(jié)硬脂酰輔酶A去飽和酶基因表達(dá)的分子機制仍了解很少。目前對調(diào)節(jié)機制的理解涉及PUFA與推定的PUFA結(jié)合蛋白相結(jié)合，然后，通過PUFA結(jié)合蛋白與硬脂酰輔酶A去飽和酶基因的順式作用PUFA應(yīng)答元件(SREBP)的結(jié)合發(fā)生轉(zhuǎn)錄抑制(Ntambi, Lipid Res.，1999，40，1549-1558 ；Zhang 等，Biochem. J.，2001，357，183-193)。雖然，已經(jīng)在不同生物中研究了 S⑶基因催化活性的調(diào)節(jié)，但S⑶基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)對脂質(zhì)代謝的意義本身仍未成為深入研究的對象。已提出SCD影響飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸(例如硬脂酸與油酸)的比率。本發(fā)明的一些方面涉及出乎意料地發(fā)現(xiàn)S⑶還作為微生物中(例如解脂耶氏酵母中)脂肪酸和TAG代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。本發(fā)明的一些方面涉及出乎意料地發(fā)現(xiàn)單獨過表達(dá)SCD基因產(chǎn)物不僅改變受影響細(xì)胞中的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比率，而且足以引起脂肪酸和/或TAG合成速率和/或儲存的顯著且出乎意料地增加。單獨操作去飽和酶表達(dá)為以工業(yè)規(guī)模將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的微生物(例如產(chǎn)油酵母細(xì)胞)賦予極理想表型的該出乎意料的發(fā)現(xiàn)對通過微生物介導(dǎo)的發(fā)酵過程從可再生碳源有效生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體具有深遠(yuǎn)意義。通過在微生物中過表達(dá)SCD克制脂肪酸合成和儲存的下調(diào)不僅賦予微生物增加的脂肪酸合成率和積累，還克服了培養(yǎng)中FA/TAG合成限于微生物的穩(wěn)定期的限制。出乎意料地，微生物(例如用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物)中SCD的過表達(dá)還賦予微生物對高濃度底物(例如可發(fā)酵糖)和與底物相關(guān)的有毒物質(zhì)(例如底物預(yù)處理過程的副產(chǎn)物)的耐受。由S⑶過表達(dá)賦予的表型(例如上述耐受提高表型)允許在將糖轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的工業(yè)發(fā)酵過程中的獲得高濃度的脂質(zhì)(參見圖11的通過S⑶過表達(dá)克服FA合成負(fù)調(diào)節(jié))。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，操作其它基因可有助于通過微生物發(fā)酵從碳源大規(guī)模生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體。例如，影響含碳底物(例如糖)轉(zhuǎn)向脂肪酸合成的基因。因此，本發(fā)明的一些方面提供了操作調(diào)節(jié)碳流入或流出脂質(zhì)合成途徑所涉及之基因的表達(dá)以實現(xiàn)脂質(zhì)生產(chǎn)參數(shù)的改善的方法。本發(fā)明的一些方面提供了對調(diào)節(jié)生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體之微生物的脂質(zhì)代謝的其它基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或活性進(jìn)行操作的方法。本發(fā)明一些方面的操作旨在增加碳水化合物向脂肪酸和/或TAG的轉(zhuǎn)化以針對從碳水化合物源大規(guī)模生產(chǎn)脂質(zhì)對所操作生物進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明一些方面提供的操作例如特定基因產(chǎn)物的過表達(dá)、敲除、敲低、活化和/或抑制可以單獨或組合，和/或與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它操作組合實施。術(shù)語“操作”是指遺傳操作(例如特定基因產(chǎn)物的過表達(dá)、敲除、敲低、活化和/或抑制)和非遺傳操作(例如培養(yǎng)基、底物、底物預(yù)處理、pH、溫度、轉(zhuǎn)化方法等的操作)二者。基因表達(dá)操作(在本文中也稱為基因表達(dá)的調(diào)控)可以是對給定基因表達(dá)的天然調(diào)節(jié)的破壞或抑制，過表達(dá)，表達(dá)的抑制或表達(dá)的完全消除。在天然基因序列(例如天然SCD基因序列)上游插入異源啟動子或在啟動子中缺失調(diào)節(jié)序列(例如介導(dǎo)SCD基因通過飽和脂肪酸的反饋抑制的調(diào)節(jié)序列)是破壞或抑制表達(dá)的天然調(diào)節(jié)的例子。調(diào)控基因表達(dá)的策略可以包括遺傳改變(例如通過重組技術(shù)如基因靶向或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo))，或者非遺傳改變(例如已知引起基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的環(huán)境改變，或者調(diào)控因子的瞬時遞送例如將藥物或 小RNA分子瞬時遞送至靶細(xì)胞)。遺傳和非遺傳改變微生物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知并且描述于例如J. Sambrook和D. Russell,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press ;第 3 版(January 15,2001) ；David C. Amberg,Daniel J. Burke ;和 Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics A Cold SpringHarbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(April2005) ；John N. Abelson,Melvin I. Simon,Christine Guthrie和Gerald R. Fink,Guide toYeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in EnzymologySeries, 194), Academic Press(March 11,2004) ；Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part B,第350卷(Methodsin Enzymology, % 350 卷),Academic Press ;第 I 版(July2, 2002) ；Christine Guthrieand Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, PartC,第351 卷,Academic Press ;第 I版(July 9,2002) ；Gregory N. Stephanopoulos,AristosA. Aristidou和 Jens Nielsen,Metabolic Engineering !Principles and Methodologies,Academic Press ； % I 版·(October 16,1998);以及 Christina SmoIke, The MetabolicPathway Engineering Handbook !Fundamentals, CRC Press ;第 I 版(July28, 2009),其全部通過引用并入本文。本文所使用的術(shù)語“過表達(dá)”是指與參照細(xì)胞(例如相同細(xì)胞類型的野生型細(xì)胞或相同細(xì)胞類型但缺少特定修飾例如遺傳修飾的細(xì)胞)相比，給定細(xì)胞、細(xì)胞類型或細(xì)胞狀態(tài)中給定基因表達(dá)水平的增加。在表現(xiàn)出會抑制野生型細(xì)胞中SCD基因表達(dá)之飽和脂肪酸濃度的解脂耶氏酵母細(xì)胞中強制地持續(xù)表達(dá)SCD基因是基因過表達(dá)的一個例子。本文所使用的術(shù)語“敲除”是指對基因產(chǎn)物(例如RNA或蛋白質(zhì))的表達(dá)的功能性破壞。其通常通過用靶向性構(gòu)建體靶向各基因組區(qū)引起來自重組基因的基因產(chǎn)物(例如mRNA或蛋白質(zhì))表達(dá)的完全抑制，所述靶向性構(gòu)建體與所述基因組區(qū)的特定部分重組并且缺失所述區(qū)的一部分和/或插入異源核苷酸或核苷酸序列。在二倍體中，這樣的同源重組事件通常只影響兩個等位基因中的一個。純合性可以通過多種策略獲得，例如通過繁殖雜合體和篩選子代。在二倍體生物(例如酵母)中，術(shù)語“敲除菌株”一般是指非功能性等位基因純合的菌株。本文所使用的術(shù)語“敲低”是指部分抑制基因產(chǎn)物(例如mRNA或蛋白質(zhì))的表達(dá)。本領(lǐng)域已知多種基因敲低策略可用于抑制基因表達(dá)(例如抑制或?qū)①Y源轉(zhuǎn)移出脂質(zhì)合成途徑的基因的表達(dá)，如產(chǎn)油酵母例如解脂耶氏酵母中的ACS2、FATU PCS60和/或AMPK)。例如，可以采用利用RNA干擾(RNAi)和/或micro RNA (miRNA)途徑(包括小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、雙鏈RNA(dsRNA) ,miRNA和本領(lǐng)域已知的其它基于核酸的小干擾分子)的基因敲低策略。在一個實施方案中，使用基于載體的RNAi模式(例如shRNA或shRNA-mir表達(dá)構(gòu)建體)降低細(xì)胞中(例如產(chǎn)油酵母細(xì)胞如解脂耶氏酵母細(xì)胞中)基因(例如抑制或?qū)①Y源轉(zhuǎn)移出脂質(zhì)合成途徑的基因，如ACS2、FATl、PCS60和/或AMPK)的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明一些方面的分離的質(zhì)?？梢园c編碼小干擾核酸(例如shRNA)的基因有效連接的啟動子。在一些實施方案中，可以使用分離的質(zhì)粒載體產(chǎn)生能夠感染細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞)的病毒顆粒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或噬菌體)。示例性病毒包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒、噬菌體和本領(lǐng)域已知以及本文中公開的其它病毒。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)活性的方法。SCD是在與輔酶A偶聯(lián)的硬脂酸的C9和ClO之間插入雙鍵的A 9去飽和酶，如在本文中其它處所詳述的，該插入步驟是產(chǎn)生去飽和的脂肪酸及其衍生物的關(guān)鍵步驟。在一些實施方案中，該操作是過表達(dá)。在一些實施方案中，操作通過使生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物與有效連接異源啟動子(例如，組成型或誘導(dǎo)型啟動子)的包含SCD基因產(chǎn)物(例如SCD蛋白)編碼核酸的表達(dá)構(gòu)建體接觸來進(jìn)行。在一些實施方案中，編碼S⑶基因產(chǎn)物的核酸包含SEQ ID NO :2的編碼序列。在一些實施方案中，S⑶是解脂耶氏酵母S⑶，例如包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的解脂耶氏酵母S⑶。在一些實施方案中，微生物是解脂耶氏酵母。在一些實施方案中，在微生物中進(jìn)行對SCD活性的操作以賦予用于大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物的增強的耐受。硬脂酰輔酶A去飽和酶基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :852825入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作c-Jun N-末端激酶2 (JNK2)的活性的方法。JNK2位于細(xì)胞質(zhì)中并在饑餓過程中催化脂肪酸分解用于產(chǎn)生能量和碳屏蔽(carbonblock)。JNK2為能量穩(wěn)態(tài)所需并在應(yīng)答于細(xì)胞低糖水平的脂肪酶活化中扮演著重要角色。參見Grimard V, Massier J, Richter D, SchwudkeD, Kalaidzidis Y, Fava E, Hermetter A, Thiele C. , siRNA screening revealsJNK2as an evolutionary conserved regulator of triglyceride homeostasis. JLipid Res. 2008Nov ；49(11) :2427-40. Epub 2008 Jul 8。在一些實施方案中，消除或降低生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中的JNK2活性，例如分別通過敲除或敲低。在一些實施方案中，降低生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中的JNK2活性以增加產(chǎn)物穩(wěn)定性和/或減少產(chǎn)物分解代謝。在一些實施方案中，使用了條件性抑制系統(tǒng)，并在碳水化合物源(例如可發(fā)酵糖)很少的生產(chǎn)過程期間抑制JNK2活性。在一些實施方案中，在微生物中對JNK2基因產(chǎn)物的活性進(jìn)行操作以賦予用于大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物增強的耐受。JNK2基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :5601入口下可見不例性的代表性基因和基因廣物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作A-12去飽和酶基因產(chǎn)物的活性的方法。△ -12去飽和酶參與將含油酸的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為高級鏈脂質(zhì)。在一些實施方案中，例如考慮到所得生物燃料的冷流特性，期望避免長鏈脂肪酸的生產(chǎn)或使其最小化以生產(chǎn)生物燃料。在一些實施方案中，消除或降低生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中△-12去飽和酶的活性，例如分別通過完全(例如，敲除)或部分基因缺失或敲低。在一些實施方案中，降低用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中的A-12去飽和酶活性以增加產(chǎn)物穩(wěn)定性、在微生物中獲得期望的TAG譜和/或降低產(chǎn)物的分解代謝。在一些實施方案中，使用條件性抑制系統(tǒng)抑制A-12去飽和酶活性。在一些實施方案中，在微生物中對A-12去飽和酶基因產(chǎn)物的活性進(jìn)行操作以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率，增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率，增加的脂質(zhì)儲存，增加的C18脂肪酸的含量，增加的微生物的總脂肪酸儲積中C18脂肪酸的百分?jǐn)?shù)，所產(chǎn)生的脂質(zhì)、油或TAG的增加的冷流特性，增加的生長速率，對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物增強的耐受。A-12去飽和酶基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :2909806入口下可見不例性的代表性基因和基因廣物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作血紅蛋白基因產(chǎn)物的活性的方法。對于血紅蛋白基因產(chǎn)物(包括用于本發(fā)明一些實施方案的血紅蛋白基因產(chǎn)物)的概述，參見Frey AD, Kallio PT. Bacterial hemoglobinsand flavoh emoglobins versatile proteinsand their impactonmicrobiology andbiotechnology. FEMS MicrobiolRev. 20030ct ；27(4) :525_45。在一些實施方案中，例如通過過表達(dá)編碼血紅蛋白蛋白質(zhì)的核酸來增加微生物中血紅蛋白基因產(chǎn)物(例如血紅蛋白蛋白質(zhì))的活性。在一些實施方案中，微生物中血紅蛋白的過表達(dá)引起微生物中氧傳遞增加。在一些實施方案中，由于增加的氧流入需要高氧的合成途徑(例如脂肪酸合成途徑)，所以增加的血紅蛋白活性導(dǎo)致生物燃料或生物燃料前體合成增加。在一些實施方案中，在微生物中操作血紅蛋白基因產(chǎn)物的活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物增強的耐受。血紅蛋白基因和基因 產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID :7738539 (Deide 12990)入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作細(xì)胞色素基因產(chǎn)物的活性的方法，所述細(xì)胞色素基因產(chǎn)物例如細(xì)胞色素B基因產(chǎn)物，更特別地為細(xì)胞色素B5基因產(chǎn)物。在一些實施方案中，通過例如過表達(dá)編碼細(xì)胞色素蛋白的核酸來增加微生物中細(xì)胞色素基因產(chǎn)物(例如細(xì)胞色素蛋白)的活性。在一些實施方案中，在微生物中過表達(dá)細(xì)胞色素引起微生物中的氧傳遞增加。在一些實施方案中，由于增加的氧流入需要高氧的合成途徑(例如脂肪酸合成途徑)，所以增加的細(xì)胞色素活性導(dǎo)致生物燃料或生物燃料前體合成增加。在一些實施方案中，在微生物中操作細(xì)胞色素基因產(chǎn)物的活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物的增強的耐受。細(xì)胞色素基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :1528入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)基因產(chǎn)物(例如Glut I基因產(chǎn)物)的活性的方法。在一些實施方案中，通過例如過表達(dá)編碼GLUT蛋白質(zhì)的核酸來增加微生物中GLUT基因產(chǎn)物(例如GLUT蛋白質(zhì))的活性。在一些實施方案中，在微生物中過表達(dá)編碼GLUT蛋白質(zhì)的核酸引起微生物的葡萄糖攝取增加。在一些實施方案中，由于葡萄糖的攝取增加，所以增加的GLUT活性導(dǎo)致生物燃料或生物燃料前體合成增加。在一些實施方案中，在微生物中操作GLUT基因產(chǎn)物的活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物增強的耐受。GLUT基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :38109入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作丙酮酸羧化酶(PC)基因產(chǎn)物的活性的方法。在一些實施方案中，通過例如過表達(dá)編碼PC蛋白質(zhì)的核酸來增加微生物中PC基因產(chǎn)物(例如PC蛋白質(zhì))的活性。在一些實施方案中，在微生物中過表達(dá)編碼PC蛋白質(zhì)的核酸引起微生物的葡萄糖攝取增加。在一些實施方案中，由于葡萄糖的攝取增加，所以增加的PC活性導(dǎo)致生物燃料或生物燃料前體合成增加。在一些實施方案中，在微生物中操作PC基因產(chǎn)物的活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物增強的耐受。PC基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :5091A口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作蘋果酸酶(ME)基因產(chǎn)物的活性的方法。ME催化(S)-蘋果酸氧化脫羧成丙酮酸，同時伴隨二氧化碳的釋放和NADP+到NADPH的轉(zhuǎn)化。在一些實施方案中，通過例如過表達(dá)編碼ME蛋白質(zhì)的核酸來增加微生物中ME基因產(chǎn)物(例如ME蛋白質(zhì))的活性。在一些實施方案中，在微生物中過表達(dá)編碼ME蛋白質(zhì)的核酸引起微生物中NADPH水平增加，導(dǎo)致充足水平的還原性代謝物(例如NADPH)用于增加脂肪酸合成。在一些實施方案中，由于NADPH水平增加，所以增加的ME活性導(dǎo)致生物燃料或生物燃料前體合成增加。在一些實施方案中，在微生物中操作ME基因產(chǎn)物的活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物增強的耐受。ME基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID : 17436入口下可見示例性的代表性基因和基因廣物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中(例如解脂耶氏酵母中)操作乙酰輔酶A羧化酶(ACC)基因產(chǎn)物的方法。ACC基因產(chǎn)物介導(dǎo)乙酰輔酶A (脂肪酸合成中的主要C2前體)轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，該轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是脂肪酸合成中的第一關(guān)鍵步驟并且還被認(rèn)為是脂肪酸合成中的限速步驟(參見Cao Y，Yang J，Xian M，Xu X,Liu W. Increasing unsaturated fatty acid contents in Esch erich ia coli bycoexpression of three different genes. Appl Microbiol Biotechnol. 2010)。在一些實施方案中，ACC活性操作是ACC過表達(dá)。在一些實施方案中，微生物中ACC過表達(dá)增加脂肪酸合成率和/或賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存、增加的生長速率、對物質(zhì)(例如碳源、生物燃料或生物燃料前體或有毒物質(zhì))濃度的增強的耐受。ACC基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :855750入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作?；o酶A合成酶(ACS)的活性的方法。ACS是催化具有輔酶A的脂肪酸的硫酯化以形成活化中間體的酶家族(參見 Lu X, Vora H, Khosla C. , Ov erproduction of free fattyacids in E.coli !implications for biodiesel production Metab Eng.2008 Nov ；10(6) :333-9)。這些中間體是磷脂、脂肪酸膽固醇酯或脂肪酸醇酯(如TAG)的前體。解脂耶氏酵母包含兩種已知的和兩種預(yù)測的酰基輔酶A合成酶。在本發(fā)明的一些實施方案中，在產(chǎn)生脂質(zhì)的生物中過表達(dá)ACS酶以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存和/或分泌、增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物增強的耐受。ACS基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中GeneID :851245入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作酰基輔酶A合成酶2(ACS2)的活性的方法，ACS2是位于過氧化物酶體中的酶并且參與脂肪酸的降解。在一些實施方案中，抑制ACS2阻止或抑制脂肪酸通過酵母分解代謝降解，并且在一些實施方案中，這種抑制補充FAAl基因產(chǎn)物活性的增加以使增加的脂肪酸分泌入培養(yǎng)基中。解脂耶氏酵母包含ACS2乙?；o酶A合成酶(參見Beopoulos A，Cescut J，Haddouche R,Uribelarrea JL, Molina-Jouve C, Nicaud JM. ,Yarrowia lipolytica as amodel for bio-oil production. Prog Lipid Res. 2009Nov ；48(6) :375-87)。在一些實施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制ACS2基因產(chǎn)物表達(dá)或活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對物質(zhì)(例如碳源、生 物燃料或生物燃料前體或有毒物質(zhì))濃度的增強的耐受。ACS2基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID :850846入口下可見不例性的代表性基因和基因廣物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作FAAl基因產(chǎn)物的活性的方法。FAAl基因產(chǎn)物催化具有輔酶A的長鏈脂肪酸的細(xì)胞質(zhì)硫酯化以產(chǎn)生活化的中間體。解脂耶氏酵母FAAl是釀酒酵母P30624FAA1長鏈脂肪酸輔酶A連接酶的同系物。該酶參與游離脂肪酸儲積的產(chǎn)生以及脂肪酸的分泌。在一些實施方案中，在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中過表達(dá)FAAl基因產(chǎn)物以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對濃度升高的碳源或脂質(zhì)產(chǎn)物增強的耐受。FAAl基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih.gov)中GeneID :854495入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中操作非常長鏈脂肪酸輔酶A合成酶(FATl)活性的方法。認(rèn)為FATl控制具有輔酶A的非常長鏈脂肪酸的脂肪酸轉(zhuǎn)運和硫酯化。解脂耶氏酵母包含F(xiàn)ATl非常長鏈脂肪酸輔酶A合成酶。在一些實施方案中，通過例如遺傳操作來抑制FATl活性以阻止非常長脂肪酸衍生物的合成和/或增加游離脂肪酸的儲積。在一些實施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制FATl基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對物質(zhì)(例如碳源、生物燃料或生物燃料前體或有毒物質(zhì))濃度的增強的耐受。FATl基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi.nlm. nih. gov)中GeneID :852329入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了操作PCS60的方法，PCS60也稱為FAT2、AMP結(jié)合蛋白?；o酶A合成酶或過氧化物酶體輔酶A合成酶，它是具有未確定底物特異性的過氧化物酶體?；o酶A合成酶。解脂耶氏酵母包含釀酒酵母PCS 60同系物。抑制PCS60將阻止非常長脂肪酸衍生物的合成并增加游離脂肪酸的儲積。在本發(fā)明的一些實施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制PCS60基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對物質(zhì)(例如碳源、生物燃料或生物燃料前體或有毒物質(zhì))濃度的增強的耐受。FAT2基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID :852523入口下可見不例性的代表性基因和基因廣物序列。本發(fā)明的一些方面提供了在用于大規(guī)模生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物(例如解脂耶氏酵母)中過表達(dá)ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)的方法。適于以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的一些微生物(包括解脂耶氏酵母)通常產(chǎn)生大量檸檬酸。ACLY介導(dǎo)檸檬酸轉(zhuǎn)化為輔酶A，根據(jù)本發(fā)明的一些方面，該反應(yīng)可以通過ACLY表達(dá)促進(jìn)(參見 Holz M, Forster A, Mauersberger S, Barth G, Aconitase overexpression changestheproduct ratio of citric acidproduction by Yarrowia lipolytica. Appl MicrobiolBiotechnol. 2009Jan ；81 (6) :1087-96) 0在一些實施方案中，ACLY過表達(dá)降低不期望的檸檬酸產(chǎn)生和/或提供其它來源的乙酰輔酶A用于合成生物燃料或生物燃料前體。在一些實 施方案中，在用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物(包括解脂耶氏酵母)中抑制檸檬酸的過量產(chǎn)生。在一些實施方案中，微生物中(例如解脂耶氏酵母中)ACLY過表達(dá)增加脂肪酸合成率和/或賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存以及增加的生長速率、對物質(zhì)(例如碳源、生物燃料或生物燃料前體或有毒物質(zhì))濃度的增強的耐受。也參見 Lasserre JP, Nicaud JM, Pagot Y, Joubert-Caron R, Caron M, HardouinJ. Talanta. First complexomic study of alkane—binding protein complexes in theyeast Yarrowia lipolytica. 2010 Feb 15 ；80(4) :1576_85。ACLY 基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID : 108728入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了過表達(dá)脂肪酸合酶復(fù)合物(FAS)的方法。雖然ACC可能是脂肪酸合成中的限速酶，但是也已提出其它步驟對該途徑進(jìn)行控制，最值得注意的是 FAS (參見 Schweizer E, JCiittig H，Regler R，Rottner G. J，Genetic control ofYarrowia lipolytica fatty acid synthetase biosynthesis and function. BasicMicrobiol. 1988 ;28 (5) :283-92)。該復(fù)合物是在整個脂質(zhì)合成途徑中底物最強(mostsubstrate-intensive)的過程中延伸脂肪酸鏈的多功能多肽。在一些實施方案中，微生物中(例如解脂耶氏酵母中)ACLY過表達(dá)增加了脂肪酸合成率和/或賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存和/或分泌、增加的生長速率、對物質(zhì)(例如碳源、生物燃料或生物燃料前體或有毒物質(zhì))濃度增強的耐受。FAS基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。NCBI 數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中 GeneID :853653 和 GeneID 855845入口下可見示例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。本發(fā)明的一些方面提供了抑制AMP活化蛋白激酶(AMPK)的方法。AMPK是通過應(yīng)答于細(xì)胞AMP =ADP比率通過磷酸化來調(diào)節(jié)其它蛋白質(zhì)的活性的調(diào)節(jié)酶(參見Lee-YoungRS, Palmer MJ, Linden KC, LePlastrier K， Canny BJ, Hargreaves M， Wadley GD， KempBE，McConell GK. Carbohydrate ingestion does not alter skeletal muscle AMPKsignaling during exercise in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006Sep ；291(3) :E566-73)。在酵母中，AMPK表現(xiàn)出靶向ACC和INO I，INOl是脂質(zhì)生物合成早期步驟所需的基因。在AMPK敲除突變體中缺少ACC磷酸化導(dǎo)致超活化的ACC和脂肪酸的過量產(chǎn)生。在一些實施方案中，在微生物中抑制AMPK引起脂質(zhì)合成的超活化。在一些實施方案中，通過例如敲除AMPK基因完全消除微生物中的AMPK活性。在一些實施方案中，通過例如遺傳或非遺傳操作抑制微生物中AMPK的活性。AMPK活性的抑制(與完全消除不同)可避免對由AMPK調(diào)節(jié)的其它細(xì)胞過程的負(fù)作用。在一些實施方案中，在微生物(例如解脂耶氏酵母)中敲除、敲低和/或抑制AMPK基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性以賦予大規(guī)模地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的有利表型，例如增加的脂質(zhì)合成率、增加的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率、增加的脂質(zhì)儲存和/或分泌、增加的生長速率、對物質(zhì)(如碳源、生物燃料或生物燃料前體或有毒物質(zhì))濃度增強的耐受。AMPK基因和基因產(chǎn)物序列為本領(lǐng)域技術(shù)
人員所公知。NCBI 數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中 GeneID : 100145903 入口下可見不例性的代表性基因和基因產(chǎn)物序列。分離的核酸本發(fā)明的一些方面提供了為微生物(例如解脂耶氏酵母)賦予生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的需要和/或期望表型之基因產(chǎn)物的編碼核酸。在一些實施方案中，該核酸是來自解脂耶氏酵母的核酸。在一些實施方案中，該核酸編碼去飽和酶，例如A9去飽和酶。在一些實施方案中，該核酸編碼解脂耶氏酵母A 9去飽和酶。在一些實施方案中，該核酸包含SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，該核酸是SEQ ID N0:1。在一些方案中，該核酸編碼基因產(chǎn)物，例如由SEQ ID NO 1編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一些方面提供了基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))，其為微生物(例如解脂耶氏酵母)賦予生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的需要和/或期望表型。在一些實施方案中，該蛋白質(zhì)是來自解脂耶氏酵母的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，該蛋白質(zhì)是去飽和酶，例如A9去飽和酶。在一些實施方案中，該蛋白質(zhì)是解脂耶氏酵母A9去飽和酶。在一些實施方案中，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列是提供于SEQ ID NO 2中的氨基酸序列。術(shù)語“核酸”是指包含多個連接的核苷酸的分子?！昂怂帷焙汀昂怂岱肿印被Q使用并且意指寡核糖核苷酸以及寡脫氧核糖核苷酸。該術(shù)語還涵蓋多核苷(即多核苷酸除去磷酸)和包含核酸的任意其它有機堿。有機堿包括腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和肌苷。核酸可以是單鏈的或雙鏈的。核酸可以天然或非天然的。核酸可以從天然來源獲得或者可以使用核酸合成儀合成(即合成的)。本領(lǐng)域中常規(guī)地進(jìn)行核酸的分離并且合適的方法可見標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)教科書。(參見，例如Maniatis’Handbook of MolecularBiology。)如本文所述，核酸可以是DNA或RNA，如基因組DNA、線粒體DNA、mRNA、cDNA、rRNA、miRNA、PNA或LNA或者其組合。根據(jù)本發(fā)明的一些方面也可使用非天然核酸如細(xì)菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)。本發(fā)明的一些方面涉及使用核酸衍生物。如將在本文中描述的，使用某些核酸衍生物可以通過防止本發(fā)明核酸的消化來增加其穩(wěn)定性，特別是當(dāng)它們暴露于可能包含核酸酶的生物樣本時。本文中所使用的核酸衍生物是非天然核酸或其單元。核酸衍生物可以包含非天然元件如非天然核苷酸和非天然骨架連接。根據(jù)本發(fā)明一些方面的核酸衍生物可以包含骨架修飾例如但并不限于硫代磷酸酯連接、磷酸二酯修飾的核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的組合、磷酸甲酯、磷酸烷基酯、磷酸酯、硫代磷酸烷基酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯(acetamidate)、羧甲基酯、硫代磷酸甲酯、二硫代磷酸酯、對乙氧基及其組合。核酸的骨架組成可以是同源的或異源的。根據(jù)本發(fā)明的一些方面的核酸衍生物可以包含糖和/或堿中的替換或修飾。例如，一些核酸衍生物可以包括具有骨架糖的核酸，骨架糖共價連接除3'位處的羥基外的和除5'位處的磷酸基外的低分子量有機基團(tuán)(例如2' -0-烷基化核糖基團(tuán))。核酸衍生物可以包括非核糖糖阿拉伯糖。核酸衍生物可以包含取代的嘌呤和嘧啶如C-5丙炔修飾堿基、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、次黃嘌呤、2-硫脲嘧啶和假異胞嘧啶。在一些實施方案中，核酸可以包括肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA) ,DNA,RNA或上述的聯(lián)合核酸(co-nucleic acid)如DNA-LNA聯(lián)合核酸。 本文所使用的術(shù)語“分離的核酸分子”是指不在其天然環(huán)境中的核酸，例如，(i)通過本領(lǐng)域已知方法從細(xì)胞或微生物(例如細(xì)菌或酵母)中提取和或/純化的核酸，所述本領(lǐng)域已知方法例如堿性裂解宿主細(xì)胞然后例如通過氧化硅吸附法純化核酸；(ii)通過例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體外擴增的核酸；(iii)通過克隆(例如將核酸克隆入表達(dá)載體)重組產(chǎn)生的核酸；(iv)通過例如體外酶消化或通過剪切然后膠分離的片段化和大小分離的核酸；或者(V)通過例如化學(xué)合成而合成的核酸。在一些實施方案中，通過本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)易于操作分離的核酸。因此，認(rèn)為克隆入載體的核酸或遞送到宿主細(xì)胞并整合入宿主基因組的核酸是分離的，但在其天然宿主中的天然狀態(tài)下(例如在宿主的基因組中)的核酸則不是。分離的核酸可以是基本純化的，但不需要如此。例如，克隆或表達(dá)載體中的分離的核酸不是純的，其可僅包含小百分比的其所處細(xì)胞中的物質(zhì)。但是本文所使用的術(shù)語中這種核酸是分離的。本發(fā)明的一些方面涉及賦予生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物所需或期望表型的基因產(chǎn)物的編碼核酸，其與啟動子或其它轉(zhuǎn)錄活化元件相連接。在一些實施方案中，編碼基因產(chǎn)物且與啟動子連接的核酸包含于表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體中。本文所使用的術(shù)語“表達(dá)載體”或“表達(dá)構(gòu)建體”是指用一系列允許特定核酸在宿主微生物(例如產(chǎn)油酵母)中轉(zhuǎn)錄的特定核酸元件重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體。在一些實施方案中，表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。在一些實施方案中，表達(dá)載體包含與啟動子有效連接的待轉(zhuǎn)錄的編碼核酸。啟動子是促進(jìn)待轉(zhuǎn)錄核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的核酸元件。啟動子通常位于相同鏈和其所控制轉(zhuǎn)錄的核酸序列的上游(或5’)。在一些實施方案中，表達(dá)載體包含與異源啟動子有效連接的待轉(zhuǎn)錄的編碼核酸。異源啟動子是非天然地與給定核酸序列有效連接的啟動子。例如，解脂耶氏酵母中的SCD基因天然地與解脂耶氏酵母SCD基因啟動子有效連接。因此，除野生型解脂耶氏酵母SCD基因啟動子以外的與SCD基因或其部分有效連接的任意啟動子(例如表達(dá)構(gòu)建體中)是異源啟動子。在一些實施方案中，表達(dá)載體包含有效連接組成型啟動子的編碼核酸，例如編碼SCD基因產(chǎn)物的核酸。術(shù)語“組成型啟動子”是指允許其相關(guān)聯(lián)的基因持續(xù)轉(zhuǎn)錄的啟動子。在一些實施方案中，表達(dá)載體包含有效連接誘導(dǎo)型啟動子的編碼核酸，例如，編碼S⑶基因產(chǎn)物的核酸。在本文中與術(shù)語“條件性啟動子”替換使用的術(shù)語“誘導(dǎo)型啟動子”是指僅在存在或不存在生物或非生物因子時允許其相關(guān)聯(lián)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。本領(lǐng)域公知的誘導(dǎo)型啟動子的例子是藥物誘導(dǎo)型啟動子(例如四環(huán)素/強力霉素誘導(dǎo)型啟動子、他莫昔芬誘導(dǎo)型啟動子)以及依賴于重組事件活化的啟動子(例如crc-介導(dǎo)的IoxP位點的重組)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知將表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體遞送到微生物(例如酵母細(xì)胞)中的方法。可以通過生物相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法將核酸(包括表達(dá)載體)遞送到原核微生物或真核微生物。根據(jù)本發(fā)明的一些方面的將核酸遞送到微生物中的方法包括但不限于不同的化學(xué)、電化學(xué)和生物方法，例如，熱休克轉(zhuǎn)化、電穿孔、轉(zhuǎn)染(例如脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或磷酸鈣轉(zhuǎn)染)。在一些實施方案中，使用用于轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的載劑或載體將核酸構(gòu)建體(例如SCD表達(dá)構(gòu)建體)引入宿主微生物中。用于將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到微生物中的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，包括例如質(zhì)粒、人工染色體和病毒載體。用于構(gòu)建核酸構(gòu)建體(包括包含組成型或誘導(dǎo)型異源啟動子的表達(dá)構(gòu)建體、敲除或敲低構(gòu)建體)的方法以及用于將核酸或核酸構(gòu)建體遞送到微生物中的方法和載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并描述于例如以下中J. Sambrook和D. Russell, Molecular Cloning ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress ;第3版(January 15,2001)；David C. Amberg,Daniel J. Burke和 Jeffrey N. Strathern,Methods in Yeast Genetics ACold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (April 2005) ； John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie 和 GeraldR. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A,第 194 卷(Methodsin Enzymology Series,194), Academic Press(March 11,2004) ；Christine Guthrie 和Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B,第 350 卷(Methods in Enzymology,第 350 卷)，Academic Press ;第 I 版(July 2,2002)；Christine Guthrie andGerald R, Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part C,第 351 卷，Academic Press ;第 I 版(July 9,2002) ；Gregory N. Stephanopoulos,Aristos A.Aristidou 和 Jens Nielsen, Metabolic Engineering !Principles andMethodologies, Academic Press ;第 I 版(October 16,1998);以及Christina SmoIke, TheMetabolic Pathway Engineering Handbook !Fundamentals,CRC Press ;第 I 版(July 28,2009)，其全部通過引用并入本文。在一些實施方案中，在微生物中對賦予微生物所需或期望表型之基因產(chǎn)物的編碼基因的天然啟動子(例如天然SCD啟動子)進(jìn)行修飾以改變其轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)。在一些實施方案中，與未經(jīng)修飾的對應(yīng)物相比，經(jīng)修飾啟動子表現(xiàn)出增加的轉(zhuǎn)錄活性。本文所使用的術(shù)語“經(jīng)修飾啟動子”是指其核苷酸序列已被人工改變的啟動子。這樣的人工改變的例子是單獨的或組合的核苷酸缺失、插入或突變。可以以靶向的方式進(jìn)行人工啟動子改變，例如通過同源重組方法，如基因靶向、敲除、敲低、定點突變或人工鋅指核酸酶介導(dǎo)的策略?；蛘?，可以通過隨機或半隨機事件如照射或非靶向的核苷酸整合后續(xù)選擇來進(jìn)行這樣的改變。一般進(jìn)行啟動子修飾以調(diào)控各啟動子的轉(zhuǎn)錄活化特性。例如，破壞或缺失介導(dǎo)應(yīng)答于胞內(nèi)脂肪酸水平升高來抑制SCD啟動子的調(diào)節(jié)元件將引起SCD基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄活化，即使在胞內(nèi)脂肪酸水平升高的條件下也是如此。類似地，將組成型活化的轉(zhuǎn)錄活化元件插入條件性啟動子區(qū)可以使各基因在正常抑制性條件下過表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知在微生物中靶向破壞(例如引起轉(zhuǎn)錄速率增加的祀向破壞)天然啟動子(例如天然SCD啟動子)的方法。在一些實施方案中，提供核酸構(gòu)建體用于在生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物中敲除A-12去飽和酶基因。在一些實施方案中，敲除構(gòu)建體包含微生物A-12去飽和酶基因的基因組序列，其側(cè)翼的核苷酸序列在插入A-12去飽和酶基因時破壞A-12去飽和酶基因產(chǎn)物的表達(dá)。在一些實施方案中，破壞A-12去飽和酶基因產(chǎn)物表達(dá)的核酸是抗生素抗性標(biāo)記物，例如腐草霉素抗性基因。在一些實施方案中，A-12去飽和酶敲除載體包含SEQ IDNO :28所提供的序列。將敲除載體遞送到微生物中的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在微生物中(例如酵母中)進(jìn)行同源重組的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。本發(fā)明并不限于該方面。微生物改造方法本發(fā)明的一些方面涉及經(jīng)改造微生物(例如解脂耶氏酵母)以表現(xiàn)出以大規(guī)模生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的所需和/或期望表型。本發(fā)明的一些方面涉及代謝改造S⑶ 途徑以得到針對生產(chǎn)生物燃料進(jìn)行了優(yōu)化的微生物。本發(fā)明的一些方面涉及代謝改造調(diào)節(jié)碳流入或流出脂肪酸合成途徑的基因以得到針對生產(chǎn)生物燃料進(jìn)行了優(yōu)化的微生物。本發(fā)明的一些方面提供了通過調(diào)節(jié)解脂耶氏酵母的天然脂代謝大大增加解脂耶氏酵母介導(dǎo)的碳源向脂質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率的方法。本發(fā)明的一些方面涉及這樣的發(fā)現(xiàn)過表達(dá)增加脂肪酸或三酰甘油積累的基因(如SC1D)不僅引起脂質(zhì)積累增加，而且引起脂質(zhì)合成率、脂質(zhì)含量和/或生長速率增加。顯著地和出乎意料地，根據(jù)由本發(fā)明提供的一些方法的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)還賦予另一些有利性質(zhì)，例如對原料物質(zhì)(包括高濃度底物(例如葡萄糖))和/或通常污染原料(例如經(jīng)預(yù)處理的原料)的有毒物質(zhì)的耐受增強。這樣的污染物質(zhì)的一些非限制性例子是糠醛、5-羥甲基糠醛和乙酸類。預(yù)處理后產(chǎn)生污染的有毒物質(zhì)的原料物質(zhì)的非限制例子是來自木材的原料、玉米秸桿和甘蔗渣。本發(fā)明的一些方面涉及在解脂耶氏酵母中通過克制脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄抑制(例如通過克制SCD的轉(zhuǎn)錄抑制)來改造出所需和/或期望表型。還考慮了在產(chǎn)生生物燃料的另一些微生物(例如酵母、細(xì)菌、真菌或藻類)中操作脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(例如，SCD)。為了改造用于以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)生物燃料的生物(例如產(chǎn)油酵母)，重要的是詳細(xì)理解各生物中調(diào)控脂肪酸和脂質(zhì)代謝的分子機制。直至本發(fā)明，用于生物燃料生產(chǎn)的產(chǎn)生油的微生物(例如產(chǎn)油酵母)中的脂肪酸和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子的鑒定和功能注釋仍未解決。本發(fā)明的一些方面提供了產(chǎn)油酵母解脂耶氏酵母中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子基因SCD的鑒定和功能注釋。還提供了分離的SCD核酸和蛋白質(zhì)分子。本發(fā)明的一些方面涉及通過遺傳改造在微生物中改造出用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的期望表型。本發(fā)明的一些方面涉及在微生物中操作參與生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體(例如脂肪酸或三酰甘油)的基因。本發(fā)明的一些方面涉及在微生物中平行地操作參與生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的多個基因。在一些實施方案中，通過本發(fā)明的一些方面提供的方法操作單個基因來改造微生物用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體，所述基因例如A 9去飽和酶(例如，S⑶)、GLUT (例如，Glutl)、血紅蛋白、細(xì)胞色素(例如，細(xì)胞色素B5)、蘋果酸酶、ACC、ACS、ACS2、FAAUFAT1、FAT2、ACLY、FAS、AMPK、JNK2或A-12去飽和酶。在一些實施方案中，通過本發(fā)明的一些方面提供的方法操作多個基因來改造微生物用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體，所述基因例如A9去飽和酶(例如，S⑶)、GLUT(例如，Glutl)、血紅蛋白、細(xì)胞色素(例如，細(xì)胞色素 B5)、蘋果酸酶、ACC、ACS、ACS2、FAAl、FATl、FAT2、ACLY、EAS, JNK2、A-12 去飽和酶和/或AMPK中兩個或更多個的任意組合。在一些實施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因產(chǎn)物和另外的基因產(chǎn)物表達(dá)的其它操作(例如遺傳操作)，所述另外的基因產(chǎn)物例如GLUT (例如，Glutl)、血紅蛋白、細(xì)胞色素(例如，細(xì)胞色素B5)、蘋果酸酶、ACC、ACS、ACS2、FAA1、FAT1、FAT2、ACLY、FAS、JNK2、A-12去飽和酶或AMPK基因產(chǎn)物。在一些實施方案中，改造微生物以包含增加水平的S⑶基因產(chǎn)物和血紅蛋白基因產(chǎn)物。在一些實施方案中，改造微生物以包含增加水平的S⑶基因產(chǎn)物和GLUT基因產(chǎn)物(例如Glutl基因產(chǎn)物)。在一些實施方案中，改造微生物以包含增加水平的S⑶基因產(chǎn)物、GLUT基因產(chǎn)物(例如Glutl基因產(chǎn)物)以及血紅蛋白和/或細(xì)胞色素基因產(chǎn)物。在一些實施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因產(chǎn)物和Glutl、血紅蛋白以及細(xì)胞色素b5和任選的△ 12去飽和酶敲除。在一些實施方案中，微生物是解脂耶氏酵母。用于生產(chǎn)生物燃料的經(jīng)改造微生物 本發(fā)明的一些方面涉及針對大規(guī)模生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體進(jìn)行了改造和/或優(yōu)化的微生物。在一些實施方案中，提供了通過由本發(fā)明的一些方面提供的方法或者使用由本發(fā)明的一些方面提供的核酸或蛋白質(zhì)進(jìn)行了操作的經(jīng)改造微生物。在一些實施方案中，提供了過表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的一些方面為微生物賦予生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體所需和/或期望之表型的基因產(chǎn)物的經(jīng)改造微生物。在一些實施方案中，提供了包含增加的SCD基因產(chǎn)物活性的微生物。在一些實施方案中，微生物表現(xiàn)出增加的脂肪酸合成率、增加的TAG儲存和/或其它所需或期望性狀。 在一些實施方案中，經(jīng)改造微生物是產(chǎn)油酵母，例如解脂耶氏酵母。在一些實施方案中，由本發(fā)明提供的經(jīng)改造酵母表現(xiàn)出一個或更多個極理想和出乎意料的表型特性，例如增加的碳至油的轉(zhuǎn)化(例如以接近理論值的比率)、強生長、持續(xù)的油生產(chǎn)、顯著的生物質(zhì)生產(chǎn)以及對碳源和相關(guān)物質(zhì)增強的耐受。在一些實施方案中，由本發(fā)明的一些方面提供的經(jīng)改造微生物(例如，經(jīng)改造酵母)表現(xiàn)出約0.02g/g(所產(chǎn)生的油、脂質(zhì)或TAG的克數(shù)/所消耗的葡萄糖的克數(shù))至約0. 3g/g的碳至油轉(zhuǎn)化率。在一些實施方案中，由本發(fā)明的一些方面提供的經(jīng)改造微生物(例如經(jīng)改造酵母)表現(xiàn)出以下碳至油轉(zhuǎn)化率約0. 010g/g(所產(chǎn)生TAG的克數(shù)/所消耗的葡萄糖的克數(shù))、約 0. 02g/g,約 0. 025g/g,約 0. 03g/g,約 0. 04g/g,約 0. 05g/g,約 0. 06g/g,約 0. 07g/g,約 0. 075g/g,約 0. 08g/g,約 0. 09g/g,約 0. lg/g,約 0. llg/g,約 0. 12g/g,約0. 13g/g,約 0. 14g/g,約 0. 15g/g,約 0. 16g/g,約 0. 17g/g,約 0. 18g/g,約 0. 19g/g,約 0. 2g/g,約 0. 21g/g,約 0. 22g/g,約 0. 23g/g,約 0. 24g/g,約 0. 25g/g,約 0. 26g/g,約 0. 27g/g,約0. 28g/g，約0. 29g/g或約0. 3g/g或者接近理論值。在一些實施方案中，由本發(fā)明的一些方面提供的經(jīng)改造微生物(例如經(jīng)改造酵母)表現(xiàn)出以下碳至油轉(zhuǎn)化率至少約0. OlOg/g(所產(chǎn)生的TAG克數(shù)/所消耗的葡萄糖克數(shù))、至少約0. 02g/g、至少約0. 025g/g、至少約0. 03g/g、至少約0. 04g/g、至少約0. 05g/g、至少約0. 06g/g、至少約0. 07g/g、至少約0. 075g/g、至少約 0. 08g/g、至少約 0. 09g/g、至少約 0. lg/g、至少約 0. llg/g、至少約 0. 12g/g、至少約0. 13g/g、至少約0. 14g/g、至少約0. 15g/g、至少約0. 16g/g、至少約0. 17g/g、至少約0. 18g/g、至少約0. 19g/g、至少約0. 2g/g、至少約0. 21g/g、至少約0. 22g/g、至少約0. 23g/g、至少約 0. 24g/g、至少約 0. 25g/g、至少約 0. 26g/g、至少約 0. 27g/g、至少約 0. 28g/g、至少約0. 29g/g或至少約0. 3g/g或接近理論值。在一些實施方案中，與野生型酵母相比，由本發(fā)明的一些方面提供的經(jīng)改造酵母表現(xiàn)出增加為以下的生物質(zhì)產(chǎn)生約2倍、約2. 5倍、約5倍、約7. 5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約32倍、約35倍或約40倍。在一些實施方案中，由本發(fā)明的一些方面提供的經(jīng)改造酵母表現(xiàn)出對碳源和/或相關(guān)物質(zhì)濃度的耐受為由野生型酵母所耐受的最高濃度的多至約150%、多至約175%、多至約200%、多至約225%、多至約250%、多至約275%、多至約300%、多至約325%、多至約350%、多至約375%、多至約400%或多至約500%。碳源相關(guān)物質(zhì)的非限制性例子包括污染碳源的有毒物質(zhì)，例如在預(yù)處理碳源期間產(chǎn)生或使用的物質(zhì)(例如，酸性物質(zhì)如乙酸類或氨)。
本文中所示出的數(shù)據(jù)確定了產(chǎn)油酵母中脂質(zhì)積累的一個新的限速步驟，改造其使得經(jīng)操作的微生物大大改進(jìn)就從碳水化合物源(例如葡萄糖)生產(chǎn)生物燃料而言的特性。因此，由本發(fā)明提供的方法和生產(chǎn)是使用微生物(例如酵母)發(fā)酵從可再生碳水化合物源替代性地生成生物燃料的重大進(jìn)步。用于生產(chǎn)生物燃料的微生物培養(yǎng)物本發(fā)明的一些方面涉及本文中所提供的或者根據(jù)本發(fā)明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分離的核酸或蛋白質(zhì)的微生物培養(yǎng)物。在一些實施方案中，培養(yǎng)物包含本文中所提供的或者根據(jù)本發(fā)明的一些方面改造的或者包含來自本文列出的分離的核酸或蛋白質(zhì)的微生物，以及培養(yǎng)基(例如液體培養(yǎng)基)。在一些實施方案中，培養(yǎng)物包含本文中所提供的或者根據(jù)本發(fā)明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分離的核酸或蛋白質(zhì)的微生物，以及碳水化合物源。在一些實施方案中，培養(yǎng)物包含本文中所提供的或者根據(jù)本發(fā)明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分離的核酸或蛋白質(zhì)的微生物，以及建立順應(yīng)微生物的存活、生長和或微生物中碳水化合物向生物燃料或生物燃料前體轉(zhuǎn)化的鹽度、滲透壓和pH條件的鹽和/或緩沖液。在一些實施方案中，培養(yǎng)物包含其它組分，例如添加劑。添加劑的非限制性實例是營養(yǎng)物、酶、氨基酸、白蛋白、生長因子、酶抑制劑(例如蛋白酶抑制劑)、脂肪酸、脂質(zhì)、激素(例如地塞米松和赤霉素)、微量元素、無機化合物(例如還原劑如錳)、氧化還原調(diào)節(jié)劑(例如抗氧化劑)、穩(wěn)定劑(例如二甲亞砜)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明膠、抗生素(例如布雷菲德菌素A)、鹽(例如NaCl)、螯合劑(例如EDTA、EGTA)和酶(例如纖維素酶、分散酶(dispase)、透明質(zhì)酸酶或DNA酶)。在一些實施方案中，培養(yǎng)物可以包含誘導(dǎo)或抑制從條件性或誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄的藥物，例如多西環(huán)素、四環(huán)素、他莫昔芬、IPTG、激素或金屬離子。盡管具體培養(yǎng)條件(例如碳源的濃度)取決于各待培養(yǎng)的經(jīng)改造微生物，但用于產(chǎn)生微生物培養(yǎng)物的一般方法和培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并描述于例如以下中J. Sambrook和D. Russell,Molecular Cloning ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press ;第 3 版(January 15,2001) ；David C. Amberg, Daniel J. Burke 和Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics A Cold Spring Harbor LaboratoryCourse Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005) ；John N. Abelson,Melvin I. Simon, Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology, Part A,第 194 卷(Methods in Enzymology Series,194), AcademicPress (March 11,2004) ；Christine Guthrie和Gerald R. Fink,Guide to Yeast Geneticsand Molecular and CEllBiology,Part B,第 350 卷(Methods in Enzymology, Vol 350),Academic Press ;第 I 板(July 2,2002)；以及 Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology Part C,第351 善,AcademicPress ;第I版(July 9，2002)，其全部通過引用并入本文。如本領(lǐng)域公知的，對于油生產(chǎn)，在適于油積累的條件下培養(yǎng)本文所述的經(jīng)改造微生物培養(yǎng)物。在一些實施方案中，提供了顯示超出相同類型的野生型微生物和/或超出其它微
生物(例如通常見于在碳源向生物燃料或生物燃料前體轉(zhuǎn)化中污染微生物培養(yǎng)物的微生物)的生長優(yōu)勢的經(jīng)改造微生物。例如，在一些實施方案中，提供了與相同類型的野生型微生物或其它微生物相比表現(xiàn)出增加的增殖速率和/或在對相同種類的野生型微生物和/或其它微生物有毒或限制生長或繁殖的條件下的增強的耐受或存活力。在一些實施方案中，由本發(fā)明的一些方面提供的經(jīng)改造微生物的生長和/或增殖優(yōu)勢轉(zhuǎn)化成使用未滅菌培養(yǎng)和發(fā)酵條件來生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的可能性，因為這樣緩解或完全取消了由污染微生物引起的培養(yǎng)物過度生長問題。在一些實施方案中，在未滅菌條件下培養(yǎng)由本發(fā)明的一些方面提供的經(jīng)改造微生物以生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體。例如，在一些實施方案中，使用未滅菌原料、未滅菌培養(yǎng)基、未滅菌添加物或未滅菌生物反應(yīng)器(例如未滅菌條件下的開放反應(yīng)器)生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體。用于生產(chǎn)生物燃料的方法/原料/生物反應(yīng)器本發(fā)明的一些方面涉及使用本發(fā)明的經(jīng)修飾微生物生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的方法。在一些實施方案中，提供了以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的方法。使用由本發(fā)明的一些方面提供的方法可以將多種碳源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體。糖、淀粉和纖維是適用于由本發(fā)明的一些方面提供的轉(zhuǎn)化方法的碳水化合物源的非限制性例子。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，碳水化合物源可以包含精煉和/或未精煉的糖、淀粉和/或纖維或者其任意組合。糖的非限制性例子是可發(fā)酵糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和乳糖。淀粉的非限制性例子是淀粉酶和支鏈淀粉。纖維的非限制性例子是植物纖維，如纖維素、半纖維素和木質(zhì)纖維。本發(fā)明的一些方面涉及使用工業(yè)副產(chǎn)品、中間產(chǎn)物或廢品(例如粗植物提取物、糖蜜、秸桿或污水)作為碳源。在一些實施方案中，碳源來自藻類。在一些實施方案中，特意產(chǎn)生藻類生物質(zhì)以在微生物介導(dǎo)的生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)中用作碳源。在一些實施方案中，提供了用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的方法，其包括使用廉價的、豐富的和易于得到的碳源原料作為碳源。在一些實施方案中，使用纖維素或半纖維作為碳源。在一些實施方案中，纖維素或半纖維素來自工業(yè)副產(chǎn)品或廢品。在一些實施方案中，纖維素或半纖維素直接地來自植物或藻類生物質(zhì)。植物或藻類生物質(zhì)是最豐富的原料之一，并且包括大量不可發(fā)酵糖和纖維，例如纖維素和半纖維素。在一些實施方案中，預(yù)處理生物質(zhì)原料以將不可發(fā)酵糖或纖維轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖，從而使其可用于微生物生長和微生物介導(dǎo)的生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)。在一些實施方案中，生物質(zhì)原料的預(yù)處理包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的預(yù)處理方法將纖維素和/或半纖維素組分解聚為單糖，所述預(yù)處理方法例如稀酸或氨纖維膨脹(AFEX)法(參見,例如Yang B,ffyman CE. Dilute acidand autohydrolysis pretreatment. Methods Mol Biol. 2009 ;581 :103—14 ;Balan V，BalsB， Chundawat SP, Marshall D， Dale BE， Lignocellulosic biomasspretreatment usingAFEXMethods Mol Biol. 2009 ；581 :61-77)。用于將生物質(zhì)聚合物解聚為單糖的其它方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知并考慮用于本發(fā)明的一些實施方案中。在一些實施方案中，使用稀酸法預(yù)處理包含不可發(fā)酵糖的生物質(zhì)原料以將不可發(fā)酵糖解聚為可發(fā)酵單糖。在一些實施方案中，在適度溫和的溫度下用稀硫酸以確定的時間處理生物質(zhì)。例如，在一些實施方案中，用約0. 5%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%或約6%的硫酸處理生物質(zhì)。在一些實施方案中，在約30°C、約371、約401、約50°C、約60°C、約 70°C、約 80°C、約 90°C、約 100°C、約 110°C、約 120°C、約 130°C、約 140°C、約 150°C、約175°C、約200°C或多于約200°C下處理生物質(zhì)。 在一些實施方案中，所得水解產(chǎn)物包含不溶性木質(zhì)素和可溶性纖維素聚合物和半纖維素聚合物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如通過用纖維素酶或其它水解酶)處理來進(jìn)一步處理后面的產(chǎn)物以產(chǎn)生己糖和戊糖如葡萄糖和木糖單體。在一些實施方案中，用稀酸預(yù)處理不可發(fā)酵糖導(dǎo)致產(chǎn)生包含有毒化合物的副產(chǎn)物，根據(jù)本發(fā)明的一些方面，其抑制未改造微生物的生長、降低其活力和/或抑制其生物燃料或生物燃料前體的生產(chǎn)。在一些實施方案中，洗滌經(jīng)預(yù)處理的原料，補充支持微生物生長和生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的培養(yǎng)基和/或加過量石灰以解毒。在一些實施方案中，使用AFEX法預(yù)處理包含不可發(fā)酵糖的生物質(zhì)原料以使不可發(fā)酵糖解聚為可發(fā)酵單糖。在一些實施方案中，在高溫和高壓下用液氨以確定的時間處理生物質(zhì)。在一些實施方案中，處理生物質(zhì)約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約60分鐘、約70分鐘、約80分鐘、約90分鐘或更長。在一些實施方案中，在約30°C、約 37°C、約 40°C、約 50°C、約 60°C、約 70°C、約 80°C、約 90°C、約 100°C、約 110°C、約 120°C、約130°C、約140°C、約150°C、約175°C、約200°C或多于約200°C下處理生物質(zhì)。在一些實施方案中，AFEX預(yù)處理導(dǎo)致包含于原料中的結(jié)晶纖維素轉(zhuǎn)化為非定形的可發(fā)酵形式。在一些實施方案中，經(jīng)AFEX預(yù)處理的生物質(zhì)原料不包含大量抑制微生物生長和/或生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的有毒副產(chǎn)物，并且使用之前無需為生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體而解毒。在一些實施方案中，用水解或解聚糖聚合物的酶(例如用纖維素酶或半纖維素酶)處理經(jīng)預(yù)處理或未經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)原料。在一些實施方案中，使原料與酶在液相中接觸，并在使得酶催化解聚或水解反應(yīng)的溫度下孵育足以水解或解聚生物質(zhì)原料中的顯著量不可發(fā)酵糖或纖維的一段時間。在一些實施方案中，孵育以水解和解聚之后，通過例如離心將與酶接觸的原料的液相(包含可溶性可發(fā)酵糖級分)與包含不可發(fā)酵糖和纖維的固相分離。在一些實施方案中，隨后使原料的液體級分與用于轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的微生物(例如由本發(fā)明的一些方面提供的)接觸。在一些實施方案中，不可發(fā)酵糖或纖維的酶促轉(zhuǎn)化發(fā)生于聯(lián)合的生物過程中，例如與所產(chǎn)生的可發(fā)酵糖向生物燃料或生物燃料前體的微生物轉(zhuǎn)化在相同時間和/或相同反應(yīng)器中。在一些實施方案中，先進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化，然后使與酶接觸的原料與生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物接觸。在一些實施方案中，在相同時間和在相同反應(yīng)器中進(jìn)行酶促和微生物轉(zhuǎn)化。在一些實施方案中，以乙酸類作為主要碳源來培養(yǎng)本文中提供的經(jīng)改造微生物，例如過表達(dá)SCD基因且任選地攜帶本文所述的其它修飾的解脂耶氏酵母。例如，在一些實施方案中，在濃度為以下的乙酸類溶液中培養(yǎng)微生物:約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%。在一些實施方案中，乙酸類濃度為約3% 10%。在一些實施方案中，以乙酸類作為主要碳源培養(yǎng)的包含如本文所提供的經(jīng)改造微生物的細(xì)胞培養(yǎng)物與甘油接觸或被摻入甘油。在一些實施方案中，使微生物與甘油間歇地接觸。在一些實施方案中，使微生物與甘油連續(xù)地或半連續(xù)地接觸。在一些實施方案中，微生物與濃度為約0. 5%、約1%、約2%、約3%、約4%或約5%的甘油接觸。使本文所提供的經(jīng)改造微生物與甘油接觸為產(chǎn)生TAG提供了更需要代謝物，并且從碳水化合物生產(chǎn)脂肪酸所需的還原部分。在一些實施方案中，在使用除乙酸類以外的碳源(例如本文所述的任意碳源)進(jìn)行生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)方法中摻入甘油。 在一些實施方案中，大規(guī)模的微生物介導(dǎo)的碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)酵過程可以在生物反應(yīng)器中進(jìn)行。本文中替換使用的術(shù)語“生物反應(yīng)器”和“發(fā)酵器”是指其中發(fā)生生物和/或化學(xué)反應(yīng)(其至少部分涉及活生物或者活生物的部分)的封閉物(enclosure)或部分封閉物。“大規(guī)模生物反應(yīng)器”或“工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器”是用于以商業(yè)或半商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)物(例如生物燃料或生物燃料前體例如脂肪酸和/或TAG)的生物反應(yīng)器。大規(guī)模生物反應(yīng)器的體積范圍通常在數(shù)升、數(shù)百升、數(shù)千升或更大。根據(jù)本發(fā)明一些方面的生物反應(yīng)器可以包含微生物或微生物培養(yǎng)物。在一些實施方案中，生物反應(yīng)器可以包含例如由本發(fā)明的一些方面提供的任意分離的微生物的芽孢和/或任意種類的休眠細(xì)胞類型，例如呈干燥狀態(tài)的。在一些實施方案中，向這樣的生物反應(yīng)器中添加合適的碳水化合物源可以引起休眠細(xì)胞的活化，例如酵母孢子的萌發(fā)和隨后至少部分碳水化合物源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體。根據(jù)本發(fā)明一些方面的一些生物反應(yīng)器可以包含細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中微生物與移動液體和/或氣泡接觸。根據(jù)本發(fā)明的一些方面的微生物或微生物培養(yǎng)物可以在懸液中或者附著到固相載體上培養(yǎng)。載體系統(tǒng)的非限制性例子包括微載體(例如可以是多孔的或非多孔的聚合物球體、微珠和微盤)、具有特定化學(xué)基團(tuán)(例如叔胺基)的交聯(lián)珠(例如葡聚糖)、包含捕獲于無孔聚合物纖維的細(xì)胞的2D微載體、3D微載體(例如，可以包含多孔纖維的載體纖維、空心纖維、多筒反應(yīng)器和半滲透膜)、具有降低的離子交換能力的微載體、包封的細(xì)胞、毛細(xì)管和聚集體。載體可以由材料如葡聚糖、明膠、玻璃和纖維素制成?？梢砸赃B續(xù)、半連續(xù)或非連續(xù)模式進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明一些方面的工業(yè)規(guī)模的碳水化合物向脂質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程。根據(jù)本發(fā)明的操作模式的非限制性例子是分批、補料分批、延伸分批(extended batch)、重復(fù)分批、抽/填、旋轉(zhuǎn)壁、旋轉(zhuǎn)瓶和/或灌注模式的操作。在一些實施方案中，可以使用允許從生物反應(yīng)器連續(xù)或半連續(xù)補給底物原料(例如碳水化合物源)和/或連續(xù)或半連續(xù)分離產(chǎn)物(例如分泌脂質(zhì)、包含脂質(zhì)的有機相、和/或表現(xiàn)出所需脂質(zhì)含量的細(xì)胞)的生物反應(yīng)器。本發(fā)明生物反應(yīng)器的非限制性例子是攪拌式發(fā)酵罐、通過旋轉(zhuǎn)混合裝置進(jìn)行攪拌的生物反應(yīng)器、恒化器、通過振搖裝置進(jìn)行攪拌的生物反應(yīng)器、氣升式發(fā)酵器、填充床反應(yīng)器、固定床反應(yīng)器、流化床生物反應(yīng)器、利用波誘導(dǎo)型攪拌的生物反應(yīng)器、離心式生物反應(yīng)器、輥瓶和空心纖維生物反應(yīng)器、輥裝置(例如臺式的、車載的和/自動種類的)、垂直堆疊盤、轉(zhuǎn)瓶、攪拌或搖動瓶、振蕩式多孔板、MD瓶、T瓶、Roux瓶、多表面組織培養(yǎng)培育器、改進(jìn)的發(fā)酵器和包被的珠(例如，用血清蛋白、硝化纖維素或羧甲基纖維素包被以防止細(xì)胞粘附的珠)。根據(jù)本發(fā)明一些方面的生物反應(yīng)器和發(fā)酵器可以任選地包含傳感器和/或控制系統(tǒng)以測量和/或調(diào)節(jié)反應(yīng)參數(shù)。反應(yīng)參數(shù)的非限制性例子是生物參數(shù)例如生長速率、細(xì)胞大小、細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞密度、細(xì)胞類型或細(xì)胞狀態(tài)；化學(xué)參數(shù)例如pH、氧化還原電位、反應(yīng)底物和/或產(chǎn)物的濃度、溶解氣體的濃度例如氧濃度和CO2濃度、營養(yǎng)物濃度、代謝物濃度、葡萄糖濃度、谷氨酰胺濃度、丙酮酸濃度、磷灰石濃度、寡聚肽濃度、氨基酸濃度、維生素濃度、激素濃度、添加劑濃度、血清濃度、離子強度、離子濃度、相對濕度、摩爾濃度、滲透壓、其它化學(xué)品(例如緩沖劑、佐劑或反應(yīng)副產(chǎn)物)的濃度；物理/化學(xué)參數(shù)，例如密度、傳導(dǎo)率、攪拌程度、壓力和流速、剪切應(yīng)力、剪切速率、粘度、顏色、濁度、光吸收、混合速率、轉(zhuǎn)化率以及熱動力學(xué)參數(shù)，例如溫度、光強/光質(zhì)等。
能夠測量本文所述的參數(shù)的傳感器為力學(xué)和電學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知?；趶谋疚乃龅膫鞲衅鬏斎肽軌蛘{(diào)節(jié)生物反應(yīng)器中參數(shù)的控制系統(tǒng)為生物反應(yīng)器工程領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知?？梢栽诤线m的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)本發(fā)明一些方面所提供的多種不同微生物以根據(jù)本發(fā)明的一些方面進(jìn)行大規(guī)模的碳水化合物向生物燃料或生物燃料前體轉(zhuǎn)化，例如來自多種酵母(如產(chǎn)油酵母)、細(xì)菌、藻類和真菌源的微生物。酵母細(xì)胞的非限制性例子是來自以下的細(xì)胞解脂耶氏酵母、多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、貝酵母(S. bayanus)、克魯氏乳酸酵母(S. K. lactis)、Waltomyceslipofer. Mortierella alpine、Mortierella isabellina、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、魯氏毛霉(Mucor rouxii)、皮狀絲抱酵母(Trichosporon cutaneu)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、淀粉酶酵母(Saccharomyces diastasicus)、許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、釀酒酵母(S. cerevisiae)、樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。細(xì)菌的非限制性例子是枯草桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、鏈霉菌(Streptomyces)、突光假單抱菌(Pseudomonas fIuorescens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、假單抱菌屬(Pseudomonas sp)、紅球菌屬(Rhodococcus sp)、鏈霉菌屬(Streptomvces sp)和產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes sp.)?？梢詮睦缫韵挛锓N培養(yǎng)真菌細(xì)胞曲霉菌西肉薩米(Aspergillusshirousamii)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。藻類細(xì)胞的非限制性例子是來自以下的細(xì)胞富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)、對斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、微藻屬(Nannochloropsis sp)、杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、小球藻(Chlorella vulgaris)、浮水小球藻(Chlorellaemersonii)和極大螺方定藻(Spirulina maxima)。根據(jù)本發(fā)明一些方面轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的碳水化合物源的類型取決于所使用的特定微生物。由本發(fā)明的一些方面提供的一些微生物可以用于有效地轉(zhuǎn)化特定碳水化合物源，而不同的碳水化合物源可能不能被相同的微生物高效處理或者根本不能處理。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，產(chǎn)油酵母解脂耶氏酵母可以有效地將糖(如葡萄糖、果糖、蔗糖和/或乳糖)和糖含量較高的碳水化合物源(例如糖蜜)和植物纖維轉(zhuǎn)化為脂肪酸及其衍生物。在一些實施方案中，由本發(fā)明的一些方面提供的微生物(例如產(chǎn)油酵母如解脂耶氏酵母)至少部分地分泌產(chǎn)生自碳源原料的生物燃料或生物燃料前體，例如脂肪酸或三酰甘油。在一些實施方案中，使本發(fā)明一些方面提供的微生物與碳水化合物源在反應(yīng)器中的水性溶液中接觸，并且所分泌的生物燃料或生物燃料前體形成可以與水相分離的有機相。本文所使用的術(shù)語有機相是指包含非極性有機化合物(例如脂肪酸、TAG和/或其它非極性脂質(zhì))的液相。本發(fā)明的有機相可以進(jìn)一步包含微生物、碳水化合物或見于各生物反應(yīng) 器中其它相中的其它化合物。用于工業(yè)規(guī)模的相分離的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。在一些實施方案中，有機相被連續(xù)地或半連續(xù)地吸除。在一些實施方案中，使用包含連續(xù)地或半連續(xù)地提取有機相的分離器的生物反應(yīng)器。在一些實施方案中，生物燃料或生物燃料前體在根據(jù)本發(fā)明一些方面的細(xì)胞中積累。在一些實施方案中，通過例如離心、沉降或過濾從生物反應(yīng)器中連續(xù)地或半連續(xù)地分離積累了期望量的生物燃料或生物燃料前體的細(xì)胞?？梢岳缁诩?xì)胞物理特性(如細(xì)胞大小或密度)的變化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)一步進(jìn)行的細(xì)胞分離。然后，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知標(biāo)準(zhǔn)萃取方法(例如溶劑己烷萃取)從各細(xì)胞中萃取所積累的生物燃料或生物燃料前體。在一些實施方案中，收集微生物細(xì)胞并用3倍所收集細(xì)胞體積的己烷進(jìn)行萃取。在一些實施方案中，進(jìn)一步精煉所萃取的生物燃料或生物燃料前體。在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如酯交換方法)將生物燃料前體(例如三酰甘油)轉(zhuǎn)化為生物燃料(例如生物柴油)。本發(fā)明的這些和其它實施方案的功能和優(yōu)點將從下列實施例變得更完全地理解。以下實施例意在解釋本發(fā)明的益處，但并不代表本發(fā)明的全部范圍。
實施例材料和方法基因構(gòu)建體將各基因(例如，GLUT1、血紅蛋白、細(xì)胞色素、丙酮酸羧化酶、S⑶等)克隆入質(zhì)粒YLEX(圖12)的位點PmlI和Kpn之間。所使用的限制性位點是PmlI和Kpnl。對所有cDNA進(jìn)行測序并在基因組數(shù)據(jù)庫中比對(mapped)。比對的所克隆cDNA的示例性有代表性的序列數(shù)據(jù)庫條目包括GLUTl :基因ID 6513 ;血紅蛋白糞透明顫菌(Vitreoscillastercoraria)細(xì)菌血紅蛋白基因，ACCESSION L77863 ;細(xì)胞色素基因ID :1528, CYB5A細(xì)胞色素b5A型；丙酮酸羧化酶基因ID :5091 ;Sra硬脂酰輔酶A去飽和酶(SOT):基因ID 710155?？捎糜诋a(chǎn)生過表達(dá)微生物的代表性序列(例如編碼序列)為，例如血紅蛋白(細(xì)菌)
ATGTTAGACCAACAAACCGTAGACACCAGCAAAGCCACTGTTCCTGTATTGAAAGAGCATGGCGTGACCATTACCACGACGTTTTACCAAAATTTGTTTGCCAAACATCCTGAAGTACGACCTTTGTTTGACATGGGTCGCCAAGCATCTTTGGAACAGCCTAAGGCTTTGGCGATGACGGTTGGGGCGGCGGCACAAAACATTGAAAATTTACCTGCAATTTTGCCTGCAGTACAAAAAATTGCCGTCAAACATTGTCAAGCAGGCGTGGCGGCACGACATTATCCGATTGTGGGTCAAGAATTGTTGGGTGCGATTAAAGAATTATTGGGTGATGCGGCGACCGATGATATTTTGGATGCGTGGGGCAAGGCTTATGGCGTGATTGCCGATGTTTTTATTCAAGTGGAAGCGGATTTGTACGCTCAAGACGCTGAATAA (SEQ ID NO :3)細(xì)胞色素B(耶氏酵母)ATGATCATCAACGGCAAGGTCTACGACATCTCCAGCTTCGTTGACGAGCATCCCGGTGGAGAGGAGGTTCTTCTTGATGCCGGTGGAACTGAGGCCACCAACGCTTTCGACGACGTTGGACACTCTGAGGACGCTTACGGCATCCTTAACGACCTCTATGTCGGTGAGGTTGACCCCAGCGAGGACGTTATCCGAAAGACTCACACTGTCAAGACTTCTTACGAGGACGGCGAGTCTGTTGGTGATGACCACGGATCTTCTTCCATGATCTTCCTCATTGTTGCTGCTGCTGTTGCCGCCGCTGCTTTCTTCTACCTCCAGGGTCAGAAATAA(SEQ ID NO :4)GLUT(大鼠)ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGGTGACGGGCCGCCTTATGTTGGCCGTGGGAGGGGCAGTGCTCGGATCCCTGCAGTTCGGCTATAACACCGGTGTCATCAACGCCCCCCAGAAGGTAATTGAGGAGTTCTACAATCAAACATGGAACCACCGCTATGGAGAGTCCATCCCATCCACCACACTCACCACACTCTGGTCTCTCTCCGTGGCCATCTTCTCTGTCGGGGGCATGATTGGTTCCTTCTCTGTGGGCCTCTTTGTTAATCGCTTTGGCAGGCGGAACTCCATGCTGATGATGAACCTGTTGGCCTTTGTGTCTGCCGTGCTTATGGGTTTCTCCAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATTGGAGTGTACTGTGGCCTGACCACCGGCTTTGTGCCCATGTATGTGGGGGAGGTGTCACCCACAGCTCTTCGTGGAGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCTGGGCATCGTCGTTGGGATCCTTATTGCCCAGGTGTTCGGCTTAGACTCCATCATGGGCAATGCAGACTTGTGGCCTCTACTGCTCAGTGTCATCTT CATCCCAGCCCTGCTACAGTGTATCCTGTTGCCCTTCTGCCCTGAGAGCCCCCGCTTCCTGCTCATCAATCGTAACGAGGAGA ACCGGGCCAAGAGTGTGCTGAAAAAGCTTCGAGGGACAGCCGATGTGACCCGAGACCTGCAGGAGATGAAAGAAGAGGGTCGG
權(quán)利要求
1.分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其包含 提聞選自以下的一種或更多種基因的表達(dá)的遺傳修飾血紅蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶、ACC、SCD、FAAU ACS, ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY, FAS、?；o酶 A 合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因，和/或 降低JNK2和/或Λ-12去飽和酶的表達(dá)的遺傳修飾。
2.權(quán)利要求I所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述遺傳修飾包括提高或降低所述基因產(chǎn)物的表達(dá)的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含 (a)包含在合適的同源或異源啟動子的控制下編碼所述基因產(chǎn)物的核酸的表達(dá)盒， (b)包含在異源啟動子的控制下編碼靶向所述基因產(chǎn)物之干擾RNA的核酸的表達(dá)盒，和/或 (c)在插入所述細(xì)胞的基因組時調(diào)節(jié)所述基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的核酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述異源啟動子是誘導(dǎo)型或組成型啟動子。
4.權(quán)利要求2所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述核酸構(gòu)建體抑制或破壞編碼所述基因產(chǎn)物的天然基因的天然調(diào)節(jié)，導(dǎo)致所述天然基因的過表達(dá)。
5.權(quán)利要求2所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述核酸構(gòu)建體抑制或消除所述天然基因的表達(dá)。
6.權(quán)利要求4或5所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞， 其中通過缺失、破壞、突變和/或替換調(diào)節(jié)所述基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的一部分來介導(dǎo)對所述天然基因的天然調(diào)節(jié)的抑制或破壞，或者 其中通過缺失、破壞、突變和/或替換所述天然基因的編碼序列或調(diào)節(jié)所述天然基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的一部分來介導(dǎo)對天然基因表達(dá)的抑制或消除。
7.權(quán)利要求I至6中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中通過組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)靶向JNK2和/或Λ-12去飽和酶基因產(chǎn)物且抑制所述基因表達(dá)的核酸來介導(dǎo)對JNK2和/或Λ-12去飽和酶表達(dá)的降低。
8.權(quán)利要求7所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述基因產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄本，以及靶向JNK2和/或Λ -12去飽和酶轉(zhuǎn)錄本的所述核酸通過RNAi途徑抑制所述轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。
9.權(quán)利要求8所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中靶向JNK2和/或△-12去飽和酶轉(zhuǎn)錄本的所述核酸是 siRNA、shRNA 或 micro RNA。
10.權(quán)利要求3至9所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述核酸構(gòu)建體插入所述細(xì)胞的基因組中。
11.權(quán)利要求I至10中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述基因產(chǎn)物表達(dá)的提高或降低賦予所述細(xì)胞將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油(TAG)的有利表型。
12.權(quán)利要求11所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述有利表型是改變的脂肪酸譜、改變的TAG譜、增加的脂肪酸和/或三酰甘油合成率、增加的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率、增加的三酰甘油在細(xì)胞中積累和對滲透壓增強的耐受、增加的增殖速率、增加的細(xì)胞體積和/或增強的細(xì)胞對對于相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞而言致死和/或抑制其增殖的濃度的物質(zhì)的耐受。
13.權(quán)利要求12所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞改變的脂肪酸譜或改變的TAG譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少2倍。
14.權(quán)利要求12所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞改變的脂肪酸譜或改變的TAG譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少2. 5倍。
15.權(quán)利要求12所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞改變的脂肪酸譜或改變的TAG譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少5倍。
16.權(quán)利要求12所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞改變的脂肪酸譜或改變的TAG譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少6. 5倍。
17.權(quán)利要求12至16中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在對未經(jīng)修飾細(xì)胞致死的滲透壓條件下存活。
18.權(quán)利要求12至16中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在滲透壓水平為未經(jīng)修飾細(xì)胞所耐受最高水平的200%的條件下存活。
19.權(quán)利要求12至16中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在滲透壓水平為未經(jīng)修飾細(xì)胞所耐受最高水平的300%的條件下存活。
20.權(quán)利要求12至16中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在滲透壓水平為未經(jīng)修飾細(xì)胞所耐受最高水平的400%的條件下存活。
21.權(quán)利要求12至20中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的增殖速率增加為至少5倍。
22.權(quán)利要求12至20中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的增殖速率增加為至少10倍。
23.權(quán)利要求12至20中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的增殖速率增加為至少20倍。
24.權(quán)利要求12至20中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的增殖速率增加為至少25倍。
25.權(quán)利要求12至20中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的增殖速率增加為至少30倍。
26.權(quán)利要求12至25中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的體積增加為至少2倍。
27.權(quán)利要求12至26中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞耐受致死相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞和/或抑制其增殖的濃度的物質(zhì)。
28.權(quán)利要求27所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述物質(zhì)是可發(fā)酵糖，以及所述濃度為至少80g/l。
29.權(quán)利要求27所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述物質(zhì)是可發(fā)酵糖，以及所述濃度為至少 100g/l。
30.權(quán)利要求27所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述物質(zhì)是可發(fā)酵糖，以及所述濃度為至少 150g/l。
31.權(quán)利要求27所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述物質(zhì)是可發(fā)酵糖，以及所述濃度為至少 200g/l。
32.權(quán)利要求27所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述物質(zhì)是可發(fā)酵糖，以及所述濃度為至少 300g/l。
33.權(quán)利要求12至32中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的脂肪酸或TAG合成率增加為至少5倍。
34.權(quán)利要求12至33中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的脂肪酸或TAG合成率增加為至少10倍。
35.權(quán)利要求12至34中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞以約0.025g/g至約0. 3g/g(產(chǎn)生的TAG的克數(shù)/消耗葡萄糖的克數(shù))的轉(zhuǎn)化率將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或TAG。
36.權(quán)利要求12至34中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞以至少約0.2g/g的轉(zhuǎn)化率將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或TAG。
37.權(quán)利要求12至34中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞以至少約0.3g/g的轉(zhuǎn)化率將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或TAG。
38.權(quán)利要求I至37中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
39.權(quán)利要求I至38中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
40.權(quán)利要求I至39中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是產(chǎn)油酵母細(xì)胞。
41.權(quán)利要求I至40中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是解脂耶氏酵母(Y. Iipolytica)細(xì)胞。
42.培養(yǎng)物，其包含權(quán)利要求I至41或138中任一項所述的產(chǎn)油細(xì)胞。
43.培養(yǎng)物，其包含分離的產(chǎn)油細(xì)胞和碳水化合物源， 所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞包含提高選自血紅蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶、ACC、S⑶、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基輔酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因中一種或更多種基因的表達(dá)的遺傳修飾，和/或降低JNK2和/或A-12去飽和酶基因產(chǎn)物的表達(dá)的遺傳修飾。
44.權(quán)利要求42或43所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖。
45.權(quán)利要求42至44中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源是單糖。
46.權(quán)利要求42至45中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源是葡萄糖和/或甘油。
47.權(quán)利要求42至46中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源未滅菌。
48.權(quán)利要求42至47中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物保持在未滅菌條件下。
49.權(quán)利要求42至48中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物不包含對所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞有選擇性的抗生素或抗增殖劑。
50.權(quán)利要求42至49中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源來自植物或藻類生物質(zhì)。
51.權(quán)利要求42至50中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源來自纖維素、半纖維素、淀粉、甘油或其衍生物。
52.權(quán)利要求50或51所述的培養(yǎng)物，其還包含纖維素水解酶或半纖維素水解酶。
53.權(quán)利要求50至52中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述生物質(zhì)或所述纖維素或半纖維素在熱水或稀酸或氨纖維膨脹處理中預(yù)處理，用水解酶預(yù)處理，通過蒸汽預(yù)處理和/或石灰預(yù)處理。
54.權(quán)利要求42至53中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含對與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾的野生型未經(jīng)修飾細(xì)胞為致死濃度的物質(zhì)。
55.權(quán)利要求54所述的培養(yǎng)物，其中所述物質(zhì)是在預(yù)處理所述碳水化合物源如乙酸類、糠醛或芳族化合物期間產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。
56.權(quán)利要求54或55所述的培養(yǎng)物，其中所述物質(zhì)是所述碳水化合物源。
57.權(quán)利要求54至56中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述物質(zhì)是可發(fā)酵糖。
58.權(quán)利要求54至57中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述物質(zhì)是單糖。
59.權(quán)利要求44至58中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含濃度為至少80g/l的所述可發(fā)酵糖。
60.權(quán)利要求44至59中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含濃度為至少IOOg/I的所述可發(fā)酵糖。
61.權(quán)利要求44至60中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含濃度為至少150g/I的所述可發(fā)酵糖。
62.權(quán)利要求44至61中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含濃度為至少200g/I的所述可發(fā)酵糖。
63.權(quán)利要求44至62中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含濃度為至少250g/I的所述可發(fā)酵糖。
64.權(quán)利要求44至64中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含濃度為至少300g/I的所述可發(fā)酵糖。
65.—種方法,其包括 使碳水化合物源與分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞包含 提聞選自以下的一種或更多種基因的表達(dá)的遺傳修飾血紅 蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶、ACC、SCD、FAAl、ACS、 ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、?；o酶 A 合成 酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因產(chǎn)物，和/或 降低JNK2和/或A-12去飽和酶基因的表達(dá)的遺傳修飾；和 在適于由所述細(xì)胞至少部分地將所述碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或三酰甘油的條件下孵育與所述細(xì)胞接觸的所述碳水化合物源。
66.權(quán)利要求65所述的方法，其中所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞是權(quán)利要求I至41中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞。
67.權(quán)利要求65或66所述的方法，其中所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖如葡萄糖或木糖或來自植物或藻類生物質(zhì)的碳水化合物淀粉。
68.權(quán)利要求65至67中任一項所述的方法，其中所述碳水化合物源來自纖維素或半纖維素。
69.權(quán)利要求65至68中任一項所述的方法，其中在纖維素水解酶或半纖維素水解酶的存在下，使所述碳水化合物源與所述細(xì)胞接觸。
70.權(quán)利要求65至69中任一項所述的方法，其中在每克生物質(zhì)約15IU纖維素水解酶或半纖維水解酶的存在下，使所述碳水化合物源與所述細(xì)胞于55°C接觸48小時。
71.權(quán)利要求67至70中任一項所述的方法，其中用熱水或稀酸或氨纖維膨脹處理和/或水解酶預(yù)處理所述生物質(zhì)或所述纖維素或半纖維素。
72.權(quán)利要求65至71中任一項所述的方法，其中與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的所述碳水化合物源包含對與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞為致死濃度的物質(zhì)。
73.權(quán)利要求72所述的方法，其中所述物質(zhì)是在預(yù)處理所述碳水化合物源如乙酸類、糠醛或芳族化合物期間產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。
74.權(quán)利要求72所述的方法，其中所述物質(zhì)是所述碳水化合物源。
75.權(quán)利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖，以及與所述產(chǎn)油細(xì)胞接觸后所述可發(fā)酵糖的濃度為至少80g/l。
76.權(quán)利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖，以及與所述產(chǎn)油細(xì)胞接觸后所述可發(fā)酵糖的濃度為至少80g/l。
77.權(quán)利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖，以及與所述產(chǎn)油細(xì)胞接觸后所述可發(fā)酵糖的濃度為至少100g/l。
78.權(quán)利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖，以及與所述產(chǎn)油細(xì)胞接觸后所述可發(fā)酵糖的濃度為至少200g/l。
79.權(quán)利要求74所述的方法，其中所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖，以及與所述產(chǎn)油細(xì)胞接觸后所述可發(fā)酵糖的濃度為至少300g/l。
80.權(quán)利要求65至79中任一項所述的方法，其中在未滅菌條件下使所述碳水化合物源與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸。
81.權(quán)利要求65至80中任一項所述的方法,其中在未滅菌條件下孵育與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的所述碳水化合物源。
82.權(quán)利要求65至81中任一項所述的方法，其中在開放反應(yīng)器中孵育與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的所述碳水化合物源。
83.權(quán)利要求65至82中任一項所述的方法，其中在補料分批過程中使所述碳水化合物源與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸并孵育以將所述碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或三酰甘油。
84.權(quán)利要求65至82中任一項所述的方法，其中在連續(xù)過程中使所述碳水化合物源與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸并孵育以將所述碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或三酰甘油。
85.權(quán)利要求65至84中任一項所述的方法，其中通過溶劑萃取從與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的所述碳水化合物源萃取所述脂肪酸或所述三酰甘油。
86.權(quán)利要求85所述的方法，其中所述溶劑萃取是己烷萃取。
87.權(quán)利要求65至86中任一項所述的方法，其中將所述脂肪酸或所述三酰甘油從與所述分離的產(chǎn)油細(xì)胞接觸的所述碳水化合物源中分離，然后通過酯交換反應(yīng)精煉。
88.—種方法,其包括 通過提高細(xì)胞中選自以下的一種或更多種基因產(chǎn)物的表達(dá)血紅蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶、ACC、SCD、FAAI、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基輔酶 A 合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因產(chǎn)物，和/或 降低所述細(xì)胞中JNK2和/或A-12去飽和酶基因的表達(dá) 來改變所述細(xì)胞中的脂肪酸譜、三酰甘油譜、脂肪酸合成率、三酰甘油合成率、脂肪酸衍生物的積累程度、脂肪酸衍生物的分泌率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物轉(zhuǎn)化的速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物轉(zhuǎn)化的有效產(chǎn)率、對滲透壓的耐受、增殖速率、細(xì)胞體積或細(xì)胞對將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或三酰甘油的有毒物質(zhì)的耐受。
89.權(quán)利要求88所述的方法，其中改變所述脂肪酸譜、所述三酰甘油譜、所述脂肪酸合成率、所述三酰甘油合成率、細(xì)胞中所述脂肪酸衍生物的積累程度或細(xì)胞的所述脂肪酸衍生物的分泌率是增加由細(xì)胞合成、積累或分泌的脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的量。
90.權(quán)利要求88或89所述的方法，其中改變所述細(xì)胞將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的效率是將轉(zhuǎn)化效率增加為至少2倍。
91.權(quán)利要求88或89所述的方法，其中改變所述細(xì)胞將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的效率是將轉(zhuǎn)化效率增加為至少3倍。
92.權(quán)利要求88或89所述的方法，其中改變所述細(xì)胞將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的效率是將轉(zhuǎn)化效率增加為至少4倍。
93.權(quán)利要求88或89所述的方法，其中改變所述細(xì)胞將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的效率是將轉(zhuǎn)化效率增加為至少5倍。
94.權(quán)利要求88至93中任一項所述的方法，其中所述脂肪酸衍生物是三酰甘油。
95.權(quán)利要求88至94中任一項所述的方法，其中改變所述細(xì)胞對滲透壓的耐受或?qū)τ卸疚镔|(zhì)的耐受是賦予對相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞為致死水平的滲透壓或有毒物質(zhì)的耐受。
96.權(quán)利要求88至95中任一項所述的方法，其中改變所述增殖速率是將所述增殖速率增加為至少2倍。
97.權(quán)利要求88至95中任一項所述的方法，其中改變所述增殖速率是將所述增殖速率增加為至少5倍。
98.權(quán)利要求88至95中任一項所述的方法，其中改變所述增殖速率是將所述增殖速率增加為至少10倍。
99.權(quán)利要求88至95中任一項所述的方法，其中改變所述增殖速率是將所述增殖速率增加為至少20倍。
100.權(quán)利要求88至95中任一項所述的方法，其中改變所述增殖速率是將所述增殖速率增加為至少30倍。
101.權(quán)利要求88至100中任一項所述的方法，其中改變所述細(xì)胞體積是將所述細(xì)胞體積增加為至少2倍。
102.權(quán)利要求88至101中任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
103.權(quán)利要求102所述的方法，其中所述酵母是產(chǎn)油酵母。
104.權(quán)利要求103所述的方法，其中所述產(chǎn)油酵母是解脂耶氏酵母。
105.分離的核酸分子，其包含a)編碼SEQID NO :1 (解脂耶氏酵母SCD)的核苷酸序列，或 b)與a)的核苷酸序列有至少85%同一丨丨生的核苷酸序列。
106.權(quán)利要求105所述的分離的核酸分子，其中編碼SEQID NO :1的所述核苷酸序列是 SEQ ID NO :2。
107.權(quán)利要求105所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與SEQID NO:2的核苷酸序列有至少85%的同一性。
108.權(quán)利要求107所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列與SEQID NO :2的核苷酸序列有至少90%的同一性。
109.權(quán)利要求108所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列與SEQID NO :2的核苷酸序列有至少95%的同一性。
110.權(quán)利要求108所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列與SEQID NO :2的核苷酸序列有至少97. 5%的同一性。
111.權(quán)利要求108所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列與SEQID NO :2的核苷酸序列有至少99%的同一性。
112.表達(dá)盒，其包含權(quán)利要求105至111中任一項所述的分離的核酸分子和異源的分尚的啟動子。
113.權(quán)利要求112所述的表達(dá)盒，其中所述啟動子是組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。
114.權(quán)利要求113所述的表達(dá)盒，其中所述組成型啟動子是翻譯延伸因子(TEF)啟動子。
115.權(quán)利要求113所述的表達(dá)盒，其中所述誘導(dǎo)型啟動子是藥物誘導(dǎo)型啟動子。
116.表達(dá)盒,其包含權(quán)利要求105至111中任一項所述的分離的核酸分子。
117.權(quán)利要求116所述的表達(dá)盒，其還包含經(jīng)修飾S⑶啟動子。
118.權(quán)利要求117所述的表達(dá)盒，其中所述修飾是完全或部分缺失和/或突變野生型SCD啟動子序列，導(dǎo)致對所述SCD啟動子應(yīng)答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的反饋抑制的破壞。
119.權(quán)利要求117所述的表達(dá)盒，其中所述修飾是將異源序列插入野生型SCD啟動子區(qū)，任選地結(jié)合完全或部分缺失和/或突變野生型SCD啟動子序列，導(dǎo)致對所述SCD啟動子應(yīng)答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的反饋抑制的破壞。
120.載體，其包含權(quán)利要求112至119中任一項所述的表達(dá)盒。
121.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求112至119中任一項所述的表達(dá)盒或權(quán)利要求120所述載體的至少一部分。
122.權(quán)利要求43所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源是乙酸類。
123.權(quán)利要求122所述的培養(yǎng)物，其中所述乙酸類的濃度為至少I%。
124.權(quán)利要求122所述的培養(yǎng)物，其中所述乙酸類的濃度為至少2%。
125.權(quán)利要求122所述的培養(yǎng)物，其中所述乙酸類的濃度為至少3%。
126.權(quán)利要求122所述的培養(yǎng)物，其中所述乙酸類的濃度為至少4%。
127.權(quán)利要求122所述的培養(yǎng)物，其中所述乙酸類的濃度為至少5%。
128.權(quán)利要求122至127中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物還包含甘油。
129.權(quán)利要求128所述的培養(yǎng)物，其中所述甘油的濃度為2%。
130.權(quán)利要求65至74中任一項所述的方法，其中所述碳水化合物源是乙酸類。
131.權(quán)利要求131所述的方法，其中所述乙酸類的濃度為至少I%。
132.權(quán)利要求131所述的方法，其中所述乙酸類的濃度為至少2%。
133.權(quán)利要求131所述的方法，其中所述乙酸類的濃度為至少3%。
134.權(quán)利要求131所述的方法，其中所述乙酸類的濃度為至少4%。
135.權(quán)利要求131所述的方法，其中所述乙酸類的濃度為至少5%。
136.權(quán)利要求131至135中任一項所述的方法，其中所述方法還包括使所述細(xì)胞與甘油接觸。
137.權(quán)利要求136所述的方法，其中所述方法包括使所述細(xì)胞與濃度為約2%的甘油接觸。
138.權(quán)利要求I至40中任一項所述的分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其中所述降低JNK2和/或A-12去飽和酶表達(dá)的遺傳修飾是基因破壞，任選地為完全或部分基因缺失。
全文摘要
本發(fā)明的一些方面涉及用于使用經(jīng)改造微生物將碳源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的方法。本發(fā)明的一些方面涉及發(fā)現(xiàn)微生物中脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本發(fā)明的一些方面涉及用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的經(jīng)改造微生物。
文檔編號C12N1/12GK102869768SQ201180022036
公開日2013年1月9日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者格里戈里·斯特凡諾普洛斯, 賽義德·侯賽因·伊馬姆·阿比迪 申請人:麻省理工學(xué)院