專利名稱：由正交配體激活的經(jīng)修飾的pyr/pyl受體的制作方法
由正交配體激活的經(jīng)修飾的PYR/PYL 受體
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求于2010年4月28日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/328，999和2011 年I月19日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.61/434，407的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容為所有目的分別以參閱形式并入本文中。針對(duì)聯(lián)邦政府資助研究和開發(fā)的發(fā)明的權(quán)利聲明
本發(fā)明在國(guó)家科學(xué)基金會(huì)資金項(xiàng)目No.10S0820508的政府資助下完成。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
升高的溫度和減少的新鮮水供給是兩種環(huán)境脅迫形式，也稱非生物脅迫，其降低農(nóng)業(yè)的糧食產(chǎn)量。一種非生物脅迫耐受性的關(guān)鍵調(diào)控劑是植物激素脫落酸(ABA)，其在對(duì)各種非生物脅迫的應(yīng)答中由植物合成并主導(dǎo)其適應(yīng)性應(yīng)答以提高植物的存活(Cutler, S. 等人，植物生物學(xué)年評(píng)(Annual Review of Plant Biology) (2009) ;Nambara, E.等人，植物生物學(xué)年評(píng)(Annual Review of Plant Biology) 56:165-185 (2005))。經(jīng)基因工程改造具有增加的ABA敏感性的作物表明其在干旱條件下提高了產(chǎn)量(Wang，Y.等人，植物雜志 (Plant J) 43:413-424 (2005)) ο而且，將ABA或ABA類似物直接應(yīng)用于大田植物已經(jīng)表明改善了水的利用效率(Hawkins, A. F.等人,用于農(nóng)業(yè)和便利設(shè)施的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(Plant Growth Regulators for Agricultural and Amenity Use)(英國(guó)農(nóng)作物保護(hù)委員會(huì)) (1987) ；Kreeb, K. H.等人，對(duì)環(huán)境脅迫的結(jié)構(gòu)和功能性應(yīng)答(Structural and Functional Responses to Environmental Stresses) (Balogh科學(xué)叢書)(1989));然而，由于其復(fù)雜的生產(chǎn)途徑和高成本，ABA的該用途沒有成功地商業(yè)化。
令人感興趣的是，許多殺菌劑和殺蟲劑表現(xiàn)出未知機(jī)制的脅迫耐受性“副作用”，并被商業(yè)化用于脅迫耐受性用途，其顯示了用化學(xué)方法控制脅迫耐受性的強(qiáng)烈興趣和認(rèn)識(shí)需要(Asrar, J.等人，在US2009/0270254A1中(孟山都技術(shù)公司，美國(guó))(2003)； Beckers, G. J. Μ.等人，植物生物學(xué)當(dāng)前見解(Current Opinion in Plant Biology) 10:425 -431(2007) ; Schulz, A.等人，US 2007/0124839A1 (拜耳作物科學(xué)公司，美國(guó))(2006))。該興趣的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)力是，近100年來(lái)獲得的玉米產(chǎn)量的巨大提高可主要?dú)w因于新高產(chǎn)玉米品種非生物脅迫耐受性的提高(Duvick，D. N.等人，作物科學(xué)(Crop Science) 39:1622-1 630(1999) ;Tollenaar, Μ.等人，農(nóng)作物研究(Field CropsResearch) 75:161-169 (2002) ;To llenaar, Μ.等人，作物科學(xué)(Crop Sci) 39:1597-1604 (1999))。由于ABA被認(rèn)為是植物脅迫生理學(xué)的關(guān)鍵性激素調(diào)控劑，人們對(duì)在作物中調(diào)控ABA途徑具有強(qiáng)烈興趣?？刂艫BA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一個(gè)可能的要點(diǎn)是受體蛋白，原則上其能夠進(jìn)行ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫耐受性的化學(xué)和基因調(diào)控。
近來(lái)，新的ABA受體家族，帕雷巴克汀(Pyrabactin)抗性/PYR-樣(“PYR/PYL”) 家族被確認(rèn)為ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控劑(Park’S. Y.等人，Science 324:1068-1071 (2009))。ABA 受體PYL5的過(guò)表達(dá)賦予擬南芥屬植物耐旱性(Santiago，J.等人，植物雜志(The Plant Journal) 9999 (2009))，將該新受體家族確認(rèn)為控制植物脅迫耐受性的關(guān)鍵靶標(biāo)。然而，基因過(guò)表達(dá)能產(chǎn)生相反的產(chǎn)量后果，其被稱為“產(chǎn)量拖累”。產(chǎn)量拖累被認(rèn)為是由于脅迫耐受性途徑未經(jīng)調(diào)控的激活而發(fā)生，其與在正常條件下(即，無(wú)干旱或其他脅迫因素)發(fā)生的生長(zhǎng)緩慢有關(guān)。獲得調(diào)控的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制的一個(gè)方式是研制激活A(yù)BA受體(即，激動(dòng)劑) 的化學(xué)制劑。一旦干旱或其他脅迫條件到來(lái)即可將其應(yīng)用于植物，這使得能夠在不良條件下進(jìn)行選擇性保護(hù)。這使得在理想的生產(chǎn)條件下脅迫耐受性的優(yōu)點(diǎn)得以實(shí)現(xiàn)而沒有降低產(chǎn)量。
原則上，ABA可用作激動(dòng)劑以實(shí)現(xiàn)這些優(yōu)勢(shì)。然而，其為天然產(chǎn)物，制造成本高且由于紫外光異構(gòu)化作用和代謝失活會(huì)快速分解。其還對(duì)哺乳動(dòng)物具有生理學(xué)作用，從而大大影響其用作農(nóng)業(yè)化學(xué)品的合適性(Guri，A. J.等人，Clin Nutr. (2010))。因此，用于控制 ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的理想試劑應(yīng)該是便宜、環(huán)境上穩(wěn)定和無(wú)毒的分子。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供包含異源表達(dá)盒的植物(或源自該植物的植物細(xì)胞、種子、花、葉子、 果實(shí)或其他植物部位或源自該植物加工食品或食品成分)，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被化學(xué)品激活，且其中當(dāng)野生型PYR/PYL 受體多肽與所述化學(xué)品接觸時(shí)，所述野生型PYR/PYL受體多肽沒有明顯被化學(xué)品激活。
在一些實(shí)施方案中，所述化學(xué)品包括殺真菌劑、除草劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、植物活化劑、增效劑、除草劑安全劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲劑或肥料。
在一些實(shí)施方案中，所述化學(xué)品選自下組溴苯腈、羥敵草腈、碘苯腈、殺鼠迷、二氯苯腈、環(huán)酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID勵(lì):1的1(59位的突變？￥10^1^受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、 蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸。
在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述化學(xué)品為溴苯腈、羥敵草腈、碘苯腈、二氯苯腈、解草嗪或環(huán)酰菌胺。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈激活，對(duì)應(yīng)于 SEQ ID N0:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn) 21、41、50、57、60、82、92、102、116、125、141 和 / 或151的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自H21Y、P41L、R50G、T57A、H60R、I82N、 S92T、E102G、R116K、T125A、E141Q、E141D、N151D 或其組合。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被環(huán)酰菌胺 激活，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的K59位的突變PYR/PYL 受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn) 10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、 144、154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自 R10Q、E12G、E12K、L25R、P27L、S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、S47P、V491、R74C、V751、V81M、 D97N、I110S、Y120C、Y120H、V1231、T124M、N133D、V138M、V1391、V144A、E154G、M1581、V1631、 A172T、T173A、V1741、A177T 或其組合。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被環(huán)酰菌胺激活，所述突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)59、120和158的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镵59R、Y120H 和M158I。在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)62和110的氨基酸位點(diǎn)上的異亮氨酸殘基。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的K59位的突變PYR/PYL 受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)27和/或63的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自P27L、K63N或其組合。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活，所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)26、37、71和/或94的氨基酸上的突變，其中所述突變選自D26G、R37Q、F71S、E94D或其組合。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)119的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镹119Y。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活，所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)110、114和/或138的氨基酸上的突變，其中所述突變選自 I110T、E114D、V138M 或其組合。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與BTH接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被BTH激活，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)24、82、 159和/或161的氨基酸上的突變，其中所述突變選自Q24R、I82T、F159L、D161G或其組合。
在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與BTH接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被BTH激活，所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)115和/或159的氨基酸上的突變，其中所述突變選自H115Y、 F159S、F159L或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽與下述的任一序列基本上相同 (例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%,至少 95%,至少 96%,至少 97%,至少 98% 或至少 99% 相同):SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118 或 119，且包含一個(gè)或多個(gè)如本文所述的突變。
在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述中任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少 92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ IDNO: 131-139( SP，SEQ ID NO: 131、132、133、134、135、136、137、138 或 139 中任一序列)，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL 受體多肽被溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈激活。
在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述中任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 124-130 或 165-178( BP, SEQ ID NO:124、125、126、127、128、129、130、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、17 4、175、176、177或178中任一序列)，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被環(huán)酰菌胺激活。
在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述中任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%， 至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 140-144(即，SEQ ID NO: 140、141、142、143 或 144 中任一序列)，且當(dāng)所述突變的 PYR/ PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活。
在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述中任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同):SEQ ID NO: 145或 146，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活。
在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述中任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同):SEQ ID NO: 147、 148或164，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與BTH (阿拉酸式苯-S-甲基)接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被BTH激活。
在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在含有PYR/PYL受體多肽的配體結(jié)合口袋的氨基酸殘基上的突變。
在一些實(shí)施方案中，當(dāng)與所述化學(xué)品接觸時(shí)，所述植物與缺少所述表達(dá)盒的植物相比具有提高的非生物脅迫耐受性。
本發(fā)明還提供提高上述植物的非生物脅迫耐受性的方法，其通過(guò)使所述植物與選自下組的化學(xué)品接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)溴苯腈、羥敵草腈、碘苯腈、殺鼠迷、二氯苯腈、環(huán)酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明(例如，如本文所述)突變的PYR/PYL受體多肽的多肽。 在一些實(shí)施方案中，多肽包含突變的PYR/PYL受體多肽，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述中任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少 90%,至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少 99% 相同)SEQ ID NO: 124-148 或 164-178(即，SEQ ID NO: 124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、1 34、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177 或 178 中任一序列)。
本發(fā)明還提供編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明(例如，如本文所述)的突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸編碼一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽， 所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述中任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少 96%,至少 97%,至少 98% 或至少 99% 相同)SEQ ID NO: 124-148 或 164-178 (即，SEQ ID NO:124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、 176、177或178中任一序列)。本發(fā)明還提供分離的核酸，其包含編碼一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明 (例如，如本文所述)的突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列。
本發(fā)明還提供制備突變的PYR/PYL受體多肽的方法，當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被所述化學(xué)品激活，其中當(dāng)野生型 PYR/PYL受體多肽與所述化學(xué)品接觸時(shí)，所述野生型PYR/PYL受體多肽沒有明顯地被所述化學(xué)品激活，所述方法包括
(a)誘變所述野生型PYR/PYL受體多肽；
(b)使一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸；以及
(c)確定所述化學(xué)品是否激活所述一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽，其中激活作用確認(rèn)所述一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽被所述化學(xué)品激活。
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括，在步驟(b)之前，篩選所述化學(xué)品以確定所述化學(xué)品是否與所述野生型PYR/PYL受體多肽結(jié)合，然后使一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽與所述化學(xué)品接觸。
在一些實(shí)施方案中，所述方法的確定步驟(C)包括使所述化學(xué)品與包含雙雜交系統(tǒng)的細(xì)胞接觸，其中所述雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)所述突變的PYR/PYL受體多肽與2型蛋白磷酸酶 (PP2C)的相互作用，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽與PP2C的化學(xué)特異性相互作用確認(rèn)了所述突變的PYR/PYL受體多肽被所述化學(xué)品激活。
在一些實(shí)施方案中，所述方法的化學(xué)品包括殺真菌劑、除草劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、 植物活化劑、增效劑、除草劑安全劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲劑或肥料。
在一些實(shí)施方案中，所述方法的化學(xué)品選自下組溴苯腈、羥敵草腈、碘苯腈、殺鼠迷、二氯苯腈、環(huán)酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
本發(fā)明還提供表達(dá)盒，其包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)，所述突變的PYR/ PYL受體多肽被所述化學(xué)品激活，其中當(dāng)野生型PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)，所述野生型PYR/PYL受體多肽沒有明顯地被所述化學(xué)品激活。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸。在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X 為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述化學(xué)品為溴苯腈、 羥敵草腈、碘苯腈、二氯苯腈、解草嗪或環(huán)酰菌胺。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈激活，且對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn) 21、41、50、57、60、82、92、102、116、125、141 和 / 或 151 的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自H21Y、P41L、R50G、T57A、H60R、I82N、S92T、 E102G、R116K、T125A、E141Q、E141D、N151D 或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被環(huán)酰菌胺激活，且對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、 154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自R10Q、 E12G、E12K、L25R、P27L、S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、S47P、V491、R74C、V751、V81M、D97N、 I110S、Y120C、Y120H、V1231、T124M、N133D、V138M、V1391、V144A、E154G、M1581、V1631、 A172T、T173A、V1741、A177T 或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被環(huán)酰菌胺激活，且所述突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)59、120和158的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镵59R、Y120H 和M158I。在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ IDNO:1)中位點(diǎn)62和110的氨基酸上的異亮氨酸殘基。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活，且對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的K59位的突變PYR/PYL 受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQID NO:1)中位點(diǎn) 27和/或63的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自P27L、K63N或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活，且所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)26、37、71和/或94的氨基酸上的突變，其中所述突變選自 D26G、R37Q、F71S、E94D 或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活，且對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、 亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)119的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镹119Y。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活，且所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)110、114和/或138的氨基酸上的突變，其中所述突變選自 I110T、E114D、V138M 或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與BTH接觸時(shí)，所述突變的 PYR/PYL受體多肽被BTH激活，且對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的K59位的突變PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸，且所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQID NO:1)中位點(diǎn)24、82、159 和/或161的氨基酸上的突變，其中所述突變選自Q24R、I82T、F159L、D161G或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與BTH接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被BTH激活，且所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)115和/或159的氨基酸上的突變，其中所述突變選自H115Y、 F159S、F159L或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%， 至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 131-139(即，SEQ ID NO: 131、132、133、134、135、136、137、138 或 139 中任一序列)，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL 受體多肽被溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈激活。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 124-130 或 165-178( BP, SEQ IDN0:124、125、126、127、128、129、130、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175、176、177或178中任一序列)，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被環(huán)酰菌胺激活。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%， 至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 140-144(即，SEQ ID NO: 140、141、142、143 或 144 中任一序列)，且當(dāng)所述突變的 PYR/ PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同):SEQ ID NO: 145或 146，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所 述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同):SEQ ID NO: 147、 148或164，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與BTH (阿拉酸式苯-S-甲基)接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被BTH激活。
在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在含有所述PYR/ PYL受體多肽的配體結(jié)合口袋的氨基酸殘基上的突變。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明表達(dá)盒(例如,如本文所述)的表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明表達(dá)盒(例如,如本文所述)的多核苷酸序列。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)具有提高的脅迫耐受性的植物的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物， 所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少 96%,至少 97%,至少 98% 或至少 99% 相同)SEQ ID NO: 124-148 或 164-178 (即，SEQ ID NO:124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、 176、177或178中任一序列)，由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如， 至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少 92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 131-139，由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽，且當(dāng)所述突變的 PYR/PYL受體多肽與溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈激活。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 124-130 或165-178，由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽，且當(dāng)所述突變的PYR/ PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的受體多肽被環(huán)酰菌胺激活。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少 92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 140-144，由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽，且當(dāng)所述突變的 PYR/PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的受體多肽被二氯苯腈激活。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少 92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 145-146，由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽，且當(dāng)所述突變的 PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的受體多肽被解草嗪激活。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽具有下述任一序列或與其基本上相同(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 147-148 或164，由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽，且當(dāng)所述突變的PYR/PYL 受體多肽與BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)接觸時(shí)，所述突變的受體多肽被BTH激活。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽與下述任一序列基本上相同 (例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 1-119 ( BP,SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、 101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118 或 119 中任一序列)并包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1中位點(diǎn)K59的氨基酸X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸；由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的 PYR/PYL受體多肽。在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn) 21、41、50、57、60、82、92、102、116、125、141 和 / 或 151 的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自H21Y、P41L、R50G、T57A、H60R、I82N、S92T、 E102G、R116K、T125A、E141Q、E141D、N151D或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/ PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQID NO:1)中位點(diǎn)10、12、25、27、29、33、42、 43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、163、172、173、 174和/或177的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自R10Q、E12G、E12K、L25R、P27L、 S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、S47P、V491、R74C、V751、V81M、D97N、I110S、Y120C、Y120H、 V1231、T124M、N133D、V138M、V1391、V144A、E154G、M1581、V1631、A172T、T173A、V1741、 A177T或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)27和/或63的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自P27L、K63N或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ IDN0:1)中位點(diǎn)119的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镹119Y。在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)24,82,159和/或161的氨基酸上的突 變，其中所述突變選自Q24R、I82T、F159L、D161G 或其組合。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽與下述任一序列基本上相同 (例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同):SEQ ID NO: 1-119并包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)26、37、71和/或94的氨基酸上的突變，其中所述突變選自R37Q、F71S、E94D或其組合；由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL 受體多肽。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變的PYR/PYL受體多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽與下述任一序列基本上相同于(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同):SEQ ID NO: 1-119并包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)110、114和/或138的氨基酸上的突變，其中所述突變選自I110T、E114D、V138M或其組合；由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/ PYL受體多肽。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽與下述任一序列基本上相同 (例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同)SEQ ID NO: 1-119，且所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)115和/或159 的氨基酸上的突變，其中所述突變選自H115Y、F159S、F159L或其組合；由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括種植包含至少一個(gè)編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述突變的PYR/PYL受體多肽與下述任一序列基本上相同于(例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%， 至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同):SEQ ID NO: 1-119，且所述突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)59、120和158的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镵59R、Y120H和M158I ;由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽。在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ IDNO:1)中位點(diǎn)62和110的氨基酸位點(diǎn)上的異亮氨酸殘基。


圖1. PYRl突變體27-18賦予了對(duì)環(huán)酰菌胺而非ABA的應(yīng)答性。使用體外PP2C磷酸酶活性檢測(cè)測(cè)定，與野生型PYRl對(duì)照相比，代表性PYRl突變體27-18 (包含S47P、K59R 和Y120H替換突變)對(duì)漸增濃度的脫落酸("ABA") (A)和環(huán)酰菌胺⑶的應(yīng)答性。
圖2.確認(rèn)在27C-2突變體中對(duì)環(huán)酰菌胺應(yīng)答性的關(guān)鍵性殘基。Α.在pBD_PYRl中構(gòu)建突變體(圖示左側(cè)所列)并轉(zhuǎn)入至Y190pAD-HABl酵母細(xì)胞。然后，將轉(zhuǎn)化體在漸增濃度的環(huán)酰菌胺下培養(yǎng)，并用X-gal染色對(duì)應(yīng)答性計(jì)分，其操作描述于Park等人，2009。如圖所示，K59R、Y120H和M158I突變是27C-2對(duì)環(huán)酰菌胺應(yīng)答所必需的。B. PYR1K59R、Y120H、 M158I突變體的體外特征。按照前述的描述制備重組野生型和突變體 PYRl蛋白并用于如之前所述的PP2C檢測(cè)(Park等人，2009)，不同之處在于所用的受體與磷酸酶的比例為2:1。
圖3.通過(guò)基因工程將環(huán)酰菌胺應(yīng)答性引入至PYL2。A.將在PYRl (K59R、Y120H、 M158I)中足以產(chǎn)生環(huán)酰菌胺應(yīng)答性的同源性突變引入至PYL2(K64R、Y124H、M164I)。此外， 在V114I和/或V67I引入口袋殘基突變。在pBD-PYL2中構(gòu)建突變體(圖示左側(cè)所列)并轉(zhuǎn)化至Y190pAD-HABl酵母細(xì)胞。然后，將轉(zhuǎn)化體在漸增濃度的環(huán)酰菌胺下培養(yǎng)，并用X_gal 染色對(duì)應(yīng)答性計(jì)分，其操作描述于Park等人，2009。如圖所示，通過(guò)組合這些突變可以設(shè)計(jì)出環(huán)酰菌胺應(yīng)答性。B. PYL2K64R、Y124H、M1641、V671、V114I突變體的體外特征。按照前述的描述制備重組野生型和突變體PYR2蛋白并用于如之前所述的PP2C檢測(cè)(Park等人， 2009)，不同之處在于所用的受體與磷酸酶的比例為2:1。
圖 4.在 35S: :GFP-PYL2K64R、Y124H、M1641、V671、V114I 轉(zhuǎn)基因植物中幼苗對(duì)環(huán)酰菌胺應(yīng)答的表征。為了研究環(huán)酰菌胺應(yīng)答性PYL2受體的體內(nèi)敏感性，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化制備表達(dá)野生型和突變體受體蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。圖中所示為源自最初的轉(zhuǎn)基因植物(Tl)的分離的表達(dá)GFP的T2幼苗。哥倫比亞型(Columbia)為野生型背景，是非轉(zhuǎn)基因的。除了野生型PYL2過(guò)表達(dá)系以外，對(duì)兩個(gè)單獨(dú)的PYL2K64R、Y124H、M1641、V671、 V114I( “PYL2MUT”)轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行了表征。將來(lái)自各系的種子于黑暗中在含有100 μ M環(huán)酰菌胺的培養(yǎng)基中萌發(fā)，吸入后兩天對(duì)其計(jì)分。如圖所示兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系而非對(duì)照系表現(xiàn)出強(qiáng)烈的萌發(fā)后生長(zhǎng)抑制。上部分圖顯示了代表性幼苗的透射光圖像，下部分圖顯示了確認(rèn)株系的GFP表達(dá)的落射熒光并表明株系間的表達(dá)水平是相似的。該資料表明PYL2K64R、 Y124H、M1641、V671、V114I受體蛋白激活了對(duì)于環(huán)酰菌胺應(yīng)答的表征良好的ABA應(yīng)答(生長(zhǎng)抑制)。
圖5.在 35S: :GFP-PYL2K64R、Y124H、M1641、V671、Vl 141 轉(zhuǎn)基因植物中幼苗對(duì)環(huán)酰菌胺的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的表征。將在培養(yǎng)皿中萌發(fā)后的源自各株系的表達(dá)GFP的T2幼苗分開， 并用落射熒光顯微鏡預(yù)篩選，然后在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，再將幼苗用100 μ M環(huán)酰菌胺或?qū)φ?O. 1%DMS0)處理6小時(shí)。然后，使用3個(gè)表征良好的ABA應(yīng)答轉(zhuǎn)錄(如上所述，Park 等人，2009)，從樣品中分離RNA并用于定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)。用于RT-PCR分析的引物序列從 Roche公司獲得并通過(guò)Invitrogen載體合成。使用SybrGreen染料在BioRad CFX 96實(shí)時(shí) PCR儀上進(jìn)行定量RT-PCR。mRNA拷貝數(shù)表示為每納克(ng)總RNA的拷貝數(shù)。使用ACT2基因?qū)?shù)據(jù)歸一化。使用靶基因的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定拷貝數(shù)。所得數(shù)據(jù)表明，PYL2K64R、 Y124H、M1641、V671、V114I受體蛋白激活了對(duì)環(huán)酰菌胺應(yīng)答的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。所示數(shù)據(jù)為3次技術(shù)重復(fù)的平均值，且誤差線顯示為標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖6.環(huán)酰菌胺減少了轉(zhuǎn)基因PYL2_’Y124H’M164I’V67I’V1141表達(dá)植物中的失水。圖中所示為在用對(duì)照、含100 μ M環(huán)酰菌胺或100 μ MABA的溶液處理的轉(zhuǎn)基因植物上進(jìn)行的3 個(gè)獨(dú)立的失水實(shí)驗(yàn)(A-C)。按照下述實(shí)施例部分的描述處理植物，分開后測(cè)量其通過(guò)氣孔 (aerial rosette)的失水。在所有實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因PYL2系表現(xiàn)出對(duì)環(huán)酰菌胺處理應(yīng)答的失水減少。
圖7.環(huán)酰菌胺預(yù)處理沒有減少在野生型哥倫比亞型(Columbia)植物中的失水。 用對(duì)照、含100 μ M環(huán)酰菌胺或100 μ M ABA的溶液處理哥倫比亞型(Columbia)植物。按照下述實(shí)施例部分的描述處理植物，分開后測(cè)量其通過(guò)氣孔(aerial rosette)的失水。
定義
術(shù)語(yǔ)“PYR/PYL受體多肽”是指部分表征為存在多聚乙酰環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域 2(PF10604)、多聚乙酰環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域1(PF03364)和BetVI結(jié)構(gòu)域(PF03364)中的一個(gè)或多個(gè)或所有結(jié)構(gòu)域的蛋白，所述結(jié)構(gòu)域在野生型中調(diào)節(jié)脫落酸(ABA)和ABA類似物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 本領(lǐng)域已知有許多種PYR/PYL受體多肽序列。在一些實(shí)施方案中，PYR/PYL受體多肽包含與下述任一序列基本上相同的多肽PYR1 (SEQ IDNO:1), PYLl (SEQ ID NO: 2)、PYL2 (SEQ ID N0:3)、PYL3(SEQ ID NO:4)、PYL4(SEQ ID NO:5)、PYL5(SEQ ID NO:6)、PYL6(SEQ ID NO:7)、 PYL7 (SEQ ID NO: 8)、PYL8 (SEQ ID NO: 9)、PYL9 (SEQ ID NO: 10)、PYL10 (SEQ ID NO: 11)、 PYLll(SEQ ID NO:12)、PYL12(SEQ ID NO:13)、PYL13(SEQ ID NO:14)和SEQ ID NO:15-119。
“野生型PYR/PYL受體多肽”是指調(diào)節(jié)脫落酸(ABA)和ABA類似物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的天然產(chǎn)生的PYR/PYL受體多肽。
“突變的PYR/PYL受體多肽”或“修飾的PYR/PYL受體多肽”是指由天然產(chǎn)生的(SP， 野生型)PYR/PYL受體多肽變異而來(lái)的PYR/PYL受體多肽。如本文所用，相比對(duì)應(yīng)的野生型 PYR/PYL受體多肽，突變的或修飾的PYR/PYL受體多肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。在本文 中，可用任何產(chǎn)生非野生型核苷酸序列的方法制備“突變的”多肽或“修飾的”多肽。突變的PYR/PYL受體多肽可能調(diào)節(jié)或可能不調(diào)節(jié)脫落酸(ABA)和ABA類似物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
“對(duì)應(yīng)于[特定序列]的位點(diǎn)[X] ”的氨基酸是指在目標(biāo)多肽中與特定序列的等價(jià)氨基酸匹配的氨基酸。通常，如本文所述，對(duì)應(yīng)于PYR/PYL受體多肽的位點(diǎn)的氨基酸可使用比對(duì)算法如BLAST進(jìn)行確定。如本文進(jìn)一步討論的，在本發(fā)明的典型實(shí)施方案中，氨基酸位點(diǎn)的“一致性(correspondence) ”通過(guò)與包含SEQ ID NO:1的所述PYR/PYL受體多肽的一個(gè)區(qū)比對(duì)而確定。當(dāng)PYR/PYL受體多肽序列與SEQ ID NO:1不同(例如，通過(guò)氨基酸的改變或氨基酸的增加或刪除)，其可能為，與不激活野生型PYR/PYL的化學(xué)品的激活作用有關(guān)的特定突變將不會(huì)出現(xiàn)在SEQ ID NO:1中的相同位點(diǎn)序號(hào)上。例如，PYLl (SEQ ID NO:2)的氨基酸位點(diǎn)K86匹配于SEQ ID NO:1的氨基酸位點(diǎn)K59，其在兩個(gè)序列的比對(duì)中很容易表明；在該實(shí)例中，在SEQ ID NO:2的氨基酸位點(diǎn)86的突變對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的位點(diǎn)59。
如下所述，如果兩個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的序列在進(jìn)行最大一致性比對(duì)時(shí)分別是相同的，那么稱這兩個(gè)核酸序列或多肽為“相同的”。術(shù)語(yǔ)“相同的”或“同一性”百分比在兩個(gè)或更多核酸或多肽序列的情況下是指，當(dāng)通過(guò)一個(gè)比較窗口進(jìn)行最大一致性的比較和比對(duì)，使用下列序列比較算法之一進(jìn)行測(cè)量或通過(guò)人工比對(duì)和目測(cè)檢查時(shí)，兩個(gè)或更多序列或子序列是相同的或有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸是相同的。當(dāng)序列同一性百分比用于指向蛋白或肽時(shí)，認(rèn)為不相同的殘基位點(diǎn)通常是由于保守氨基酸替換而不同，其中氨基酸殘基被替換為具有類似化學(xué)性質(zhì)的其他氨基酸殘基(例如，荷電或疏水性)從而沒有改變?cè)摲肿拥墓δ苄蕴匦?。其中可?duì)保守替換中的序列差異、序列同一性百分比進(jìn)行上調(diào)以改正該替換的保守性。進(jìn)行該調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常這涉及到將一個(gè)保守替換記為部分錯(cuò)配而非完全錯(cuò)配，從而增加其序列同一性百分比。因此，例如，如相同的氨基酸計(jì)分為1，而非保守替換計(jì)分為0，那么保守替換的計(jì)分為0-1。保守替換計(jì)分的計(jì)算根據(jù)，例如，Meyers&Miller 算法,Computer Applic. Biol. Sc1. 4:11-17 (1988)，例如，如在程序PC/GENE所運(yùn)行(Intelligenetics公司，美國(guó)加利福尼亞州山景城)。
兩個(gè)核酸或多肽的情況下使用的詞語(yǔ)“基本上相同”是指，與參考序列具有至少 60%序列同一性的序列。或 者，同一性百分比可為60%-100%的任何整數(shù)。使用本文所述的程序與參考序列相比，一些實(shí)施方案包括至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% ;如下所述，優(yōu)選使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST。本發(fā)明的實(shí)施方案提供編碼多肽的核酸，所述多肽與下述任一序列基本上相同SEQ ID NO: 1-119。
對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列作為參考序列，將測(cè)試序列與其比較。當(dāng)使用序列比算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入至計(jì)算機(jī)，隨后設(shè)計(jì)坐標(biāo)，如需要，還設(shè)計(jì)序列算法程序參數(shù)。可使用默認(rèn)的程序參數(shù)或者也可設(shè)計(jì)替代性參數(shù)。然后，基于程序參數(shù)用所述序列比較算法計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列同一性百分比。
本文所用“比較窗口 ”包括參考選自20-600的連續(xù)相鄰位點(diǎn)數(shù)目的任何一個(gè)片段，通常為約50至約200，更通常為約100至約150，其中將兩個(gè)序列進(jìn)行最佳對(duì)齊后，可將該序列與參考序列中同樣數(shù)目的連續(xù)相鄰位點(diǎn)進(jìn)行比較。對(duì)齊用于比較的序列的方法為本領(lǐng)域所熟知。用于比較的序列最佳對(duì)齊的實(shí)施可通過(guò)，例如，Smith&Waterman的局部同源性算法，Adv. Appl. Math. 2:482(1981) ；Needleman&ffunsch 的同源性比對(duì)算法，J. Mol. Biol. 48:443 (1970) ；Pearson&Lipman 的搜索類似性方法，Proc. Nat '1. Acad. Sc1. USA 85:2444(1988);計(jì)算機(jī)操作的算法(Wisconsin公司的遺傳軟件包GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA,遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)集團(tuán)(Genetics Computer Group),威斯康星州，麥迪遜市科學(xué)大道575號(hào))或人工比對(duì)和目測(cè)檢查。
適于確定序列同一性百分比和序列相似性的的算法為BLAST和BLAST 2. O算法， 其分別描述于 Altschul 等人，(1990)J. Mol. Biol. 215:403-410 和 Altschul 等人，(1977) Nucleic AcidsRes. 25:3389-3402。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站公開提供進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法涉及通過(guò)確定待查詢序列中長(zhǎng)度為W的短詞(short words) 首先確認(rèn)高分值序列對(duì)(high scoring sequence paris, HSP),當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)中同樣長(zhǎng)度的序列的一個(gè)詞比對(duì)時(shí)所述短詞匹配或符合一些正值的閾值數(shù)T。T是指臨近詞的閾值數(shù) (Altschul等人,如上)。這些最初臨近的目標(biāo)詞(word hits)作為種子啟動(dòng)搜索以尋找含有它們的更長(zhǎng)HSP。然后將該目標(biāo)詞沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向延伸，只要累計(jì)比對(duì)分?jǐn)?shù)能夠增加即可。對(duì)于核苷酸序列，用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的得分；總是>0)和N(錯(cuò)配殘基的得分；總是〈O)計(jì)算累計(jì)分?jǐn)?shù)。對(duì)于氨基酸序列，使用打分矩陣計(jì)算累計(jì)分?jǐn)?shù)。當(dāng)累計(jì)比對(duì)分?jǐn)?shù)從其最大值下降至數(shù)量X時(shí)；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分值殘基比對(duì)的累計(jì)而使得累計(jì)分?jǐn)?shù)趨于O或低于O時(shí)；或當(dāng)?shù)竭_(dá)序列的一個(gè)末端時(shí)，目標(biāo)詞在每個(gè)方向的延伸停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)默認(rèn)使用的詞數(shù) (W)為28，預(yù)期值(E)為10，Μ=1，Ν=-2，進(jìn)行雙鏈比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)使用的詞數(shù)(W)為3，預(yù)期值(E)為10，以及BL0SUM62打分矩陣(參見，Henikoff&Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 89:10915 (1989))。
BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性統(tǒng)計(jì)分析(參見，例如， Karlin&Altschul, Proc. Nat;1. Acad. Sc1. USA 90:5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的一種相似性測(cè)量是最小總概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間可能發(fā)生隨機(jī)匹配的概率指示。例如，如果將測(cè)試核酸與參考核酸進(jìn)行比較后的最小總概率為小于約0. 01，更優(yōu)選小于約10_5，最優(yōu)選小于約10_2°，即 認(rèn)為該核酸與參考序列相似。
“保守性修飾的變異體”應(yīng)用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定核酸序列，保守性修飾的變異體是指，編碼相同的或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在該核酸不編碼氨基酸序列的情況下，是指基本上相同的序列。由于遺傳密碼簡(jiǎn)并，許多功能上相同的核酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每個(gè)由密碼子定義的丙氨酸位點(diǎn)，該密碼子可被改變?yōu)槿魏螌?duì)應(yīng)的密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異稱為“沉默變異”，其為保守性修飾的變異的一種。本文的每個(gè)編碼多肽的核酸序列也描述該核酸的每個(gè)可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，核酸的每個(gè)密碼子(除AUG外，通常其為編碼蛋氨酸的唯一密碼子)均可修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，每個(gè)編碼多肽的核酸的沉默變異暗含在每個(gè)描述的序列中。
對(duì)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在核酸、肽、多肽或蛋白序列中的單獨(dú)替換，其改變了所編碼序列的單一氨基酸或少量百分?jǐn)?shù)的氨基酸，即“保守性修飾的變異體”，其中該改變導(dǎo)致用化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸替換氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守替換表為本領(lǐng)域熟知。
下列6個(gè)組各自含有彼此保守替換的氨基酸
I)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
(參見,例如，Creighton,蛋白質(zhì)(Proteins)(1984))。
應(yīng)理解，在突變的PYR/PYL受體多肽中的替換突變不僅包括本說(shuō)明書中所稱的那些特定的氨基酸替換，例如，在本說(shuō)明書的實(shí)施例部分或任何附圖或表格中，還包括對(duì)這些特定氨基酸進(jìn)行保守替換的氨基酸，只要該保守性替換的氨基酸不是野生型氨基酸。作為非限制性實(shí)例，其中突變的PYR/PYL受體多肽包含絲氨酸-至-蘇氨酸的替換，應(yīng)理解，突變的PYR/PYL受體多肽可替代性地包含絲氨酸-至-丙氨酸的替換，因?yàn)樘K氨酸和丙氨酸彼此互為保守替換；然而，所述突變的PYR/PYL受體多肽不包含絲氨酸-至-絲氨酸的替換，因?yàn)榻z氨酸為野生型PYR/PYL多肽中存在的氨基酸。
本文所用術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑(單/復(fù)數(shù))”是指如本文其他地方描述的用體內(nèi)和體外檢測(cè)法確認(rèn)的用于所描述的靶蛋白活性的分子。激動(dòng)劑為制劑，例如，其誘導(dǎo)或激活靶蛋白的表達(dá)，或結(jié)合至、刺激、增加、啟動(dòng)、激活、促進(jìn)、提高作用、敏化或上調(diào)靶蛋白(或編碼多核苷酸)的活性。激動(dòng)劑包括天然產(chǎn)生的和合成的分子。在一些實(shí)施方案中，所述激動(dòng)劑為農(nóng)業(yè)化學(xué)品，例如，殺菌劑、除草劑、殺蟲劑和/或肥料。確定是否激動(dòng)劑“激活”或“未激活”靶蛋白的檢測(cè)包括，例如，使純化的靶蛋白與推定的激動(dòng)劑接觸，然后如上所述確定其對(duì)靶蛋白活性的功能效果，或使表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞與推定的激動(dòng)劑接觸，然后如上所述確定其對(duì)靶蛋白活性的功能效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該能夠確定，一項(xiàng)檢測(cè)是否適合于確定是否激動(dòng)劑激活或未激活靶蛋白。將以推定的激動(dòng)劑處理的包含靶蛋白的樣品或檢測(cè)與無(wú)激動(dòng)劑的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，以檢測(cè)其效果范圍。指定對(duì)照樣品(未以激動(dòng)劑處理)的相對(duì)活性值為100%。當(dāng)相對(duì)于對(duì)照的活性值為110%，優(yōu)選150%，優(yōu)選200%、300%、400%、500% 或1000-3000%或更高時(shí)，實(shí)現(xiàn)了靶蛋白的激活作用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“正交受體”是指已修飾為選擇性識(shí)別新配體(“正交配體”)的受體。本文所用術(shù)語(yǔ)“正交配體”是指激活突變的或修飾的PYR/PYL受體多肽但不激活野生型PYR/PYL受體多肽的制劑。在一些實(shí)施方案中，正交配體為為農(nóng)業(yè)化學(xué)品，例如，殺菌劑、 除草劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、植物激活劑、增效劑、除草劑安全劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲劑和 /或肥料。
術(shù)語(yǔ)“植物”包括整株植物、嫩枝營(yíng)養(yǎng)器官和/或結(jié)構(gòu)(例如，葉、莖和塊莖)、根、花和花器官(例如，苞片、萼片、雄蕊、心皮、花藥)、胚珠(包括卵細(xì)胞和中央細(xì)胞)、種子(包括受精卵、胚胎、胚乳和種皮)、果實(shí)(例如，成熟子房)、幼苗、植物組織(例如，維管組織、 基本組織等)、細(xì)胞(例如，保衛(wèi)細(xì)胞、卵細(xì)胞、衛(wèi)細(xì)胞等)及其子代?？捎糜诒景l(fā)明方法中的植物類別通常寬泛至可實(shí)施轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等和低等植物，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物和多細(xì)胞藻類。其包括各種倍性的植物，包括非整倍體、多倍體、二倍體、單倍體和半合子。
本文所用術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指能夠啟動(dòng)細(xì)胞中編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。 因此，用于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的啟動(dòng)子包括順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和涉及調(diào)節(jié)或調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄計(jì)時(shí)和/或比率的調(diào)控序列。例如，啟動(dòng)子可為順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制起始點(diǎn)、染色體整合序列、5’和3’端未翻譯區(qū)或內(nèi)含子序列，其與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。通常這些順式作用序列與蛋白質(zhì)或其他生物分子相互作用以進(jìn)行 (打開/關(guān)閉、調(diào)節(jié)、控制等)基因轉(zhuǎn)錄?！爸参飭?dòng)子”為能夠在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子?！敖M成性啟動(dòng)子”為能夠在幾乎所有組織類型中中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中“組織特異性啟動(dòng)子”僅在一種或幾種特定組織類型中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。
如果多核苷酸序列源自外來(lái)的物種或源自同樣物種但在其初始形式上做了修飾， 則該多核苷酸序列對(duì)生物體或第二多核苷酸序列來(lái)說(shuō)是“異源的”。例如，當(dāng)說(shuō)啟動(dòng)子可操作地連接至異源的編碼序列時(shí)，是指所述編碼序列來(lái)源于一個(gè)物種而所述啟動(dòng)子序列來(lái)源于另一個(gè)物種；或如果二者來(lái)源于相同物種，則所述編碼序列與所述啟動(dòng)子并不天然地相關(guān)聯(lián)(例如，為基因修飾的編碼序列，例如，來(lái)源于相同物種的不同基因，或來(lái)源于不同生態(tài)型或品種的等位基因)。
“表達(dá)盒”是指核酸構(gòu)建體，當(dāng)其被引入至宿主細(xì)胞后分別導(dǎo)致RNA或多肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。該定義清楚地包括不翻譯或不能翻譯的反義或正義構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在轉(zhuǎn)基因表達(dá)和內(nèi)源基因抑制(例如，通過(guò)反義或正義抑制)兩種情況下，插入的多核苷酸序列不必是相同的，但可僅與其所源自的基因序列基本上相同。如本文所描述，通過(guò)參考特定核酸序列，特別地涵蓋了這些基本上相同的變異體。
如本文所用術(shù)語(yǔ)“非生物脅迫”、“脅迫”或“脅迫條件”是指將植物、植物細(xì)胞等暴露于非生命的(“非生物的”)物理或化學(xué)制劑，其對(duì)植物的代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖或生存 (總體地說(shuō)“生長(zhǎng)”)具有不利作用。施加于植物的脅迫可由于，例如，環(huán)境因子如水(例如， 水澇、干旱或脫水)、缺氧條件(例如，低水平的氧和高水平的CO2)、異常滲透條件、鹽分或溫度(例如，熱/高溫、冷、凍害或霜)，營(yíng)養(yǎng)缺乏或暴露于污染或通過(guò)激素、第二信使或其他分子。無(wú)氧脅迫，例如，由于氧氣水平降低(低氧或缺氧)足以產(chǎn)生脅迫應(yīng)答。因?yàn)楸热缬昙?、潮濕季?jié)、突發(fā)水澇或過(guò)度灌溉植物等發(fā)生的將植物、植物部分、組織或分離的細(xì)胞長(zhǎng)期或暫時(shí)地浸沒于液體媒介中會(huì)導(dǎo)致水澇脅迫。由于對(duì)于植物物種的最適宜生長(zhǎng)溫度范圍的溫度分別被降低或升高可導(dǎo)致發(fā)生冷脅迫或熱脅迫。該最適宜生長(zhǎng)溫度范圍易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定或?yàn)樗麄兯熘?。脫水脅迫可由于細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物失水、膨壓降低或減少含水量而誘導(dǎo)。干旱脅迫可由于細(xì)胞、組織、器官或生物體損失水分或供水減少而誘導(dǎo)或與其有關(guān)。鹽分誘導(dǎo)的脅迫(鹽脅迫)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外環(huán)境的滲透勢(shì)混亂有關(guān)或由其所誘導(dǎo)。本文所用術(shù)語(yǔ)“非生物脅迫耐受性”或“脅迫耐受性”是指相比正常條件下，植物對(duì)非生物脅迫具有增加的抗性或耐受性，并在非生物脅迫條件下能有相對(duì)出眾的表現(xiàn)。本文所用術(shù)語(yǔ)“抗旱性”和“耐旱性”是指相比正常情況，植物對(duì)供水減少誘導(dǎo)的脅迫具有增加的抗性或耐受性，并在缺水環(huán)境下能活動(dòng)和生存，并有相對(duì)出眾的表現(xiàn)。
發(fā)明詳述
1.簡(jiǎn)介
令人驚奇的是，屬于脫落酸(ABA)受體家族的蛋白，PYR/PYL受體家族，可突變?yōu)槟軌蚪Y(jié)合和應(yīng)答除ABA以外的化學(xué)品。已發(fā)現(xiàn)在ABA存在下，當(dāng)野生型PYR/PYL受體多肽與某些農(nóng)業(yè)化學(xué)品接觸時(shí)，降低了由ABA導(dǎo)致的PYR/PYL受體激活作用。另一個(gè)出人意料的啟示是發(fā) 現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于PYRl的K59殘基的氨基酸，接觸野生型PYR/PYL受體中ABA的PYR/ PYL配體結(jié)合口袋的保守殘基，可被突變?yōu)槎喾N變異體從而能夠產(chǎn)生多個(gè)正交配體的正交受體。
當(dāng)隨后對(duì)PYR/PYL受體多肽進(jìn)行誘變和篩選以確定是否能夠提高PYR/PYL受體與這些信化學(xué)激動(dòng)劑的結(jié)合，出人意料地發(fā)現(xiàn)PYR/PYL受體多肽中一些突變導(dǎo)致由非天然配體(正交配體)激活所述突變的PYR/PYL多肽。而且，在一些情況下，所述突變重新構(gòu)建了 PYR/PYL的配體結(jié)合口袋，因而同時(shí)廢除了天然配體(ABA)激活突變的PYR/PYL多肽的能力。
因此，有可能改變ABA受體如PYR/PYL受體多肽，以便除ABA以外的化合物可用于選擇性地激活它們。而且，由于突變的PYR/PYL受體(正交受體)可通過(guò)應(yīng)用正交配體(例如，作為一個(gè)程序的一部分而促進(jìn)植物對(duì)缺水的應(yīng)答)而被選擇性地激活，可以避免“產(chǎn)量下降(yield drag)”的問(wèn)題。產(chǎn)量下降通常與受體過(guò)表達(dá)有關(guān)，正?；蜃罴焉L(zhǎng)條件下 (即，無(wú)干旱或其他脅迫)基因過(guò)表達(dá)與生長(zhǎng)緩慢有關(guān)。
I1.突變的PYR/PYL受體多肽
本發(fā)明提供突變的PYR/PYL受體多肽，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受體多肽的化學(xué)品激活；以及編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受體多肽的化學(xué)品激活；包括編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的表達(dá)盒和表達(dá)載體，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受體多肽的化學(xué)品激活；包括突變PYR/PYL 受體多肽的植物，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受體多肽的化學(xué)品激活；生產(chǎn)包括突變PYR/PYL受體多肽的植物的方法，所述多肽被不激活野生型PYR/PYL受體多肽的化學(xué)品激活；以及制備突變的PYR/PYL受體多肽的方法。
在一些實(shí)施方案中，當(dāng)PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)，突變的PYR/PYL受體多肽，而非野生型PYR/PYL受體多肽，被化學(xué)品溴草腈、羥敵草腈、碘苯腈、殺鼠迷、二氯苯腈、 環(huán)酰菌胺、解草嗪或BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)激活。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽被不激活野生型PYR/PYL受體多肽的化學(xué)品激活，也被不激活野生型 PYR/PYL受體多肽的化合物ABA激活。
眾多野生型(天然產(chǎn)生的)PYR/PYL多肽序列為本領(lǐng)已知。盡管PYRl首先在擬南芥中被確定為脫落酸(ABA)受體，其實(shí)PYRl是在擬南芥的同樣蛋白家族中也調(diào)節(jié)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的至少14種蛋白(PYR/PYL蛋白)的小組成員之一。該蛋白家族也存在于其他植物中(參見，例如，序列LISTING)，其部分特征在于存在多聚乙酰環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域2 (PF10604)、 多聚乙酰環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域1(PF03364)和Bet VI結(jié)構(gòu)域(PR)3364)中的一個(gè)或多個(gè)或全部。 START/Bet vl 超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域描述于，例如，Radauer，BMC Evol. Biol. 8:286 (2008)。在一些實(shí)施方案中，野生型PYR/PYL受體多肽包含SEQ ID NO: 1-119中任一序列。在一些實(shí)施方案中，野生型PYR/PYL受體多肽與SEQ IDNO: 1-119中任一序列基本上相同(例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%95%、96%、97%、98% 或 99% 相同)。
突變的PYR/PYL受體多肽是源自天然產(chǎn)生的(即，野生型)PYR/PYL受體多肽的變異體。變異體包括，例如，保持活性的融合蛋白、缺失、插入或突變。在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽與下述任一序列基本上相同(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%95%、96%、97%、98% 或 99% 相同)SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118或119，并包括如本文所述的與對(duì)應(yīng)野生型PYR/ PYL受體多肽相關(guān)的1、2、3、4、5、6或更多個(gè)突變。此外，在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL 受體多肽還包含與異源氨基酸序列融合的氨基和/或羧基末端。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了許多影響對(duì)化學(xué)品應(yīng)答的突變。一些突變?cè)诓煌瘜W(xué)品的測(cè)試過(guò)程中產(chǎn)生并在一些情況下使得修飾的PYR/PYL受體蛋白能夠?qū)Σ煌囊幌盗谢瘜W(xué)品產(chǎn)生應(yīng)答。情況并非總是這樣，一些突變顯示出對(duì)一種化學(xué)品的選擇性，而不顯示出通過(guò)其他化學(xué)品促進(jìn)對(duì)修飾的PYR/PYL受體蛋白的激活。在一些情況下，對(duì)于修飾的PYR/PYL受體蛋白來(lái)說(shuō)單個(gè)突變足以使其通過(guò)化學(xué)品激動(dòng)劑而激活。在其他情況下，多個(gè)突變使得修飾的PYR/ PYL受體蛋白通過(guò)化學(xué)品激動(dòng)劑而激活。在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體蛋白含有2、 3、4、5、6或更多個(gè)突變，以便蛋白通過(guò)化學(xué)品激動(dòng)劑而被激活。
修飾的PYR/PYL受體蛋白可在PYR/PYL受體多肽序列的任何位點(diǎn)發(fā)生突變。在一些情況下，如本文所討論，突變可在PYR/PYL多肽的配體結(jié)合口袋中發(fā)生。然而，突變不必在PYR/PYL多肽的配體結(jié)合口袋中發(fā)生，以實(shí)現(xiàn)被正交配體激活。撇開特定理論的束縛而推測(cè)，由配體結(jié)合口袋外發(fā)生的導(dǎo)致PYR/PYL受體蛋白被正交配體激活的的突變，對(duì)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)具有間接影響，所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)使得受體具有被正交配體激活的能力。進(jìn)一步推測(cè)，對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中氨基酸K59的位點(diǎn)的特定突變使得PYR/PYL受體多肽相比野生型PYR/PYL受體多肽，能夠更容易地被正交配體激活，其為對(duì)正交受體進(jìn)行基因操作的理想特性。
本文所述的任何突變可產(chǎn)生于SEQ ID NO: 1-119中任一序列的多肽或與SEQ ID NO: 1-119中任一序列基本上相同的多肽?；蛘?，上述任何突變可產(chǎn)生于含有確定PYR/PYL 蛋白的任何一致性序列的多肽，例如，如下所述的。
一致性序列
PYR/PYL受體蛋白的描述，可參照確認(rèn)保守氨基酸或基序(即，其中序列中的改變會(huì)改變蛋白功能)的序列比對(duì)和序列比對(duì)中發(fā)生變異的區(qū)(即，其中的序列變異不會(huì)明顯影響蛋白活性)。SEQ IDNO: 120-12 3提供了用于確認(rèn)野生型PYR/PYL受體多肽的一致性序列。SEQ ID NO: 120-123的一致性序列通過(guò)對(duì)擬南芥PYR/PYL受體蛋白家族所有14個(gè)成員的比對(duì)而產(chǎn)生。在SEQ ID NO: 120-123的一致性序列中，大寫字母表示在擬南芥PYR/PYL 受體蛋白家族所有14個(gè)成員中完全保守的氨基酸殘基，而"X"在擬南芥PYR/PYL受體蛋白家族所有14個(gè)成員中并非完全保守的氨基酸殘基，其可為任何氨基酸。應(yīng)理解，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)選擇一個(gè)氨基酸插入至以"X"標(biāo)記的位點(diǎn)，所述氨基酸選擇在野生型或突變的PYR/PYL蛋白中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸。
PYRl 至 PYL13
CxSxxxxxxxAPxxxxffxxxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:120)
GxxRxVxxxSxxPAxxSxExLxxxD(SEQ ID NO:121)
GGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:122)
E SxxVDxPxGxxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:123)
一致性序列 CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxxxFxxxC (SEQ ID NO: 120)包含對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)的氨基酸30-65的區(qū)。一致性序列GxxRxVxxxSxxPAxxSxExLxxxD (SEQ ID NO: 121)包含對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)的氨基酸 76-100 的區(qū)。一致性序列 GGxHRLxNYxS (SEQ ID NO: 122)包含對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1) 的氨基酸 112-122 的區(qū)。ESxxVDxPxGxxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO: 123)包含對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)的氨基酸 141-171 的區(qū)。
在一些情況下，PYR/PYL突變?cè)赟EQ ID NO: 120-123的一致性序列內(nèi)的殘基上發(fā)生。在一些情況下，突變?cè)赑YR/PYL受體蛋白家族所有14個(gè)成員的完全保守的殘基上發(fā)生。在一些情況下，突變?cè)诓煌耆Ｊ氐臍埢习l(fā)生。如本文所示，一致性序列內(nèi)殘基上的替換突變被描述為替換一致性序列氨基酸的括號(hào)。如果一個(gè)以上的氨基酸被這樣的括號(hào)包住，就表明被括號(hào)包住的任一個(gè)氨基酸均可被替換為在所述一致性序列該殘基上的野生型氨基酸。
此外，修飾的PYR/PYL受體蛋白可在一致性序列內(nèi)包含一個(gè)以上的突變，或可包含至少2或更多的一致性序列且各一致性序列具有至少一個(gè)突變。
K59.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxx xxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)。
Y120.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列GGxHRLxN[HC] xS (SEQ ID NO:150)。
1110.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列[STCAYW] xGGxHRLxNYxS(SEQ ID NO:151)。
P42.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAP [ST] xxxffxxxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:152)。
S47.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列 CxSxxxxxxxAPxxxxff[PRA]xxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQ ID NO:153)。
K59和Y120.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAPx xxxffxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYW]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和 GGxHRLxN[HC]Xs(SEQ ID NO:150)。
K59和1110.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxx xxAPxxxxffxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和[STCAYW] xGGxHRLxNYxS(SEQID NO:151)。
K59和P42.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列 CxSxxxxxxxAP[ST]xxxffxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff]xFxxxC(SEQ ID NO:154)。
K59和S47.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列 CxSxxxxxxxAPxxxxff[PRA]xxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff]xFxxxC(SEQ ID NO:155)。
H60.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxx xxFxxPxxxx[R]FxxxC(SEQ ID NO:156)。
S92.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列GxxRxVxxxSxxPAxx [T] xExLxxxD(SEQ ID NO:157)。
E140.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列[GQD] SxxVDxPxGNxxxx TxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:158)。
K59和H60.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff][R]FxxxC(SEQ ID NO:159)。
K59和S92.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxx xxffxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff]xFxxxC (SEQ ID NO:149)和 GxxRxVxxxSxxPAxx[T] xExLxxxD(SEQ ID NO:157)。
K59和E140.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAPx xxxffxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff]xFxxxC(SEQ ID NO: 149)和[GQD]SxxVDxPxGNxxxx TxxFxxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:158)。
E94.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列 GxxRxVxxxSxxPAxxSx[D]xLxxxD(SEQ ID NO:160)。
K59和E94.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAPxxx xffxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff]xFxxxC(SEQ ID NO: 149)和 GxxRxVxxxSxxPAxxSx[D] xLxxxD(SEQ ID NO:160)。
N119.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列GGxHRLx[Y]YxS(SEQ ID NO:161)。
K59和NI 19.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxSxxxxxxxAP xxxxWxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和 GGxHRLx[Y]YxS(SEQ ID NO:161)。
Hl 15.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列GGx [Y] RLxNYxS (SEQ ID NO:162)。
F159.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列 ESxxVDxPxGNxxxxTxx[SL]xxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:163)。
K59和F159.在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體包含一致性序列CxS xxxxxxxAPxxxxffxxxxxFxxPxxx[ACDEFGHLMNQRSTVYff]xFxxxC(SEQ ID NO:149)和 ESxxVDxPxGNxxxxTxx[SL]xxxxxxxNLxxL(SEQ ID NO:163)。
因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述突變的PYR/PYL受體多肽包含一個(gè)或多個(gè)如上所述的一致性序列(SEQ ID NO: 149-163)或其保守性變異體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸，所述突變的PYR/PYL受體多肽包含一個(gè)或多個(gè)如上所述的一致性序列(SEQ ID NO: 149-163)或其保守性變異體。
修飾的PYR/PYL受體蛋白也可參考PYR/PYL多肽的序列標(biāo)識(shí)符(“SEQ ID” )描述。修飾的PYR/PYL受體可包含本文所列舉的SEQID，并進(jìn)一步包含如本文所述的至少一個(gè) (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變(例如，替換、缺失或插入突變)。因此，在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含SEQ ID NO: 1-119中任一序列且還包括至少一個(gè)在任一氨基酸位點(diǎn)的突變。
或者，修飾的PYR/PYL受體可與本文所列舉的SEQ ID基本上相同，并進(jìn)一步包含在氨基酸位點(diǎn)上的至少一個(gè)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)突變。在一些實(shí)施方案中， 突變的PYR/PYL受體多肽與SEQ ID NO: 1-119中任一序列基本上相同，還包括在任一氨基酸位點(diǎn)上的至少一個(gè)突變。
在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體蛋白在對(duì)應(yīng)于PYR1(SEQID NO:1)中氨基酸位點(diǎn)59的殘基上被修飾。在該殘基上的突變，也稱“K59”，破壞了修飾的PYR/PYL受體蛋白的ABA應(yīng)答性。
在一些情況下，K59突變不僅足以廢除修飾的PYR/PYL受體蛋白的ABA敏感性，還足以賦予修飾的PYR/PYL受體蛋白對(duì)新化學(xué)激動(dòng)劑("正交配體")的敏感性。在一些情況下，導(dǎo)致受體被正交配體激活的K59突變?yōu)楸彼釟埢鎿Q為野生型殘基，半胱氨酸殘基替換為野生型殘基，天冬氨酸殘基替換為野生型殘基，谷氨酸殘基替換為野生型殘基，苯丙氨酸殘基替換為野生型殘基，甘氨酸殘基替換為野生型殘基，組氨酸殘基替換為野生型殘基，亮氨酸殘基替換為野生型殘基，蛋氨酸殘基替換為野生型殘基，天冬酰胺殘基替換為野生型殘基，谷氨酰胺殘基替換為野生型殘基，精氨酸殘基替換為野生型殘基，絲氨酸殘基替換為野生型殘基，蘇氨酸殘基替換為野生型殘基，纈氨酸殘基替換為野生型殘基，酪氨酸殘基替換為野生型殘基，或色氨酸殘基替換為野生型殘基。
此外，除K59突變外，修飾的PYR/PYL受體蛋白可包含至少一個(gè)以上突變。如下述的表1-5所示，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)修飾包括K59突變和在所述蛋白其他殘基上的1、2、3、4或5個(gè)另外的突變時(shí)，很多化學(xué)激動(dòng)劑可激活修飾的PYR/PYL受體蛋白。突變組合的非限制性示例列舉，其中K59是一個(gè)突變位點(diǎn)，且其中修飾的PYR/PYL受體沒有被ABA激活而是被正交配體激活，包括
S47、K59 和 Y120
K59、Y120 和 V144
Ρ42、Κ59 和 Υ120
Ρ42、Κ59、Υ120 和 Τ124
Ρ42、Κ59、Υ120 和 Ε154
E12、E43、K59、IllO 和 Ν133
E12、L25、E43、K59、IllO 和 N133
P27、K59 和 Κ63
Τ57 和 Κ59
R50、K59 和 E141
K59、H60 和 NI51
K59、H60、E102、T125和E141
K59 和 182
K59 和 S92
H21、K59、H60、S92 和 Rl 16
P4UK59 和 H60
K59 和 NI 19
Q24、K59、I82、F159 和 D161
K59、Y120 和 Μ158
Ρ42、Κ59、Υ120 和 Μ158
Ρ42、Κ59、D97、Υ120、V163 和 Α172
Ρ42、L44、Κ59、Υ120、V138 和 Μ158
Ρ42、Κ59、Υ120、V123、V139 和 Μ158
S47、V49、Κ59、Υ120、Μ158 和 Α177
K59、V81、Y120、M158 和 V163
P27、P42、K59、D97、Y120、M158 和 T173
P42、K59、R74、Y120 和 M158
S29、K59、D97、Y120、V163 和 A172
P42、K59、Y120、V123、V139、M158 和 V163
K59、V81、Y120、M158 和 V163
E12、K59、V75、D97、Y120、V163 和 A172
L33、P42、K59、Y120、V123 和 M158
P42、K59、Y120、M158、V163 和 V174
RIO、P42、K59、D97、Y120、V163 和 A172。
因此，在一些實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的K59位的突變的PYR/PYL受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、 亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸或色氨酸。
在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽還包含從天然產(chǎn)生的殘基至非天然產(chǎn)生的殘基的至少一個(gè)另外的突變，所述突變?cè)趯?duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)10、12、 25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、 158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上。在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)另外的突變，所述突變?yōu)閺膶?duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)10、12、25、 27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、 163、172、173、174和/或177的氨基酸上的天然產(chǎn)生的殘基至丙氨酸殘基、半胱氨酸殘基、 天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、組氨酸殘基、異亮氨酸殘基、賴氨酸殘基、亮氨酸殘基、蛋氨酸殘基、天冬酰胺殘基、脯氨酸殘基、谷氨酸殘基、精氨酸殘基、絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、纈氨酸殘基、色氨酸殘基或酪氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)另外的突變，所述突變?cè)趯?duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn) 10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、110、120、123、124、133、138、139、 144、154、158、163、172、173、174和/或177的氨基酸上，其中所述突變選自R10Q、E12G、 E12K、L25R、P27L、S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、S47P、V491、R74C、V751、V81M、D97N、1110S、 Y120C、Y120H、V1231、T124M、N133D、V138M、V1391、V144A、E154G、M1581、V1631、A172T、 T173A、V1741、A177T或其組合。在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽還包括在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)62和110的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的異亮氨酸殘基。 在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)62 和110的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的纈氨酸-至-異亮氨酸突變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。
在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體蛋白已在除K59殘基外的殘基上被修飾。除 K59以外的突變的非限制性示例列舉，其中突變廢除了 ABA的激活作用但提高了正交配體對(duì)修飾的PYR/PYL受體蛋白的激活作用，包括
D26
E94
F159。
因此，在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中氨基酸位點(diǎn)26的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镈26G。在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中氨基酸位點(diǎn)94的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镋94D。在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中氨基酸位點(diǎn)159的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镕159L。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。
在一些情況下，修飾的PYR/PYL受體蛋白已在除K59殘基外的至少兩個(gè)殘基上被修飾。除K59突變以外的非限制性示例列舉，其中所述突變廢除了 ABA的激活作用但提高了正交配體對(duì)修飾的PYR/PYL受體蛋白的激活作用，包括
R37 和 F71
I110、E114 和 V138
H115 和 F159。
因此，在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)37、71、110、114、115、138和/或159的氨基酸上的至少兩個(gè)突變，其中所述突變選自R37Q、F71S、I110T、E114D、H115Y、V138M、F159S或其組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL受體多肽包含SEQ ID NO: 124-148或164-178 中任一序列。
PYR/PYL的配體結(jié)合口袋
PYR/PYL受體蛋白具有一個(gè)保守的START-結(jié)構(gòu)域配體結(jié)合口袋，其兩側(cè)連接有兩個(gè)稱為“門”和“栓”的環(huán)(MeIcher, K.等人，自然(Nature)462 (2009))。ABA在配體結(jié)合口袋與PYR/PYL受體蛋白結(jié)合，且ABA結(jié)合誘導(dǎo)兩個(gè)環(huán)關(guān)閉而將ABA封閉于配體結(jié)合口袋中。 在野生型PYR/PYL受體蛋白中，當(dāng)ABA結(jié)合至PYR/PYL受體蛋白的口袋中時(shí)，包括所述配體結(jié)合口袋的殘基是那些具有長(zhǎng)度在4埃以內(nèi)的ABA或伴隨ABA的水分子側(cè)鏈的殘基。例如，PYRl (SEQ ID NO:1)中包含配體結(jié)合口袋的殘基為P55、K59、F61、162、R79、V81、V83、 P88、A89、S92、E94、F108、1110、H115、L117、Y120、E141、F159、V163 和 N167。
在一些實(shí)施方案中，PYR/PYL受體多肽在包括PYR/PYL受體蛋白的配體結(jié)合口袋的至少一個(gè)氨基酸殘基上發(fā)生突變。因此，在一些實(shí)施方案中突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于 PYR1(SEQ ID NO:1)中位點(diǎn) 55、59、61、62、79、81、83、88、89、92、94、108、110、 115、117、120、141、159、163和/或167的氨基酸上的至少一個(gè)突變，其中所述突變選自 P55、K59、F61、162、R79、V81、V83、P88、A89、S92、E94、F108、1110、H115、L117、Y120、E141、 F159、V163、N167或其組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述突變的 PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。.
本 發(fā)明的實(shí)施方案在本發(fā)明的方法和組合物(例如，表達(dá)盒、植物等)中提供上述蛋白的用途和/或編碼該多肽的核酸序列。編碼植物野生型PYR/PYL受體(例如，從其中 PYR/PYL序列還未確認(rèn)的植物中)的多核苷酸序列的分離可通過(guò)許多技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，基于本文公開的PYR/PYL編碼序列(例如，在序列表中列出的)的寡核苷酸探針可用于確認(rèn)在cDNA或基因組DNA庫(kù)中的所需野生型PYR/PYL基因。為構(gòu)建基因組庫(kù)，通過(guò)隨機(jī)破碎來(lái)產(chǎn)生大片段的基因組DNA，例如，使用限制性內(nèi)切酶，并連接至載體DNA以形成可包裝至合適載體的串聯(lián)體。為制備cDNA庫(kù)，從所需組織如特定植物物種的葉子中分離mRNA，并從所述mRNA制備含有目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄本的cDNA庫(kù)?；蛘?，可從自其中PYR/PYL基因已表達(dá)的其他組織中提取的mRNA制備cDNA。
然后，可用基于本文公開的PYR/PYL基因序列的探針篩選cDNA或基因組庫(kù)?？捎锰结樑c基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同植物物種中的同源基因?；蛘撸捎门囵B(yǎng)的抗-多肽的抗體篩選mRNA表達(dá)庫(kù)。
或者，編碼PYR/PYL的核酸可用擴(kuò)增技術(shù)從核酸樣品擴(kuò)增。例如，可用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)從基因組DNA、cDNA、基因組庫(kù)或cDNA庫(kù)直接擴(kuò)增PYR/PYL的編碼序列。也可使用PCR和其他體外擴(kuò)增方法，例如，克隆待表達(dá)的編碼PYR/PYL的多核苷酸序列，將核酸用作探針用于檢測(cè)樣品中所需mRNA的存在，以用于核酸測(cè)序或其他目的。全面的PCR概述參見PCR指南方法和應(yīng)用指導(dǎo)(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications)，(Innis, M. , Gelfand, D. , Sninsky, J.和 White, T.編著)，圣迭戈，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press) (1990)。用于從植物組織中確認(rèn)序列的合適引物和探針通過(guò)將本文提供的序列與其他相關(guān)基因進(jìn)行比較而產(chǎn)生。
在一些實(shí)施方案中，許多植物的部分或全部基因組已經(jīng)測(cè)序并公開了確認(rèn)的閱讀框。通過(guò)BLAST搜索可以在各種植物中確認(rèn)野生型PYR/PYL的編碼序列。
II1.化學(xué)激動(dòng)劑和激動(dòng)劑制劑
本發(fā)明的實(shí)施方案提供農(nóng)業(yè)化學(xué)制劑，其被配制用于接觸突變的PYR/PYL受體多肽和/或含有突變的PYR/PYL受體多肽的植物，其中所述制劑含有本發(fā)明的突變PYR/PYL 多肽的激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，農(nóng)業(yè)化學(xué)激動(dòng)劑包括殺真菌劑、除草劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、植物活化劑、增效劑、除草劑安全劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲劑或肥料。在一些實(shí)施方案中，農(nóng)業(yè)化學(xué)激動(dòng)劑選自下組溴苯腈、羥敵草腈、碘苯腈、殺鼠迷、二氯苯腈、環(huán)酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
農(nóng)業(yè)化學(xué)品通常制備并作為可促進(jìn)吸收和效率的酯或鹽用于植物。普遍存在的細(xì)胞酯酶的功能可將酯(或同系物如S-甲基衍生物或阿拉酸式苯)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘钚孕问降淖杂伤峄虼?。例如，溴草腈丁酯、溴草腈庚酸酯、溴草腈辛酸酯和溴草?鉀為溴草腈的替代性制劑。吸收后這些化合物在植物中形成同樣的生物活性種類(溴草腈)。羥敵草腈和碘苯腈的類似變異體能夠制備且為已知(例如，碘苯腈-鋰、碘苯腈辛酸酯、碘苯腈-鈉等) BTH為阿拉酸式苯的S-甲基衍生物，其為BTH在植物中的活性形式。
環(huán)酰菌胺
已發(fā)現(xiàn)，突變對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，并一起突變PYR/PYL受體多肽中至少一個(gè)以上氨基酸導(dǎo)致修飾的受體被環(huán)酰菌胺(表1、7和8)激活。導(dǎo)致所述修飾的受體被環(huán)酰菌胺激活的突變組合的非限制性例舉，包括
S47P、K59R 和 Y120H
K59R、Y120H 和 V144A
P42S、K59R 和 Y120C
P42S、K59R、Y120C 和 T124M
P42S、K59R、Y120C 和 E154G
E12G、E43G、K59R、1110S 和 N133D
E12G、L25R、E43G、K59R、IllOS和 N133D
K59R、Y120H 和 M158I
P42S、K59R、Y120H 和 M158I
P42S、K59R、D97N、Y120H、V163I 和 A172T
P42S、L44F、K59R、Y120H、V138M 和 M158I
P42S、K59R、Y120H、V1231、V139I 和 M158I
S47P、V491、K59R、Y120H、M158I 和 A177T
K59R、V81M、Y120C、M158I 和 V163I
P27L、P42S、K59R、D97N、Y120H、M158I 和 T173A
P42S、K59R、R74C、Y120H 和 M158I
S29N、K59R、D97N、Y120H、V163I 和 A172T
P42S、K59R、Y120H、V1231、V1391、M158I 和 V163I
K59R、V81M、Y120H、M158I 和 V163I
E12K、K59R、V751、D97N、Y120H、V163I 和 A172T
L33F、P42S、K59R、Y120H、V123I 和 M158I
P42S、K59R、Y120H、M1581、V163I 和 V174I
R10Q、P42S、K59R、D97N、Y120H、V163I 和 A172T。
因此，在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL受體被環(huán)酰菌胺激活。在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL蛋白包含對(duì)應(yīng)于上述各組的一組或多組突變。在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL受體蛋白包含對(duì)應(yīng)于上述各組的任一組，還包括在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1) 中位點(diǎn)62和110的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的異亮氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，修飾的 PYR/PYL受體蛋白包含在對(duì)應(yīng)于PYR1(SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)62和110的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的纈氨酸-至-異亮氨酸突變(例如，在PYL2 (SEQ ID NO: 3)中氨基酸位點(diǎn)64和/ 或114上的纈氨酸-至-異亮氨酸突變，其分別對(duì)應(yīng)于PYRl中位點(diǎn)62和110)。在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL受體蛋白與SEQ ID NO: 1-119任一序列基本上相同和/或包含選自SEQ ID NO: 149-163的一個(gè)或多個(gè)一致性序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述修飾的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。
此外，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，篩選修飾的PYR/PYL受體多肽的方法包括篩選所述修飾的多肽以確定其是否被環(huán)酰菌胺激活。
溴草腈
已發(fā)現(xiàn)，突變對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，并一起突變PYR/PYL受體多肽中至少一個(gè)以上氨基酸導(dǎo)致所述修飾的受體被溴草腈(表2)激活。導(dǎo)致所述修飾的受體被溴草腈激活的突變組合的非限制性例舉，包括
T57A 和 K59R
R50G、K59R 和 E141Q
K59、H60R 和 N151D
K59R、H60R、E102G、T125A 和 E141D
K59R 和 I82N
K59R 和 S92T
H21Y、K59R、H60R、S92T 和 R116K
P41L、K59R 和 H60R。
因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明修飾的PYR/PYL受體被溴草腈或溴草腈類似物羥敵草腈和碘苯腈激活。在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL蛋白包含對(duì)應(yīng)于上述各組的一組或多組突變。在一些實(shí)施方案中，該蛋白與SEQ ID NO: 1-119中任一序列基本上相同和/或包含選自SEQ ID NO: 149-163的一個(gè)或多個(gè)一致性序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述修飾的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。
此外，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，篩選修飾的PYR/PYL受體多肽的方法包括篩選所述修飾的多肽以確定其是否被溴草腈或溴草腈類似物羥敵草腈和碘苯腈激活。
二氯苯腈
在一些情況下，僅突變對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸導(dǎo)致修飾的受體被二氯苯腈(表3)激活。突變對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，并一起突變PYR/PYL受體多肽中至少一個(gè)以上氨基酸導(dǎo)致所述修飾的受體被二氯苯腈激活。在一些情況下，為使二氯苯腈激活所述受體，并不需要突變所述修飾的PYR/PYL受體多肽中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1 中K59的氨基酸，只要在PYR/PYL受體多肽中另一個(gè)氨基酸上存在至少一個(gè)突變。導(dǎo)致修飾的PYR/PYL受體被二氯苯腈激活的突變組合的非限制性例舉，包括
K59R
D26G
E94D
R37Q 和 F71S
P27L、K59R 和 K63N。
因此，在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL受體被二氯苯腈激活。在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL蛋白包含對(duì)應(yīng)于上述各組的一組或多組突變。在一些實(shí)施方案中，該蛋白與SEQ ID NO: 1-119中任一序列基本上相同和/或包含選自SEQ ID NO: 149-163的一個(gè)或多個(gè)一致性序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述修飾的PYR/PYL 受體多肽的多核苷酸。
此外，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，篩選修飾的PYR/PYL受體多肽的方法包括篩選所述修飾的多肽以確定其是否被二氯苯腈激活。
解草嗪
在一些情況下，僅突變對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸導(dǎo)致修飾的受體被解草嗪(表4)激活。在一些情況下，為使解草嗪激活所述受體，并不需要突變修飾的PYR/PYL 受體多肽中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1中K59的氨基酸，只要在所述PYR/PYL受體多肽中另一個(gè)氨基酸上存在至少一個(gè)突變。導(dǎo)致修飾的PYR/PYL受體被解草嗪激活的突變組合的非限制性例舉，包括
K59R 和 N119Y
I110T、E114D 和 V138M。
因此，在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL受體被解草嗪激活。在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL蛋白包含對(duì)應(yīng)于上述各組的一組或多組突變。在一些實(shí)施方案中，該蛋白與SEQ ID NO: 1-119中任一序列基本上相同和/或包含選自SEQ ID NO: 149-163的一個(gè)或多個(gè)一致性序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述修飾的PYR/PYL 受體多肽的多核苷酸。
此外，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，篩選修飾的PYR/PYL受體多肽的方法包括篩選所述修飾的多肽以確定其是否被解草嗪激活。
BTH
在一些情況下，突變PYR/PYL受體多肽中一個(gè)氨基酸導(dǎo)致修飾的受體被BTH(表5) 激活。在一些情況下，突變PYR/PYL受體多肽中兩個(gè)或更多氨基酸導(dǎo)致所述修飾的受體被 BTH激活。導(dǎo)致修飾的PYR/PYL受體被BTH激活的突變組合的非限制性例舉，包括
Q24R、K59R、I82T、F159L 和 D161G
H115Y 和 F159S
F159L。
因此，在一些實(shí)施方案中，修飾的PYR/PYL受體被BTH激活。在一些實(shí)施方案中， 修飾的PYR/PYL蛋白包含對(duì)應(yīng)于上述各組的一組或多組突變。在一些實(shí)施方案中，該蛋白與SEQ ID NO: 1-119中任一序列基本上相同和/或包含選自SEQ ID NO: 149-163的一個(gè)或多個(gè)一致性序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼一個(gè)或多個(gè)所述修飾的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。
此外，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，篩選修飾的PYR/PYL受體多肽的方法包括篩選所述修飾的多肽以確定其是否被BTH激活。
可通過(guò)本領(lǐng)域人員已知的各種方法制備化學(xué)激動(dòng)劑，例如，描述于綜合有機(jī)轉(zhuǎn)化 (Comprehensive Organic Transformations),第二版，Richard C. Larock 編著，1999 中的方法。上述方法中的起始原料可商業(yè)獲得(Sigma-Aldrich公司)或可通過(guò)本領(lǐng)域人員已知的方法制備。
在一些實(shí)施方案中，預(yù)期的農(nóng)業(yè)化學(xué)制劑被配制為用于與植物接觸。根據(jù)本發(fā)明， 所述制劑適于例如在載體中處理植物或植物繁殖材料如種子。合適的添加劑包括緩沖劑、 潤(rùn)濕劑、涂覆劑、多糖和研磨劑。示例性載體包括水、水溶液、漿液、固體和干粉(例如，泥炭、小麥、麥麩、蛭石、粘土、巴氏殺菌的土壤、許多形式的碳酸鈣、白云石、各種等級(jí)的石膏、 膨潤(rùn)土和其它粘土礦物、巖石磷酸鹽和其它磷化合物、二氧化鈦、腐殖質(zhì)、滑石、藻酸鹽和活性炭)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何農(nóng)業(yè)上合適的載體均可接受并可考慮用于本發(fā)明中。 任選地，所述制劑還可包括至少一個(gè)表面活性劑、除草劑、殺真菌劑、殺蟲劑或肥料。
農(nóng)業(yè)化學(xué)制劑與突變的PYR/PYL受體多肽的接觸可在體外進(jìn)行(例如，其中突變的PYR/PYL受體多肽以純化形式存在或在酵母細(xì)胞中表達(dá))或在體內(nèi)進(jìn)行(例如，其中突變的PYR/PYL受體多肽由植物表達(dá))。可使用各種已知的方法使農(nóng)業(yè)化學(xué)制劑與突變的 PYR/PYL受體多肽在體外接觸，例如，通過(guò)將所述制劑應(yīng)用于蛋白結(jié)合試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物或酵母雙雜交試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)或使用其他生物體的基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。
可使用各種已知的方法使農(nóng)業(yè)化學(xué)制劑與突變的PYR/PYL受體多肽在體內(nèi)(例如，與植物)接觸，例如，通過(guò)在繁殖材料上噴灑、霧化、撒粉、散布組合物，或在植物上涂刷或傾澆組合物或與其接觸，或在種子的情況下，通過(guò)涂覆、包衣種子或其他方法處理種子。 或者，在種植以前直接處理植物或種子，可將本發(fā)明所述制劑引入至用于播種種子的土壤或其他媒介中。在一些實(shí)施方案中，該實(shí)施方案中也使用載體。如上 所述，載體可為固體或液體。在一些實(shí)施方案中，將泥炭懸浮于水中作為化學(xué)激動(dòng)劑的載體，種植時(shí)將混合物噴灑至土壤或種植媒介和/或種子上。
IV.制備突變的PYR/PYL受體多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案提供制備突變的PYR/PYL受體多肽的方法，所述突變的PYR/ PYL受體多肽被不激活野生型PYR/PYL受體多肽的化學(xué)品激動(dòng)劑激活。在一些實(shí)施方案中，方法包括誘變野生型PYR/PYL受體多肽，使一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽與推定的化學(xué)激動(dòng)劑接觸，以及確定所述化學(xué)品是否激活所述一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽，其中激活作用確認(rèn)所述一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽被所述化學(xué)品激活。
突變的PYR/PYL受體多肽可通過(guò)對(duì)編碼對(duì)應(yīng)野生型PYR/PYL受體多肽(例如， SEQ ID N0:l-119中任一序列的野生型PYR/PYL多肽或本發(fā)明突變體PYR/PYL受體多肽產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)變異體)的DNA序列進(jìn)行突變而構(gòu)建，如通過(guò)使用通常所說(shuō)的定點(diǎn)誘變技術(shù)。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)編碼野生型PYR/PYL受體多肽的核酸分子進(jìn)行突變(參見，例如，PCR策略(PCRStrategies) (M. A.1nnis, D. H. Gelfand 和J. J. Sninsky編著，1995,學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),加利福尼亞州圣迭戈市)第14 章；PCR 指南方法和應(yīng)用指導(dǎo)(PCR Protocols:AGuide to Methods andAppIications) (M. A.1nnis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky 和 T. J. White 編著，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，紐約，1990)。
以非限制性實(shí)例的方式，誘變可通過(guò)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增(ePCR)的方法來(lái)完成，為了提高DNA復(fù) 制的錯(cuò)誤增加率，其修改了 PCR反應(yīng)條件(例如，使用易錯(cuò)聚合酶，改變鎂或錳的濃度，或提供未經(jīng)平衡的dNTP比率)。用于ePCR誘變的試劑盒可商業(yè)獲得，如 GeneMorph pcR誘變?cè)噭┖?Stratagene公司)和Diversify PCR隨機(jī)誘變?cè)噭┖?(Clontech公司)。簡(jiǎn)而言之，將DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)、鹽(例如，MgC12, MgS04 或MnS04)、未經(jīng)平衡比率的dNTP、反應(yīng)緩沖劑和DNA模板組合起來(lái)按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增。ePCR擴(kuò)增后，將反應(yīng)產(chǎn)物克隆至合適的載體以構(gòu)建誘變庫(kù)，然后如下所述將其轉(zhuǎn)化至合適的細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞)用于隨后的篩選(例如，通過(guò)雙雜交篩選)。
或者，可通過(guò)重組(S卩，DNA改組)來(lái)完成誘變。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)將親本DNA隨機(jī)破碎再使用PCR進(jìn)行重組，使用體外同源重組進(jìn)行DNA改組而產(chǎn)生改組的突變體庫(kù)，導(dǎo)致隨機(jī)引入的點(diǎn)突變。進(jìn)行DNA改組的方法為本領(lǐng)域已知(參見，例如，Stebel, S.C.等人， Methods MolBiol352:167-190(2007))。
任選地，為了提高分離的突變體蛋白的效率，可進(jìn)行多輪誘變。因此，在一些實(shí)施方案中，分離自ePCR的PYR/PYL突變體以及隨后的篩選可合并，且用作模板用于后來(lái)幾輪誘變。
V.篩選突變的PYR/PYL受體多肽的激動(dòng)作用(Agonism)
本發(fā)明實(shí)施方案還提供篩選推定的化學(xué)激動(dòng)劑的方法以確定，當(dāng)推定的激動(dòng)劑與 PYR/PYL受體多肽接觸時(shí)，是否推定的激動(dòng)劑激活突變的PYR/PYL受體多肽，而不明顯激活野生型PYR/PYL受體多肽。如本文所用，如果一種制劑的存在導(dǎo)致PYR/PYL受體蛋白的激活作用或活性上調(diào)，那么該制劑就“激活(agonize) ”該受體，例如，提高來(lái)自PYR/PYL受體的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于本發(fā)明，如果當(dāng)一種制劑以不大于200 μ M的濃度存在時(shí)，使該制劑與PYR/PYL受體接觸導(dǎo)致PYR/PYL受體的激活作用或活性上調(diào)，那么該制劑激活所述PYR/PYL受體。如果當(dāng)一種制劑以不大于200 μ M的濃度存在時(shí)，使該制劑與PYR/PYL受體接觸不誘導(dǎo)PYR/PYL受體蛋白的激活作用或活性上調(diào)，那么該制劑不明顯激活所述PYR/PYL受體。如本文所用，“激活作用(activation)”需要由所述制劑誘導(dǎo)的最小活性閾值。確定是否該符合的(met)最小活性閾值能夠?qū)崿F(xiàn)，例如，通過(guò)使用酶法磷酸酶試驗(yàn)，設(shè)定必須誘導(dǎo)的酶活性水平的最小值，或在顏色檢測(cè)試劑存在下(例如，磷酸對(duì)硝基苯酯)，通過(guò)使用酶的磷酸酶試驗(yàn)，其中如果觀察到顏色變化則最小活性閾值符合要求。
可使用許多不同篩選方案確認(rèn)激活突變的 PYR/PYL受體多肽而非野生型PYR/PYL 受體多肽的化學(xué)制劑?？墒褂梅蛛x的、純化的或部分純化的制劑進(jìn)行篩選。在一些實(shí)施方案中，可使用純化的或部分純化的PYR/PYL多肽。
或者，可使用基于細(xì)胞的或基于植物的篩選方法。例如，可使用天然表達(dá)野生型 PYR/PYL受體多肽的細(xì)胞或重組地表達(dá)野生型或突變的PYR/PYL受體多肽的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所用細(xì)胞為植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞，包括但不限于酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？偟膩?lái)說(shuō)，篩選方法涉及篩選一個(gè)或多個(gè)化學(xué)制劑以確認(rèn)激活突變PYR/PYL受體多肽的活性(例如，激活突變的PYR/PYL受體多肽或增加突變的PYR/ PYL受體多肽表達(dá)或編碼突變的PYR/PYL受體多肽的轉(zhuǎn)錄體)的制劑，但該制劑并不激活野生型PYR/PYL受體多肽的活性。任選地，篩選方法可包含兩個(gè)篩選過(guò)程首先，篩選多個(gè)推定的激動(dòng)劑以確認(rèn)與野生型PYR/PYL受體多肽發(fā)生弱相互作用的化合物(“弱配體”)，然后，篩選這些針對(duì)野生型PYR/PYL受體多肽的弱配體和多個(gè)誘變的PYR/PYL受體多肽，從而確定哪個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽被弱配體激活以及哪個(gè)弱配體只是選擇性激活突變的 PYR/PYL受體多肽而不激活野生型PYR/PYL受體多肽。
結(jié)合試驗(yàn)
任選地，通過(guò)篩選能夠結(jié)合野生型PYR/PRL受體多肽的制劑而進(jìn)行初步篩選。弱結(jié)合配體預(yù)選提高了分離被所述制劑激活的突變PYR/PYL受體多肽的頻率，推測(cè)因?yàn)樾枰潴w結(jié)合位點(diǎn)的更少改變來(lái)實(shí)現(xiàn)分子識(shí)別。
結(jié)合試驗(yàn)可包括使野生型PYR/PYL受體多肽與一種或多種化學(xué)制劑結(jié)合并允許蛋白和化學(xué)制劑有足夠時(shí)間來(lái)形成結(jié)合復(fù)合體。使用眾多已有分析技術(shù)中的任何技術(shù)均可檢測(cè)所形成的任何結(jié)合復(fù)合體。蛋白結(jié)合試驗(yàn)包括但不限于，測(cè)量共沉淀或在非變性 SDS聚丙烯酰胺凝膠上共遷移和在免疫印跡上共遷移的方法(參見，例如，Bennet, J. P.和 Yamamura, H.1. (1985) “神經(jīng)遞質(zhì)、激素或藥物受體結(jié)合方法(Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods) ”，神經(jīng)遞質(zhì)受體結(jié)合(Neurotransmitter Receptor Binding) (Yamamura, H.1.，等人編著)，pp. 61-89。其他結(jié)合試驗(yàn)包括使用質(zhì)譜或NMR技術(shù)確認(rèn)分子結(jié)合至PYR/PYL多肽或標(biāo)記底物的置換(例如，標(biāo)記的農(nóng)業(yè)化學(xué)品)。該試驗(yàn)中所用的PYR/PYL多肽蛋白可天然地表達(dá)、克隆或合成。
激動(dòng)劑試驗(yàn)
激動(dòng)劑試驗(yàn)可包括篩選推定的化學(xué)激動(dòng)劑(其可能已預(yù)選或未預(yù)選為弱結(jié)合配體)以確定哪個(gè)推定的激動(dòng)劑激活至少一個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽而不激活野生型PYR/ PYL受體多肽，和/或用推定的化學(xué)激動(dòng)劑(其可能已預(yù)選或未預(yù)選為弱結(jié)合配體)篩選誘變的PYR/PYL受體多肽以確定哪個(gè)誘變的PYR/PYL受體多肽被所述推定的激動(dòng)劑激活。
可使用任何數(shù)量的試驗(yàn)篩選突變PYR/PYL受體多肽的激動(dòng)劑。一種活性試驗(yàn)包括檢測(cè)是否一種推定的激動(dòng)劑能夠以激動(dòng)劑-特定方式誘導(dǎo)突變的PYR/PYL蛋白與2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽結(jié)合。可使用哺乳動(dòng)物或酵母雙雜交法(參見，例如，Bartel, P. L.等人，MethodsEnzymol, 254:241 (1995))確認(rèn)當(dāng)在一起在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)互相作用或結(jié)合的多肽或其他分子。在一些實(shí)施方案中，激活突變的PYR/PYL受體多肽而非野生型PYR/PYL受體多肽的制劑，在PYR/PYL多肽和2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽之間于雙雜交試驗(yàn)確認(rèn)，其中激動(dòng)劑被確認(rèn)為激活或使PYR/PYL多肽和PP2C多肽相結(jié)合的制劑。因此，兩種多肽在所述制劑存在下結(jié)合，而其在無(wú)所述制劑下不結(jié)合。任選地，陽(yáng)性和陰性挑選方案均可用于雙雜交試驗(yàn)中。例如，酵母雙雜交試驗(yàn)可使用URA3報(bào)告菌株進(jìn)行陽(yáng)性和陰性挑選；在無(wú)外源尿嘧啶供給下URA菌株的生長(zhǎng)使得能夠?qū)Υ龠M(jìn)激動(dòng)劑應(yīng)答性(即，激動(dòng)劑-促進(jìn)的蛋白-蛋白相互作用)的突變體進(jìn)行陽(yáng)性挑選，當(dāng)在FOA (5-氟-乳清酸，其被URA3代謝為有毒代謝物)上生長(zhǎng)時(shí)使得能夠選擇促進(jìn)激動(dòng)劑應(yīng)答(例如，去除導(dǎo)致組成性(即，非配體化)相互作用的突變體)的突變體。
還提供了篩選提高突變PYR/PYL受體多肽的表達(dá)而不提高野生型PYR/PYL受體多肽的表達(dá)的化合物。篩選方法通常包括進(jìn)行基于細(xì)胞的或基于植物的試驗(yàn)，其中使測(cè)試化合物與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)PYR/PYL多肽的細(xì)胞接觸，然后檢測(cè)在PYR/PYL表達(dá)(轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物)上的增加。試驗(yàn)可在天然表達(dá)野生型PYR/PYL的細(xì)胞中進(jìn)行，或在重組改變后表達(dá)突變的或野生型PYR/PYL的細(xì)胞中進(jìn)行?？蛇M(jìn)行各種對(duì)照試驗(yàn)以確信所觀察的活性是真實(shí)的，包括與缺少報(bào)告構(gòu)建體的細(xì)胞進(jìn)行平行反應(yīng)，或不使含有所述報(bào)告構(gòu)建體的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸。
通過(guò)任何前述篩選方法初步確認(rèn)的制劑和突變的PYR/PYL受體多肽，可進(jìn)一步檢測(cè)以證實(shí)其明顯的活性和/或確定所述制劑和/或突變PYR/PYL受體多肽的其他生物功能。在一些情況下，對(duì)于所確認(rèn)制劑和/或突變的PYR/PYL受體多肽，檢測(cè)其對(duì)植物脅迫 (例如，耐旱性)、種子萌發(fā)或受ABA作用的另一表現(xiàn)型的影響能力。本領(lǐng)域已知很多這種試驗(yàn)和表現(xiàn)型，并能夠根據(jù)本發(fā)明方法使用。
V1.重組表達(dá)載體
一旦獲得了編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列，其也可用于制備在轉(zhuǎn)基因植物中在異源啟動(dòng)子的控制 下表達(dá)所述突變的PYR/PYL受體多肽的表達(dá)盒。突變的PYR/ PYL多核苷酸的表達(dá)增加可用于，例如，生產(chǎn)對(duì)不激活內(nèi)源PYR/PYL受體蛋白的化學(xué)激動(dòng)劑產(chǎn)生應(yīng)答的植物，由此而提高非生物脅迫抗性。
本領(lǐng)域熟知的眾多方法中的任何方法均可用于促進(jìn)植物中的突變PYR/PYL活性或表達(dá)。其可靶向任何器官如枝芽營(yíng)養(yǎng)器官/結(jié)構(gòu)(例如，葉、莖和塊莖)、根、花和花器官 /結(jié)構(gòu)(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥和胚珠)、種子(包括胚、胚乳和種皮)和果實(shí)。或者，突變的PYR/PYL多核苷酸可進(jìn)行組成性表達(dá)(例如，使用CaMV 35S啟動(dòng)子)。
為了在上述技術(shù)中使用突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列，制備適于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重組DNA載體。轉(zhuǎn)化各種高等植物物種的技術(shù)是已知的并描述于技術(shù)和科技文獻(xiàn)中。參見，例如，Weising等人，Ann. Rev. Genet. 22:421-477(1988)。優(yōu)選地，將編碼突變的PYR/PYL受體多肽的DNA序列與轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)調(diào)控序列組合，所述啟動(dòng)調(diào)控序列調(diào)控從轉(zhuǎn)化植物目標(biāo)組織的基因進(jìn)行序列轉(zhuǎn)錄。
例如，可使用植物啟動(dòng)子片段調(diào)控再生植物各種組織中突變的PYR/PYL多核苷酸的表達(dá)。本文將這樣的啟動(dòng)子稱為“組成性”啟動(dòng)子，其在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下具有活性。組成性啟動(dòng)子的實(shí)例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)，源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的I’ -或2’ -啟動(dòng)子，來(lái)自各種植物基因的其他轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
或者，植物啟動(dòng)子可在特定組織(組織特異性啟動(dòng)子)或者也可在更加精確的環(huán)境控制下(可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子)調(diào)控突變的PYR/PYL受體蛋白的表達(dá)。在發(fā)育控制下的組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括僅在一些組織如葉子或保衛(wèi)細(xì)胞(包括但不限于那些公布于 W0/2005/085449 ;美國(guó)專利 No. 6，653，535 ;Li 等人，Sci China C Life Sc1. 2005 年 4 月，48 (2) : 181-6 ；Husebye 等人，植物生理學(xué)(Plant Physiol)，2002 年 4 月,Vol. 128, pp. 1180-1188 ；以及 Plesch,等人，Gene, Volume 249, Number I, 16May 2000, pp. 83-89(7))中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^(guò)可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件、升高的溫度或光的存在。
如果期望合適的蛋白表達(dá)，在編碼區(qū)的3’-端需要含有多腺苷酸化區(qū)。所述多腺苷酸化區(qū)可來(lái)自天然產(chǎn)生的PYR/PYL基因、各種其他植物基因或T-DNA。
含有所述序列(例如，啟動(dòng)子或PYR/PYL編碼區(qū))的載體通常包括在植物細(xì)胞上賦予可選擇的表現(xiàn)型的標(biāo)記基因。例如，所述標(biāo)記基因可編碼殺生劑抗性，尤其是抗生素抗性如對(duì)卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素的抗性，或除草劑抗性如對(duì)綠黃隆 (chlorosIuforon)或 Basta 的抗性。
在一些實(shí)施方案中，所述突變的PYR/PYL核酸序列在植物細(xì)胞中重組地表達(dá)。 可制備適于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的各種不同表達(dá)構(gòu)建體如表達(dá)盒和載體。轉(zhuǎn)化各種高等植物物種的技術(shù)是已知的并描述于技術(shù)和科技文獻(xiàn)中。參見，例如，Weising等人Ann. Rev. Genet. 22:421-477(1988)。可將編碼PYR/PYL蛋白的DNA序列與順式作用(啟動(dòng)子)和反式作用(增強(qiáng)子)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列組合，以調(diào)控轉(zhuǎn)化的植物目標(biāo)組織中的轉(zhuǎn)錄時(shí)間、組織類型和水平。也可使用翻譯控制元件。
本發(fā)明實(shí)施方案還提供了可操作地連接至啟動(dòng)子的突變PYR/PYL核酸，在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)植物中PYR/PYL編碼序列的轉(zhuǎn)錄。所述啟動(dòng)子可源自，例如，植物或病毒來(lái)源。所述啟動(dòng)子可具有，例如，組成型活性、可誘導(dǎo)性或組織特異性。在構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)盒、載體、轉(zhuǎn)基因中，可選擇不同的啟動(dòng)子并用于區(qū)別地調(diào)控基因表達(dá)，例如，在植物或動(dòng)物的一些或所有組織中。
組成性啟動(dòng)子
可使用啟動(dòng)子片段調(diào)控在所有轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織中突變的PYR/PYL核酸的表達(dá)，例如，再生植物的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織。術(shù)語(yǔ)“組成性調(diào)控元件”是指賦予可操作地連接的核酸分子表達(dá)水平的調(diào)控元件，所述核酸分子相對(duì)獨(dú)立于所述組成性調(diào)控元件表達(dá)的細(xì)胞或組織類型。在植物中表達(dá)的組成性調(diào)控元件通常在大量細(xì)胞和組織類型中廣泛表達(dá)。在生理?xiàng)l件下連續(xù)地調(diào)控表達(dá)的啟動(dòng)子被稱為“組成性”啟動(dòng)子，并在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下具有活性。
可用于在轉(zhuǎn)基因植物中異位表達(dá)的各種組成性調(diào)控元件為本領(lǐng)域熟知。例如花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)啟動(dòng)子，是一種被很好地表征的在所有植物組織中產(chǎn)生高表達(dá)水平的組成性調(diào)控元件(Odell等人，自然(Nature) 313:810-812 (1985))。由于其在很多不同的植物物種中具有活性，CaMV 35S啟動(dòng)子非常有用(Benfey和Chua，科學(xué) (Science)250:959-966 (1990) ；Futterer 等人，Physiol. Plant 79:154(1990) ；Odell 等人，supra, 1985)。其中內(nèi)在啟動(dòng)子元件已復(fù)制的串聯(lián)35S啟動(dòng)子賦予了比未修飾的35S啟動(dòng)子更高的表達(dá)水平(Kay等人，科學(xué)(Science) 236:1299 (1987))。其他有用的組成性調(diào)控元件包括，例如，花椰菜花葉病毒19S啟動(dòng)子；玄參花葉病毒啟動(dòng)子；以及胭脂堿合成酶 (nos)基因啟動(dòng)子(Singer 等人,Plant Mol. Biol. 14:433 (1990) ; An,植物生理學(xué)(Plant Physiol. )81:86(1986)) ο
其他的組成性調(diào)控元件,包括在單子葉植物中有效表達(dá)的組成性調(diào)控元件,也是本領(lǐng)域已知的，例如，the pEmu啟動(dòng)子和基于水稻肌動(dòng)蛋白-1的5’區(qū)的啟動(dòng)子(Last等人，Theor. Appl. Genet. 81:581(1991) ；Mcelroy 等人，Mol. Gen. Genet. 231:150(1991)； Mcelroy等人，植物細(xì)胞(Plant Cell) 2:163 (1990))。組合有來(lái)自不同基因的元件的嵌合性調(diào)控元件也可用于編碼突變PYR/PYL受體蛋白的核酸分子的異位表達(dá)(Comai等人，Plant Mol. Biol. 15:373(1990)) ο
其他組成性啟動(dòng)子的實(shí)例包括來(lái)自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的Γ-或2’-啟動(dòng)子(參見，例如，Mengiste (1997) supra ;0’Grady (1995) Plant Mol. Biol. 29:99-108)； 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子如擬南芥(Arabidopsis)肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子(參見，例如， Huang (1997) Plant Mol. Biol. 199733:125-139);酒精脫氫酶(Adh)基因啟動(dòng)子(參見，例如，Millar(1996)Plant Mol. Biol. 31:897-904);來(lái)自擬南芥的 ACTll (Huang 等人 Plant Mol. Biol. 33:125-139(1996))，來(lái)自擬南芥的 Cat3(GenBank No. U43147, Zhong 等人，Mol. Gen. Genet. 251:196-203 (1996)),來(lái)自油菜(Brassica napus)的編碼硬脂酰-酰基載體蛋白脫氫酶的基因(Genbank No. X74782，Solocombe等人Plant Physiol. 104:1167-1176(1994))，來(lái)自玉米的 GPcl (GenBank No. X15596, Martinez 等人 J. Mol. Biol 208:551-565 (1989))，來(lái)自玉米的 Gpc2 (GenBank No. U45855, Manjunath 等人， Plant Mol. Biol. 33:97-112(1997))，來(lái)自各種植物基因的其他轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見，Holtorf Plant Mol. Biol. 29:637-646 (1995)。
可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子
或者，植物啟動(dòng)子可調(diào)控改變的環(huán)境條件或發(fā)育條件影響下的突變PYR/PYL多核苷酸的表達(dá)。可通過(guò)可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件、升高的溫度或光的存在。本發(fā)明將這樣的啟動(dòng)子稱為“可誘導(dǎo)性”啟動(dòng)子。例如，本發(fā)明可整合干旱特異性啟動(dòng)子如玉米的干旱-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(例如，玉米的rabl7干旱-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子 (Vilardell 等人(1991)Plant Mol. Biol. 17:985-993 ;Vilardell 等人(1994)Plant Mol. Biol. 24:561-569));或者來(lái)自馬鈴薯的寒冷、干旱和高鹽可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(Kirch(1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909)。
或者，將當(dāng)暴露于植物激素如生長(zhǎng)素時(shí)可誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子用于表達(dá)突變的PYR/ PYL多核苷酸。例如，本發(fā)明可使用大豆的生長(zhǎng)素-應(yīng)答元件El啟動(dòng)子片段(AuxREs) (Glycine max L.) (Liu(1997)植物生理學(xué)(Plant Physiol.) 115:397-407)；生長(zhǎng)素-應(yīng)答性擬南芥GST6啟動(dòng)子(也對(duì)水楊酸和過(guò)氧化氫產(chǎn)生應(yīng)答)(Chen(1996)Plant J. 10:955-966);煙草的生長(zhǎng)素-可誘導(dǎo)性parC啟動(dòng)子(Sakai (1996) 37: 906-913);植物生物素應(yīng)答元件(Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937);以及對(duì)脅迫激素脫落酸產(chǎn)生應(yīng)答的啟動(dòng)子(Sheen(1996)科學(xué)(Science) 274:1900-1902)。
當(dāng)暴露于可用于植物的化學(xué)制劑如除草劑或抗生素時(shí)可誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子，也可用于表達(dá)突變的PYR/PYL多核苷酸。例如，可使用被苯磺酰胺除草劑安全劑激活的玉米 In2-2 啟動(dòng)子(De Veylder (1997)植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol.) 38:568-577)； 應(yīng)用不同的除草劑安全劑誘導(dǎo)獨(dú)特的基因表達(dá)方式，包括在根部、排水器和頂端分生組織中的表達(dá)。PYR/PYL編碼序列也可在例如四環(huán)素-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的控制下，例如，含有燕麥(Avena sativa L.)精氨酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物(Masgrau(1997)Plant J. 11:465-473);或水楊酸應(yīng)答性元件(Stange (1997)PlantJ. 11:1315_1324;Uknes 等人， 植物細(xì)胞(Plant Cell) 5:159-169 (1993) ; Bi 等人，Plant J. 8:235-245 (1995))。
有用的可誘導(dǎo)性調(diào)控元件的實(shí)例包括銅-可誘導(dǎo)性調(diào)控元件(Mett 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 90 : 4567-4571 (1993) ;Furst 等人，細(xì)胞 (Cell)55:705-717(1988));四環(huán)素和鹽酸氯四環(huán)素-可誘導(dǎo)性調(diào)控元件(Gatz等人， Plant J. 2:397-404(1992) ; Rikler 等人，Mol. Gen. Genet. 243:32-38 (1994) ；Gatz, Meth. Cell Biol. 50:411-424(1995));脫皮激素可誘導(dǎo)性調(diào)控元件(Christopherson 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA89:6314-6318(1992) ；Kreutzweiser 等人，Ecotoxicol. Environ. Safety28:14-24 (1994));熱激可誘導(dǎo)性調(diào)控元件(Takahashi等人，植物生理學(xué)(Plant Physiol. )99:383-390(1992) ;Yabe 等人，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol. )35:1207-1219(1994) ;Ueda 等人，Mol. Gen. Genet. 250:533-539 (1996))；以及 lac操縱子元件，其被用于與組成性表達(dá)的Iac阻抑蛋白結(jié)合而賦予，例如，IPTG-可誘導(dǎo)表達(dá)(Wilde等人，EMBO J. 11:1251-1259 (1992))?？捎糜诒景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的可誘導(dǎo)性調(diào)控元件也可為，例如，來(lái)自菠菜亞硝酸鹽還原酶基因的硝酸鹽-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(Back 等人，Plant Mol. Biol. 17:9(1991))或光-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子如那些與RuBP羧化酶小亞單位或LHCP基因家族有關(guān)的啟動(dòng)子(Feinbaum等人，Mo1. Gen. Genet. 226:449(1991) ;Lam和 Chua,科學(xué)(Science) 248:471 (1990))。
組織特異性啟動(dòng)子
或者，所述植物啟動(dòng)子可調(diào)控突變的PYR/PYL多核苷酸在特定組織中的表達(dá)(組織特異性啟動(dòng)子)。組織特異性啟動(dòng)子是在植物發(fā)育中的特定時(shí)間在特定細(xì)胞或組織如營(yíng)養(yǎng)組織或生殖組織中具有活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
在發(fā)育控制下的組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括僅(或主要僅)在某些組織如營(yíng)養(yǎng)組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述營(yíng)養(yǎng)組織為，例如，根或葉或生殖組織如果實(shí)、胚珠、種子、 花粉、花瓣、花或任何胚胎組織或上皮或葉肉。生殖組織特異性啟動(dòng)子可為，例如，胚珠-特異性、胚胎-特異性、胚乳-特異性、珠被-特異性、種子和種皮-特異性、花粉-特異性、花瓣-特異性、萼片-特異性或它們的一些組合。在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子為細(xì)胞類型特異性，例如，保衛(wèi)細(xì)胞-特異性。
其他組織特異性啟動(dòng)子包括種子啟動(dòng)子。合適的種子-特異性啟動(dòng)子來(lái)自下列基因玉米的 MACl (Sheridan (1996) Geneticsl42:1009-1020);玉米的 Cat3 (GenBank No. L05934, Abler (1993) PIantMo1. Biol. 22:10131-1038);擬南芥的 vivparous-1 (Genbank No. U93215);擬南芥的 atmycl(Urao (1996) Plant Mol. Biol. 32:571-57 ；Conceicao (1994) Plant 5:493-505);油菜的 napA (GenBank No. J02798,Josefsson(1987) JBL26:12196-1301);以及油菜的油菜籽蛋白基因家族(Sjodahl (1995)Planta 197:264-271)。
許多特異性地在營(yíng)養(yǎng)組織如葉、莖、根和塊根中具有活性的啟動(dòng)子也可用于編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸。例如，可使用控制馬鈴薯塊莖中的主要儲(chǔ)藏蛋白馬鈴薯糖蛋白的啟動(dòng)子，參見，例如，Kim(1994)Plant Mol. Biol. 26:603-615 ；Martin(1997) Plant J. 11:53-62o也可使用在根中表現(xiàn)出高活性的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的 ORF 13 啟動(dòng)子(Hansen(1997)Mol. Gen. Genet. 254:337-343。其他有用的營(yíng)養(yǎng)組織特異性啟動(dòng)子包括編碼主要的芋頭(Colocasia esculenta L. Schott)球莖蛋白家族球蛋白的基因的 tarin 啟動(dòng)子(Bezerra(1995)Plant Mol. Biol. 28:137-144);在芋頭球莖發(fā)育過(guò)程中具有活性的仙茅甜蛋白啟動(dòng)子(de Castro (1992)植物細(xì)胞(Plant Cell)4:1549-1559)以及煙草根-特異性基因TobRB7的啟動(dòng)子，其表達(dá)定位于根分生組織和未成熟的中軸區(qū)(Yamamoto (1991)植物細(xì)胞(Plant Cell) 3:371-382)。
可使用葉-特異性啟動(dòng)子如核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)啟動(dòng)子。例如，番茄 RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因在葉和光-生長(zhǎng)幼苗中表達(dá)，僅RBCSl和RBCS2在發(fā)育中的番茄果實(shí)表達(dá)(Meier (1997)FEBSLett. 415:91-95)。可使用幾乎僅在葉片和葉鞘的葉肉細(xì)胞中高水平表達(dá)的核酮糖二磷酸羧化酶啟動(dòng)子，其描述于Matsuoka(1994)Plant J. 6:311-319。另一種葉-特異性啟動(dòng)子為捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子，參見，例如，Shiina(1997)植物生理學(xué)(Plant Physiol.) 115:477-483 ；Casal (1998)植物生理學(xué) (Plant Physiol. ) 116:1533-1538。擬南芥(Arabidopsis thaliana)myb_相關(guān)基因啟動(dòng)子 (Atmyb5)為葉-特異性的，其描述于Li (1996) FEBS Lett. 379:117-121。Atmyb5啟動(dòng)子在幼嫩蓮座葉和莖葉邊緣發(fā)育的葉毛、托葉和上皮細(xì)胞中和未成熟的種子中表達(dá)。Atmyb5mRNA 在從受精到胚胎發(fā)育的16個(gè)細(xì)胞階段期間出現(xiàn)，并持續(xù)至超過(guò)心形階段。也可使用在玉米中確認(rèn)的葉子啟動(dòng)子，Busk(1997)Plant J. 11:1285-1295。
另一類有用的營(yíng)養(yǎng)組織特異性啟動(dòng)子為分生組織(根尖和莖尖)啟動(dòng)子。例如， 可使用在發(fā)育中的芽尖或根尖分生組織具有活性的“SHOOTMERISTEMLESS”和“SCARECR0 W” 啟動(dòng)子，描述于 DiLaurenzio (1996)細(xì)胞(Cell) 86:423-433 ;和 Long (1996)自然 (Nature) 379:66-69。另一個(gè)有用的啟動(dòng)子為控制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶HMG2基因表達(dá)的啟動(dòng)子，其表達(dá)限于分生組織和花器官(柱頭分泌區(qū)、成熟花粉顆粒、雌蕊維管組織和受精卵細(xì)胞)組織(參見，例如，Enjjuto (1995)植物細(xì)胞(Plant C e 11). 7:517-5 2 7)。還可使用在分生組織-特異性表達(dá)的玉米和其他物種的kn1-相關(guān)基因，參見，例如，Granger (1996)Plant Mol. Biol. 31:373-378 ；Kerstetter (1994) 植物細(xì)胞(Plant Cell) 6:1877-1887 ；Hake (1995) Philos. Trans. R. Soc. LondB. Biol. Sc1. 350:45-51。例如，擬南芥(Arabidopsis thaliana)KNATl 啟動(dòng)子(參見，例如， Lincoln(1994)植物細(xì)胞((Plant Cell))6:1859-1876)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，組織特異性啟動(dòng)子可啟動(dòng)在除目標(biāo)組織以外的組織中可操作地連接的序列的表達(dá)。因此，如本文所用，組織特異性啟動(dòng)子優(yōu)先啟動(dòng)目標(biāo)組織中的表達(dá)，但也可啟動(dòng)其他組織中的一些表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變的PYR/PYL多核苷酸通過(guò)轉(zhuǎn)座因子而表達(dá)。這使得所述組成型活性多肽能夠進(jìn)行組成性、周期性和低頻率的表達(dá)。本發(fā)明還提供源自病毒的組織特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用，包括例如，煙草花葉病毒亞基因組啟動(dòng)子(Kumagai (1995)Pioc.Natl. Acad. Sc1. USA 92:1679-1683 ;水稻東格魯桿狀病毒(RTBV)，其僅在感染的水稻植物韌皮部細(xì)胞中復(fù)制，且其啟動(dòng)子啟動(dòng)強(qiáng)的韌皮部-特異性報(bào)告基因表達(dá)；木薯葉脈花葉病毒(CVMV)啟動(dòng)子，在維管組織、葉肉組織細(xì)胞和根尖組織中具有高活性(Verdaguer(1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139)。
VI1.轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)
如本文詳述，如本文所述在植物中，本發(fā)明的實(shí)施方案提供含有用于表達(dá)突變體 PYR/PYL受體蛋白的重組表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。在一些實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物含有除所述轉(zhuǎn)基因植物以外的物種的多核苷酸的完整或部分序列。應(yīng)理解，轉(zhuǎn)基因植物包括所述植物或引入所述表達(dá)盒的植物以及含有所述表達(dá)盒的這種植物或植物細(xì)胞的子代，包括具有穩(wěn)定地整合至染色體的所述表達(dá)盒的子代。
可通過(guò)各種常規(guī)技術(shù)將包含由異源啟動(dòng)子啟動(dòng)的PYR/PYL編碼序列的重組表達(dá)載體引入至期望的植物基因組中。例如，可使用一些技術(shù)如電穿孔和植物細(xì)胞原生質(zhì)體微注射，將DNA構(gòu)建體直接引入至植物細(xì)胞的基因組DNA，或使用沖擊法如DNA粒子轟擊法直接將DNA構(gòu)建體引入至植物組織中?；蛘?，可將DNA構(gòu)建體與合適的T-DNA側(cè)翼區(qū)組合并引入至常規(guī)的根癌農(nóng)桿菌宿主載體。根癌農(nóng)桿菌宿主的毒力作用使得在當(dāng)細(xì)胞被細(xì)菌感染時(shí)啟動(dòng)，將所述構(gòu)建體和鄰近標(biāo)記插入至植物細(xì)胞DNA。雖然本發(fā)明包括突變PYR/PYL的瞬時(shí)表達(dá)，通常通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建體的表達(dá)源于將表達(dá)盒插入至所述植物基因組中，例如，從而至少一些植物子代也含有所述整合的表達(dá)盒。
微注射技術(shù)也可用于該目的。這些技術(shù)為本領(lǐng)域熟知并充分記載于文獻(xiàn)中。使用聚乙二醇沉淀法引入DNA構(gòu)建體描述于Paszkowski等人EMBO J. 3:2717-2722 (1984)。電穿孔技術(shù)描述于Fromm等人Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 82:5824 (1985)。沖擊法轉(zhuǎn)化技術(shù)描述于 Klein 等人自然(Nature) 327:70-73 (1987)。
根癌農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括卸甲(disarming)或使用二元載體，其描述于科學(xué)文獻(xiàn)。參見，例如，Horsch等人,科學(xué)(Science) 233:496-498 (1984)，以及Fraley等人 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA80:4803 (1983)。
可將通過(guò)上述任何轉(zhuǎn)化技術(shù)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培養(yǎng)為具有轉(zhuǎn)化的基因型的完整植物，從而具有期望的提高了非生物脅迫抗性的表型。這種再生技術(shù)取決于對(duì)組織培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的某些植物激素的控制，通常取決于與期望的核苷酸序列一起引入的殺生劑和/或除草劑標(biāo)記物。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體進(jìn)行植物再生描述于Evans等人，原生體分離和培養(yǎng)(Protoplasts Isolation and Culture),植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)(Handbook of Paint Cell Culture), pp. 124-176，麥克米蘭出版公司，紐約，1983 ;植物、植物原生質(zhì)體的結(jié)合、 再生(Binding, Regeneration ofPlants, Plant Protoplasts), pp. 21-73，CRC 出版社，博卡拉頓(BocaRaton)，1985。也可從植物愈傷組織、外植體、器官或其部分獲得再生。這種再生技術(shù)概述于 Klee 等人 Ann. Rev. ofPlant Phys. 38:467-486 (1987)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，將表達(dá)盒穩(wěn)定地整合至轉(zhuǎn)基因植物中并確認(rèn)為可操作后，可通過(guò)有性雜交將其引入至其他植物?？筛鶕?jù)需要雜交的物種使用眾多標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的任何技術(shù)。
本發(fā)明表達(dá)盒可用于賦予幾乎任何植物非生物脅迫抗性。因此，本發(fā)明可應(yīng)用于廣泛的植物，包括下述各屬的物種天門冬屬(Asparagus)、顛爺屬(Atropa)、燕麥屬(Avena)、 蕓苔屬(Brassica)、柑橘屬(Citrus)、西瓜屬(Citrullus)、辣椒屬(Capsicum)、 黃瓜屬(Cucumis)、南瓜屬(Cucurbita)、胡蘿卜屬(Daucus)、草莓屬(Fragaria)、大豆屬 (Glycine)、棉屬(Gossypium)、向日葵屬(Helianthus),Heterocallis、大麥屬(Hordeum)、 天仙子屬(Hyoscyamus)、萵苣屬(Lactuca)、亞麻屬(Linum)、黑麥草屬(Lolium)、番爺屬(Lycopersicon)、蘋果屬(Malus)、木薯屬(Manihot)、墨角蘭屬(Majorana)、苜猜屬(Medicago)、煙草屬(Nicotiana)、稻屬(Oryza)、黍?qū)?Panieum)、Pannesetum、鱷梨屬(Persea)、豌豆屬(Pisum)、梨屬(Pyrus)、李屬(Prunus)、蘿卜屬(Raphanus)、黑麥屬 (Secale)、千里光屬(Senecio)、芥屬(Sinapis)、爺屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、葫蘆巴屬(Trigonella)、小麥屬(Triticum)、葡萄屬(Vitis)、紅豆屬(Vigna)和玉米屬(Zea)。 在一些實(shí)施方案中，所述植物選自下組水稻、玉米、小麥、大豆、棉花、油菜、草坪草和苜蓿。 在一些實(shí)施方案中，所述植物為觀賞植物。在一些實(shí)施方案中，所述植物為蔬菜植物或水果植物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，許多植物物種可用作模式植物以預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)在其他植物中的表型效果。例如，眾所周知，煙草(煙草屬)和擬南芥植物均可用作轉(zhuǎn)基因表達(dá)的模式植物，尤其是在其他雙子葉植物中。
在一些實(shí)施方案中，與除了所述突變的PYR/PYL受體多肽的表達(dá)以外其他方面相同的植物相比，本發(fā)明植物具有提高的對(duì)某些化學(xué)激動(dòng)劑的敏感性。對(duì)激活A(yù)BA受體的 PYR/PYL家族的激動(dòng)劑的敏感性，可通過(guò)觀察或測(cè)量任何由ABA介導(dǎo)的表型來(lái)檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，ABA是已充分研究的植物激素，ABA介導(dǎo)許多特征變化，任何變化均可檢測(cè)以確定是否ABA的敏感性已被改變。在一些實(shí)施方案中，改變的ABA敏感性通過(guò)改變的種子萌發(fā)時(shí)間或改變的脅迫(例如，干旱)耐受性得以證實(shí)。
可根據(jù)眾多已知技術(shù)中的任何技術(shù)檢測(cè)非生物脅迫抗性。例如，對(duì)于耐旱性，植物可生長(zhǎng)在所提供的水分少于適宜水分的條件下?？赏ㄟ^(guò)眾多標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量中的任何一種包括膨壓、生長(zhǎng)、產(chǎn)量等的測(cè)量來(lái)確定抗旱性。實(shí)施例
下列實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明而非旨在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1:PYRl正交受體的分離
為了分離突變的(正交的)PYR/PYL受體，首先確認(rèn)出合適的靶配體。接著，進(jìn)行受體誘變和選擇實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)對(duì)靶正交配體產(chǎn)生應(yīng)答的正交受體?？傮w上說(shuō)，誘變前靶配體對(duì)受體的起始親和力越高，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)識(shí)別所需突變的數(shù)目就越少。具有混雜配體結(jié)合口袋的蛋白與那些具有高度選擇性口袋的蛋白相比是固有的進(jìn)行基因工程操作的更好起始點(diǎn)， 因?yàn)橄啾雀叨冗x擇性結(jié)合的口袋，混雜配體結(jié)合口袋更可能與大量配體發(fā)生弱接觸。而且， 能在異源宿主如釀酒酵母(S. cerevisiae)中測(cè)量其功能的受體蛋白是進(jìn)行受體基因工程操作的優(yōu)選靶標(biāo)，因?yàn)檫@種試驗(yàn)使得大量變異受體能夠被快速篩選。
方法和結(jié)果
使用兩步法分離PYRl正交受體。首先對(duì)大量系列化合物進(jìn)行篩選以確認(rèn)與受體發(fā)生弱相互作用的化合物，根據(jù)它們?cè)诟?jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中取代受體-結(jié)合ABA的能力來(lái)定義確認(rèn)。 一旦確認(rèn)了弱結(jié)合配體，將從最終應(yīng)用前景上具有最理想特性的弱結(jié)合配體用作進(jìn)行重復(fù)誘變和篩選方案的靶標(biāo)。弱結(jié)合配體的預(yù)選提高了分離新受體蛋白的頻率，實(shí)現(xiàn)分子識(shí)別所需的配體結(jié)合位點(diǎn)改變比較少。然而,預(yù)選并非成功的先決條件。
配體預(yù)選。從大量約 1500可商業(yè)獲得的農(nóng)業(yè)化學(xué)品中篩選得到結(jié)構(gòu)不同的74種農(nóng)業(yè)化學(xué)品。當(dāng)以相對(duì)于ABA超過(guò)1000-倍的量加入(即，IOOnM ABA和100 μ M測(cè)試化學(xué)品)時(shí)，在合適的酵母菌株中測(cè)量這74種化合物降低ABA-促進(jìn)的PYR/PYL-PP2C蛋白-蛋白相互作用的能力。該試驗(yàn)篩選揭示，密切相關(guān)的除草劑溴草腈及其氯代類似物羥敵草腈、 滅鼠劑殺鼠迷、除草劑二氯苯腈和殺真菌劑環(huán)酰菌胺均與ABA競(jìng)爭(zhēng)。觀察到的74種化合物篩選出5種的命中率表明，與PYR/PYL配體結(jié)合口袋的弱結(jié)合是普遍的，這與觀察到的 START蛋白具有混雜的配體結(jié)合口袋相一致(Mogensen, J. E.等人,生物化學(xué)雜志(Journal of Biological Chemistry)277:23684-23692(2002))。
基于PCR的PYRl誘變。為了確認(rèn)改變激動(dòng)劑應(yīng)答性的PYR/PYL突變，使用已有方案通過(guò)易錯(cuò)PCR對(duì)PYRl的編碼序列進(jìn)行突變(Lin-Goerke等人，生物技術(shù)(Biotechniq ues) 23:409-412 (1997))，并克隆至酵母雙雜交載體pBD_GAL4中產(chǎn)生 70，000個(gè)突變體的庫(kù)(稱為ePCRl庫(kù))。將該質(zhì)粒庫(kù)在大腸桿菌(E. coli)中擴(kuò)增，然后轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株 MAV99中與由質(zhì)粒pAD-HABl編碼的Gal4激活結(jié)構(gòu)域(AD)-PP2C融合蛋白共轉(zhuǎn)化，如前文所述(Park 等人，科學(xué)(Science)324:1068-1071 (2009)) ο MAV99 (Vidal 等人，Proc NatlAcad Sci USA93:10315-10320 (1996))是含有Gal4激活的URA3報(bào)告基因的反向雙雜交菌株。該菌株在無(wú)外源尿嘧啶供給下無(wú)法生長(zhǎng)。然而，如果該菌株表達(dá)了使得PYRl和HABl之間發(fā)生蛋白-蛋白相互作用的PYRl突變體，則所述URA3報(bào)告基因被激活，其使得菌株生長(zhǎng)并最后形成菌落。因此，BD-PYRl和AD-HABl在MAV99菌株中的共表達(dá)使得允許非天然激動(dòng)劑促進(jìn)PYR1-HAB1相互作用的PYRl突變的陽(yáng)性挑選方案能夠進(jìn)行，其可觀察為激動(dòng)劑促進(jìn)的無(wú)尿嘧啶添加下的生長(zhǎng)。此外，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中包含化合物5-氟-乳清酸(F0A，其通過(guò) URA3代謝為有毒代謝物)而非尿嘧啶，使得能夠篩選賦予BD-PYRl和AD-HABl之間的激動(dòng)劑-非依賴性方式相互作用的突變(“組成性突變”)。在該篩選策略中組成性突變是不期望的突變，因?yàn)榘袠?biāo)農(nóng)業(yè)化學(xué)品分子將不調(diào)控組成性突變體的活性。由于調(diào)節(jié)的和組成性 PYRl突變體均使得表達(dá)HABl-AD的MAV99菌株在無(wú)外源尿嘧啶供給下生長(zhǎng)，使用陽(yáng)性和陰性兩種挑選方案都是有益的。
農(nóng)業(yè)化學(xué)品應(yīng)答性突變體的分離。為了確認(rèn)賦予對(duì)非天然農(nóng)業(yè)化學(xué)激動(dòng)劑應(yīng)答性的PYRl突變，將ePCRl庫(kù)轉(zhuǎn)化至MAV99/pAD_HABl菌株以建立稱為“A”的庫(kù)。然后，使A庫(kù)在含有0. 15%F0A的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。如此建立的突變體庫(kù)稱為“A' ”庫(kù)，其為具有降低數(shù)目的組成性突變的PYRl突變體庫(kù)。
然后，將A’庫(kù)用于使用不同農(nóng)業(yè)化學(xué)品的各種篩選實(shí)驗(yàn)。例如，為了分離環(huán)酰菌胺應(yīng)答性突變，將 300，000個(gè)A’細(xì)胞接種到缺少尿嘧啶且含有200 μ M環(huán)酰菌胺的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。孵育幾天后，出現(xiàn)了 80個(gè)菌落，單獨(dú)收集并在含有或缺少環(huán)酰菌胺的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上再次測(cè)試。在缺少環(huán)酰菌胺的平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落含有在制備Α’庫(kù)期間未去除的組成性突變而被放棄。將剩余的 30個(gè)突變的PYRl編碼序列測(cè)序，結(jié)果表明分離出7個(gè)不同的突變序列(表I):
27-18 :S47P、K59R、Y120H
27-24 :K59R、Y120H、V144A
27-31 :P42S、K59R、Y120C
27-28: P42S、K59R、Y120C、T124M
27-9: P42S、K59R、Y120C、E154G
27-36:E12G、E43G、K59R、1110S、N133D
27-14:E12G、L25R、E43G、K59R、1110S、N133D
表1.環(huán)酰菌胺應(yīng)答的PYR/PYL受體多肽突變體
權(quán)利要求
1.含有異源表達(dá)盒的植物，所述表達(dá)盒含有可操作地連接至編碼突變的PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)所述突變的PYR/PYL受體多肽被所述化學(xué)品激活，且其中當(dāng)所述野生型PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)所述化學(xué)品沒有明顯地激活野生型PYR/PYL受體多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述化學(xué)品包括殺真菌劑、除草劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、植物活化劑、增效劑、除草劑安全劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲劑或肥料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述化學(xué)品選自下組溴苯腈、羥敵草腈、碘苯腈、 殺鼠迷、二氯苯腈、環(huán)酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1的K59位的突變的PYR/PYL 受體多肽的氨基酸為X，其中X為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物，其中所述化學(xué)品為溴苯腈、羥敵草腈、碘苯腈、二氯苯腈、解草嗪或環(huán)酰菌胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn) 21、41、50、57、60、82、92、102、116、125、141 和 / 或 151 的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自H21Y、P41L、R50G、T57A、H60R、I82N、S92T、 E102G、R116K、T125A、E141Q、E141D、N151D或其組合，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈激活。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn) 10、12、25、27、29、33、42、43、44、47、49、74、75、81、97、 110、120、123、124、133、138、139、144、154、158、163、172、173、174 和 / 或 177 的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自 R10Q、E12G、E12K、L25R、P27L、S29N、L33F、P42S、E43G、L44F、 S47P、V491、R74C、V751、V81M、D97N、I110S、Y120C、Y120H、V1231、T124M、N133D、V138M、 V1391、V144A、E154G、M1581、V1631、A172T、T173A、V174I 和 / 或 A177T 或其組合，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被環(huán)酰菌胺激活。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽包含在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)59、120和158的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镵59R、Y120H 和M158I，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL 受體多肽被環(huán)酰菌胺激活。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)62和110的氨基酸位點(diǎn)上的異亮氨酸殘基。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)27和/或63的氨基酸上的另外的突變，其中所述突變選自P27L、K63N或其組合，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)26、37、71和/或94的氨基酸上的突變，其中所述突變選自D26G、R37Q、F71S、E94D或其組合，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含在對(duì)應(yīng)于 PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)119的氨基酸上的突變，其中所述突變?yōu)镹119Y，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)110、114和/或138的氨基酸上的突變，其中所述突變選自I110T、E114D、V138M或其組合，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活。
14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽還包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)24、82、159和/或161的氨基酸上的突變，其中所述突變選自Q24R、I82T、F159L、D161G或其組合，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被BTH激活。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在對(duì)應(yīng)于PYRl (SEQ ID NO:1)中位點(diǎn)115和/或159的氨基酸上的突變，其中所述突變選自 H115Y、F159S、F159L或其組合，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被BTH激活。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽與SEQID NO: 131-139中任一序列基本上相同，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被溴苯腈、羥敵草腈或碘苯腈激活。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽與SEQID NO: 124-130或165-178中任一序列基本上相同，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與環(huán)酰菌胺接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被環(huán)酰菌胺激活。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽與SEQID NO: 140-144中任一序列基本上相同，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與二氯苯腈接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被二氯苯腈激活。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽與SEQID NO: 145-146中任一序列基本上相同，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與解草嗪接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被解草嗪激活。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽與SEQID NO: 147-148或164中任一序列基本上相同，且其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與 BTH (阿拉酸式苯-S-甲基)接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被BTH激活。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述突變的PYR/PYL受體多肽包含至少一個(gè)在含有所述PYR/PYL受體多肽的配體結(jié)合口袋的氨基酸殘基上的突變。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的植物，其中與所述化學(xué)品接觸時(shí)，與缺少所述表達(dá)盒的植物相比，所述植物具有改善的非生物脅迫耐受性。
23.源自如權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述植物的植物細(xì)胞。
24.源自如權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述植物的種子、花、葉子、果實(shí)、加工食品或食品成分。
25.提高如權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述植物的非生物脅迫耐受性的方法，其通過(guò)使所述植物與選自下組的化學(xué)品接觸實(shí)現(xiàn)溴苯腈、羥敵草腈、碘苯腈、殺鼠迷、二氯苯腈、環(huán)酰菌胺、解草嗪和BTH(阿拉酸式苯-S-甲基)。
26.制備突變PYR/PYL受體多肽的方法，當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)其被所述化學(xué)品激活，其中當(dāng)野生型PYR/PYL受體多肽與所述化學(xué)品接觸時(shí)所述化學(xué)品沒有明顯地激活所述野生型PYR/PYL受體多肽，該方法包括(a)誘變所述野生型PYR/PYL受體多肽；(b)使一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸；以及(c)確定所述化學(xué)品是否激活所述一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽，其中激活作用確認(rèn)所述一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽被所述化學(xué)品激活。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其還包括，在步驟(b)之前，篩選化學(xué)品以確定所述化學(xué)品是否與所述野生型PYR/PYL受體多肽結(jié)合，然后使一個(gè)或多個(gè)突變的PYR/PYL受體多肽與所述化學(xué)品接觸。
28.一種表達(dá)盒，其包含可操作地連接至編碼突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述突變的PYR/PYL受體多肽與化學(xué)品接觸時(shí)，所述突變的PYR/PYL受體多肽被所述化學(xué)品激活，且其中當(dāng)野生型PYR/PYL受體多肽與所述化學(xué)品接觸時(shí)，所述化學(xué)品沒有明顯地激活野生型PYR/PYL受體多肽。
29.一種表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求28所述的表達(dá)盒。
30.一種生產(chǎn)具有提高的脅迫耐受性的植物的方法，所述方法包括種植一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包含至少一個(gè)編碼與SEQID NO: 124-148或164-178中任一序列基本上相同的突變PYR/PYL受體多肽的多核苷酸序列，由此所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述突變的PYR/ PYL受體多肽。
31.一種肽，其包含與SEQ ID NO: 124-148或164-178中任一序列基本上相同的突變的 PYR/PYL受體多肽。
32.一種多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO: 124-148或164-178中任一序列基本上相同的突變的PYR/PYL受體多肽的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變的PYR/PYL受體多肽，以及制備和使用突變的PYR/PYL受體多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103025153SQ201180021648
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者肖恩·R·卡特勒, 桑·尤爾·帕克 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)