專利名稱：食物中毒菌檢測用載體以及食物中毒菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測食物中毒菌的微陣列等的載體，特別是涉及能夠特異性地且同時檢測出多種食物中毒菌的食物中毒菌檢測用載體、以及食物中毒菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
以往，在食品檢查或環(huán)境檢查、臨床試驗、家畜衛(wèi)生等方面上，進(jìn)行是否存在食物 中毒菌的檢查。在這樣的檢查中，近年來進(jìn)行如下操作利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，將檢查試樣中所包含的DNA擴(kuò)增，根據(jù)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物來檢測對象菌。此時，在食物中毒菌的檢測中廣泛使用電泳，由此判定是否存在對象菌。另外，還通過將檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物精制，進(jìn)行測序，從而進(jìn)行正確的菌株的鑒定。但是，在利用電泳檢測時，存在這樣的問題難以辨別擴(kuò)增大小相近的物質(zhì)，因此難以識別菌株，其鑒定困難。此外，在利用電泳檢測時，還有這樣的問題凝膠制作等操作繁雜，使用致癌物質(zhì)(溴化乙錠等)進(jìn)行染色。另外還有測序是無迅速性、且操作困難這樣的問題。因此，最近，除了利用電泳的檢測之外，還逐漸進(jìn)行使用DNA微陣列的檢測。在DNA微陣列上固定與對象菌雜交的探針，使通過PCR而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與該探針雜交，由此能夠進(jìn)行菌株級的識別，而與擴(kuò)增片段大小無關(guān)。此外，利用DNA微陣列的檢測由于不需要進(jìn)行使用致癌物質(zhì)等的染色，與測序相比，具有迅速性，操作簡便。另外，還利用原位雜交法等，使通過PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交，檢測對象菌。例如，在專利文獻(xiàn)I中，公開了能夠檢測出如下細(xì)菌的探針和DNA微陣列酸熱脂環(huán)酸芽抱桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、熱堅芽抱桿菌(Bacilluscaldotenax)、臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、普通嗜熱放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepiderimidis)。此外，在專利文獻(xiàn)2中，公開了能夠檢測出如下細(xì)菌等食物中毒細(xì)菌的探針、以及使用該探針利用原位雜交法檢測食物中毒細(xì)菌的方法氣單胞菌屬細(xì)菌、李斯特菌、Welsh菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、病原性大腸桿菌。專利文獻(xiàn)I :日本特開2008-200012號公報專利文獻(xiàn)2 :日本特開2006-166912號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題目前，大腸桿菌、李斯特菌、彎曲菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌的七種食物中毒菌占細(xì)菌性食物中毒原因的90%以上。因此，如果能夠同時且分別特異性地檢測出這些七種食物中毒菌是否存在于食品或環(huán)境等中，則非常有用。但是，為了分別特異性地且同時一次性檢測出這些多種食物中毒菌，探針需要優(yōu)異的特異性。設(shè)計這樣的探針是不容易的，以往未發(fā)現(xiàn)將能夠一次性檢測出這些多種食物中毒菌的探針固定化的DNA微陣列等。于是，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，反復(fù)進(jìn)行了多次實驗，結(jié)果成功地開發(fā)出，能夠以上述七個菌種八個區(qū)域的毒素區(qū)域基因或生物體內(nèi)必須基因為檢測對象、分別特異性地且一次性檢測出這些七個菌種的食物中毒菌的探針，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明的目的在于提供能夠同時且特異性地一次性檢測出大腸桿菌(Escherichia coli)、李斯特菌(Listeria 屬)、彎曲菌(Campylobacter 屬)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella屬)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)中的兩種以上的食物中毒菌的食物中毒菌檢測用載體、以及食物中毒菌的檢測方法。
用于解決課題的手段本發(fā)明的食物中毒菌檢測用載體是將分別選自如下探針組的兩個以上組中的一個或兩個以上的探針固定化而形成，所述探針組包括用于檢測大腸桿菌的由具有序列編號I 6所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第一探針組；用于檢測李斯特菌的由具有序列編號7 13所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第二探針組；用于檢測彎曲菌的由具有序列編號14 19所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第三探針組；用于檢測副溶血弧菌的由具有序列編號20 24所不的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成的第四探針組；用于檢測金黃色葡萄球菌的由具有序列編號25 29所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第五探針組；用于檢測沙門氏菌的由具有序列編號30 40所不的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成的第六探針組；以及用于檢測蠟樣芽孢桿菌的由具有序列編號41 49所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成的第七探針組。本發(fā)明的食物中毒菌的檢測方法如下使用含有由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對、試樣的基因組DNA、核酸合成酶和核酸合成底物的PCR用反應(yīng)液，在所述試樣中包含對應(yīng)于所述兩個以上的引物對中的至少一個引物對的食物中毒菌的基因組DNA時，利用PCR法擴(kuò)增該食物中毒菌的核酸，所述引物對包括用于擴(kuò)增大腸桿菌的DNA的、具備由序列編號50所示的堿基序列組成的引物和由序列編號51所示的堿基序列組成的引物的第一引物對；用于擴(kuò)增李斯特菌的DNA的、具備由序列編號52所不的喊基序列組成的引物和由序列編號53所不的喊基序列組成的引物的第二引物對；用于擴(kuò)增彎曲菌的DNA的、具備由序列編號54所示的堿基序列組成的引物和由序列編號55所示的堿基序列組成的引物的第三引物對；用于擴(kuò)增副溶血弧菌的DNA的、具備由序列編號56所示的堿基序列組成的引物和由序列編號57所示的堿基序列組成的引物的第四引物對；用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的DNA的、具備由序列編號58所示的堿基序列組成的引物和由序列編號59所示的堿基序列組成的引物的第五引物對；用于擴(kuò)增沙門氏菌的DNA的、具備由序列編號60所示的堿基序列組成的引物和由序列編號61所示的堿基序列組成的引物的第六引物對；用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌的DNA的、具備由序列編號62所示的堿基序列組成的引物和由序列編號63所示的堿基序列組成的引物的第七引物對；以及用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌的DNA的、具備由序列編號64所示的堿基序列組成的引物和由序列編號65所示的堿基序列組成的引物的第八引物對；使所述通過擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與將探針固定化而得到的食物中毒菌檢測用載體接觸，并使之與所述固定化的探針雜交，由此檢測出食物中毒菌，所述探針為分別選自如下探針組中的對應(yīng)于與所述兩個以上的引物對所對應(yīng)的食物中毒菌的兩個以上組中的一個或兩個以上的探針，所述探針組包括用于檢測大腸桿菌的由具有序列編號I 6所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第一探針組；用于檢測李斯特菌的由具有序列編號7 13所不的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成的第二探針組；用于檢測彎曲菌的由具有序列編號14 19所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第三探針組；用于檢測副溶血弧菌的由具有序列編號20 24所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第四探 針組；用于檢測金黃色葡萄球菌的由具有序列編號25 29所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第五探針組；用于檢測沙門氏菌的由具有序列編號30 40所不的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成的第TK探針組；以及用于檢測蠟樣芽孢桿菌的由具有序列編號41 49所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成的第七探針組。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠同時且特異性地一次性檢測出大腸桿菌、李斯特菌、彎曲菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌中的兩種以上的食物中毒菌。


圖I為示出本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體中的用于大腸桿菌、李斯特菌、彎曲菌和副溶血弧菌的各新型探針及其檢測對象區(qū)域與序列編號及其堿基序列之間的對應(yīng)關(guān)系的圖。圖2為示出本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體中的用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和蠟樣芽孢桿菌的各新型探針及其檢測對象區(qū)域與序列編號及其堿基序列之間的對應(yīng)關(guān)系的圖。圖3為示出本發(fā)明實施方式的食物中毒菌的檢測方法中所用的新型引物對及其擴(kuò)增對象區(qū)域與序列編號及其堿基序列之間的對應(yīng)關(guān)系的圖。圖4為示出利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌的檢測方法的對象食物中毒菌的DNA的擴(kuò)增結(jié)果的圖。圖5為示出本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體中的序列編號I 49所示的探針在食物中毒菌檢測用載體上的配置的圖。圖6為示出利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體的檢測結(jié)果(熒光照片)的圖。圖7為示出利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體的檢測結(jié)果(熒光強(qiáng)度值)的圖。
圖8為示出利用PCR的擴(kuò)增對象區(qū)域中的探針位置和熒光強(qiáng)度的關(guān)系的曲線圖。圖9為示出利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌的檢測方法的對象食物中毒菌DNA的多重PCR的擴(kuò)增結(jié)果的圖。圖10為示出利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體的一次性檢測結(jié)果(熒光照片)的圖。圖11為示出利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體的一次性檢測結(jié)果(熒光強(qiáng)度值)的圖。圖12為示出本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體中的新型探針的檢測結(jié)果 總結(jié)的矩陣。圖13為示出用于確認(rèn)有無利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體所引起的假陽性反應(yīng)的檢測結(jié)果I (結(jié)果，熒光照片)的圖。圖14為示出用于確認(rèn)有無利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體所引起的假陽性反應(yīng)的檢測結(jié)果2 (結(jié)果，熒光照片)的圖。圖15為示出用于確認(rèn)有無利用本發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體所引起的假陽性反應(yīng)的檢測結(jié)果I (熒光強(qiáng)度值)的圖。圖16為示出用于確認(rèn)有無利用發(fā)明實施方式的食物中毒菌檢測用載體所引起的假陽性反應(yīng)的檢測結(jié)果2 (熒光強(qiáng)度值)的圖。
具體實施例方式下面，對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行具體的說明。[探針]首先，參照圖I和圖2，對本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法中所用的探針進(jìn)行說明。這些圖中，在檢測對象食物中毒菌的欄中，顯示出使用探針來檢測的對象食物中毒菌的名稱和學(xué)名。在對象區(qū)域的欄中，顯示出所對應(yīng)的食物中毒菌的檢測對象區(qū)域的基因的名稱。在序列編號和堿基序列的欄中，顯示出序列表所記載的序列編號和堿基序列。該喊基序列顯不出選自對象區(qū)域的基因中的新型探針的喊基序列。序列編號I 4顯示出用于檢測大腸桿菌(Escherichia coli)的熱休克蛋白基因(dnaj)的探針的喊基序列。序列編號5和6顯示出用于檢測大腸桿菌(Escherichia coli)的尿苷單磷酸激酶基因(PyrH)的探針的堿基序列。序列編號7 13顯示出用于檢測李斯特菌(Listeria屬)的熱休克蛋白基因(dnaj)的探針的喊基序列。序列編號14 19顯示出用于檢測彎曲菌(Campylobacter屬)的核糖體基因(16SrDNA)的探針的堿基序列。序列編號20 24顯示出用于檢測副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐熱性溶血毒素基因(tdh)的探針的喊基序列。序列編號25 29顯示出用于檢測金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的熱休克蛋白基因(dnaj)的探針的喊基序列。
序列編號30 40顯不出用于檢測沙門氏菌(Salmonella屬)的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)的探針的喊基序列。序列編號41 45顯示出用于檢測臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)的探針的堿基序列。序列編號46 49顯示出用于蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的嘔吐毒素合成酶基因(cesB)的探針的堿基序列。這些序列編號所示的堿基序列示出從5’末端到3’末端方向的序列。本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法中所用的探針并不僅限于上述的堿基序列，可以為各個堿基序列中的I個或幾個堿基被缺失、置換或增加后的堿基序列。此外，也可以為能夠在嚴(yán)格條件下與由與各個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的核酸片段雜交的探針。進(jìn)而，也可以使用具有與這樣的探針或由序列編號I 49所示的喊基序列組成的探針互補(bǔ)的喊基序列的探針。 另外，嚴(yán)格條件是指形成特異性雜交、不形成非特異性雜交的條件。例如，可以舉出如下條件相對于由序列編號I 49所示的序列組成的DNA具有高同源性(同源性為90%以上，優(yōu)選為95%以上)的DNA和由與各序列編號I 49所示的序列所組成的DNA互補(bǔ)的堿基序列組成的DNA雜交的條件。通常是指在與完全雜交的熔解溫度(Tm)相比低約5°C 約30°C、優(yōu)選低約10°C 約25°C的溫度下形成雜交的情況。關(guān)于嚴(yán)格條件，可以使用 J· Sambrook 等在 Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中、特別是在 11. 45 節(jié) “Conditions forHybridization of Oligonucleotide Probes” 中所記載的條件等。本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法中所用的探針，其長度均為20 33mer (堿基)左右，可以利用DNA合成裝置來合成。[食物中毒菌檢測用載體]本實施方式的食物中毒菌檢測用載體是用于檢測特定的食物中毒菌的媒介裝置，可以使用微陣列等來構(gòu)成。該食物中毒菌檢測用載體只要是將用于檢測檢測對象的食物中毒菌的至少I個上述探針固定化而得到的載體就沒有特別的限定，例如，可以使用點(spot)型DNA微陣列、合成型DNA微陣列等。此外，本實施方式的食物中毒菌檢測用載體可以使用具備序列編號I 49的序列的探針、用現(xiàn)有通常的方法來制造。例如，作為本實施方式的食物中毒菌檢測用載體，制作粘附型DNA微陣列時，可通過利用DNA點樣儀將探針固定在載玻片上來制作。此外，在制作合成型DNA微陣列時，可通過利用光刻技術(shù)，在玻璃基板上合成具備上述序列的單鏈低聚DNA來制成探針，而制作本實施方式的食物中毒菌檢測用載體。[PCR 用引物]接著，參照圖3，對本實施方式的食物中毒菌的檢測方法中所用的PCR用引物進(jìn)行說明。PCR用引物是為了利用PCR法來擴(kuò)增試樣中的基因組DNA的一部分而使用，利用正向引物和反向引物兩種的引物對擴(kuò)增特定的區(qū)域。PCR用引物對包含在PCR反應(yīng)液中。在PCR反應(yīng)液中除引物以外還含有核酸合成底物、核酸合成酶、試樣的基因組DNA、標(biāo)記成分、緩沖液等。并且，使用該P(yáng)CR反應(yīng)液，采用熱循環(huán)儀等核酸擴(kuò)增裝置，可擴(kuò)增試樣中的基因組DNA的一部分。即，當(dāng)在試樣中存在具有基于PCR用引物對的擴(kuò)增對象區(qū)域的基因組DNA時，擴(kuò)增該對象區(qū)域。本實施方式中所用的PCR用引物對能夠在通常的PCR法中使用。圖3中，在擴(kuò)增對象食物中毒菌(學(xué)名)的欄中，顯示出利用PCR用引物對來擴(kuò)增的對象食物中毒菌的名稱和學(xué)名。在對象區(qū)域的欄中，顯示出所對應(yīng)的食物中毒菌中的擴(kuò)增對象區(qū)域的基因的名稱。在擴(kuò)增產(chǎn)物的欄中，顯示出使用PCR用引物對擴(kuò)增對象區(qū)域時的擴(kuò)增廣物的喊基序列的長度(bp :喊基對)。在序列編號的欄中，顯不出序列表中所不的堿基序列的序列編號。在F/R的欄中顯示出正向引物和反向引物的區(qū)別，F(xiàn)表示正向引物，R表不反向引物。在喊基序列的欄中顯不出序列表中所記載的喊基序列。該喊基序列顯不
出為了特異性地擴(kuò)增各所對應(yīng)的對象區(qū)域而設(shè)計的新型引物對的堿基序列。序列編號50和51表不用于擴(kuò)增大腸桿菌(Escherichia coli)的基因組DNA中所包含的生物體內(nèi)必須區(qū)域的尿苷單磷酸激酶基因(PyrH)的引物對的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為157bp。序列編號52和53表示用于擴(kuò)增李斯特菌(Listeria屬)的基因組DNA中所包含的生物體內(nèi)必須區(qū)域的熱休克蛋白基因(dnaj)的引物對的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為176bp。序列編號54和55表示用于擴(kuò)增彎曲菌(Campylobacter屬)的基因組DNA中所包含的生物體內(nèi)必須區(qū)域的核糖體基因(16S rDNA)的引物對的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為263bp0序列編號56和57表示用于擴(kuò)增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因組DNA中所包含的毒素區(qū)域的耐熱性溶血毒素基因(tdh)的引物對的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為 380bp。序列編號58和59表示用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因組DNA中所包含的生物體內(nèi)必須區(qū)域的熱休克蛋白基因(dnaj)的引物對的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為236bp。序列編號60和61表不用于擴(kuò)增沙門氏菌(Salmonella屬)的基因組DNA中所包含的毒素區(qū)域的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)的引物對的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為180bp。序列編號62和63表示用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的毒素區(qū)域的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)的引物對的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為195bp。序列編號64和65表不用于擴(kuò)增臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的毒素區(qū)域的嘔吐毒素合成酶基因(cesB)的引物對的堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為238bp0這些序列編號所示的堿基序列示出從5’末端到3’末端方向的序列。此外，本實施方式的PCR用引物對中的各引物并不限于上述的堿基序列，可以為各個堿基序列中的I個或幾個堿基被缺失、置換或增加后的堿基序列。另外，也可以使用由能夠在嚴(yán)格條件下與如下核酸片段雜交的核酸片段組成的引物，所述核酸片段由與各個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成。進(jìn)而，也可以使用由具有與本實施方式的PCR用引物對互補(bǔ)的堿基序列的弓丨物組成的PCR用引物對。在使上述八種PCR用引物對包含在PCR反應(yīng)液中并進(jìn)行利用PCR法的擴(kuò)增反應(yīng)的情況下，只要在PCR反應(yīng)液中所含有的試樣中包含上述擴(kuò)增對象的食物中毒菌的基因組DNA的任意一種，則能夠特異性地擴(kuò)增該基因組DNA中的擴(kuò)增對象區(qū)域。此外，在試樣中含有兩種以上的上述擴(kuò)增對象的食物中毒菌的基因組DNA的情況下，能夠同時且特異性地擴(kuò)增各個基因組DNA的擴(kuò)增對象區(qū)域。進(jìn)而，即使在試樣中含有全部七種擴(kuò)增對象的食物中毒菌的基因組DNA的八個區(qū)域的基因的情況下，只要根據(jù)本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法，則也能夠同時且特異性地一次性擴(kuò)增各基因組DNA的擴(kuò)增對象區(qū)域。即，如果利用本實施方式的食物中毒菌的檢測方法中的PCR用引物對，則不會進(jìn)行除了各個對象食物中毒菌以外的基因組DNA的擴(kuò)增。此外，即使同時使用多個PCR用 引物對，也不會進(jìn)行因不同的引物對中的引物的組合而引起的非特異性擴(kuò)增。因此，通過將這樣的PCR用引物對加入到PCR反應(yīng)液中，在試樣中包含具有擴(kuò)增對象區(qū)域的食物中毒菌的基因組DNA的情況下，能夠特異性地擴(kuò)增該區(qū)域。此外，即使在試樣中包含多種擴(kuò)增對象的食物中毒菌的情況下，也能夠同時且特異性地擴(kuò)增各擴(kuò)增對象區(qū)域。理所當(dāng)然，即使在PCR反應(yīng)液中不包含所有的上述八種PCR用引物對，而包含其中的一種至七種PCR用引物對的情況下，當(dāng)在PCR反應(yīng)液中包含具有該P(yáng)CR用引物對的擴(kuò)增對象區(qū)域的食物中毒菌的基因組DNA時，也能夠特異性地擴(kuò)增該對象區(qū)域。[PCR用反應(yīng)液]接著，對本實施方式的食物中毒菌的檢測方法中所用的PCR用反應(yīng)液進(jìn)行說明。本實施方式的PCR反應(yīng)液至少含有上述八種PCR用引物對中的任意一種，優(yōu)選含有其中的兩種以上，更優(yōu)選含有所有的八種PCR用引物對。PCR反應(yīng)液中的除PCR用引物對以外的成分可以使用通常物質(zhì)。具體地說，例如可以使用由以下的組成形成的材料，但并不限定于此。特別是，弓丨物、試樣的DNA和滅菌水的容量根據(jù)作為擴(kuò)增對象的食物中毒菌的種類數(shù)的不同而不同。 緩沖液(10體積％)·核酸合成底物(8體積％ ) 正向引物(IOng/ μ I、2體積％ 16體積％ ) 反向引物(IOng/ μ I、2體積% 16體積% )·核酸合成酶(O. 5體積％ )·標(biāo)記成分 Cy5 IOpmoI / μ I (I 8 體積 ％ )·試樣的DNA (5體積％ 35體積% ) 水(71. 5體積％ 6. 5體積％ )[食物中毒菌的檢測方法]下面，對本實施方式的食物中毒菌的檢測方法進(jìn)行說明。首先，使用上述的PCR反應(yīng)液，利用PCR法，擴(kuò)增試樣中所包含的基因組DNA。另外，實用上，在進(jìn)行食物中毒菌的檢測時，例如從食品或環(huán)境等中采集樣品，進(jìn)行該樣品中所包含的菌的培養(yǎng)。然后，從培養(yǎng)的菌提取基因組DNA，使用該提取的基因組DNA作為上述PCR反應(yīng)液中的試樣。因此，在實際使用上，在試樣中是否存在擴(kuò)增對象食物中毒菌是不明確的，當(dāng)在試樣中存在擴(kuò)增對象的食物中毒菌時，本實施方式的食物中毒菌的檢測方法能夠檢測出該菌。因此，在PCR反應(yīng)液中含有所有的上述八種PCR用引物對的情況下，如果在試樣中存在上述七個菌種八個區(qū)域的基因中的至少一種，則能夠特異性地擴(kuò)增出擴(kuò)增對象區(qū)域。在利用PCR法擴(kuò)增基因時，使用核酸擴(kuò)增裝置。作為該核酸擴(kuò)增裝置，可以使用通常的熱循環(huán)儀等。例如，PCR的反應(yīng)條件如下，但并不限定于此。(1)95°C 2 分鐘(2) 950C 10秒鐘(DNA鏈的解離工序)(3)68°C 30秒鐘(退火工序)⑷72 °C 30秒鐘(DNA合成工序) (5) 72 0C 2 分鐘將⑵ ⑷進(jìn)行40個循環(huán)接著，將所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到本實施方式的食物中毒菌檢測用載體上，對與固定在該載體上的探針雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記進(jìn)行檢測。具體地說，例如可以如下進(jìn)行。首先，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中混合規(guī)定的緩沖液，將其滴加到食物中毒菌檢測用載體上。接著，在45°C下將食物中毒菌檢測用載體靜置I小時，其后，利用規(guī)定的緩沖液從食物中毒菌檢測用載體洗掉未雜交的PCR產(chǎn)物。然后，將食物中毒菌檢測用載體放在標(biāo)記檢測裝置中進(jìn)行標(biāo)記檢測，從而檢測在試樣中是否存在對象食物中毒菌。[探針的設(shè)計]接著，對為了提高本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法中所用的探針的特異性而研究出的探針的設(shè)計方法進(jìn)行說明。本實施方式中所用的探針是為了一次性特異性地檢測出七個菌種的食物中毒菌的八個區(qū)域而使用的。這樣，為了能夠特異性地檢測多個對象，對于本實施方式中所用的探針要求高特異性。于是，本發(fā)明人對能夠提高這樣的探針的特異性的探針的設(shè)計方法進(jìn)行研究，從而發(fā)現(xiàn)按照以下的基準(zhǔn)設(shè)計時能夠提高探針的特異性。(I) GC 含量將探針的堿基序列中的GC含量設(shè)為40 %以下。這樣，可通過使GC含量比AT含量少一定量，使探針更容易解離。由此，能夠減少雜交時的非特異結(jié)合，能夠提高探針的特異性。另外，該GC含量的百分率表示探針的堿基序列中的GC的序列數(shù)的百分率。(2)從PCR擴(kuò)增對象區(qū)域的3’末端側(cè)選擇從作為檢測對象的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3’末端側(cè)一半的區(qū)域中選擇，設(shè)計正義鏈的探針(從擴(kuò)增對象區(qū)域的正義鏈中選擇的探針)。即，從利用探針檢測對象的食物中毒菌用的引物對而得到的擴(kuò)增對象區(qū)域的3’末端側(cè)一半的區(qū)域中選擇，進(jìn)行設(shè)計。由此，與從同一個擴(kuò)增對象區(qū)域的5’末端側(cè)一半的區(qū)域中選擇探針的情況相比，能夠進(jìn)一步增大所得到的熒光強(qiáng)度。
另一方面，關(guān)于探針的反義鏈(從擴(kuò)增對象區(qū)域的反義鏈中選擇的探針)，與上述正義鏈的探針相反，優(yōu)選從與利用探針檢測對象的食物中毒菌用的引物對而得到的擴(kuò)增對象區(qū)域的互補(bǔ)序列中的5’末端側(cè)一半的區(qū)域中選擇，進(jìn)行設(shè)計。(3)與非對象的堿基序列的連續(xù)配對數(shù)為12堿基以內(nèi)按照與不是檢測對象的非對象菌的基因序列等的連續(xù)配對數(shù)為12堿基以內(nèi)的方式設(shè)計探針。在本實施方式的食物中毒菌的檢測方法中，進(jìn)行以七個菌種的食物中毒菌的八個區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物為對象的雜交。因此，各探針優(yōu)選按照至少相對于除檢測對象的區(qū)域以外的七個區(qū)域的序列，連續(xù)配對數(shù)為12堿基以內(nèi)的方式進(jìn)行設(shè)計。本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法中所用的探針是按照該基準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計的，從而在七個菌種的食物中毒菌的八個區(qū)域中，不進(jìn)行非特異性雜 交。這樣，通過采用(I) (3)中的任一項基準(zhǔn)進(jìn)行探針設(shè)計，與以往的探針相比，能夠進(jìn)一步提高其特異性、即特異性地與檢測對象的基因區(qū)域雜交的性質(zhì)。本實施方式的食物中毒菌檢測用載體、以及食物中毒菌的檢測方法通過設(shè)計并使用符合這些所有的基準(zhǔn)的探針而能夠同時且特異性地檢測出七個菌種的食物中毒菌的八個區(qū)域，是優(yōu)異的。(4)檢測對象區(qū)域此外，如在上文中用圖I和圖2進(jìn)行的說明，本實施方式中所用的探針從各食物中毒菌的特定區(qū)域中選擇進(jìn)行設(shè)計。g卩，以這些食物中毒菌的毒素區(qū)域的基因和/或生物體內(nèi)必需區(qū)域的基因為檢測對象。具體地說，作為檢測對象區(qū)域，對于大腸桿菌選擇熱休克蛋白基因(dnaj)和尿苷單磷酸激酶基因(PyrH),對于李斯特菌選擇熱休克蛋白基因(dnaj),對于彎曲菌選擇核糖體基因(16S rDNA)，對于副溶血弧菌選擇耐熱性溶血毒素基因(tdh)，對于金黃色葡萄球菌選擇熱休克蛋白基因(dnaj)，對于沙門氏菌選擇侵襲性因子相關(guān)基因(invA)，對于蠟樣芽孢桿菌選擇不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)和嘔吐毒素合成酶基因(cesB)。本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法中所用的探針通過以上述區(qū)域為檢測對象區(qū)域、并從這些區(qū)域中進(jìn)行選擇而能夠進(jìn)一步提高特異性。如以上說明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體、以及食物中毒菌的檢測方法，則能夠同時且異性地檢測出大腸桿菌、李斯特菌、彎曲菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌七種食物中毒菌中的八個區(qū)域。此外，如果利用本實施方式探針的設(shè)計方法，則能夠設(shè)計特異性高的探針。實施例首先，進(jìn)行了用于確認(rèn)利用本實施方式的食物中毒菌的檢測方法中使用的PCR用引物對是否能夠正確地擴(kuò)增出擴(kuò)增對象區(qū)域的試驗。試驗方法利用上述實施方式中所說明的方法，使用含有本實施方式的PCR用引物對的PCR反應(yīng)液，利用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，由此確認(rèn)了能夠得到正確的擴(kuò)增產(chǎn)物。
(試驗 I)PCR反應(yīng)液使用了如下組成的材料。這些成分當(dāng)中，引物(引物F (正向)，引物R(反向))使用了由Life Technologies日本株式會社合成的引物。除此以外，使用了
TakaraBio株式會社制的材料?！ぞ彌_液 IOXEx Taq buffer (20mM Mg 2+plus) 2. O μ I·核酸合成底物 dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2. 5mM) I. 6 μ I 引物 F(10ng/μ I、最終濃度(final conc. ) 4ng) 0. 4 μ I 引物 R(10ng/μ I、最終濃度(final conc. ) 4ng) 0. 4 μ I·核酸合成酶 EX Taq (5U/ μ 1)0. I μ I ·標(biāo)記成分 Cy5 O. 2 μ I 試樣的 DNA(lng/y I) I. 0μ I 滅菌水 14. 3μ I(總量20 μ I)對于引物對而言，各擴(kuò)增對象的食物中毒菌分別使用了圖3所示的引物對。此外，對于試樣的DNA而言，各引物對所對應(yīng)的食物中毒菌使用了如下菌株。并且，對各食物中毒菌進(jìn)行利用PCR的擴(kuò)增反應(yīng)。I.蠟樣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)TIFT 1140112.彎曲菌空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)ATCC 335603.大腸桿菌大腸桿菌(Escherichia coli) NBRC 1022034.李斯特菌單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 153135.沙門氏菌腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)ATCC 92706.金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) NBRC1009107.副溶血弧菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) RIMD 22210050 這些食物中毒菌的菌株由下面的機(jī)構(gòu)分售而得?！?TIFT東洋食品研究所· ATCC 美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culture collection) · NBRC獨(dú)立行政法人制品評價基盤機(jī)構(gòu)· RIMD大阪大學(xué)微生物研究所利用PCR法的基因擴(kuò)增使用了 ep梯度(Eppendorf株式會社制)，對各上述試樣在如下條件下進(jìn)行。(1)95°C 2 分鐘(2) 950C 10秒鐘(DNA鏈的解離工序)(3)68°C 30秒鐘(退火工序)(4) 72 0C 30 秒鐘(DNA 合成工序)(5) 72 0C 2 分鐘將⑵ ⑷進(jìn)行40個循環(huán)接著，利用電泳，使通過PCR而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物遷移，從而確認(rèn)是否得到了正確的擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳是使用MultiNA(株式會社島津制作所制)而進(jìn)行的。將其結(jié)果示于圖4。在圖4中，供試菌株I 7的列中所示的條帶表示對通過使用含有各自對應(yīng)的編號的食物中毒菌的基因組DNA的PCR反應(yīng)液來進(jìn)行的PCR而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳的結(jié)
果O此處，在對通過PCR而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳的情況下，由于機(jī)器測定誤差，有時與理論上的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列并不完全一致，而得到相似值的結(jié)果。在圖4中，對于使用了蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株I而言，在200bp附近和250bp附近可見條帶。由該結(jié)果可以判斷，蠟樣芽孢桿菌的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)和嘔吐毒素合成酶基因(cesB)中的各個擴(kuò)增對象區(qū)域得到擴(kuò)增。此外，對于使用了彎曲菌的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株2而言，在275bp附近可見條帶，由該結(jié)果可以判斷，彎曲菌的核糖體基因(16S rDNA)中的擴(kuò)增對象 區(qū)域得到擴(kuò)增。另外，對于使用了大腸桿菌的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株3而言，在160bp附近可見條帶，由該結(jié)果可以判斷，大腸桿菌的尿苷單磷酸激酶基因(pyrH)中的擴(kuò)增對象區(qū)域得到適當(dāng)擴(kuò)增。另外，對于使用了李斯特菌的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株4而言，在200bp附近可見條帶，由該結(jié)果可以判斷，李斯特菌的熱休克蛋白基因(dnaj)中的擴(kuò)增對象區(qū)域得到適當(dāng)擴(kuò)增。此處，發(fā)現(xiàn)，李斯特菌的熱休克蛋白基因理論上的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度(176bp)和供試菌株4的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度之差為20bp左右。該原因推定為，供試菌株4的熱休克蛋白基因(dnaj)中發(fā)生了某種序列的插入。另外，對于使用了沙門氏菌的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株5而言，在190bp附近可見條帶，由該結(jié)果可以判斷，沙門氏菌的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)中的擴(kuò)增對象區(qū)域得到適當(dāng)擴(kuò)增。另外，對于使用了金黃色葡萄球菌的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株6而言，在240bp附近可見條帶，由該結(jié)果可以判斷，金黃色葡萄球菌的熱休克蛋白基因(dnaj)中的擴(kuò)增對象區(qū)域得到適當(dāng)擴(kuò)增。另外，對于使用了副溶血弧菌的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株7而言，在400bp附近可見條帶，由該結(jié)果可以判斷，副溶血弧菌的耐熱性溶血毒素基因(tdh)中的擴(kuò)增對象區(qū)域得到適當(dāng)擴(kuò)增。如上所述，可確認(rèn)到，通過PCR，作為本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法中的探針的檢測對象的食物中毒菌的擴(kuò)增對象區(qū)域得到適當(dāng)擴(kuò)增，得到了對應(yīng)于各個區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(實施例I)接著，使用這些PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行用于確認(rèn)利用固定在本實施方式的食物中毒菌檢測用載體上的探針可否檢測出檢測對象食物中毒菌的實驗。如圖5所示，本實施方式的食物中毒菌檢測用載體使用了將探針固定化的載體。即，在位點I 4上，固定了序列編號I 4的大腸桿菌的熱休克蛋白基因檢測用探針。在位點5、6上，固定了序列編號5、6的大腸桿菌的尿苷單磷酸激酶基因檢測用探針。在位點7 13上，固定了序列編號7 13的李斯特菌的熱休克蛋白基因檢測用探針。在位點14 19上，固定了序列編號14 19的彎曲菌的核糖體基因檢測用探針。在位點20 24上，固定了序列編號20 24的副溶血弧菌的耐熱性溶血毒素基因檢測用探針。在位點25 29上，固定了序列編號25 29的金黃色葡萄球菌的熱休克蛋白基因檢測用探針。在位點30 40上，固定了序列編號30 40的沙門氏菌的侵襲性因子相關(guān)基因檢測用探針。在位點41 45上，固定了序列編號41 45的蠟樣芽孢桿菌的基因組中所包含的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因檢測用探針。在位點46 49上，固定了序列編號46 49的蠟樣芽孢桿菌的基因組中所包含的嘔吐毒素合成酶基因檢測用探針。在該食物中毒菌檢測用載體上，按各食物中毒菌滴加試驗例I中所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對與固定在該載體上的探針雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記進(jìn)行檢測。此外，還同樣使用如下PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用供試菌株3的大腸桿菌的基因組DNA作為試樣的DNA，并且使用序列編號66和67所示的引物對(擴(kuò)增對象區(qū)域dnaj，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小218bp)作為引物，在其他條件與試驗I同樣的條件下進(jìn)行擴(kuò)增而得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。具體如下進(jìn)行。
首先，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，混合將0.3% SDS(十二烷基硫酸鈉)添加到緩沖液(3X SSC檸檬酸一生理鹽水)中而得的溶液，并將其滴加到微陣列上。在45°C下將該微陣列靜置I小時。接著，使用上述緩沖液從微陣列洗掉未雜交的PCR產(chǎn)物。然后，將微陣列放在標(biāo)記檢測裝置(BI0SH0T，東洋鋼板株式會社制)測定熒光強(qiáng)度。對于熒光強(qiáng)度而言，用激光激發(fā)以使標(biāo)記成分(Cy5)發(fā)光，利用安裝于檢測器內(nèi)的CCD照相機(jī)，檢測該光量。將其結(jié)果示于圖6。另外，將光量轉(zhuǎn)換成電信號，并將其數(shù)字化而得到熒光強(qiáng)度。將其結(jié)果示于圖7。該熒光強(qiáng)度是該裝置中的強(qiáng)度指標(biāo)，而不是單位，其是按照背景的數(shù)值為O的方式修正后計算出的。在圖6和圖7中，“大腸桿菌”顯不出使供試菌株3 (大腸桿菌Escherichia coliNBRC 102203)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(dnaj、pyrH的各擴(kuò)增產(chǎn)物)分別雜交的結(jié)果，“李斯特菌”顯示出使供試菌株4 (李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC 15313)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的結(jié)果，“彎曲菌”顯示出使供試菌株2 (空腸彎曲菌Campylobacter jejuni ATCC33560)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的結(jié)果，“副溶血弧菌”顯示出使供試菌株7(副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus RIMD 22210050)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的結(jié)果，“金黃色葡萄球菌”顯示出使供試菌株6 (金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus NBRC 100910)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的結(jié)果，“沙門氏菌”顯示出使供試菌株5 (沙門氏菌Salmonella enterica ATCC 9270)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的結(jié)果，“蠟樣芽孢桿菌”顯示出使供試菌株I (蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus TIFT 114011)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的結(jié)果。關(guān)于大腸桿囷，圖6中，在位點2 4、6上明確地檢測到突光。另外，由圖7可知，在位點1、5上也得到一定的熒光強(qiáng)度值，檢測到熒光。由此表明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體，則在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有大腸桿菌的熱休克蛋白基因或尿苷單磷酸激酶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物時，能夠檢測出大腸桿菌。另外，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，還含有具有與這些探針雜交的核酸片段互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段。因此，由與序列編號I 6互補(bǔ)的堿基序列組成的探針能夠與這樣的具有互補(bǔ)堿基序列的核酸片段雜交。因而，在將由與序列編號I 6互補(bǔ)的堿基序列組成的探針固定于本實施方式的食物中毒菌檢測用載體上時，也同樣地能夠檢測出大腸桿菌。這對于以下的食物中毒菌也同樣。關(guān)于李斯特菌，圖6中，在位點7、9 13上明確地檢測到熒光。另外，由圖7可知，在位點8上也得到一定的熒光強(qiáng)度值，檢測到熒光。由此表明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體，則在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有李斯特菌的熱休克蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物時，能夠檢測出李斯特菌。另外，固定在位點7上的探針為反義鏈的探針(具有與序列編號7所不的喊基序列互補(bǔ)的喊基序列的探針)。關(guān)于彎曲菌，圖6中，在位點14 19上明確地檢測到熒光。另外，圖7中，也在這些位點上檢測到熒光。由此表明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體，則在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有李斯特菌的熱休克蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物時，能夠檢測出李斯特菌。另外，固定在位點14、15上的探針為反義鏈的探針(具有與序列編號14、15所示的堿基序列互補(bǔ)的喊基序列的探針)。關(guān)于副溶血弧菌，圖6中，在位點20 24上明確地檢測到熒光。另外，圖7 中，也在這些位點上檢測到熒光。由此表明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體，則在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有副溶血弧菌的耐熱性溶血毒素基因的擴(kuò)增產(chǎn)物時，能夠檢測出副溶血弧菌。關(guān)于金黃色葡萄球菌，圖6中，在位點25 29上明確地檢測到熒光。另外，圖7中，也在這些位點上得到檢測到熒光。由此表明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體，則在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有金黃色葡萄球菌的熱休克蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物時，能夠檢測出金黃色葡萄球菌。關(guān)于沙門氏菌，圖6中，在位點30 35上明確地檢測到熒光。另外，由圖7可知，在位點36 40上也得到一定的熒光強(qiáng)度值，檢測到熒光。由此表明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體，則在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有沙門氏菌的侵襲性因子相關(guān)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物時，能夠檢測出沙門氏菌。關(guān)于蠟樣芽孢桿菌，圖6中，在位點41 45、48、49上明確地檢測到熒光。另外，由圖7可知，在位點46、47上也得到一定的熒光強(qiáng)度值，檢測到熒光。由此表明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體，則在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有蠟樣芽孢桿菌的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因或嘔吐毒素合成酶基因時，能夠檢測出蠟樣芽孢桿菌。綜上所述，可確認(rèn)到，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法，則在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有與各個探針雜交的食物中毒菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時，能夠適當(dāng)?shù)貦z測出該菌。<利用PCR的擴(kuò)增對象區(qū)域中的探針的位置與熒光強(qiáng)度的關(guān)系>在此，參照圖8，對于利用PCR的擴(kuò)增對象區(qū)域中的探針的位置對熒光強(qiáng)度造成怎樣的影響進(jìn)行研究。探針的設(shè)計是通過從檢測對象的食物中毒菌的基因的擴(kuò)增對象區(qū)域(利用引物對擴(kuò)增的區(qū)域)中，選擇能夠特異性地檢測該食物中毒菌的堿基序列而進(jìn)行的。于是，進(jìn)行了用于調(diào)查這樣的擴(kuò)增對象區(qū)域中的探針的位置與熒光強(qiáng)度是否有相關(guān)性的試驗。(試驗2)
首先，以李斯特菌的熱休克蛋白基因為擴(kuò)增對象區(qū)域，制作了分別與該區(qū)域的各個位置雜交的多個探針。然后，使用序列編號52和53所示的引物對，擴(kuò)增李斯特菌的基因組DNA，使上述制作的探針與所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，與實施例I同樣地測量各個熒光強(qiáng)度。將其結(jié)果示于圖8(a)。在圖8中，縱軸表示熒光強(qiáng)度，橫軸表示擴(kuò)增對象區(qū)域中的探針的位置，橫軸的左端(O)表示擴(kuò)增對象區(qū)域的5’末端，右端(在圖8(a)的情況下，為176)表示同一個擴(kuò)增對象區(qū)域的3’末端的位置，各繪制點表示與此雜交的探針的3’末端的位置。另外，各探針的堿基序列的長度為21 3Imer。在圖8 (a)中，橫軸50的繪制點表不基于反義鏈的探針的突光強(qiáng)度,橫軸65 120中的各繪制點表示基于正義鏈的探針的熒光強(qiáng)度。由該圖可知，對于正義鏈的探針而言，探針的位置越是擴(kuò)增對象區(qū)域的3’末端側(cè)，熒光強(qiáng)度就越變大。特別是，在位于擴(kuò)增對象區(qū)域的3’末端側(cè)一半時，熒光強(qiáng)度變大。 另一方面，關(guān)于反義鏈的探針，在橫軸50的位置上，與橫軸65的位置的正義鏈的探針相比，得到更大的熒光強(qiáng)度。在試驗4中，參照圖8 (C)，對于反義鏈的探針進(jìn)一步進(jìn)行說明。(試驗3)接著，以沙門氏菌的侵襲性因子相關(guān)基因為擴(kuò)增對象區(qū)域，制作了分別與該區(qū)域的各個位置雜交的多個探針。然后，使用序列編號60和61所示的引物對，擴(kuò)增沙門氏菌的基因組DNA，使上述制作的探針與所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，與實施例I同樣地測量各個熒光強(qiáng)度。將其結(jié)果示于圖8(b)。在圖8(b)中，各繪制點表示基于正義鏈的探針的熒光強(qiáng)度。由該圖也可知，對于正義鏈的探針而言，探針的位置越是擴(kuò)增對象區(qū)域的3’末端側(cè)，熒光強(qiáng)度就越變大。特別是，在位于擴(kuò)增對象區(qū)域的3’末端側(cè)一半時，熒光強(qiáng)度變大。另外，與橫軸112的位置的探針的熒光強(qiáng)度相比，橫軸118的位置的探針的熒光強(qiáng)度略低。該原因推測為熒光強(qiáng)度已飽和。(試驗4)接著，以彎曲菌的核糖體基因為擴(kuò)增對象區(qū)域，制作了分別與該區(qū)域的各個位置雜交的多個探針。然后，使用序列編號54和55所示的引物對，擴(kuò)增彎曲菌的基因組DNA，使上述制作的探針與所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，與實施例I同樣地測量各個熒光強(qiáng)度。將其結(jié)果示于圖8(c)。在圖8(c)中，各繪制點表示基于反義鏈的探針的熒光強(qiáng)度。由該圖可知，對于反義鏈的探針而言，與正義鏈相反，探針的位置越是擴(kuò)增對象區(qū)域的5’末端側(cè)，熒光強(qiáng)度就越變大，特別是，在位于擴(kuò)增對象區(qū)域的5’末端側(cè)一半時，熒光強(qiáng)度變大。如上所述，由試驗2 4的結(jié)果表明，利用PCR的擴(kuò)增對象區(qū)域中的探針的位置與熒光強(qiáng)度有如下關(guān)系。S卩，在正義鏈的探針的情況下，如果探針的位置在擴(kuò)增對象區(qū)域的3’末端側(cè)，則熒光強(qiáng)度增加；如果在5’末端側(cè)，則熒光強(qiáng)度減少。另一方面，在反義鏈的探針的情況下，如果探針的位置在擴(kuò)增對象區(qū)域的5’末端偵牝則熒光強(qiáng)度增加；如果在3’末端側(cè)，則熒光強(qiáng)度減少。
(實施例2)接著，進(jìn)行了用于檢驗本實施方式的食物中毒菌檢測用載體能夠同時檢測作為檢測對象的七種食物中毒菌的試驗。作為PCR反應(yīng)液,使用了如下組成的材料。引物使用了由Life Technologies日本株式會社合成的引物。除此以外，使用了 Takara Bio株式會社制的材料?！ぞ彌_液 IOXEx Taq buffer (20mM Mg 2+plus) 2. O μ I·核酸合成底物 dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2. 5mM) I. 6 μ I 引物 F(10ng/μ I、最終濃度(final conc. ) 2ng) 0. 2 μ I X 7·引物 R(10ng/y I、最終濃度(final conc. ) 2ng) O. 2 μ I X 7
·弧菌檢測用引物F O. 4μ I·弧菌檢測用引物R O. 4μ I·核酸合成酶 EX Taq (5U/ μ 1)0. I μ I·標(biāo)記成分 Cy5 O. 2 μ I 試樣的 DNA I. 0μ 1X7·滅菌水 5. 5 μ I(總量20 μ I)PCR用引物對使用了圖3所示的擴(kuò)增七個菌種八個區(qū)域的所有的引物對。另外，試樣的DNA與試驗I同樣地使用了如下材料，使它們?nèi)抗餐性赑CR反應(yīng)液中。供試菌株I.蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus TIFT 114011)供試菌株2.彎曲菌(Campylobacter jejuni ATCC 33560)供試菌株3.大腸桿菌(Escherichia coli NBRC 102203)供試菌株4.李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 15313)供試菌株5.沙門氏菌(Salmonella enterica ATCC 9270)供試菌株6.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus NBRC 100910)供試菌株7.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus RIMD 2221005)然后,使用ep梯度(Eppendorf株式會社制),采用如下條件，使用PCR法,一次性進(jìn)行各個食物中毒菌的對象區(qū)域的擴(kuò)增。(1)95°C 2 分鐘(2) 950C 10秒鐘(DNA鏈的解離工序)⑶68 °C 30秒鐘(退火工序)(4) 72 0C 30 秒鐘(DNA 合成工序)(5) 72 0C 2 分鐘將⑵ ⑷進(jìn)行40個循環(huán)接著，利用電泳，使通過PCR而得到的產(chǎn)物遷移，從而確認(rèn)是否得到了正確的擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳是使用MultiNA(株式會社島津制作所制)而進(jìn)行的。將其結(jié)果示于圖9。如圖9所示，電泳的結(jié)果，在擴(kuò)增產(chǎn)物中存在如下8個峰。(I) 168bp (2) 172bp (3) 187bp (4)201bp(5)224bp (6)243bp (7)273bp (8)387bp與試驗I的結(jié)果對照后可認(rèn)為，這些峰分別示出以下的供試菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物。
(I)供試菌株 3.大腸桿菌(Escherichia coli NBRC 102203)(2)供試菌株 5.沙門氏菌(Salmonella entericaATCC 9270)(3)供試菌株 4.李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 15313)(4)供試菌株 I.蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus TIFT 114011)(5)供試菌株 6.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus NBRC 100910)(6)供試菌株 I.蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus TIFT 114011)(7)供試菌株 2.彎曲菌(Campylobacter jejuni ATCC 33560)(8)供試菌株 7.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus RIMD22210050) 由此可判斷，在本實施例的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，包含利用圖3所示的所有的引物對而分別得到的七個菌種的食物中毒菌的八個區(qū)域所有的擴(kuò)增產(chǎn)物。接著，將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到本實施方式的食物中毒菌檢測用載體上，與實施例I同樣地，對與固定在該載體上的探針雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記進(jìn)行檢測。將對檢測到的熒光進(jìn)行拍攝的結(jié)果示于圖10，將對熒光強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)字化的結(jié)果示于圖11。參照圖10，關(guān)于大腸桿菌，在位點6上明確地檢測到熒光。關(guān)于李斯特菌，在位點9 13上明確地檢測到熒光。關(guān)于彎曲菌，在位點14 19上明確地檢測到熒光。關(guān)于副溶血弧菌，在位點20 24上明確地檢測到熒光。關(guān)于金黃色葡萄球菌，在位點25 29上明確地檢測到熒光。關(guān)于沙門氏菌，在位點30 35上明確地檢測到熒光。關(guān)于蠟樣芽孢桿菌，在位點41 45、48、49上明確地檢測到熒光。另外，參照圖11，對于序列編號5 49所不的所有的探針,檢測到突光。圖12示出總結(jié)實施例I和實施例2的結(jié)果的矩陣。如該圖所示，可知本實施方式的食物中毒菌檢測用載體能夠分別檢測出大腸桿菌、李斯特菌、彎曲菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌。另外，即使在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中混合有這些七個菌種中的八個區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物的情況下，也能夠全部一次性檢測出各菌。如上表明，如果利用本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法，則能夠同時一次性檢測出這些七個菌種八個區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(實施例3)接著，進(jìn)行了用于確認(rèn)固定在本實施方式的食物中毒菌檢測用載體上的探針不產(chǎn)生假陽性反應(yīng)的實驗。在本實施例中，準(zhǔn)備了從實施例2的PCR反應(yīng)液中除去一種食物中毒菌的基因組DNA而含有六種食物中毒菌的基因組DNA的材料，除此之外，與實施例2同樣的進(jìn)行實驗。然后，對于在固定有一種食物中毒菌用探針的位點上是否檢測到熒光進(jìn)行確認(rèn)，該種食物中毒菌的基因組DNA不含于PCR反應(yīng)液中。將熒光照片的拍攝結(jié)果示于圖13和圖14,將突光強(qiáng)度值不于圖15和圖16。在圖13和圖14中，各列I 7表示分別進(jìn)行的實驗的編號，將在PCR反應(yīng)液中含有基因組DNA的食物中毒菌以〇表示，將未含有的食物中毒菌以X表示。另外，“芯片結(jié)果”中，示出熒光照片的拍攝結(jié)果，用方形框出未含有的食物中毒菌的位點部分。此外，在“探針特異性”中，將在未含有的食物中毒菌的位點上未檢測到熒光的情況以〇表示。如這些圖所示，任一實驗中，在未包含于PCR反應(yīng)液中的一種食物中毒菌的位點上，均未檢測到熒光。
另外，再參照圖15和圖16中的熒光強(qiáng)度值，在未含有的食物中毒菌的位點上，也均未檢測到熒光。因此，由以上結(jié)果表明，本實施方式的食物中毒菌檢測用載體和食物中毒菌的檢測方法中所用的探針在特異性方面上優(yōu)異，能夠同時且特異性地檢測出對象的七種食物中
國 ο本發(fā)明并不限定于以上的實施方式或?qū)嵤├?，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以實施各種變更是理所當(dāng)然的。例如，對于PCR反應(yīng)液的組成而言，只要是含有上述PCR用引物對和試樣、且能夠
得到同樣的效果的材料，則對于其他的成分，可以進(jìn)行適當(dāng)變更，例如使用與上述實施方式和實施例不同的成分等。此外，也可以將本實施方式的探針的設(shè)計方法適用于以檢測其他菌的基因組DNA為目的的引物設(shè)計。工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明能夠適合利用于同時且特異性地在短時間內(nèi)檢查在食品或設(shè)備等中是否存在大腸桿菌、李斯特菌、彎曲菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌。
權(quán)利要求
1.ー種食物中毒菌檢測用載體，其是將分別選自如下探針組的兩個以上組中的ー個或兩個以上的探針固定化而得到的，所述探針組包括 用于檢測大腸桿菌(Escherichia coli)的第一探針組由具有序列編號I 6所示的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成； 用于檢測李斯特菌(Listeria屬)的第二探針組由具有序列編號7 13所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成； 用于檢測彎曲菌(Campylobacter屬)的第三探針組由具有序列編號14 19所示的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成； 用于檢測副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的第四探針組由具有序列編號20 24所不的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成； 用于檢測金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的第五探針組由具有序列編號25 29所不的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成； 用于檢測沙門氏菌(Salmonella屬)的第六探針組由具有序列編號30 40所不的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成；以及 用于檢測臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的第七探針組由具有序列編號41 49所的喊基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的食物中毒菌檢測用載體，其特征在于，所述載體是將分別選自所述第一至第七探針組的所有的組中的ー個或兩個以上的探針固定化而得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的食物中毒菌檢測用載體，其特征在于，所述載體是將具有序列編號I 49所的喊基序列的探針和/或具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針固定化而得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的食物中毒菌檢測用載體，其特征在于，所述探針按照以下的(a) (g)的基準(zhǔn)選擇 (a)用于檢測大腸桿菌(Escherichiacoli)的探針從該食物中毒菌的基因組中所包含的熱休克蛋白基因dnaj和/或尿苷單磷酸激酶基因pyrH中選擇； (b)用于檢測李斯特菌(Listeria屬)的探針從該食物中毒菌的基因組中所包含的熱休克蛋白基因dnaj中選擇； (C)用于檢測彎曲菌(Campylobacter屬)的探針從該食物中毒菌的基因組中所包含的核糖體基因16s rDNA中選擇； (d)用于檢測副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的探針從該食物中毒菌的基因組中所包含的耐熱性溶血毒素基因tdh中選擇； (e)用于檢測金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的探針從該食物中毒菌的基因組中所包含的熱休克蛋白基因dnaj中選擇； (f)用于檢測沙門氏菌(Salmonella屬)的探針從該食物中毒菌的基因組中所包含的侵襲性因子相關(guān)基因invA中選擇； (g)用于檢測蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的探針從該食物中毒菌的基因組中所包含的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因nhe和/或嘔吐毒素合成酶基因cesB中選擇。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項所述的食物中毒菌檢測用載體，其特征在于，所述第一至第七探針組中的至少ー個探針為以下的(I) (3)中的任一種探針(1)在序列編號所示的堿基序列中I個或幾個堿基被缺失、置換或增加而成的探針、 (2)能夠在嚴(yán)格條件下與由與序列編號所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的核酸片段雜交的探針、 (3)具有與(I)或(2)的探針互補(bǔ)的堿基序列的探針。
6.ー種食物中毒菌的檢測方法，其特征在于， 使用含有由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對、試樣的基因組DNA、核酸合成酶和核酸合成底物的PCR用反應(yīng)液，在所述試樣中包含對應(yīng)于所述兩個以上的引物對中的至少ー個引物對的食物中毒菌的基因組DNA時，利用PCR法擴(kuò)增該食物中毒菌的核酸，所述引物對包括用于擴(kuò)增大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的、具備由序列編號50所不的喊基序列組成的引物和由序列編號51所不的喊基序列組成的引物的第 一引物對；用于擴(kuò)增李斯特菌(Listeria屬)的DNA的、具備由序列編號52所示的堿基序列組成的引物和由序列編號53所示的堿基序列組成的引物的第二引物對；用于擴(kuò)增彎曲菌(Campylobacter屬)的DNA的、具備由序列編號54所示的堿基序列組成的引物和由序列編號55所示的堿基序列組成的引物的第三引物對；用于擴(kuò)增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、具備由序列編號56所示的堿基序列組成的引物和由序列編號57所示的堿基序列組成的引物的第四引物對；用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、具備由序列編號58所示的堿基序列組成的引物和由序列編號59所示的堿基序列組成的引物的第五引物對；用于擴(kuò)增沙門氏菌(Salmonella屬)的DNA的、具備由序列編號60所示的堿基序列組成的引物和由序列編號61所示的堿基序列組成的引物的第六引物對；用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、具備由序列編號62所示的堿基序列組成的引物和由序列編號63所示的堿基序列組成的引物的第七引物對；以及用于擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、具備由序列編號64所示的堿基序列組成的引物和由序列編號65所示的堿基序列組成的引物的第八引物對； 使所述通過擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與將探針固定化而得到的食物中毒菌檢測用載體接觸，并使之與所述固定化的探針雜交，由此檢測出食物中毒菌， 所述探針為分別選自如下探針組中的對應(yīng)于與所述兩個以上的引物對所對應(yīng)的食物中毒菌的兩個以上組中的ー個或兩個以上的探針， 所述探針組包括 用于檢測大腸桿菌的第一探針組由具有序列編號I 6所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成； 用于檢測李斯特菌的第二探針組由具有序列編號7 13所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成； 用于檢測彎曲菌的第三探針組由具有序列編號14 19所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成； 用于檢測副溶血弧菌的第四探針組由具有序列編號20 24所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成； 用于檢測金黃色葡萄球菌的第五探針組由具有序列編號25 29所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針組成；用于檢測沙門氏菌的第六探針組由具有序列編號30 40所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成；以及 用于檢測蠟樣芽孢桿菌的第七探針組由具有序列編號41 49所示的堿基序列的探針以及具有與它們互補(bǔ)的堿基序列的探針組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的食物中毒菌的檢測方法，其特征在于， 使用含有由序列編號50 65所示的堿基序列組成的各引物、試樣的基因組DNA、核酸合成酶和核酸合成底物的PCR用反應(yīng)液，在所述試樣中至少包含大腸桿菌、李斯特菌、彎曲菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和蠟樣芽孢桿菌中的任ー種食物中毒菌時，利用PCR法，擴(kuò)增該食物中毒菌的核酸， 使所述通過擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與將探針固定化而得到的食物中毒菌檢測用載體 接觸，并使之與所述固定化的探針雜交，由此檢測出食物中毒菌，所述探針為分別選自第一至第七探針組的所有的組中的ー個或兩個以上的探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的食物中毒菌的檢測方法，其特征在于，使所述通過擴(kuò)增而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與將探針固定化而得到的食物中毒菌檢測用載體接觸，并使之與所述固定化的探針雜交，由此檢測出食物中毒菌，所述探針為具有序列編號I 49所示的堿基序列的探針和/或具有與它們互補(bǔ)的喊基序列的探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 8中任一項所述的食物中毒菌的檢測方法，其特征在于，所述引物為以下的(A)或⑶ (A)在序列編號50 65所示的堿基序列中I個或幾個堿基被缺失、置換或增加而成的引物、 (B)由能夠在嚴(yán)格條件下與如下核酸片段雜交的核酸片段組成的引物，所述核酸片段由與序列編號50 65所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成。
10.ー種食物中毒菌的檢測方法，其特征在于，使用由具有與權(quán)利要求6 9中任ー項所述的引物對互補(bǔ)的堿基序列的引物組成的引物對，進(jìn)行所述利用PCR法的核酸的擴(kuò)增。
11.根據(jù)權(quán)利要求6 10中任一項所述的食物中毒菌的檢測方法，其特征在于，所述第一至第七探針組中的至少ー個探針為以下的(I) (3)中的任一種探針 (1)在序列編號所示的堿基序列中I個或幾個堿基被缺失、置換或增加而成的探針、 (2)能夠在嚴(yán)格條件下與由與序列編號所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的核酸片段雜交的探針、 (3)具有與(I)或(2)的探針互補(bǔ)的堿基序列的探針。
全文摘要
一種食物中毒菌檢測用載體，其同時且特異性檢測出大腸桿菌、李斯特菌、彎曲菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌中的二種以上的食物中毒菌。所述食物中毒菌檢測用載體是將分別選自如下探針組的兩個以上組中的一個或兩個以上的探針固定化而得到，所述探針組包括由序列編號1～6探針及其互補(bǔ)探針(以下相同)等組成的大腸桿菌檢測用第一探針組；由序列編號7～13的探針等組成的李斯特菌檢測用第二探針組；由序列編號14～19的探針等組成的彎曲菌檢測用第三探針組；由序列編號20～24的探針等組成的副溶血弧菌檢測用第四探針組；由序列編號25～29的探針等組成的金黃色葡萄球菌檢測用第五探針組；由序列編號30～40的探針等組成的沙門氏菌檢測用第六探針組；由序列編號41～49的探針等組成的蠟樣芽孢桿菌檢測用第七探針組。
文檔編號C12N15/09GK102844447SQ20118001859
公開日2012年12月26日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日
發(fā)明者山崎隆明, 原田天章, 猿渡由寬, 龜井修一 申請人:東洋制罐株式會社, 東洋鋼鈑株式會社