專利名稱：Pcr用引物對、pcr用反應(yīng)液以及食物中毒菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測食物中毒菌的PCR用引物對，特別是涉及能夠特異性地檢測多種食物中毒菌的PCR用引物對、PCR用反應(yīng)液、食物中毒菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
以往，在食品檢查或環(huán)境檢查、臨床試驗、家畜衛(wèi)生等方面上，進行是否存在食物中毒菌的檢查。在這樣的檢查中，近年來進行如下操作利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，將檢查試樣中所包含的DNA(脫氧核糖核酸)擴增，并基于所得到的擴增產(chǎn)物，判定對象菌。
當進行這樣的PCR時，設(shè)計能夠特異性地擴增對象菌的引物為重要。于是，在專利文獻I中，公開了能夠檢測出如下五種食物中毒菌的引物對腸管出血性大腸桿菌0157、沙門氏菌、彎曲菌、李斯特菌和金黃色葡萄球菌群。此外，在專利文獻2中，公開了用于如下目的的引物對使用LAMP法(環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，Loop-Mediated Isothermal Amplification)來擴增沙門氏菌 04 群的 DNA。專利文獻I :日本特開2007-274934號公報專利文獻2 :日本特開2008-72951號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題然而，用這些方法不能檢測出其他的食物中毒菌。在細菌性食物中毒中，還多有由蠟樣芽孢桿菌或副溶血弧菌引起的情況，包括大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、彎曲菌、金黃色葡萄球菌的五種與蠟樣芽孢桿菌和副溶血弧菌的七種食物中毒菌占引起細菌性食物中毒疾病的原因的90%以上。因此，如果能夠同時且分別特異性地檢測出這些七種食物中毒菌是否存在于食品或環(huán)境等中，則非常有用。此處，當存在多種食物中毒菌時,為了分別特異性地檢測出這些食物中毒菌,需要設(shè)計能夠同時擴增該多種食物中毒菌的DNA的一部分的引物對。此時，不得因不同的對象區(qū)域的引物對的引物的組合而擴增非對象區(qū)域。此外，當存在多個不同的對象區(qū)域引物對時，如果引物的長度或熔解溫度等相似，則有時進行競爭，因此，需求設(shè)計能夠進行與單一情況相比特異性更高的擴增的引物。如此，分別特異性地檢測出多種食物中毒菌是非常困難的，至今認為，特異性地檢測出食物中毒菌五種為限，無法檢測出五種以上的多種食物中毒菌。于是，本發(fā)明人進行了深入研究，反復(fù)進行了多次實驗，結(jié)果成功地開發(fā)出，能夠以上述七個菌種中的八個區(qū)域的毒素區(qū)域基因或生物體內(nèi)必須基因為對象、分別特異性地擴增這些基因的多重PCR用引物對，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明的目的在于提供能夠特異性地擴增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus),彎曲菌(Campylobacter 屬)、大腸桿菌(Escherichia coli)、李斯特菌(Listeria 屬)、沙門氏菌(Salmonella屬)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中的兩種以上的食物中毒菌的PCR用引物對、PCR用反應(yīng)液、食物中毒菌的檢測方法、以及引物的設(shè)計方法。用于解決課題的手段本發(fā)明的PCR用引物對PCR用引物對是用于通過PCR法來擴增核酸的引物對，其由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對混合而成，所述引物對包括第一引物對，具備用于擴增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號I所示的堿基序列組成的引物和由序列編號2所示的堿基序列組成的引物；第二引物對，具備用于擴增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號3所示的堿基序列組成的引物和由序列編號4所示的堿基序列組成的引物；第三引物對,具備用于擴增彎曲菌(Campylobacter屬)的DNA的、由序列編號5所不的喊基序列組成的引物和由序列編號6所不的喊基序列組成的引物；第四引物對，具備用于擴增大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列編號7所示的堿基序列組成的引物和由序列編號8所示的堿基序列組成的引物；第五引物對，具備用于擴增李斯特菌(Listeria屬)的DNA的、由序列編號9所示的堿基序列組成的引物和由序列編號10所示的堿基序列組成的引物；第六引物對，具備用于擴增沙門氏菌(Salmonella屬)的DNA的、由序列編號11所不的喊基序列組成的引物和由序列編號12所不的喊基序列組成的引物；第七引物對，具備用于擴增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列編號13所不的喊基序列組成的引物和由序列編號14所不的喊基序列組成的引物；以及第八引物對，具備用于擴增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列編號15所不的喊基序列組成的引物和由序列編號16所不的喊基序列組成的引物。另外，本發(fā)明的PCR用引物對是用于通過PCR法來擴增核酸的引物對，其由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對混合而成，所述引物對包括以蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)為擴增對象區(qū)域的引物對、以蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的嘔吐毒素合成酶基因(cesB)為擴增對象區(qū)域的引物對、以彎曲菌(Campylobacter屬)的基因組DNA中所包含的核糖體基因(16S rDNA)為擴增對象區(qū)域的引物對、以大腸桿菌(Escherichia coli)的基因組DNA中所包含的尿苷單磷酸激酶基因(pyrH)為擴增對象區(qū)域的引物對、以李斯特菌(Listeria屬)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因(dnaj)為擴增對象區(qū)域的引物對、以沙門氏菌(Salmonella屬)的基因組DNA中所包含的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)為擴增對象區(qū)域的引物對、以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因(dnaj)為擴增對象區(qū)域的引物對、以及以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因組DNA中所包含的耐熱性溶血毒素基因(tdh)為擴增對象區(qū)域的引物對。此外，本發(fā)明的PCR用反應(yīng)液含有上述PCR用引物對。此外，本發(fā)明的食物中毒菌的檢測方法是使用由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對，在利用PCR法的擴增對象的試樣中包含對應(yīng)于這些引物對的一個或兩個以上的食物中毒菌的核酸時，特異性地擴增該核酸，并基于所得到的擴增產(chǎn)物，檢測食物中毒菌的方法，所述引物對包括第一引物對，具備用于擴增臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號I所不的喊基序列組成的引物和由序列編號2所不的喊基序列組成的引物；第二引物對，具備用于擴增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號3所示的堿基序列組成的引物和由序列編號4所示的堿基序列組成的引物；第三引物對，具備用于擴增彎曲菌(Campylobacter屬)的DNA的、由序列編號5所示的堿基序列組成的引物和由序列編號6所示的堿基序列組成的引物；第四引物對，具備用于擴增大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列編號7所示的堿基序列組成的引物和由序列編號8所示的堿基序列組成的引物；第五引物對，具備用于擴增李斯特菌(Listeria屬)的DNA的、由序列編號9所不的喊基序列組成的引物和由序列編號10所不的喊基序列組成的引物；第六引物對，具備用于擴增沙門氏菌(Salmonella屬)的DNA的、由序列編號11所示的堿基序列組成的引物和由序列編號12所示的堿基序列組成的引物；第七引物對，具備用于擴增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列編號13所示的堿基序列組成的引物和由序列編號14所示的堿基序列組成的引物；以及第八引物對，具備用于擴增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列編號15所示的堿基序列組成的引物和由序列編號16所不的喊基序列組成的引物。發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，能夠特異性地擴增蠟樣芽孢桿菌、彎曲菌、大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌中的兩種以上的食物中毒菌。因此，能夠分別特異性地檢測出這些食物中毒菌。


圖I為示出本發(fā)明實施方式的對應(yīng)于新型引物對的序列編號、正向和反向的區(qū)另IJ、對象食物中毒菌、擴增對象區(qū)域、以及擴增產(chǎn)物的長度的圖。圖2為示出本發(fā)明實施方式的新型引物對的擴增對象區(qū)域與對應(yīng)序列的圖。圖3為示出試驗I的蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA中所包含的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(Bacillus cereus/nhe)的擴增結(jié)果的圖。圖4為示出試驗2的蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA中所包含的嘔吐毒素合成酶基因(Bacillus cereus/cesB)的擴增結(jié)果的圖。圖5為示出試驗3的彎曲菌的基因組DNA中所包含的核糖體基因(Campylobacter/ 16S rDNA)的擴增結(jié)果的圖。圖6為示出試驗4的大腸桿菌的基因組DNA中所包含的尿苷單磷酸激酶基因(Escherichia coli/pyrH)的擴增結(jié)果的圖。圖7為示出試驗5的李斯特菌的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因(Listeria monocytogenes/dnaj)的擴增結(jié)果的圖。圖8為示出試驗6的沙門氏菌的基因組DNA中所包含的侵襲性因子相關(guān)基因(Salmonella enterica/invA)的擴增結(jié)果的圖。圖9為示出試驗7的金黃色葡萄球菌的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因(Staphylococcus aureus/dnaj)的擴增結(jié)果的圖。圖10為示出試驗8的副溶血弧菌的基因組DNA中所包含的耐熱性溶血毒素基因(Vibrio parahaemolyticus/tdh)的擴增結(jié)果的圖。圖11為示出利用實施例I的八組的所有的引物分別擴增各個七種食物中毒菌的基因組DNA的一部分的結(jié)果的圖。圖12為示出利用實施例2的八組的所有的引物一次性擴增七種食物中毒菌的基因組DNA的一部分的結(jié)果的圖。
具體實施例方式下面，對本發(fā)明的實施方式進行具體的說明。[PCR用引物對]首先，參照圖I和圖2，對本實施方式的PCR用引物對進行說明。PCR用引物對是為了利用PCR法來擴增試樣中的基因組DNA的一部分而使用，利用正向引物和反向引物的兩種引物擴增特定的區(qū)域。PCR用引物對包含在PCR反應(yīng)液中。 在PCR反應(yīng)液中還含有核酸合成底物、核酸合成酶、試樣的基因組DNA、緩沖液等。并且，使用該PCR反應(yīng)液，采用熱循環(huán)儀等核酸擴增裝置，擴增試樣中的基因組DNA的一部分。SP，當在試樣中存在具有基于PCR用引物對的擴增對象區(qū)域的基因組DNA時，擴增該對象區(qū)域。本實施方式的PCR用引物對能夠在通常的PCR法中使用。在圖I中，序列編號顯示出序列表中所示的堿基序列的序列編號。F/R顯示出正向弓丨物和反向引物的區(qū)別，F(xiàn)表示正向引物，R表示反向引物。擴增對象食物中毒菌(學名)顯示出利用本實施方式的PCR用引物對進行擴增的對象食物中毒菌的名稱。對象區(qū)域顯示出在該食物中毒菌中的利用本實施方式的PCR用引物對進行擴增的對象區(qū)域中所存在的基因的名稱。擴增產(chǎn)物顯示出使用本實施方式的PCR用引物對擴增所對應(yīng)的對象區(qū)域時的擴增產(chǎn)物的堿基序列的長度。此外，在圖2中，示出對應(yīng)于各食物中毒菌的擴增對象區(qū)域的PCR用引物對的堿基序列。序列編號I和2表示用于擴增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)的引物對的堿基序列，擴增產(chǎn)物為195bp (堿基對)。序列編號3和4表示用于擴增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的嘔吐毒素合成酶基因(cesB)的引物對的堿基序列，擴增產(chǎn)物為238bp。序列編號5和6表示用于擴增彎曲菌(Campylobacter屬)的基因組DNA中所包含的核糖體基因(16S rDNA)的引物對的堿基序列，擴增產(chǎn)物為263bp。序列編號7和8表示用于擴增大腸桿菌(Escherichia coli)的基因組DNA中所包含的尿苷單磷酸激酶基因(PyrH)的引物對的堿基序列，擴增產(chǎn)物為157bp。序列編號9和10表示用于擴增李斯特菌(Listeria屬)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因(dnaj)的引物對的堿基序列,擴增產(chǎn)物為176bp。序列編號11和12表不用于擴增沙門氏菌(Salmonella屬)的基因組DNA中所包含的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)的引物對的堿基序列，擴增產(chǎn)物為180bp。序列編號13和14表示用于擴增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因(dnaj)的引物對的堿基序列，擴增產(chǎn)物為236bp。序列編號15和16表示用于擴增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因組DNA中所包含的耐熱性溶血毒素基因(tdh)的引物對的堿基序列，擴增產(chǎn)物為380bp。這些序列編號所示的堿基序列示出從5’末端到3’末端方向的序列。
此外，本實施方式的PCR用引物對中的各引物并不限于上述的堿基序列，可以使用在各堿基序列中I個或幾個堿基被缺失、置換或增加后的堿基序列。另外，也可以使用由能夠在嚴格條件下與如下核酸片段雜交的核酸片段組成的引物，所述核酸片段由與各上述堿基序列互補的堿基序列組成。另外，嚴格條件是指形成特異性雜交、不形成非特異性雜交的條件。例如，可以舉出如下條件相對于由序列編號I 16所示的序列組成的DNA具有高同源性(同源性為90%以上，優(yōu)選為95%以上)的DNA和由與序列編號I 16所示的序列所組成的DNA互補的堿基序列組成的DNA雜交的條件。通常是指在低于完全雜交的熔解溫度(Tm)約5°C 約30°C、優(yōu)選為約10°C 約25°C的溫度下形成雜交的情況。關(guān)于嚴格條件，可以使用 J· Sambrook 等在 Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989),特別是 11.45 節(jié)“Conditions forHybridization of Oligonucleotide Probes” 中所記載的條件等。進而，也可以使用由具有與本實施方式的PCR用引物對互補的堿基序 列的引物組成的PCR用引物對。即，也可以使用如下引物具有分別與本實施方式的PCR用引物對中的引物互補的序列、且將從5’末端到3’末端的序列的方向顛倒的引物對。在使上述八種PCR用引物對包含在PCR反應(yīng)液中并進行利用PCR法的擴增反應(yīng)的情況下，只要在PCR反應(yīng)液中所含有的試樣中包含任意上述擴增對象食物中毒菌的基因組DNA,則能夠特異性地擴增該擴增對象區(qū)域。此外，在試樣中含有兩種以上的上述擴增對象食物中毒菌的基因組DNA的情況下，能夠同時且特異性地擴增各個基因組DNA的擴增對象區(qū)域。即使在試樣中含有七種擴增對象食物中毒菌的基因組DNA的八個區(qū)域所有的基因的情況下，也能夠同時且特異性地擴增各基因組DNA的擴增對象區(qū)域。S卩，如果利用本實施方式的PCR用引物對，則不會進行除了各對象食物中毒菌以外的基因組DNA所引起的競爭。此外，即使同時使用多個PCR用引物對，也不進行因不同的引物對中的引物的組合而引起的非特異性擴增。因此，通過將本實施方式的PCR用引物對加入到PCR反應(yīng)液中，在試樣中包含具有擴增對象區(qū)域的食物中毒菌的基因組DNA的情況下，能夠特異性地擴增該區(qū)域。此外，即使在試樣中包含多種擴增對象的食物中毒菌的情況下，也能夠同時且特異性地擴增各擴增對象區(qū)域。理所當然，即使在PCR反應(yīng)液中不包含所有的上述八種PCR用引物對，而包含其中的一種至七種PCR用引物對的情況下，當在PCR反應(yīng)液中包含具有該PCR用引物對的擴增對象區(qū)域的食物中毒菌的基因組DNA的情況下，也能夠特異性地擴增該對象區(qū)域。[PCR用反應(yīng)液]本實施方式的PCR反應(yīng)液至少含有上述八種PCR用引物對中的任一種，優(yōu)選含有其中兩種以上，更優(yōu)選含有所有的八種PCR用引物對。PCR反應(yīng)液中的除PCR用引物對以外的成分可以使用通常物質(zhì)。具體地說，例如可以使用由以下的組成形成的材料，但并不限于此。特別是，引物、試樣的DNA和滅菌水的容量根據(jù)作為擴增對象的食物中毒菌的種類數(shù)的不同而不同。
緩沖液(10體積％)·核酸合成底物(8體積％ ) 正向引物(IOng/ μ I、2體積％ 16體積％ ) 反向引物(IOng/ μ I、2體積% 16體積% )·核酸合成酶(O. 5體積％ )·試樣的DNA (5體積％ 35體積% )·水(72. 5 體積 ％ 14. 5 體積 ％ )[食物中毒菌的檢測方法]
下面，對本實施方式的食物中毒菌的檢測方法進行說明。首先，使用本實施方式的PCR反應(yīng)液，利用PCR法，擴增試樣中所包含的基因組。另外，實際上，當進行食物中毒菌的檢測時，從食品或環(huán)境等中采集樣品，進行該樣品中所包含的菌的培養(yǎng)。然后，從培養(yǎng)的菌提取基因組DNA，使用該提取的基因組DNA作為上述PCR反應(yīng)液中的試樣。因此，實際上，在試樣中是否存在擴增對象食物中毒菌是不明確的，當存在時，能夠檢測出該菌。另外，此時，如果使PCR反應(yīng)液中含有所有的上述八種PCR用引物對，在試樣中存在上述七個菌種八個區(qū)域的基因中的任意一種，則能夠分別特異性地擴增出擴增對象區(qū)域。在利用PCR法擴增基因時，使用核酸擴增裝置。作為該核酸擴增裝置，可以使用通常的熱循環(huán)儀等。例如，PCR的反應(yīng)條件如下，但并不限此。(1)95°C2 分鐘(2) 950C 10秒鐘(DNA鏈的解離工序)(3) 68 0C 30秒鐘(退火工序)(4) 72 0C 30 秒鐘(DNA 合成工序)(5) 72 °C 2 分鐘將⑵ ⑷進行40個循環(huán)接著，使用擴增產(chǎn)物進行電泳，確認是否得到了基于本實施方式的PCR用引物對的擴增產(chǎn)物。電泳可以利用瓊脂糖凝膠電泳、丙烯酰胺電泳或微芯片電泳等通常的方法來進行。[引物的設(shè)計方法]接著，對本實施方式引物的設(shè)計方法進行說明。如在背景技術(shù)中進行的說明，為了分別特異性地且同時檢測多種食物中毒菌，需要設(shè)計能夠同時擴增該多種食物中毒菌的DNA的引物。但是，當存在多個不同種類的引物對時，如果引物的長度或熔解溫度等相似則有時進行競爭，因此，需求設(shè)計與單獨的情況相比能夠進行特異性更高的擴增的引物。于是，本發(fā)明人對能夠提高這樣的引物的特異性的引物的設(shè)計方法進行研究，從而發(fā)現(xiàn)若按照以下的基準，能夠提高引物的特異性。(I)熔解溫度將引物的熔解溫度設(shè)為70°C以上。以往的引物通常使用熔解溫度為55°C 60°C的引物?？赏贫椋c此相對，對于本實施方式的PCR用引物對而言，通過設(shè)計成熔解溫度高的引物，能夠使PCR中擴增反應(yīng)時的自由能量增大，減少非特異性擴增反應(yīng)。(2) GC 含量將引物的堿基序列中的GC含量設(shè)為60%以上。以往的引物通常使用GC含量為40% 60%的引物?？赏贫?，與此相對，對于本實施方式的PCR用引物對而言，通過設(shè)計與AT相比具有更高的結(jié)合力的GC的含量多的引物，能夠提高退火工序中的特異性結(jié)合。⑶引物的長度將引物的堿基序列的長度設(shè)為23mer 41mer左右。更優(yōu)選為26mer 34mer左右，進一步優(yōu)選為28mer 32mer左右。以往的引物通常使用堿基序列的長度為18mer 25mer左右的引物。可推定為，與此相對，對于本實施方式的PCR用引物對而言，通過使用更長的引物，能夠排除非特異性擴增。如此，通過采用⑴ (3)中的至少任一項基準，進行引物設(shè)計，從而與以往的引物相比能夠進一步提高其特異性、即對擴增對象的基因區(qū)域進行特異性地擴增的性質(zhì)。本實施方式的PCR用引物對通過設(shè)計符合這些所有的基準的PCR用引物對，成為能夠特異性地擴增七種菌八個區(qū)域的優(yōu)異的材料。(4)檢測對象區(qū)域此外，如在上文中用圖I進行的說明，本實施方式的PCR用引物對以各食物中毒菌的特定區(qū)域為對象設(shè)計引物。g卩，以這些食物中毒菌的毒素區(qū)域的基因和/或生物體內(nèi)必需區(qū)域的基因為對象。具體地說，作為擴增對象區(qū)域，對于蠟樣芽孢桿菌選擇不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)和嘔吐毒素合成酶基因(cesB)，對于彎曲菌選擇核糖體基因(16S rDNA),對于大腸桿菌選擇尿苷單磷酸激酶基因(pyrH)，對于李斯特菌選擇熱休克蛋白基因(dnaj)，對于沙門氏菌選擇侵襲性因子相關(guān)基因(invA)，對于金黃色葡萄球菌選擇熱休克蛋白基因(dnaj)，對于副溶血弧菌選擇耐熱性溶血毒素基因(tdh)。本實施方式的PCR用引物對通過分別選擇這些區(qū)域作為擴增對象，而能夠進一步提聞引物的特異性。如以上說明，如果利用本實施方式的PCR用引物對、PCR用反應(yīng)液、食物中毒菌的檢測方法，則能夠同時且特異性地對蠟樣芽孢桿菌、彎曲菌、大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌的七種食物中毒菌中的八個區(qū)域進行擴增。因此，根據(jù)本實施方式，能夠同時且分別特異性地檢測出這些食物中毒菌。此外，如果利用本實施方式引物的設(shè)計方法，則能夠設(shè)計如本實施方式的PCR用弓I物對那樣的特異性高的引物。實施例首先，進行了用于確認本實施方式的PCR用引物對是否能夠正確地擴增出擴增對象區(qū)域的檢驗試驗。試驗方法利用上述實施方式的方法，使用含有本實施方式的PCR用引物對的PCR反應(yīng)液，利用PCR法進行擴增反應(yīng)，對擴增產(chǎn)物進行電泳，由此確認了能夠得到正確的擴增產(chǎn)物。具體地說，在以下的試驗I 8中分別對八種PCR用引物對進行說明。(試驗I)首先，作為PCR用引物對，使用了具備由序列編號I和2所示的堿基序列組成的引物的引物對。擴增對象區(qū)域為蠟樣芽孢桿菌基因組DNA的毒素區(qū)域中的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe),擴增產(chǎn)物為195bp。作為PCR反應(yīng)液,使用了組成為如下的物質(zhì)。引物由Life Technologies日本株式會社合成。除此以外是Takara Bio株式會社制的。·緩沖液 IOXEx Taq buffer (20mM Mg 2+plus) 2. O μ I·核酸合成底物 dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2. 5mM) I. 6 μ I
引物 F(10ng/μ I、最終濃度(final conc. ) 4ng) 0. 4 μ I·引物 R(10ng/y I、最終濃度 4ng)0. 4μ I·核酸合成酶 EX Taq (5U/ μ 1)0. I μ I 試樣的 DNAl. 0μ I·滅菌水 14. 5 μ I(總量20 μ I)此外，使各試樣的DNA分別含有下面I 11所示的食物中毒菌的供試菌株基因組DNA,并分別進行PCR。I.臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)NBRC 153052.臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)TIFT 1140113.結(jié)腸彎曲菌(Campylobacter coli)ATCC 434784.空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)ATCC 335605.大腸桿菌(Escherichia coli)NBRC 1022036.單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 153137.腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)ATCC 92708.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) NBRC 1009109.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) GTC 205510.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC 1780211.耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)ATCC 961012.陰性對照這些食物中毒菌的菌株為由下面的機構(gòu)分售而得。 · NBRC獨立行政法人制品評價基盤機構(gòu)· TIFT東洋食品研究所· ATCC 美國標準生物品收藏中心(American type culture collection)· GTC岐阜大學大學院醫(yī)學系研究科病原體制御分野另外，使用了含有供試菌株11的耶爾森菌(Yersinia enterocolitica ATCC9610)的PCR反應(yīng)液的試驗是為了確認關(guān)于本實施方式的各PCR用引物對的假陽性反應(yīng)而進行的。另外，12的試驗是代替試樣的DNA將同量的滅菌水加入到PCR反應(yīng)液中而進行的。在利用PCR法擴增基因時，使用了 ep梯度(Eppendorf株式會社制)。另外，PCR的反應(yīng)條件是在實施方式中說明的條件相同的下面的條件下進行。(1)95°C2 分鐘(2) 950C 10秒鐘(DNA鏈的解離工序)(3) 68 0C 30秒鐘(退火工序)(4) 72 0C 30 秒鐘(DNA 合成工序)(5) 72 °C 2 分鐘將⑵ ⑷進行40個循環(huán)接著，利用瓊脂糖凝膠電泳，對通過PCR法得到的產(chǎn)物按各擴增對象區(qū)域進 行電泳，從而確認是否得到了正確的擴增產(chǎn)物。電泳是使用MultiNA(株式會社島津制作所制)而進行的。將該結(jié)果示于圖3。在圖3中，I 12的條帶表示對使用含有各自對應(yīng)的編號的試樣的DNA等的PCR反應(yīng)液而進行的PCR產(chǎn)物分別進行電泳的結(jié)果。另外，曲線圖表示擴增產(chǎn)物的長度。在曲線圖中，關(guān)于所得到作為該PCR用引物對的擴增對象的目標擴增產(chǎn)物的條帶，示出其擴增產(chǎn)物的峰。這在以下的試驗2 8中也同樣。此處，在對通過PCR而得到的擴增產(chǎn)物進行電泳的情況下，由于受到MultiNA(株式會社島津制作所制)中所用的試劑等影響，與理論上的擴增產(chǎn)物的堿基序列并不完全一致，而得到相似值的結(jié)果。試驗I的PCR用引物對具備由序列編號I和2所示的堿基序列組成的引物，擴增對象區(qū)域為蠟樣芽孢桿菌的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)，擴增產(chǎn)物為195bp。在圖3中，對于使用了蠟樣芽孢桿菌的基因組作為試樣的DNA的供試菌株1、2而言，在200bp附近可見條帶，對于其他的供試菌株3 12而言，在200bp附近未見條帶。另夕卜，下欄的曲線圖是針對供試菌株I的圖，其示出195bp的峰。此外，推定為，電泳結(jié)果中的25bp或75bp附近等的其他的條帶表示引物或由引物形成的二聚物。這在以下的試驗2 8中也同樣。由以上結(jié)果可以判斷，對于使用了蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株1、2而言，利用試驗I的PCR用引物對正確地擴增出蠟樣芽孢桿菌的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)。另一方面，在參照使用了其他的基因組作為試樣的DNA的供試菌株3-11的條帶時，雖然可見被認為表示由引物形成的二聚物的條帶，但未見可誤認為是不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)得到擴增而形成的條帶那樣的非對象區(qū)域的擴增。由此可確認，通過使用具備了由序列編號I和2所示的堿基序列組成的引物的PCR用引物對，能夠特異性地擴增蠟樣芽孢桿菌的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因(nhe)。(試驗2)使用了具備由序列編號3和4所示的堿基序列組成的引物的引物對作為PCR用引物對，除此之外，與試驗I同樣地進行實驗。將其結(jié)果示于圖4。試驗2的PCR用引物對的擴增對象區(qū)域為蠟樣芽孢桿菌基因組DNA的毒素區(qū)域中的嘔吐毒素合成酶基因(cesB)，擴增產(chǎn)物為238bp。在圖4中，當使用了具有嘔吐毒素合成酶基因(cesB)的供試菌株2的基因組(Bacillus cereus TIFT 114011)的DNA作為試樣的DNA時，在250bp附近可見條帶，對于其他的供試菌株1、3-12而言，在250bp附近未見條帶。此外，下欄的曲線圖是針對供試菌株2的圖，其示出251bp的峰。因此可以判斷，當使用了具有嘔吐毒素合成酶基因(cesB)的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株2時，利用試驗2的PCR用引物對，正確地擴增出擴增對象區(qū)域。另一方面，在參照使用了其他的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株1、3 11的條帶時，未見可誤認為是嘔吐毒素合成酶基因(cesB)得到擴增而形成的條帶那樣的非對象區(qū)域的擴增。由此可確認，通過使用具備了由序列編號3和4所示的堿基序列組成的引物的PCR用引物對，能夠特異性地擴增蠟樣芽孢桿菌的嘔吐毒素合成酶基因(cesB)。(試驗3)
使用了具備由序列編號5和6所示的堿基序列組成的引物的引物對作為PCR用引物對，除此之外，與試驗I同樣地進行實驗。將其結(jié)果示于圖5。試驗3的PCR用引物對的擴增對象區(qū)域為彎曲菌基因組DNA的生物體內(nèi)必需區(qū)域中的核糖體基因(16S rDNA)，擴增產(chǎn)物為263bp。在圖5中，當使用了具有彎曲菌的核糖體基因(16S rDNA)的供試菌株3、4的基因組的DNA作為試樣的DNA時，在275bp附近可見條帶，對于其他的供試菌株1、2、5 12而言，在275bp附近未見條帶。此外，下欄的曲線圖是針對供試菌株3的圖，其示出268bp的峰。因此可以判斷，當使用了具有彎曲菌的核糖體基因(16S rDNA)的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株3、4時，利用試驗3的PCR用引物對，正確地擴增出擴增對象區(qū)域。另一方面，在參照使用了其他的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株1、2、5 11的條帶時，未見可誤認為是彎曲菌的核糖體基因(16SrDNA)得到擴增而形成的條帶那樣的非對象區(qū)域的擴增。由此可確認，通過使用具備了由序列編號5和6所示的堿基序列組成的引物的PCR用引物對，能夠特異性地擴增彎曲菌的核糖體基因(16SrDNA)。(試驗4)使用了具備由序列編號7和8所示的堿基序列組成的引物的引物對作為PCR用引物對，除此之外，與試驗I同樣地進行實驗。將其結(jié)果示于圖6。試驗4的PCR用引物對的擴增對象區(qū)域為大腸桿菌基因組DNA的生物體內(nèi)必需區(qū)域中的尿苷單磷酸激酶基因(PyrH)，擴增產(chǎn)物為157bp。在圖6中，當使用了具有大腸桿菌的尿苷單磷酸激酶基因(pyrH)的供試菌株5的基因組的DNA作為試樣的DNA時，在160bp附近可見條帶，對于其他的供試菌株I 4、6 12而言，在160bp附近未見條帶。此外，下欄的曲線圖是針對供試菌株5的圖，其示出159bp的峰。因此可以判斷，當使用了具有大腸桿菌的尿苷單磷酸激酶基因(pyrH)的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株5時，利用試驗4的PCR用引物對，正確地擴增出擴增對象區(qū)域。另一方面，在參照使用了其他的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株I 4、6 11的條帶時，未見可誤認為是大腸桿菌的尿苷單磷酸激酶基因(pyrH)得到擴增而形成的條帶那樣的非對象區(qū)域的擴增。由此可確認，通過使用具備了由序列編號7和8所示的堿基序列組成的引物的PCR用引物對，能夠特異性地擴增大腸桿菌的尿苷單磷酸激酶基因(PyrH)。(試驗5)使用了具備由序列編號9和10所示的堿基序列組成的引物的引物對作為PCR用引物對，除此之外，與試驗I同樣地進行實驗。將其結(jié)果示于圖7。試驗5的PCR用引物對的擴增對象區(qū)域為李斯特菌基因組DNA的生物體內(nèi)必需區(qū)域中的熱休克蛋白基因(dnaj)，擴增產(chǎn)物為176bp。在圖7中，當使用了具有李斯特菌的熱休克蛋白基因(dnaj)的供試菌株6的基因組的DNA作為試樣的DNA時，在200bp附近可見條帶，對于其他的供試菌株I 5、7 12而言，在200bp附近未見條帶。此外，下欄的曲線圖是針對供試菌株6的圖，其示出198bp的 峰。因此可以判斷，當使用了具有李斯特菌的熱休克蛋白基因(dnaj)的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株6時，利用試驗5的PCR用引物對，正確地擴增出擴增對象區(qū)域。另外，在試驗5中，發(fā)現(xiàn)理論上的擴增產(chǎn)物的長度和實際的擴增產(chǎn)物的長度有20bp左右的差異。該原因推定為，在供試菌株6中的熱休克蛋白基因(dnaj)中發(fā)生了某種序列的插入。另一方面，在參照使用了其他的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株I 5、7 11的條帶時，未見可誤認為是李斯特菌的熱休克蛋白基因(dnaj)得到擴增而形成的條帶那樣的非對象區(qū)域的擴增。由此可確認，通過使用具備了由序列編號9和10所示的堿基序列組成的引物的PCR用引物對，能夠特異性地擴增李斯特菌的熱休克蛋白基因(dnaj)。(試驗6)使用了具備由序列編號11和12所示的堿基序列組成的引物的引物對作為PCR用引物對，除此之外，與試驗I同樣地進行實驗。將其結(jié)果示于圖8。試驗6的PCR用引物對的擴增對象區(qū)域為沙門氏菌基因組DNA的毒素區(qū)域中的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)，擴增產(chǎn)物為180bp。在圖8中，當使用了具有沙門氏菌侵襲性因子相關(guān)基因(invA)的供試菌株7的基因組的DNA作為試樣的DNA時，在190bp附近可見條帶，對于其他的供試菌株I 6、8 12而言，在190bp附近未見條帶。此外，下欄的曲線圖是針對供試菌株7的圖，其示出183bp的峰。因此可以判斷，當使用了具有沙門氏菌的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株7時，利用試驗6的PCR用引物對，正確地擴增出擴增對象區(qū)域。另一方面，在參照使用了其他的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株I 6、8 11的條帶時，未見可誤認為是沙門氏菌的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)得到擴增而形成的條帶那樣的非對象區(qū)域的擴增。由此可確認，通過使用具備了由序列編號11和12所示的堿基序列組成的引物的PCR用引物對，能夠特異性地擴增沙門氏菌的侵襲性因子相關(guān)基因(invA)。
(試驗7)使用了具備由序列編號13和14所示的堿基序列組成的引物的引物對作為PCR用引物對，除此之外，與試驗I同樣地進行實驗。將其結(jié)果示于圖9。試驗7的PCR用引物對的擴增對象區(qū)域為金黃色葡萄球菌基因組DNA的生物體內(nèi)必須區(qū)域中的熱休克蛋白基因(dnaj)，擴增產(chǎn)物為236bp。在圖9中，當使用了具有金黃色葡萄球菌的熱休克蛋白基因(dnaj)的供試菌株8的基因組的DNA作為試樣的DNA時，在240bp附近可見條帶，對于其他的供試菌株I 7、9 12而言，在240bp附近未見條帶。此外，下欄的曲線圖是針對供試菌株8的圖，其示出238bp的峰。因此可以判斷，當使用了具有金黃色葡萄球菌的熱休克蛋白基因(dnaj)的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株8時，利用試驗7的PCR用引物對，正確地擴增出擴增對 象區(qū)域。另一方面，在參照使用了其他的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株I 7、9 11的條帶時，未見可誤認為是金黃色葡萄球菌的熱休克蛋白基因(dnaj)得到擴增而形成的條帶那樣的非對象區(qū)域的擴增。由此可確認，通過使用具備了由序列編號13和14所示的堿基序列組成的引物的PCR用引物對，能夠特異性地擴增金黃色葡萄球菌的熱休克蛋白基因(dnaj)。(試驗8)使用了具備由序列編號15和16所示的堿基序列組成的引物的引物對作為PCR用引物對，除此之外，與試驗I同樣地進行實驗。將其結(jié)果示于圖10。試驗8的PCR用引物對的擴增對象區(qū)域為副溶血弧菌基因組的毒素區(qū)域中的耐熱性溶血毒素基因(tdh)，擴增產(chǎn)物為380bp。在圖10中，當使用了具有副溶血弧菌的耐熱性溶血毒素基因(tdh)的供試菌株9的基因組的DNA作為試樣的DNA時，在400bp附近可見條帶，對于其他的供試菌株I 8、10 12而言，在400bp附近未見條帶。此外，下欄的曲線圖是針對供試菌株9的圖，其示出390bp的峰。另外，供試菌株10的基因組(Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802)為不具有耐熱性溶血毒素基因(tdh)的副溶血弧菌的菌株，未見擴增對象區(qū)域的擴增。因此可以判斷，當使用了具有副溶血弧菌的耐熱性溶血毒素基因(tdh)的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株9時，利用試驗8的PCR用引物對，正確地擴增出擴增對象區(qū)域。另一方面，在參照使用了其他的基因組DNA作為試樣的DNA的供試菌株I 8、10、11的條帶時，未見可誤認為是副溶血弧菌的耐熱性溶血毒素基因(tdh)得到擴增而形成的條帶那樣的非對象區(qū)域的擴增。由此可確認，通過使用具備了由序列編號15和16所示的堿基序列組成的引物的PCR用引物對，能夠特異性地擴增副溶血弧菌的耐熱性溶血毒素基因(tdh)。綜上所述，可確認到，本實施方式的PCR用引物對在各自單獨使用時，關(guān)于不是該弓丨物對的擴增對象的其他的上述食物中毒菌的基因組DNA，不引起假陽性擴增反應(yīng)。接著，對于在同時使用這些PCR用引物對時是否能夠特異性地擴增對象區(qū)域進行檢驗。對其結(jié)果在以下的實施例I和實施例2中進行說明。
(實施例I)首先，使用試驗I 8中所用的所有的引物對作為PCR用引物對，進行了實驗。即，使實施例I的PCR反應(yīng)液中含有由序列編號I 16所不的喊基序列組成的所有的引物。實施例I的PCR反應(yīng)液除了引物、試樣的DNA和滅菌水以外與試驗I相同，使用了如下組成的物質(zhì)?！ぞ彌_液 IOXEx Taq buffer (20mM Mg 2+plus) 2. O μ I·核酸合成底物 dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2. 5mM) I. 6 μ I·弧菌檢測用引物FdOng/μ I、最終濃度4ng)0. 4μ I
·弧菌檢測用引物R(10ng/μ I、最終濃度4ng)0. 4μ I·其他的引物 F(10ng/y I、最終濃度 2ng)0. 2μ 1X7·其他的引物 R(10ng/y I、最終濃度 2ng)0.2y 1X7·核酸合成酶 EX Taq (5U/ μ 1)0. I μ I 試樣的 DNAl. 0μ I 滅菌水 11. 7μ I此外，使各試樣的DNA分別含有下面的I 7所示的食物中毒菌的供試菌株基因組DNA，并分別進行PCR。I.臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)TIFT 1140112.空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)ATCC 335603.大腸桿菌(Escherichia coli)NBRC 1022034.單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 153135.腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)ATCC 92706.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) NBRC 1009107.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) GTC 2055在利用PCR法進行基因擴增時，與試驗I同樣地，使用了 ep梯度(Eppendorf株式會社制)，在如下條件下進行。(1)95°C2 分鐘(2) 950C 10秒鐘(DNA鏈的解離工序)(3) 68 0C 30秒鐘(退火工序)(4) 72 0C 30 秒鐘(DNA 合成工序)(5) 72 °C 2 分鐘將⑵ ⑷進行40個循環(huán)接著，利用電泳使通過PCR法而得到的產(chǎn)物按各擴增對象區(qū)域進行電泳，對于各試樣的DNA，進行是否得到了該擴增對象區(qū)域得到擴增的正確的擴增產(chǎn)物的確認。將該結(jié)果示于圖11。在圖11中，在使用上述供試菌株I 7的基因組DNA作為試樣的DNA時，通過PCR法而得到的各擴增產(chǎn)物分別示出以下的峰。I.臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)TIFT 114011198bp 及252bp2.空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)ATCC 33560270bp
3.大腸桿菌(Escherichia coli)NBRC 102203158bp4.單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 15313 195bp5.腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)ATCC 9270177bp6.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) NBRC 100910238bp7.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) GTC 2055390bp這些與各自理論上的擴增產(chǎn)物的堿基序列的長度相似，可以認為，通過本實施方式的PCR用引物對，能夠特異性地擴增各個作為對象的食物中毒菌的擴增對象區(qū)域。另外，供試菌株4的李斯特菌的擴增產(chǎn)物為195bp，與圖I所示的李斯特菌的擴增產(chǎn)物176bp相比，差不多長20bp，如上所述，該原因推定為，該菌株中發(fā)生了某種序列的插入。 (實施例2)使實施例2的PCR反應(yīng)液中含有實施例I中的供試菌株I 7的所有的食物中毒菌的基因組DNA作為試樣DNA。除了試樣的DNA和滅菌水以外與試驗I相同，使用了如下組成的物質(zhì)?！ぞ彌_液 IOXEx Taq buffer (20mM Mg 2+plus) 2. O μ I·核酸合成底物 dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2. 5mM) I. 6 μ I·弧菌檢測用引物F(10ng/ μ I、最終濃度4ng)0. 4 μ I·弧菌檢測用引物R(10ng/μ I、最終濃度4ng)0. 4μ I·其他的引物 F(10ng/y I、最終濃度 2ng)0. 2μ 1X7·其他的引物 R(10ngg/y I、最終濃度 2ng)0.2y 1X7·核酸合成酶 EX Taq (5U/ μ 1)0. I μ I 試樣的 DNA I. 0μ 1X7·滅菌水 5. 7 μ I使用該PCR反應(yīng)液，在與實施例I同樣的條件下，利用PCR法，一次性進行擴增對象區(qū)域的擴增。接著，使用MultiNA(株式會社島津制作所制)進行擴增產(chǎn)物的電泳。將其結(jié)果示于圖12。如圖12所示，可見如下8個擴增產(chǎn)物的峰。(I) 168bp (2) 172bp (3) 187bp (4)201bp(5)224bp (6)243bp (7)273bp (8)387bp與實施例I的結(jié)果對照后可認為，這些峰分別示出以下的供試菌株的擴增產(chǎn)物。(I)供試菌株 3.大腸桿菌(Escherichia coli)NBRC 102203(2)供試菌株 5.腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)ATCC 9270(3)供試菌株4.單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC15313(4)供試菌株 I.蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)TIFT 114011(5)供試菌株 6.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) NBRC100910(6)供試菌株 I.蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)TIFT 114011(7)供試菌株 2.空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)ATCC 33560
(8)供試菌株 7.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) GTC 2055這樣，可知根據(jù)本實施方式的PCR用引物對，能夠同時且特異性地擴增蠟樣芽孢桿菌、彎曲菌、大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌的食物中毒菌。并且，由該結(jié)果可確認，能夠同時且分別特異性地檢測出這些食物中毒菌。本發(fā)明并不限定于以上的實施方式或?qū)嵤├?，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以實施各種變更是理所當然的。例如，作為PCR反應(yīng)液的引物，只要是含有本實施方式的PCR用引物對的引物，則對于其他的成分，可以進行適當變更，例如使用與上述實施方式和實施例不同的物質(zhì)等。此夕卜，也可以將本實施方式的引物的設(shè)計方法適用于以擴增其他菌的基因組DNA為目的的引物設(shè)計。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明適合利用于如下情況等同時且特異性地在短時間內(nèi)檢查在食品或制造環(huán)境等中是否存在蠟樣芽孢桿菌、彎曲菌、大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌。
權(quán)利要求
1.ー種PCR用引物對，其用于通過PCR法來擴增核酸，其特征在于，由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對混合而成，所述引物對包括 第一引物對具備用于擴增臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號I所不的喊基序列組成的引物和由序列編號2所不的喊基序列組成的引物； 第二引物對具備用于擴增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號3所不的喊基序列組成的引物和由序列編號4所不的喊基序列組成的引物； 第三引物對具備用于擴增彎曲菌(Campylobacter屬)的DNA的、由序列編號5所示的喊基序列組成的引物和由序列編號6所不的喊基序列組成的引物； 第四引物對具備用于擴增大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列編號7所不的喊基序列組成的引物和由序列編號8所不的喊基序列組成的引物； 第五引物對具備用于擴增李斯特菌(Listeria屬)的DNA的、由序列編號9所示的堿基序列組成的引物和由序列編號10所不的喊基序列組成的引物； 第六引物對具備用于擴增沙門氏菌(Salmonella屬)的DNA的、由序列編號11所不的喊基序列組成的引物和由序列編號12所不的喊基序列組成的引物； 第七引物對具備用于擴增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列編號13所不的喊基序列組成的引物和由序列編號14所不的喊基序列組成的引物；以及第八引物對具備用于擴增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列編號15所不的喊基序列組成的引物和由序列編號16所不的喊基序列組成的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PCR用引物對，其特征在干， 所述引物對是將所述第一至第八的所有的引物對混合而成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的PCR用引物對，其特征在干， 所述第一至第八引物對中的引物為以下的(A)或(B) (A)在序列編號I 16所示的堿基序列中I個或幾個堿基被缺失、置換或增加而成的引物、 (B)由能夠在嚴格條件下與如下核酸片段雜交的核酸片段組成的引物，所述核酸片段由與序列編號I 16所示的堿基序列互補的堿基序列組成。
4.ー種PCR用引物對，其特征在于， 由具有與權(quán)利要求I 3中任一項所述的PCR用引物對互補的堿基序列的引物組成。
5.ー種PCR用引物對，其用于通過PCR法來擴增核酸，其特征在于，由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對混合而成，所述引物對包括 以蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的不顯示溶血活性的腸毒素分泌基因nhe為擴增對象區(qū)域的引物對、 以蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組DNA中所包含的嘔吐毒素合成酶基因cesB為擴增對象區(qū)域的引物對、 以彎曲菌(Campylobacter屬)的基因組DNA中所包含的核糖體基因16S rDNA為擴增對象區(qū)域的引物對、 以大腸桿菌(Escherichia coli)的基因組DNA中所包含的尿苷單磷酸激酶基因pyrH為擴增對象區(qū)域的引物對、 以李斯特菌(Listeria屬)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因dnaj為擴增對象區(qū)域的引物對、 以沙門氏菌(Salmonella屬)的基因組DNA中所包含的侵襲性因子相關(guān)基因invA為擴增對象區(qū)域的引物對、 以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因組DNA中所包含的熱休克蛋白基因dnaj為擴增對象區(qū)域的引物對、以及 以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因組DNA中所包含的耐熱性溶血毒素基因tdh為擴增對象區(qū)域的引物對。
6.ー種PCR用反應(yīng)液，其特征在于，含有權(quán)利要求I 5中任一項所述的PCR用引物對。
7.ー種食物中毒菌的檢測方法，其特征在于，使用由如下引物對組成的組中的兩個以上的引物對，在利用PCR法的擴增對象的試樣中包含對應(yīng)于這些引物對的ー個或兩個以上的食物中毒菌的核酸時，特異性地擴增該核酸，并基于所得到的擴增產(chǎn)物，檢測出食物中毒菌，所述引物對包括 第一引物對具備用于擴增臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號I所不的喊基序列組成的引物和由序列編號2所不的喊基序列組成的引物； 第二引物對具備用于擴增蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列編號3所不的喊基序列組成的引物和由序列編號4所不的喊基序列組成的引物； 第三引物對具備用于擴增彎曲菌(Campylobacter屬)的DNA的、由序列編號5所示的喊基序列組成的引物和由序列編號6所不的喊基序列組成的引物； 第四引物對具備用于擴增大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列編號7所不的喊基序列組成的引物和由序列編號8所不的喊基序列組成的引物； 第五引物對具備用于擴增李斯特菌(Listeria屬)的DNA的、由序列編號9所示的堿基序列組成的引物和由序列編號10所不的喊基序列組成的引物； 第六引物對具備用于擴增沙門氏菌(Salmonella屬)的DNA的、由序列編號11所不的喊基序列組成的引物和由序列編號12所不的喊基序列組成的引物； 第七引物對具備用于擴增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列編號13所不的喊基序列組成的引物和由序列編號14所不的喊基序列組成的引物；以及第八引物對具備用于擴增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列編號15所不的喊基序列組成的引物和由序列編號16所不的喊基序列組成的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的食物中毒菌的檢測方法，其特征在于， 使用所述第一至第八的所有的引物對，在利用PCR法的擴增對象的試樣中包含對應(yīng)于這些弓I物對的ー個或兩個以上的食物中毒菌的核酸時，特異性地擴增該核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的食物中毒菌的檢測方法，其特征在于， 所述第一至第八引物對中的引物為以下的(A)或(B) (A)在序列編號I 16所示的堿基序列中I個或幾個堿基被缺失、置換或增加而成的引物、 (B)由能夠在嚴格條件下與如下核酸片段雜交的核酸片段組成的引物，所述核酸片段由與序列編號I 16所示的堿基序列互補的堿基序列組成。
10.ー種食物中毒菌的檢測方法，其特征在于，使用由具有與權(quán)利要求7 9中任一項所述的食物中毒菌的檢測方法中所用的引物對互補的堿基序列的引物組成的引物對，在利用PCR法的擴增對象的試樣中包含對應(yīng)于這些弓I物對的ー個或兩個以上的食物中毒菌的核酸時，特異性地擴增該核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求7 10中任一項所述的食物中毒菌的檢測方法，其特征在于，將所述擴增產(chǎn)物進行電泳，同時檢測ー種或兩種以上的食物中毒菌。
全文摘要
一種PCR用引物對，其特異性擴增蠟樣芽孢桿菌、彎曲菌、大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌中的兩種以上的食物中毒菌的核酸。由此，可以同時且特異性地檢測出這些食物中毒菌。使用由如下引物對之中的兩個以上的引物對組成的PCR用引物對，利用PCR法，對食物中毒菌的核酸進行特異性擴增，所述引物對包括用于蠟樣芽孢桿菌檢測的序列編號1和2、序列編號3和4的引物對；用于彎曲菌檢測的序列編號5和6的引物對；用于大腸桿菌檢測的序列編號7和8的引物；用于李斯特菌檢測的序列編號9和10的引物對、用于沙門氏菌檢測的序列編號11和12的引物對；用于金黃色葡萄球菌檢測的序列編號13和14的引物對；用于副溶血弧菌檢測的序列編號15和16的引物對。
文檔編號C12Q1/68GK102844433SQ20118001855
公開日2012年12月26日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者山崎隆明, 原田天章, 猿渡由寬, 龜井修一 申請人:東洋制罐株式會社, 東洋鋼鈑株式會社