專利名稱：：將單鏈蛋白質(zhì)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成它們的雙鏈形式的方法將單鏈蛋白質(zhì)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成它們的雙鏈形式的方法本專利申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2010年I月25日提交的美國臨時專利申請系列第61/286，963號的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時專利申請通過引用整體并入本文。梭菌毒素例如肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(TeNT)抑制神經(jīng)元傳遞(neuronaltransmission)的能力正被開發(fā)利用于各種治療性和美容性應(yīng)用，參見，例如，WilliamJ-Lipham,Cosmetic勵ClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack，Inc.,2004)。作為藥物組合物商購可得的梭菌毒素包括BoNT/A制劑,例如BOTOXrI(Allergan,Inc.，Irvine,CA)、DYSPORTifcZRELOXiNft(BeaufourIpsen,PortonDown,England)、NEURONOX".)Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)>BTX-A(LanzhouInstituteBiologicalProducts,China)和X—EOMIN*MerzPharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)；和BoNT/B制劑，例如MY0BL0CTM/NEUR0BL0CTM(ElanPharmaceuticals,SanFrancisco,CA)。例如，botgx'k目前在一個或多個國家被批準(zhǔn)用于下列適應(yīng)征失弛緩癥，成人痙攣狀態(tài)(adultspasticity)、肛裂、背痛、眼瞼痙攣、夜磨牙癥、頸肌張力障礙、特發(fā)性震顫、眉間紋或面部動力性皺紋(hyperkineticfacialline)、頭痛、半面疫攣、膀胱機能允進(hyperactivityofbladder)、多汗癥、兒童腦性癱瘓(juvenilecerebralpalsy)、多發(fā)性硬化、肌陣攣病癥(myoclonicdisorder)、鼻唇紋(nasallabialline)、疫攣性發(fā)音困難(spasmodicdysphonia)、斜視和第七神經(jīng)障礙(VIInervedisorder)。梭菌毒素的治療性功用，除了它們目前松弛肌肉的應(yīng)用外，已被擴展至治療基于感覺神經(jīng)的疾病例如各種慢性疼痛、神經(jīng)源性炎癥和泌尿生殖系統(tǒng)病癥以及基于非神經(jīng)元的病癥例如胰腺炎。目前正被開發(fā)以擴展基于梭菌毒素的治療的一個方法包括修飾梭菌毒素以便經(jīng)修飾的毒素具有針對非-梭菌毒素靶細胞改變細胞靶向的能力。該重新靶向的(re-targeted)能力通過用顯示對存在于非-梭菌毒素靶細胞中的非_梭菌毒素受體的選擇性結(jié)合活性的靶向結(jié)構(gòu)域替代梭菌毒素的天然存在的靶向結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)。對靶向結(jié)構(gòu)域的此類修飾導(dǎo)致能夠選擇性結(jié)合存在于非-梭菌毒素靶細胞上的非-梭菌毒素受體(靶受體)(重新靶向的)的經(jīng)修飾的毒素。具有針對非-梭菌毒素靶細胞的靶向活性的重新靶向的梭菌毒素可結(jié)合非-梭菌毒素靶細胞上的受體，轉(zhuǎn)位至細胞質(zhì)中，以及對非-梭菌毒素靶細胞的SNARE復(fù)合物施加其蛋白水解作用。具有針對非-梭菌毒素靶細胞的靶向活性的重新靶向的梭菌毒素的非限定性實例描述于例如KeithA.Foster等人，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國專利5，989，545;CliffordC.Shone等人，RecombinantToxinFragments,美國專利6,461,617；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain,美國專利6,500,436；ConradP.Quinn等人,MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion,美國專利6，632，440；LanceE.Steward等人,MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis,美國專利6，843，998;J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利7,419,676；LanceE.Steward等人，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美國專利7，514，088;KeithA.Foster等人，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells,美國專利公布2003/0180289;和KeithA.Foster等人，Re-targetedToxinConjugates,國際專利公布W02005/023309。重新靶向的與梭菌毒素相關(guān)的治療作用的能力已極大地擴展能夠使用梭菌毒素療法的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的數(shù)目。作為非限定性實例，重新靶向感覺神經(jīng)元的經(jīng)修飾的梭菌毒素在治療各種類型的慢性疼痛例如痛覺過敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛和炎癥疼痛中是有用的，參見，例如，F(xiàn)oster,同上，(1999);和Donovan,同上，(2002);以及StephanDonovan,MethodForTreatingNeurogenicInflammationPainwithBotulinumToxinandSubstancePComponents，美國專利7，022，329。作為另一個非限定性實例，重新靶向的胰腺細胞的經(jīng)修飾的梭菌毒素在治療胰腺炎中是有用的，參見，例如，Steward,同上，(2005)。梭菌毒素，無論是天然存在的還是經(jīng)修飾的，都被加工成雙鏈形式以獲得完全活性。天然存在的梭菌毒素各自被翻譯為約150kDa的單鏈多肽，所述單鏈多肽隨后在二硫環(huán)內(nèi)被天然存在的蛋白酶蛋白水解而裂解(圖I)。該裂解在形成二硫橋的兩個半胱氨酸殘基之間產(chǎn)生的不連續(xù)雙鏈環(huán)區(qū)域中發(fā)生。該翻譯后加工產(chǎn)生包含約50kDa的輕鏈(LC)(其包含酶促結(jié)構(gòu)域)和約IOOkDa的重鏈(HC)(其包含轉(zhuǎn)位和細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的雙鏈分子，LC和HC通過單個二硫鍵和非共價相互作用保持在一起(圖I)。重組產(chǎn)生的梭菌毒素通常用外源蛋白酶裂解位點替代天然存在的雙鏈環(huán)蛋白酶裂解位點(圖2)。參見，例如，Dolly，J.0.等人，ActivatableClostridialToxin,美國專利7，419，676,其通過引用將其并入本文。雖然重新靶向的梭菌毒素由于靶向部分的大小而在其總體分子量上發(fā)生變化，但活化過程及其對外源裂解位點的依賴性與重組產(chǎn)生的梭菌毒素的活化過程及其對外源裂解位點的依賴性基本上相同。參見,例如，Steward,L.E.等人，ActivatableClostridialToxin,美國專利公布2009/0005313;Steward,L.Ε·等人，ModifiedClostridialToxinwithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美國專利申請11/776，075;Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinwithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells,美國專利公布2008/0241881，將所述每個專利通過弓I用并入本文。迄今為止，重組產(chǎn)生的梭菌毒素或經(jīng)修飾的梭菌毒素的單鏈形式至其雙鏈形式的轉(zhuǎn)化需要體外活化過程。首先，用于重組產(chǎn)生此類毒素的細菌細胞缺乏存在于產(chǎn)生天然毒素的梭菌屬(Clostridial)菌株中的天然存在的蛋白酶。其次，出于在處理活化毒素中產(chǎn)生的安全顧慮，不存在對重組產(chǎn)生活化毒素的細菌細胞的大量需要。參見，例如，Dolly,U.S.7，419，676，同上，(2008)。然而，如果這些顧慮可被克服，則重組產(chǎn)生的活化毒素的產(chǎn)生可使重組產(chǎn)生的梭菌毒素或經(jīng)修飾的梭菌毒素的制備過程簡化。例如，目前重組產(chǎn)生的梭菌毒素或經(jīng)修飾的梭菌毒素的制備包括下列純化步驟I)固定金屬親和層析，2)緩沖液交換透析，3)蛋白酶裂解反應(yīng)，4)離子交換層析和5)PEG的添加以及快速冷凍以在-80°C下貯存?？杉毎麅?nèi)蛋白水解裂解重組梭菌毒素同時其仍然表達毒素的細菌細胞的使用將純化步驟的數(shù)目減少至下列步驟1)固定金屬親和層析，2)緩沖液交換透析，3)離子交換層析，和4)PEG的添加以及快速冷凍以在_80°C下貯存。本說明書公開了將包含雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的方法，所述方法不依賴于用于將毒素的單鏈形式轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的體外加工。這可通過使用表達蛋白質(zhì)和將其轉(zhuǎn)化成活性雙鏈所必需的蛋白酶的細胞來實現(xiàn)。因此，本說明書的方面提供了雙重表達構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括編碼包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框和編碼可蛋白水解裂解位于雙鏈環(huán)區(qū)域中的外源蛋白酶裂解位點的蛋白酶的開放閱讀框。在其它方面，包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的經(jīng)修飾的梭菌毒素或包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)。多核苷酸以及它們編碼的包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的梭菌毒素描述于例如Dolly，J.O.等人，ActivatableClostridialToxin,美國專利7，132，259;Dolly,J.O.等人，ActivatableClostridialToxin，美國專利7，419，676(將所述每個專利通過引用整體并入本文)中。多核苷酸以及它們編碼的包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)描述于例如Steward,L.E.等人，MultivalentClostridialToxin,美國專利公布2009/0048431；Steward,L.E.等人，ActivatableClostridalToxin,美國專利公布2009/0069238；Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinwithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美國專利申請11/776,075；Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinwithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells,美國專利公布2008/0241881;Foster,Κ.A.等人，F(xiàn)usionProteins,美國專利公布2009/0035822;Foster,Κ·A.等人，Non-CytotoxicProteinConjugates,美國專利公布2009/0162341;Steward,L.E.等人，ActivatableClostridialToxin,美國專利公布2008/0032931;Foster,Κ·A.等人，Non-CytotoxicProteinConjugates,美國專利公布2008/0187960;Steward,L.E.等人，DegradableClostridialToxin,美國專利公布2008/0213830;Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinWithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForClostridialToxinTargetCells,美國專利公布2008/0241881;Dolly,J.0.等人，ActivatableClostridialToxin,美國專利7,419,676；和同伴專利申請Ghanshani等人，ModifiedClostridialToxinComprisinganIntegratedProteaseCleavageSite-BindingDomain,AttorneyDocketNo.18468PR0V(BOT)(將所述每個專利通過引用整體并入本文)中。本說明書的其它方面提供了包含雙重表達構(gòu)建體的細胞，所述構(gòu)建體包括編碼包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框和編碼可蛋白水解裂解位于雙鏈環(huán)區(qū)域中的外源蛋白酶裂解位點的蛋白酶的開放閱讀框。在其它方面，包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的經(jīng)修飾的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含本說明書中公開的外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在第一溫度下生長一定的時間段以達到最大細胞密度，所述雙重表達構(gòu)建體包含；i)編碼包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框；和ii)編碼蛋白酶的開放閱讀框；其中所述蛋白酶可裂解位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點；b)將細胞在第二溫度下生長一定的時間段以達到從編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框進行蛋白質(zhì)表達的最大誘導(dǎo)，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和蛋白酶從雙重表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的蛋白酶在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈梭菌毒素轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在37°C下生長約2至約3.5小時，所述雙重表達構(gòu)建體包含；i)編碼單鏈梭菌毒素的開放閱讀框，所述單鏈梭菌毒素包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；和ii)編碼蛋白酶的開放閱讀框，其中所述蛋白酶可裂解位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點；b)將細胞在22°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈梭菌毒素和蛋白酶從雙重表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的蛋白酶在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點上裂解單鏈梭菌毒素，從而將單鏈梭菌毒素轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本發(fā)說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在37°C下生長約2至約8個小時，所述雙重表達構(gòu)建體包含；i)編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和ii)編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框；b)將細胞在約12至約16°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶從雙重表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位點阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在37°C下生長約2至約8小時，所述雙重表達構(gòu)建體包含；i)編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和ii)編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框山)將細胞在約20至約24°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶從雙重表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位點阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在37°C下生長約2至約8小時，所述雙重表達構(gòu)建體包含；i)編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；和ii)編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框；b)將細胞在約12至約16°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶從雙重表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在37°C下生長約2至約8小時，所述雙重表達構(gòu)建體包含；i)編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域jPii)編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框；b)將細胞在約20至約24°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶從雙重表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了表達構(gòu)建體，所述表達構(gòu)建體包含編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述單鏈蛋白質(zhì)包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在其它方面，包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的經(jīng)修飾的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包含本說明書中公開的外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)。本說明書的其它方面提供了表達構(gòu)建體，所述表達構(gòu)建體包含編碼蛋白酶的開放閱讀框，所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)的雙鏈環(huán)區(qū)域中的外源蛋白酶裂解位點。本說明書的其它方面提供了細胞，所述細胞包含含有編碼單鏈蛋白質(zhì)(所述單鏈蛋白質(zhì)包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域)的開放閱讀框的表達構(gòu)建體和含有編碼蛋白酶(所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)的雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點)的開放閱讀框的另一個表達構(gòu)建體。在其它方面，包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)可以是例如包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的梭菌毒素、包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的經(jīng)修飾的梭菌毒素、或包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包含本說明書中公開的外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)生長細胞，所述細胞包含i)含有編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框的表達構(gòu)建體，所述單鏈蛋白質(zhì)包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；和ii)含有編碼蛋白酶的開放閱讀框的另一個表達構(gòu)建體；所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)的雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點；b)將細胞在第二溫度下生長一定的時間段以達到從編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框進行蛋白質(zhì)表達的最大誘導(dǎo)，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和蛋白酶從表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的蛋白酶在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈梭菌毒素轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將細胞在37°C下生長約2至約3.5小時，所述細胞包含i)含有編碼單鏈梭菌毒素的開放閱讀框的表達構(gòu)建體，所述單鏈梭菌毒素包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域和ii)含有編碼蛋白酶的開放閱讀框的另一個表達構(gòu)建體，所述蛋白酶可蛋白水解裂解位于包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈蛋白質(zhì)的雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點山)將細胞在22°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈梭菌毒素和蛋白酶從表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的蛋白酶在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點上裂解單鏈梭菌毒素，從而將單鏈梭菌毒素轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將細胞在37°C下生長約2至約8小時，所述細胞包含i)含有編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框的表達構(gòu)建體，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域以及整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和ii)含有編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框的另一個表達構(gòu)建體山)將細胞在約12至約16°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶從表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位點阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將細胞在37°C下生長約2至約8小時，所述細胞包含i)含有編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框的表達構(gòu)建體，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域以及整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和ii)含有編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框的另一個表達構(gòu)建體山)將細胞在約20至約24°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶從表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位點阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將細胞在37°C下生長約2至約8小時，所述細胞包含i)含有編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框的表達構(gòu)建體，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域，和ii)含有編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框的另一個表達構(gòu)建體山)將細胞在約12至約16°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶從表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位點阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。本說明書的其它方面提供了將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將細胞在37°C下生長約2至約8小時，所述細胞包含i)含有編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框的表達構(gòu)建體，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域，和ii)含有編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框的另一個表達構(gòu)建體山)將細胞在約20至約24°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)單鏈蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶從表達構(gòu)建體表達；并且其中所產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于整合的TEV裂解位點阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解單鏈蛋白質(zhì)，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。附圖簡述圖I顯示天然存在的梭菌毒素的結(jié)構(gòu)域組織。單鏈形式描述了包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和H。結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基至羧基的線性組織。位于轉(zhuǎn)位與酶促結(jié)構(gòu)域之間的雙鏈環(huán)區(qū)域通過雙SS托架(doubleSSbracket)來描述。該區(qū)域包含內(nèi)源雙鏈環(huán)蛋白酶裂解位點，所述裂解位點在用天然存在的蛋白酶例如內(nèi)源梭菌毒素蛋白酶或環(huán)境中產(chǎn)生的天然存在的蛋白酶蛋白水解裂解后，將毒素的單鏈形式轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。圖2顯示中樞和周圍神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和梭菌毒素中毒的目前范例的示意圖。圖2A顯示中樞和周圍神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)釋放機制的示意圖。釋放過程可被描述為包括兩個步驟1)囊泡停靠(vesicledocking),其中包含神經(jīng)遞質(zhì)分子的囊泡的囊泡結(jié)合的SNARE蛋白與位于質(zhì)膜的膜結(jié)合SNARE蛋白結(jié)合；和2)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，其中囊泡與質(zhì)膜融合并且神經(jīng)遞質(zhì)分子被胞吐。圖2B顯示中樞和周圍神經(jīng)元的破傷風(fēng)和肉毒毒素活性的中毒機制的示意圖。該中毒過程可被描述為包括4個步驟1)受體結(jié)合，其中梭菌毒素結(jié)合梭菌受體系統(tǒng)并且起始中毒過程；2)復(fù)合物內(nèi)化，其中在毒素結(jié)合后，包含毒素/受體系統(tǒng)復(fù)合物的囊泡被胞吞入細胞；3)輕鏈轉(zhuǎn)位，其中據(jù)認為發(fā)生多個事件，包括例如囊泡的內(nèi)部pH的改變,包含梭菌毒素重鏈的Hn結(jié)構(gòu)域的通道孔的形成,梭菌毒素輕鏈與重鏈的分離，以及活性輕鏈的釋放，和4)酶促靶修飾，其中梭菌毒素的活性輕鏈蛋白水解裂解其靶SNARE底物例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白，從而阻止囊泡的?？亢蜕窠?jīng)遞質(zhì)的釋放。由肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)產(chǎn)生的梭菌毒素被最廣泛地用于人和其它動物的治療性治療和美容治療。肉毒梭菌的菌株產(chǎn)生7個在抗原性上不同的類型的肉毒毒素(BoNT)，其已通過調(diào)查人(BoNT/A，/B，/E和/F)、動物(BoNT/Cl和/D)的肉毒中毒暴發(fā)被鑒定或從土壤分離(BoNT/G)。BoNT彼此具有約35%的氨基酸同一性并且共有相同的功能結(jié)構(gòu)域組織和總體結(jié)構(gòu)構(gòu)造。本領(lǐng)域技術(shù)人員承認在每一種類型的梭菌毒素內(nèi)，可存在在它們的氨基酸序列上以及也在編碼此類蛋白質(zhì)的核酸上少許不同的亞型。例如，目前存在4個BoNT/A亞型BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3和BoNT/A4，當(dāng)與另一個BoNT/A亞型相比較時特定亞型顯示約89%的氨基酸同一性。雖然所有7個BoNT血清型具有相似的結(jié)構(gòu)和藥理性質(zhì)，但每一個血清型也顯示異質(zhì)的細菌學(xué)特征。相反地，破傷風(fēng)毒素(TeNT)由均一組的破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生。兩個其它梭菌屬種類巴氏梭菌和酪酸梭菌產(chǎn)生毒素BaNT和BuNT，所述毒素分別與BoNT/F和BoNT/E相似。每一個成熟雙鏈分子包含3個功能上不同的結(jié)構(gòu)域1)位于LC中的酶促結(jié)構(gòu)域，其包括包含特異性祀向神經(jīng)遞質(zhì)釋放裝置(neurotransmitterreleaseapparatus)的核心組分的鋅依賴性內(nèi)肽酶活性的金屬蛋白酶區(qū)域；2)HC的氨基末端半部分內(nèi)包含的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(Hn)，其幫助LC從細胞內(nèi)囊泡至靶細胞的細胞質(zhì)中的釋放；和3)HC的羧基末端半部分內(nèi)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(H。)，其決定毒素對位于靶細胞的表面上的受體復(fù)合物的結(jié)合活性和結(jié)合特異性。Hc結(jié)構(gòu)域包含兩個具有大致相同尺寸的不同結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征顯示功能并且被命名為Hcm和H。。亞結(jié)構(gòu)域(subdomain)。表I提供了在示例性梭菌毒素中發(fā)現(xiàn)的每一個結(jié)構(gòu)域的大致邊界區(qū)域。表I.梭菌毒素的參照序列和區(qū)域這3個功能結(jié)構(gòu)域的結(jié)合、轉(zhuǎn)位和酶促活性全都是毒性所必需的。雖然該方法的所有細節(jié)尚未確知，但無論血清型或亞型如何，梭菌毒素籍以進入神經(jīng)元并且抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的總體細胞中毒機制是相似的。雖然申請者不希望受到下列描述的限制，但中毒機制可被描述為包括至少4個步驟1)受體結(jié)合，2)復(fù)合物內(nèi)化，3)輕鏈轉(zhuǎn)位，和4)酶促靶修飾(圖3)。當(dāng)梭菌毒素的Hc結(jié)構(gòu)域結(jié)合位于靶細胞的質(zhì)膜表面上的毒素特異性受體系統(tǒng)時，該過程被起始。受體復(fù)合物的結(jié)合特異性據(jù)認為部分地通過似乎明顯地包含每種梭菌毒素受體復(fù)合物的神經(jīng)節(jié)苷脂和蛋白質(zhì)受體的特定組合來實現(xiàn)。一旦結(jié)合，毒素/受體復(fù)合物通過胞吞作用被內(nèi)化并且內(nèi)化的囊泡被分選至特定的細胞內(nèi)途徑。轉(zhuǎn)位步驟似乎通過囊泡區(qū)室的酸化觸發(fā)。該過程似乎起始兩個重要的PH-依賴性結(jié)構(gòu)重排，所述結(jié)構(gòu)重排增加疏水性和促進毒素的雙鏈形式的形成。一旦被激活，毒素的輕鏈內(nèi)肽酶從細胞內(nèi)囊泡釋放至細胞溶膠，在細胞溶膠中其似乎特異性靶向神經(jīng)遞質(zhì)釋放裝置的3個已知核心組分之一。此類核心蛋白、囊泡關(guān)聯(lián)膜蛋白(vesicle-associatedmembraneprotein)(VAMP)/突觸囊泡蛋白、25kDa的突觸小體相關(guān)蛋白(synaptosomal-associatedprotein)(SNAP-25)和突觸融合蛋白是在可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著型的蛋白受體(^lubleN-ethylmaleimide-sensitivefactor-互ttachmentprotein-receptor)(SNARE)家族的神經(jīng)末梢和組成成員上突觸囊泡?？亢腿诤纤匦璧摹oNT/A和BoNT/E裂解羧基末端區(qū)域中的SNAP-25，從而分別釋放9或26個氨基酸的區(qū)段，BoNT/Cl還在羧基端附近裂解SNAP-25。肉毒菌素血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破傷風(fēng)毒素作用于VAMP的保守中心部分，將VAMP的氨基末端部分釋放至細胞溶膠中。BoNT/Cl在細胞溶膠膜表面附近的單個位點上裂解突觸融合蛋白。突觸SNARE的選擇性蛋白水解負責(zé)由梭菌毒素引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放的體內(nèi)阻斷。梭菌毒素的SNARE蛋白靶對于多種非神經(jīng)元類型的胞吐是共同的；在這些細胞中，如在神經(jīng)元中，輕鏈肽酶活性抑制胞吐，參見，例如，YannHumeau等人，HowBotulinumandTetanusNeurotoxinsBlockNeurotransmitterRelease,82(5)Biochimie.427-446(2000)；KathrynTurton等人,BotulinumandTetanusNeurotoxinsStructure,FunctionandTherapeuticUtility,27(11)TrendsBiochem.Sci.552-558.(2002)；GiovannaLalli等人，TheJourneyofTetanusandTetanusNeurotoxinsinNeurons,11(9)TrendsMicrobiol.431-437,(2003)。在本發(fā)明的方面，經(jīng)修飾的梭菌毒素部分地包含單鏈經(jīng)修飾的梭菌毒素和雙鏈經(jīng)修飾的梭菌毒素。如上文中所述，梭菌毒素，無論是天然存在的還是非天然存在的，最初都合成為單鏈多肽。該單鏈形式隨后在位于不連續(xù)雙鏈環(huán)區(qū)域(形成二硫橋的兩個半胱氨酸殘基之間產(chǎn)生的)內(nèi)的蛋白酶裂解位點上被蛋白酶裂解。該翻譯后加工產(chǎn)生包含輕鏈(LC)和重鏈的雙鏈分子。如本文中所用的，術(shù)語“雙鏈環(huán)區(qū)域”是指通過位于LC結(jié)構(gòu)域與HC結(jié)構(gòu)域之間的二硫橋形成的天然存在的或非天然存在的梭菌毒素的環(huán)區(qū)域。如本文中所用，術(shù)語“單鏈修飾的梭菌毒素”是指本說明書中公開的任何經(jīng)修飾的梭菌毒素，其以其單鏈形式存在，即，所述毒素在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的蛋白酶裂解位點上未被其關(guān)聯(lián)蛋白酶裂解。如本文中所用，術(shù)語“雙鏈經(jīng)修飾的梭菌毒素”是指本說明書中公開的任何經(jīng)修飾的梭菌毒素，其以其雙鏈形式形式存在，即，毒素已在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的蛋白酶裂解位點上被其關(guān)聯(lián)蛋白酶裂解。本發(fā)明的方面部分地提供了多核苷酸分子。如本文中所用，術(shù)語“多核苷酸分子”與“核酸分子”同義并且意指具有任何長度的核苷酸例如核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的多聚體形式。有用的多核苷酸分子包括但不限于天然存在的和非天然存在的DNA分子以及天然存在和非天然存在的RNA分子。天然存在的和非天然存在的DNA分子的非限定性實例包括單鏈DNA分子、雙鏈DNA分子、基因組DNA分子、cDNA分子、載體構(gòu)建體，例如質(zhì)粒構(gòu)建體、噬菌粒構(gòu)建體、噬菌體構(gòu)建體、逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體和人工染色體構(gòu)建體。天然存在和非天然存在的RNA分子的非限定性實例包括單鏈RNA、雙鏈RNA和mRNA。對于制備編碼本說明書中公開的經(jīng)修飾的梭菌毒素的多核苷酸分子可以是必需的已確立的分子生物學(xué)技術(shù)包括但不限于牽涉聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增、限制性酶反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳、核酸連接、細菌轉(zhuǎn)化、核酸純化、核酸測序的方法，基于重組的技術(shù)是常規(guī)的并且完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)以及來自本文中的教導(dǎo)。制備編碼經(jīng)修飾的梭菌毒素的多核苷酸分子所必需的具體方案的非限定性實例描述于例如M^uukCloningALaboratoryManual,問上，(2001)；^PCueeentProtocolsinMqlecularBiqlqgy(FrederickM.Ausubel等人編，JohnWiley&Sons,2004)。此外,用于制備編碼經(jīng)修飾的梭菌毒素的多核苷酸分子的多種商購可得的制品是廣泛可獲得的。此類方案是完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的常規(guī)方法并且來自本文中的教導(dǎo)。本說明書中公開的方法部分地包括開放閱讀框。如本文中所用，術(shù)語“開放閱讀框”與“0RF”同義并且意指編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分的任何多核苷酸。開放閱讀框通常始于起始密碼子(以標(biāo)準(zhǔn)密碼子表示為例如AUG(對于RNA分子)和ATG(在DNA分子中))并且以密碼子-三聯(lián)體閱讀直至框架以終止密碼子(以標(biāo)準(zhǔn)密碼子表示為例如UAA、UGA或UAG(對于RNA分子)和TAA、TGA或TAG(在DNA分子中))終止。如本文中所用，術(shù)語“密碼子”意指在蛋白質(zhì)合成過程中指定特定氨基酸的多核苷酸分子中的3個核苷酸的序列；也稱為三聯(lián)體或密碼子-三聯(lián)體。本說明書中公開的方法部分地包括表達構(gòu)建體。表達構(gòu)建體包含多核苷酸分子，所述多核苷酸包括本說明書中公開的可操作地連接于用于在細胞或無細胞提取物中表達所述多核苷酸分子的表達載體的開放閱讀框。多種表達載體可用于表達本說明書中公開的多核苷酸分子，包括但不限于病毒表達載體；原核表達載體；真核表達載體例如酵母表達載體、昆蟲表達載體和哺乳動物表達載體；以及無細胞(體外)表達載體。還應(yīng)理解，用于實施此類方法的方面的表達載體可包括在組成型、組織特異性、細胞特異性或誘導(dǎo)型啟動子元件、增強子元件或兩者的控制下表達多核苷酸分子的那些表達載體。表達載體以及用于從此類表達載體制備和使用表達構(gòu)建體的已確立的試劑和條件的非限定性實例可容易地從提供商獲得，包括但不限于BDBiosciences-Clontech,PaloAlto,CA；BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA；Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA;EMDBiosciences_Novagen,Madison,WI；QIAGEN,Inc.，Valencia,CA;和Stratagene,LaJolla,CA。適當(dāng)?shù)谋磉_載體的選擇、制備和使用是完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的常規(guī)方法以及來自本文中的教導(dǎo)。本說明書中公開的表達構(gòu)建體可包含編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述蛋白質(zhì)包括含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域，其中外源蛋白酶裂解位點的裂解將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為其雙鏈形式。在本實施方案的方面，病毒表達載體可操作地連接于編碼包含位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子；原核表達載體可操作地連接于編碼包含位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子；酵母表達載體可操作地連接于編碼包含位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子；昆蟲表達載體可操作地連接于編碼包含位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子；以及哺乳動物表達載體可操作地連接于編碼包含位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子。在本實施方案的其它方面，適用于表達本說明書中公開的多核苷酸分子的表達構(gòu)建體可使用無細胞提取物來表達。在本實施方案的方面，無細胞表達載體可操作地連接于編碼包含位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子。在一個實施方案中，本說明中公開的表達構(gòu)建體包含編碼梭菌毒素的開放閱讀框，所述梭菌毒素包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的方面，本說明書中公開的表達構(gòu)建體可包含編碼梭菌毒素的開放閱讀框，所述梭菌毒素包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的方面，單鏈梭菌毒素包含如下的線性氨基-至-羧基順序I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域、梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；3)梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域和梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域；4)梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域，包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域和梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；5)梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域、梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或6)梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域、梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼1)ΒοΝΤ/Α毒素酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/A轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/A結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)BoNT/B酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/B轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/B結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)BoNT/Cl酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)BoNT/D酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/D轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/D結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；5)BoNT/E酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/E轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/E結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；6)BoNT/F酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/F轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/F結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；7)BoNT/G酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/G轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/G結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；8)TeNT酶促結(jié)構(gòu)域、TeNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TeNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；9)BaNT酶促結(jié)構(gòu)域、BaNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BaNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；10)BuNT酶促結(jié)構(gòu)域、BuNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BuNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼1)ΒοΝΤ/Α毒素酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/A轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/A結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)BoNT/B酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/B轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/B結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)BoNT/Cl酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)BoNT/D酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/D轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/D結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；5)BoNT/E酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/E轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/E結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；6)BoNT/F酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/F轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/F結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；7)BoNT/G酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/G轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/G結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；8)TeNT酶促結(jié)構(gòu)域、TeNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TeNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；9)BaNT酶促結(jié)構(gòu)域、BaNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BaNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；10)BuNT酶促結(jié)構(gòu)域、BuNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BuNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。此類包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的梭菌毒素的實例描述于例如J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利7，132,529；J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利7，419,676；LanceSteward等人，Leucine-BasedMotifsandClostridialNeurotoxins,美國專利6，903,187；LanceSteward等人，Leucine-BasedMotifsandClostridialNeurotoxins,美國專利7,393,925；ffei-JenLin等人，NeurotoxinswithEnhancedTargetSpecificity,美國專利7，273,722；LanceSteward等人，ModifiedBotulinumNeurotoxins,美國專利7,491,799；LanceE.Steward等人，OptimizedExpressionofActiveBotulinumToxinTypeE,美國專利公布2008/0138893;EsterFernandez-Salas等人，OptimizedExpressionofActiveBotulinumToxinTypeA,美國專利公布2008/0057575中；將所述每個專利通過引用整體并入本文。在另一個實施方案中，本說明書中公開的表達構(gòu)建體可包含編碼包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)的開放閱讀框。在本實施方案的方面，單鏈蛋白質(zhì)包含如下的線性氨基-至-羧基順序1)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；3)非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域和梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域；4)非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域和梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；5)梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域、梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或6)梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、腦啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、牛腎上腺髓質(zhì)_22(BAM22)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、內(nèi)嗎啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、內(nèi)啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、強啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；6)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、痛敏肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；7)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、血衍嗎啡素(hemorphin)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或8)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、強啡肽B(Hmorphin)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、黑皮質(zhì)素肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、促黑素細胞激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、促腎上腺皮質(zhì)激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、促脂解素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、甘丙肽肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框架，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、甘丙肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、甘丙肽信息相關(guān)肽(GMAP)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、鳥尿素肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、嗜鉻粒蛋白A結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、嗜鉻粒蛋白B結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、嗜鉻粒蛋白C結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、速激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、P物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)肽K結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)肽Y結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)激肽A結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、血紅素激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或6)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、endokinin結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)肽Y相關(guān)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)肽Y(NPY)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、肽YY(PYY)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、胰腺肽(PP)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、胰腺二十肽(PIP)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)激素肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、促皮質(zhì)素-釋放激素(CCRH)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、甲狀旁腺素(PTH)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、促甲狀腺激素釋放激素(TRH)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、生長抑素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、細胞因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、血型糖蛋白-A(GPA)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、白血病抑制因子(LIF)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、白細胞介素(IL)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、抑瘤素M結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；6)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、心臟營養(yǎng)素-I(CT-I)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；7)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、心臟營養(yǎng)素-樣細胞因子(CLC)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；8)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)白細胞素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、緩激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、胰激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、desArg9緩激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、desArglO緩激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、成纖維細胞生長因子(FGF)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、FGF-I結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、FGF-2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、FGF-4結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、FGF-8結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、FGF-9結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；6)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、FGF-17結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、FGF-18結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)營養(yǎng)因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)生長因子(NGF)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5(NT-4/5)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、頭激活肽(HA)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、腫瘤壞死因子(TNF)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、膠質(zhì)細胞源性生長因子(GDNF)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、neurturin結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、persephrin結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、artemin結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFii)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TGF^I結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TGFβ2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TGFβ3結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TGFii4結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域，梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、骨形態(tài)發(fā)生蛋白β(BMP)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、ΒΜΡ2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、ΒΜΡ3結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、ΒΜΡ4結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、ΒΜΡ5結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、ΒΜΡ6結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；6)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、ΒΜΡ7結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；7)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、ΒΜΡ8結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或8)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BMPlO結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、生長分化因子β(GDF)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDFl結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDF3結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDF5結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；6)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDF7結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；7)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDF8結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；8)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDFlO結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；9)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDFll結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或10)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、GDF15結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、激活蛋白肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、激活蛋白A結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、激活蛋白B結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、激活蛋白C結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、激活蛋白E結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、抑制素A結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、胰島素生長因子(IGF)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、IGF-I結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、IGF-2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、表皮生長因子(EGF)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、高血糖素樣激素肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、分泌素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、高血糖素樣肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、生長激素釋放激素(GHRH)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、生長激素釋放激素(GHRH)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、血管活性腸肽(VIP)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、VIPl結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、VIP2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、腸抑胃肽(GIP)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、降韓素相關(guān)肽腦腸肽(Calcitonin-relatedpeptidesvisceralgutpeptide)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、胃泌素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、胃泌素-釋放肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、膽囊收縮素(CCK)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、蛋白酶激活受體(PAR)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、PARl結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、PAR2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、PAR3結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；或4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、PAR3結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域。此類包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)的實例描述于例如J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利7，132,529；J.OliverDolly等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利7，419,676；LanceE.Steward等人，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美國專利7，514，088;KeithA.Foster等人，Re-targetedToxinConjugates,InternationalPatentPublicationWO2005/023309；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利公布2008/0032930;LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利公布2008/0032931；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利公布2008/0161226；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利公布2008/0221012；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利公布2009/0004224;LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利公布2009/0005313；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利公布2009/0018081；LanceE.Steward等人，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國專利公布2009/0069238；和LanceE.Steward等人，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美國專利公布2009/0048431(將所述每個專利通過引用整體并入本文)中。在另一個實施方案中，表達構(gòu)建體包含開編碼蛋白質(zhì)的放閱讀框架，所述蛋白質(zhì)包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本實施方案的方面，單鏈蛋白質(zhì)包含如下的線性氨基-至-羧基順序1)整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域；2)整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；4)梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域；5)梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和6)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本實施方案的其它方面，表達構(gòu)建體包含開放閱讀框，其編碼I)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-腦啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域；2)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-牛腎上腺髓質(zhì)-22(BAM22)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；3)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-內(nèi)嗎啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域；4)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-內(nèi)啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域；5)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-強啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域；6)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-痛敏肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域；7)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-血衍嗎啡素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或8)梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-強啡肽B結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此類包含整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的實例描述于例如同伴專利申請SanjivGhanshani等人，ModifiedClostridialToxinsComprisinganIntegratedProteaseCleavageSite-BindingDomain,將其通過引用整體并入本文。本說明書中公開的表達構(gòu)建體可包含編碼蛋白酶的開放閱讀框。在本實施方案的方面，病毒表達載體被可操作地連接于編碼蛋白酶的多核苷酸分子；原核表達載體被可操作地連接于編碼蛋白酶的多核苷酸分子；酵母表達載體被可操作地連接于編碼蛋白酶的多核苷酸分子；昆蟲表達載體被可操作地連接于編碼蛋白酶的多核苷酸分子；以及哺乳動物表達載體被可操作地連接于編碼蛋白酶的多核苷酸分子。在本實施方案的其它方面，適用于表達本說明書中公開的多核苷酸分子的表達構(gòu)建體可使用無細胞提取物來表達。在本實施方案的方面，無細胞提取物表達載體可操作地連接于編碼蛋白酶的多核苷酸分子。在本實施方案的方面，包含開放閱讀框的表達構(gòu)建體編碼腸激酶、人鼻病毒3C蛋白酶、人腸病毒3C蛋白酶、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、煙草脈斑駁病毒(TVMV)蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶或半胱天冬酶3蛋白酶。腸激酶蛋白酶和編碼它們的多核苷酸分子的實例描述于例如EdwardR.LaVallie,CloningofEnterokinaseandMethodofUse,美國專利5，665，566;EdwardR.LaVallie,CloningofEnterokinaseandMethodofUse,美國專利6，746，859(將所述每個專利通過引用整體并入本文)中?？莶輻U菌蛋白酶和編碼它們的多核苷酸的實例描述于例如DonnN.Rubingh等人，SubtillisinProteaseVariantshavingAminoAcidDeletionsandSubstitutionsinDefinedEpitopeRegions,美國專利6，586，224(將其通過弓I用整體并入本文)中。在本實施方案的另一個方面，腸激酶為SEQIDNO:11。在本實施方案的另一個方面，腸激酶包含SEQIDNO:11的氨基酸239-1035。在本實施方案的另一個方面，腸激酶是天然存在的腸激酶變體例如腸激酶同種型。在本實施方案的另一個方面，腸激酶是非天然存在的腸激酶變體例如保守腸激酶變體、非-保守腸激酶變體、腸激酶嵌合體、活性腸激酶片段或其任意組合。在本實施方案的另一個方面，腸激酶為美國專利5，665，566或美國專利6，746，859中公開的腸激酶。在本實施方案的另一個方面，腸激酶、天然存在的腸激酶變體或非天然存在的腸激酶變體獲自哺乳動物的物種例如人、牛或嚙齒類動物。在本實施方案的其它方面，腸激酶包括多肽，所述多肽與SEQIDNO=Il具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或與SEQIDNO:11具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本實施方案的其它方面，腸激酶包括多肽，所述多肽相對于SEQIDN011具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO11具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的其它方面，腸激酶包括多肽，所述多肽相對于SEQIDNO:11具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或?qū)τ赟EQIDNO:11具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的另一個方面，人鼻病毒3C蛋白酶是SEQIDNO:12。在本實施方案的另一個方面，人鼻病毒3C蛋白酶是天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶變體例如人鼻病毒3C蛋白酶同種型。在本實施方案的另一個方面，人鼻病毒3C蛋白酶為非天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶變體例如保守人鼻病毒3C蛋白酶變體、非-保守人鼻病毒3C蛋白酶變體、人鼻病毒3C蛋白酶嵌合體、活性人鼻病毒3C蛋白酶片段或其任意組合。在本實施方案的另一個方面，人鼻病毒3C蛋白酶、天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶變體或非天然存在的人鼻病毒3C蛋白酶變體獲自鼻病毒屬的物種。在本實施方案的其它方面，人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽，所述多肽與SEQIDNO12具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或與SEQIDNO:12具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一'丨生。在本實施方案的其它方面,人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽,所述多肽相對于SEQIDNO:12具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO:12具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的其它方面，人鼻病毒3C蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDN0:12具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或至多相對于SEQIDNO12具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的另一個方面，人腸病毒3C蛋白酶為SEQIDNO:13。在本實施方案的另一個方面，人腸病毒3C蛋白酶為天然存在的人腸病毒3C蛋白酶變體例如人腸病毒3C蛋白酶同種型。在本實施方案的另一個方面，人腸病毒3C蛋白酶為非天然存在的人腸病毒3C蛋白酶變體例如保守人腸病毒3C蛋白酶變體、非-保守人腸病毒3C蛋白酶變體、人腸病毒3C蛋白酶嵌合體、活性人腸病毒3C蛋白酶片段或其任意組合。在本實施方案的另一個方面，人腸病毒3C蛋白酶、天然存在的人腸病毒3C蛋白酶變體或非天然存在的人腸病毒3C蛋白酶變體獲自腸道病毒屬的物種。在本實施方案的其它方面，人腸病毒3C蛋白酶包含多肽，所述多肽與SEQIDNO13具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或與SEQIDNO:13具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本實施方案的其它方面，人腸病毒3C蛋白酶包括多肽，所述多肽相對于SEQIDNO:13具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO:13具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的其它方面，人腸病毒3C蛋白酶包括多肽，所述多肽相對于SEQIDNO:13具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO:13具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的另一個方面，TEV蛋白酶為SEQIDNO:14。在本實施方案的另一個方面，TEV蛋白酶包含SEQISNO:14的氨基酸2038-2270。在本實施方案的另一個方面，TEV蛋白酶包含SEQIDNO15,SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO2USEQIDNO:22或SEQIDNO:23。在本實施方案的另一個方面，TEV蛋白酶為天然存在的TEV蛋白酶變體例如TEV蛋白酶同種型。在本實施方案的另一個方面，TEV蛋白酶為非天然存在的TEV蛋白酶變體例如保守TEV蛋白酶變體、非-保守TEV蛋白酶變體，TEV蛋白酶嵌合體、活性TEV蛋白酶片段或其任意組合。在本實施方案的另一個方面，TEV蛋白酶、天然存在的TEV蛋白酶變體或非天然存在的TEV蛋白酶變體獲自馬鈴薯Y病毒屬的物種。在本實施方案的其它方面，TEV蛋白酶包含多肽，所述多肽與SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO2USEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或與SEQIDNO14,SEQIDNO:15、SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO19,SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本實施方案的其它方面，TEV蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDNO14,SEQIDNO15,SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO22或SEQIDNO23具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置；或相對于SEQIDNO14,SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO2USEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的其它方面，TEV蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDNO14,SEQIDNO15,SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO2USEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的另一個方面，TVMV蛋白酶為SEQIDNO:24。在本實施方案的另一個方面，TEV蛋白酶包含SEQISNO:24的氨基酸2002-2236。在本實施方案的另一個方面，TVMV蛋白酶為天然存在的TVMV蛋白酶變體例如TVMV蛋白酶同種型。在本實施方案的另一個方面，TVMV蛋白酶為非天然存在的TVMV蛋白酶變體例如保守TVMV蛋白酶變體、非-保守TVMV蛋白酶變體、TVMV蛋白酶嵌合體、活性TVMV蛋白酶片段或其任意組合。在本實施方案的另一個方面，TVMV蛋白酶、天然存在的TVMV蛋白酶變體或非天然存在的TVMV蛋白酶變體獲自馬鈴薯Y病毒屬的物種。在本實施方案的其它方面，TVMV蛋白酶包括多肽，所述多肽與SEQIDNO24或SEQISNO:24的氨基酸2002-2236具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或與SEQIDNO:24或SEQISNO:24的氨基酸2002-2236具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本實施方案的其它方面，TVMV蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDN024或SEQISNO24的氨基酸2002-2236具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDN0:24或SEQISNO24的氨基酸2002-2236具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的其它方面，TVMV蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDN0:24或SEQISNO:24的氨基酸2002-2236具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO:24或SEQISNO:24的氨基酸2002-2236具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的另一個方面，枯草桿菌蛋白酶為SEQIDNO:25。在本實施方案的另一個方面，枯草桿菌蛋白酶包含SEQISNO:25的氨基酸107-365。在本實施方案的另一個方面，枯草桿菌蛋白酶為天然存在的枯草桿菌蛋白酶變體例如枯草桿菌蛋白酶同種型。在本實施方案的另一個方面，枯草桿菌蛋白酶為非天然存在的枯草桿菌蛋白酶變體例如保守枯草桿菌蛋白酶變體、非-保守枯草桿菌蛋白酶變體、枯草桿菌蛋白酶嵌合體、活性枯草桿菌蛋白酶片段或其任意組合。在本實施方案的另一個方面，枯草桿菌蛋白酶、天然存在的枯草桿菌蛋白酶變體或非天然存在的枯草桿菌蛋白酶變體獲自芽孢桿菌屬的物種。在本實施方案的其它方面，枯草桿菌蛋白酶包含多肽，所述多肽與SEQIDNO25或SEQISNO:25的氨基酸107-365具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或與SEQIDNO:25或SEQISNO:25的氨基酸107-365具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一'I"生。在本實施方案的其它方面，枯草桿菌蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDNO:25或SEQISNO25的氨基酸107-365具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO25或SEQISNO25的氨基酸107-365具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的其它方面，枯草桿菌蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDNO25或SEQISNO25的氨基酸107-365具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO25或SEQISNO:25的氨基酸107-365具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的另一個方面，半胱天冬酶3蛋白酶為SEQIDNO:26。在本實施方案的另一個方面，半胱天冬酶3蛋白酶為天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶變體例如半胱天冬酶3蛋白酶同種型。在本實施方案的另一個方面，半胱天冬酶3蛋白酶為非天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶變體例如保守半胱天冬酶3蛋白酶變體、非-保守半胱天冬酶3蛋白酶變體、半胱天冬酶3蛋白酶嵌合體、活性半胱天冬酶3蛋白酶片段或其任意組合。在本實施方案的另一個方面，半胱天冬酶3蛋白酶、天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶變體或非天然存在的半胱天冬酶3蛋白酶變體獲自哺乳動物的物種例如人、牛或嚙齒類動物。在本實施方案的其它方面，半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽，所述多肽與SEQIDNO:26具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性；或與SEQIDNO:26具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的氨基酸同一性。在本實施方案的其它方面，半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDNO:26具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO:26具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。在本實施方案的其它方面，半胱天冬酶3蛋白酶包含多肽，所述多肽相對于SEQIDN0:26具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換；或相對于SEQIDNO26具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的缺失、添加和/或置換。本說明書中公開的方法部分地包括雙重表達構(gòu)建體。雙重表達構(gòu)建體包含兩個多核苷酸分子，每一個多核苷酸分子包括可操作地連接于用于在細胞或無細胞提取物中表達兩個多核苷酸分子的表達載體的本說明書中公開的開放閱讀框。多種雙重表達載體可用于表達本說明書中公開的多核苷酸分子，包括但不限于病毒雙重表達載體；原核雙重表達載體；真核雙重表達載體例如酵母雙重表達載體、昆蟲雙重表達載體和哺乳動物雙重表達載體；以及無細胞提取物雙重表達載體。還應(yīng)理解，用于實施這些方法的方面的雙重表達載體可包括在組成型、組織特異性、細胞特異性或誘導(dǎo)型啟動子元件、增強子元件或兩者的控制下表達多核苷酸分子的那些表達載體。雙重表達載體以及用于從此類表達載體制備和使用表達構(gòu)建體的已確立的試劑和條件的非限定性實例可容易地從提供商獲得，包括但不限于EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI。適當(dāng)?shù)碾p重表達載體的選擇、制備和使用是完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的常規(guī)方法以及來自本文中的教導(dǎo)。本說明書中公開的雙重表達構(gòu)建體可包含編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述蛋白質(zhì)包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域，和編碼蛋白酶的另一個開放閱讀框，所述蛋白酶可裂解位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點，從而將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。因此，在一個實施方案中，雙重表達構(gòu)建體包含編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述蛋白質(zhì)包含含有本說明書中公開的外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域，和編碼蛋白酶的另一個開放閱讀框，所述蛋白酶可裂解位于本說明書中公開的雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點。在本實施方案的方面，雙重表達構(gòu)建體可包含編碼梭菌毒素(其包含含有TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域)的一個開放閱讀框和編碼TEV蛋白酶的另一個開放閱讀框。在本實施方案的另一個方面，雙重表達構(gòu)建體可包含編碼梭菌毒素(其包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域)的一個開放閱讀框和編碼TEV蛋白酶的另一個開放閱讀框。在本實施方案的另一個方面，雙重表達構(gòu)建體可包含編碼梭菌毒素(其包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、雙鏈環(huán)區(qū)域和TEV蛋白酶裂解位點，其中TEV蛋白酶裂解位點位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi))的一個開放閱讀框和編碼TEV蛋白酶的另一個開放閱讀框。在本實施方案的方面，雙重表達構(gòu)建體包含編碼蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域)的開放閱讀框和編碼可裂解位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點的蛋白質(zhì)酶的另一個開放閱讀框。在本實施方案的另一個方面，雙重表達構(gòu)建體可包含編碼蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域)的一個開放閱讀框和編碼TEV蛋白酶的另一個開放閱讀框。在本實施方案的另一個方面，雙重表達構(gòu)建體可包含編碼蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、雙鏈環(huán)區(qū)域和TEV蛋白酶裂解位點，其中TEV蛋白酶裂解位點位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi))的一個開放閱讀框和編碼TEV蛋白酶的另一個開放閱讀框。在本實施方案的方面，雙重表達構(gòu)建體包含編碼包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的開放閱讀框。在本實施方案的另一個方面，雙重表達構(gòu)建體可包含編碼蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、整合的TEV蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的一個開放閱讀框和編碼TEV蛋白酶的另一個開放閱讀框。在本實施方案的另一個方面，雙重表達構(gòu)建體可包含編碼蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中TEV蛋白酶裂解位點位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi))的一個開放閱讀框和編碼TEV蛋白酶的另一個開放閱讀框。雙重表達構(gòu)建體中包含的開放閱讀框之一的位置可以以相對于另一個開放閱讀框的位置的任何順序存在，只要從兩個開放閱讀框的轉(zhuǎn)錄仍然可發(fā)生。當(dāng)制備雙重表達構(gòu)建體時，來自第一啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始通常轉(zhuǎn)錄兩個開放閱讀框，然而，來自第二啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始通常僅轉(zhuǎn)錄開放閱讀框之一。因此，取決于開放閱讀框相對于第一和第二啟動子區(qū)域的定位，可從開放閱讀框之一產(chǎn)生多至2倍的轉(zhuǎn)錄物。因此，在一個實施方案，編碼蛋白酶的開放閱讀框處于第一啟動子區(qū)域的控制之下，然而編碼包含包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)的開放閱讀框處于第一啟動子和第二啟動子區(qū)域的控制之下。在本實施方案的方面，編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框處于第一啟動子區(qū)域的控制之下，然而編碼包含位于雙鏈環(huán)區(qū)域中的TEV蛋白酶裂解位點的梭菌毒素的開放閱讀框處于第一啟動子和第二啟動子區(qū)域的控制之下。在本實施方案的另一個方面，編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框處于第一啟動子區(qū)域的控制之下，然而編碼包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)的開放閱讀框處于第一啟動子和第二啟動子區(qū)域的控制之下。在本實施方案的另一個方面，編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框處于第一啟動子區(qū)域的控制之下，然而編碼包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的開放閱讀框處于第一啟動子和第二啟動子區(qū)域的控制之下。在另一個實施方案中，編碼包含含有外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)的開放閱讀框處于第一啟動子區(qū)域的控制之下，然而編碼蛋白酶的開放閱讀框處于第一啟動子和第二啟動子區(qū)域的控制之下。在本實施方案的方面，編碼包含含有TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的梭菌毒素的開放閱讀框處于第一啟動子區(qū)域的控制之下，然而，編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框處于第一啟動子和第二啟動子區(qū)域的控制之下。在本實施方案的另一個方面，編碼包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)的開放閱讀框處于第一啟動子區(qū)域的控制之下，然而編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框處于第一啟動子和第二啟動子區(qū)域的控制之下。在本實施方案的另一個方面，編碼包含梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和整合的TEV蛋白酶裂解位點-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的開放閱讀框處于第一啟動子區(qū)域的控制之下，然而編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框處于第一啟動子和第二啟動子區(qū)域的控制之下。雙重表達構(gòu)建體中包含的開放閱讀框之一的5’-3’取向相對于另一個開放閱讀框的5’-3’取向可以處于任何方向，只要從兩個開放閱讀框的轉(zhuǎn)錄仍然可發(fā)生。在一個實施方案中，開放閱讀框之一的5’-3’取向處于與另一個開放閱讀框的5’-3’取向相同的方向。在另一個實施方案中，開放閱讀框之一的5’-3’取向處于與另一個開放閱讀框的5’-3’取向相反的方向。在本實施方案的方面，開放閱讀框之一的5’-3’取向相對于另一個開放閱讀框的5’-3’取向是收斂的(convergent)。在本實施方案的另一個方面,開放閱讀框之一的5’-3’取向相對于另一個開放閱讀框的5’-3’取向是發(fā)散的(divergent)。本說明書中公開的方法部分地包括包含包含外源蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域的蛋白質(zhì)。如本文中所用，術(shù)語“雙鏈環(huán)區(qū)域”意指包含用于將梭菌毒素的單鏈形式轉(zhuǎn)化成雙鏈形式的蛋白酶裂解位點的梭菌毒素的氨基酸序列。梭菌毒素雙鏈環(huán)區(qū)域的非限定性實例包括包含SEQIDNO1的氨基酸430-454的BoNT/A的雙鏈環(huán)區(qū)域；包含SEQIDNO2的氨基酸437-446的BoNT/B的雙鏈環(huán)區(qū)域；包含SEQIDNO3的氨基酸437-453的BoNT/Cl的雙鏈環(huán)區(qū)域；包含SEQIDNO4的氨基酸437-450的BoNT/D的雙鏈環(huán)區(qū)域；包含SEQIDNO5的氨基酸412-426的BoNT/E的雙鏈環(huán)區(qū)域；包含SEQIDNO6的氨基酸429-445的BoNT/F的雙鏈環(huán)區(qū)域；包含SEQIDNO:7的氨基酸436-450的BoNT/G的雙鏈環(huán)區(qū)域；包含SEQIDNO8的氨基酸439-467的TeNT的雙鏈環(huán)區(qū)域；包含SEQIDNO9的氨基酸421-435的BaNT的雙鏈環(huán)區(qū)域；和包含SEQIDNO10的氨基酸412-426的BuNT的雙鏈環(huán)區(qū)域(表2)。表2.梭菌毒素的雙鏈環(huán)區(qū)域權(quán)利要求1.一種將包含雙鏈環(huán)區(qū)域的單鏈梭菌毒素轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在37°C下生長約3.5小時，所述雙重表達構(gòu)建體包含i)編碼單鏈梭菌毒素的開放閱讀框，所述單鏈梭菌毒素包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；和)編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框；b)將所述細胞在22°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)所述單鏈梭菌毒素和TEV蛋白酶從所述雙重表達構(gòu)建體的表達；以及其中所述產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于雙鏈環(huán)區(qū)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解所述單鏈梭菌毒素，從而將所述單鏈梭菌毒素轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。2.權(quán)利要求I所述的細胞內(nèi)方法，其中所述單鏈梭菌毒素包含如下的線性氨基-至-羧基單鏈多肽順序1)所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域、所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；2)所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域、所述梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；3)所述梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域和所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域；4)所述梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域和所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；5)所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域、所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或6)所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域、所述梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域。3.權(quán)利要求I所述的細胞內(nèi)方法，其中所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域為BoNT/A酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/B酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/D酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/E酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/F酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/G酶促結(jié)構(gòu)域、TeNT酶促結(jié)構(gòu)域、BaNT酶促結(jié)構(gòu)域或BuNT酶促結(jié)構(gòu)域。4.權(quán)利要求I所述的細胞內(nèi)方法，其中所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域為BoNT/A轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/B轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/D轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/E轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/F轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/G轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TeNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BaNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或BuNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。5.權(quán)利要求I所述的細胞內(nèi)方法，其中所述梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域為BoNT/A結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BoNT/B結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BoNT/D結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BoNT/E結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BoNT/F結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BoNT/G結(jié)合結(jié)構(gòu)域、TeNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BaNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域或BuNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域。6.一種將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在37°C下生長約8小時，所述雙重表達構(gòu)建體包含；i)編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和)編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框；b)將所述細胞在約12至約16°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)所述單鏈蛋白質(zhì)和所述TEV蛋白酶從所述雙重表達構(gòu)建體表達；和其中所述產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于所述整合的TEV裂解位點阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的TEV蛋白酶裂解位點上裂解所述單鏈蛋白質(zhì)，從而將所述單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。7.權(quán)利要求6所述的細胞內(nèi)方法，其中所述蛋白質(zhì)包含如下的線性氨基-至-羧基單鏈多肽順序1)所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和所述整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，2)所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、所述整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域，3)所述整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域，4)所述整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域，5)所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、所述整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域；或6)所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和所述整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。8.權(quán)利要求I所述的細胞內(nèi)方法，其中所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域為BoNT/A酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/B酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/D酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/E酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/F酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/G酶促結(jié)構(gòu)域、TeNT酶促結(jié)構(gòu)域、BaNT酶促結(jié)構(gòu)域或BuNT酶促結(jié)構(gòu)域。9.權(quán)利要求I所述的細胞內(nèi)方法，其中所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域為BoNT/A轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/B轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/D轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/E轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/F轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/G轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TeNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BaNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或BuNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。10.權(quán)利要求I所述的細胞內(nèi)方法，其中所述整合的TEV蛋白酶裂解位點-阿片樣物質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域為整合的TEV蛋白酶裂解位點-痛敏肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、整合的TEV蛋白酶裂解位點-強啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、整合的TEV蛋白酶裂解位點-腦啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、整合的TEV蛋白酶裂解位點-BAM22結(jié)合結(jié)構(gòu)域、整合的TEV蛋白酶裂解位點-內(nèi)嗎啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、整合的TEV蛋白酶裂解位點-內(nèi)啡肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域區(qū)域、整合的TEV蛋白酶裂解位點-血衍嗎啡素結(jié)合結(jié)構(gòu)域或整合的TEV蛋白酶裂解位點-強啡肽B(rimorphin)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。11.一種將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法，所述方法包括步驟a)將包含雙重表達構(gòu)建體的細胞在37°C下生長約8小時，所述雙重表達構(gòu)建體包含；i)編碼單鏈蛋白質(zhì)的開放閱讀框，所述單鏈蛋白質(zhì)包含酶促結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含TEV蛋白酶裂解位點的雙鏈環(huán)區(qū)域；和)編碼TEV蛋白酶的開放閱讀框；b)將所述細胞在約12至約16°C下生長約16至約18小時，其中在步驟(b)中的生長誘導(dǎo)所述單鏈蛋白質(zhì)和所述TEV蛋白酶從所述雙重表達構(gòu)建體表達；和其中所述產(chǎn)生的TEV蛋白酶在位于所述雙鏈環(huán)區(qū)域的TEV蛋白酶裂解位點上裂解所述單鏈蛋白質(zhì)，從而將所述單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式。12.權(quán)利要求11所述的細胞內(nèi)方法，其中所述單鏈梭菌毒素包含如下的線性氨基-至-羧基單鏈多肽順序1)所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域、所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和所述非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；2)所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域、所述非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；3)所述非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域和所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域；4)所述非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域和所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域；5)所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域、所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和所述非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或6)所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、包含TEV蛋白酶裂解位點的所述雙鏈環(huán)區(qū)域、所述非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域。13.權(quán)利要求11所述的細胞內(nèi)方法，其中所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域為BoNT/A酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/B酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/D酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/E酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/F酶促結(jié)構(gòu)域、BoNT/G酶促結(jié)構(gòu)域、TeNT酶促結(jié)構(gòu)域、BaNT酶促結(jié)構(gòu)域或BuNT酶促結(jié)構(gòu)域。14.權(quán)利要求11所述的細胞內(nèi)方法，其中所述梭菌毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域為BoNT/A轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/B轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/Cl轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/D轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/E轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/F轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BoNT/G轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、TeNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、BaNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域或BuNT轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。15.權(quán)利要求11所述的細胞內(nèi)方法，其中所述非-梭菌毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域為阿片樣物質(zhì)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、黑皮質(zhì)素肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、甘丙肽肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、烏尿素(granin)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、速激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)肽Y相關(guān)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)激素肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細胞因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、激肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、成纖維細胞生長因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)營養(yǎng)因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、腫瘤壞死因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)化生長因子β肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、骨形態(tài)發(fā)生蛋白肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、生長和分化因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、激活蛋白肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、血管內(nèi)皮生長因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、胰島素生長因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表皮生長因子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、高血糖素樣激素肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、生長激素釋放激素肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、血管活性腸肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、腸抑胃肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、降鈣素-相關(guān)肽腦腸肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或蛋白酶激活受體肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。全文摘要本說明書公開了包含含有雙鏈環(huán)區(qū)域(所述雙鏈環(huán)區(qū)域包含外源蛋白酶裂解位點)和可裂解位于雙鏈環(huán)內(nèi)的外源蛋白酶裂解位點的蛋白酶的單鏈蛋白質(zhì)的表達構(gòu)建體、包含這樣的表達構(gòu)建體的細胞組合物以及將單鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成其雙鏈形式的細胞內(nèi)方法。文檔編號C12N15/866GK102822196SQ201180014965公開日2012年12月12日申請日期2011年1月24日優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日發(fā)明者S·甘沙尼,L·Q·勒,劉漪,L·E·斯圖爾德申請人:阿勒根公司