專利名稱：新的產(chǎn)乙醇梭菌屬物種clostridium coskatii的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域涉及新的細(xì)菌物種，其能從由氫(H2)和二氧化碳(CO2CO2)和/或一氧化碳(CO)組成的氣體混合物中產(chǎn)生乙醇。特別地，本發(fā)明提供了具有ATCC號(hào)PTA-10522的鑒定特征的新梭菌屬物種，Clostridium coskatii (PS02),以及使用該新梭菌屬物種,從 H2和/或CO2和/或CO氣體中合成乙醇和其他有用產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
目前，生物燃料生產(chǎn)(從生物質(zhì)中產(chǎn)生燃料，例如乙醇)的主要方法是通過(guò)直接發(fā)酵，其在美國(guó)占 90% 的乙醇產(chǎn)量(Licht, F. O. (2001) World Ethanol Markets, Analysisand Outlook,Kent,英國(guó))。直接發(fā)酵是這樣的方法,其中糖解微生物,例如酵母或細(xì)菌將糖轉(zhuǎn)化成乙醇。這些糖可以是簡(jiǎn)單的(如葡萄糖)或復(fù)雜的(如淀粉、纖維素、半纖維素)。玉米淀粉是在當(dāng)今乙醇生產(chǎn)工廠中使用的主要底物。在乙醇的直接發(fā)酵產(chǎn)生中使用玉米淀粉的一個(gè)缺點(diǎn)是，玉米是許多人類和動(dòng)物食物的組分。因此，將玉米用于產(chǎn)生乙醇使得其不足以供給人類和動(dòng)物消耗。也正在研究其他底物，例如木質(zhì)纖維素生物質(zhì)(如草、小樹(shù)、紙廢物或木屑)，用于生物燃料的直接發(fā)酵。然而，它們也具有局限性。木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素、果膠和木質(zhì)素組成，在微生物可以利用該底物之前，其需要預(yù)處理過(guò)程，以將生物質(zhì)降解成其各個(gè)糖組分。這增加了材料、工廠設(shè)計(jì)和廢物處理領(lǐng)域中更多的花費(fèi)。此外,大約22-35%的木質(zhì)纖維素部分由木質(zhì)素組成，其不能通過(guò)當(dāng)前的直接發(fā)酵方法使用，并將其作為難以處理的廢棄材料從工藝中丟棄。生物燃料產(chǎn)生的另一備選方法是間接發(fā)酵。間接發(fā)酵是這樣的工藝，其中從含碳的非食物農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢棄材料中產(chǎn)生可以提供電子源(例如H2和CO)和碳源(例如CO和CO2)的富含能量的氣體，并然后轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中，在生物反應(yīng)器厭氧細(xì)菌將氣體轉(zhuǎn)化成生物燃料。當(dāng)木質(zhì)纖維素的生物質(zhì)熱解(燃燒)時(shí)產(chǎn)生的氣體是可用于間接發(fā)酵的廢氣類型的實(shí)例。合成氣體(也稱為“合成氣”)(主要為CO、H2和CO2)是熱解的生物質(zhì)或煤的產(chǎn)物，并且已經(jīng)確認(rèn)了其在生物質(zhì)至燃料乙醇的間接發(fā)酵中的潛在作用(Zeikus, J. G, AnnuRev. Microbiol. 34 :423-464 (1980))。富含能量的廢氣的另一來(lái)源是堿性氧氣煉鋼(LD轉(zhuǎn)化爐)工藝，其產(chǎn)生了由70%C0、1-2%H2和10-15%C02組成的顯著體積的廢氣，所述廢氣也適用于使用間接發(fā)酵法產(chǎn)生生物燃料。厭氧微生物例如產(chǎn)乙酸菌提供了通過(guò)間接發(fā)酵法，將廢氣轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物，例如乙醇和正丁醇的可行途徑。此類細(xì)菌催化H2和CO2和/或CO至生物燃料的轉(zhuǎn)化，具有比通過(guò)Fischer-Tropsch方法或者使用CC^PH2的其他化學(xué)生物燃料產(chǎn)生方法所達(dá)到的特異性、產(chǎn)率和能量消耗更高的特異性、更高的產(chǎn)率和更低的能量消耗。已經(jīng)鑒定了幾種能從廢氣和其他底物中產(chǎn)生生物燃料的微生物，并描述如下。已經(jīng)描述了使用合成氣的三種主要組分(h2+co2或CO或h2+co2和CO)的至少之一作為底物，用于產(chǎn)生生物燃料、乙醇、正丁醇或這些醇的混合物的六種產(chǎn)乙酸細(xì)菌。這些產(chǎn)乙酸細(xì)菌包括食甲基丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum) (Grethlein 等人，1990 ;Jain 等人，1994b)、Clostridium ragsdalei (Huhnke 等人，2008)、Clostridiumcarboxidivorans (Liou,等人，2005)、穆?tīng)柺暇鷮?Moorella)物種 HUC22-1 (Inokuma,等人，2007)、Clostridium autoethanogenum (Abrini 等人，1994)和揚(yáng)氏梭菌(Clostridiumljungdahlii) (Arora 等人，1995 ；Barik 等人，1988 ；Barik 等人 1990 ；和 Tanner 等人，1993)。在這些代表中，已知僅有三種產(chǎn)乙酸菌(揚(yáng)氏梭菌、Clostridium ragsdalei和Clostridium autoethanogenum)可以將CO或CO和/或H2和CO2的混合物轉(zhuǎn)化成乙酸和乙醇。因此,它們是唯一已知的能形成單一醇(乙醇)終產(chǎn)物,而同時(shí)使用合成氣體流的全部組分的生物。在本文件中，該組細(xì)菌稱為產(chǎn)乙醇梭菌(clostridial ethanologens),其具有 顯著的商業(yè)重要性，因?yàn)殚g接發(fā)酵法的經(jīng)濟(jì)學(xué)優(yōu)點(diǎn)在于(a)同時(shí)使用H2和CO，使得組合轉(zhuǎn)化率超過(guò)90%，和(b)產(chǎn)生了單一醇，其允許使用簡(jiǎn)化的和更便宜的生物燃料回收系統(tǒng)。在從合成氣體產(chǎn)生生物燃料的文獻(xiàn)中描述了六種產(chǎn)乙醇梭菌(I)揚(yáng)氏梭菌PETCt (ATCC號(hào)49587和DSMZ號(hào)13528):該生物為該物種的原始型菌株保藏物(Tanner等人，1993)。參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，173,429。(2)揚(yáng)氏梭菌ERI-2 (ATCC號(hào)55380):該生物的系統(tǒng)發(fā)生狀況仍不清楚，因?yàn)槠涿黠@與PETC型菌株不同，但其并沒(méi)有包括于已批準(zhǔn)的細(xì)菌名稱列表(Approved Lists ofBacterial Names)的列表中(Skerman 等人，1989)。參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào) 5，593，886。(3)揚(yáng)氏梭菌C-Ol ;(ATCC號(hào)55988):該生物的系統(tǒng)發(fā)生狀況仍不清楚，因?yàn)槠涿黠@與PETC型菌株不同，但其并沒(méi)有包括于已批準(zhǔn)的細(xì)菌名稱列表(Approved Lists ofBacterial Names)的列表中(Skerman 等人，1989)。參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào) 6，136, 577。(4)揚(yáng)氏梭菌0-52; (ATCC號(hào)55989):該生物的系統(tǒng)發(fā)生狀況仍不清楚，因?yàn)槠涿黠@與PETC型菌株不同，但其并沒(méi)有包括于已批準(zhǔn)的細(xì)菌名稱列表(Approved Lists ofBacterial Names)的列表中(Skerman 等人，1989)。參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào) 6，136, 577。(5) Clostridium ragsdalei ; (ATCC 號(hào) BAA-622):參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào) US20080057554(EP2061872A2)。(6) Clostridium autoethanogenum ； (DSMZ 號(hào) 10061)該分離物由 Abrini 等人，1994年描述為其從CO、H2和CO2的混合物中產(chǎn)生乙醇和乙酸。除描述用于生物燃料產(chǎn)生的特定產(chǎn)乙醇梭菌屬的用途的專利外，如上文所定義，存在以下方法專利，用于從廢氣例如合成氣體中產(chǎn)生生物燃料。某些專利還涵蓋了已知從廢氣中產(chǎn)生多種醇(主要為乙醇和正丁醇)的微生物(例如，Clostridiumcarboxidivorans)(I)Lewis 等人的美國(guó)專利號(hào) US20070275447A1 公開(kāi)了 Clostridiumcarboxidivorans ATCC號(hào)BAA-624,其是一種能從廢氣例如合成氣體中合成生物燃料,包括乙醇和正丁醇的新的厭氧梭菌屬細(xì)菌物種。
(2) Jain 等人的美國(guó)專利號(hào) 5，192，673 公開(kāi)了 Clostridium acetobytylicum 的突變菌株和用該菌株制備丁醇的方法。(3)Gaddy等人的美國(guó)專利號(hào)5，593，886公開(kāi)了使用揚(yáng)氏梭菌ATCC號(hào)55380的方法，用于使用廢氣(例如炭黑廢氣)作為底物，產(chǎn)生乙酸和乙醇。(4)Gaddy等人的美國(guó)專利號(hào)5，807，722公開(kāi)了使用厭氧細(xì)菌，例如揚(yáng)氏梭菌ATCC號(hào)55380，將廢氣轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物例如有機(jī)酸和醇的方法和裝置。(5)Gaddy等人的美國(guó)專利號(hào)6，136，577公開(kāi)了使用厭氧細(xì)菌，例如揚(yáng)氏梭菌ATCC號(hào)55988和55989，將廢氣轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物例如有機(jī)酸和醇(特別地乙醇)的方法和裝置。(6)Gaddy等人的美國(guó)專利號(hào)6，136，577公開(kāi)了使用揚(yáng)氏梭菌的厭氧菌株，將廢氣轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物例如有機(jī)酸和醇(特別地乙酸)的方法和裝置。 (7)Gaddy等人的美國(guó)專利號(hào)6，753，170公開(kāi)了用于產(chǎn)生乙酸的厭氧微生物發(fā)酵方法。(S)Gaddy等人的美國(guó)專利號(hào)7，285，402公開(kāi)了用于產(chǎn)生乙醇的厭氧微生物發(fā)酵方法。盡管本領(lǐng)域知道有關(guān)微生物在生物燃料的產(chǎn)生中的用途，但仍存在發(fā)現(xiàn)和/或研發(fā)能使用間接發(fā)酵法產(chǎn)生有用的產(chǎn)物例如生物燃料的其他微生物的持續(xù)需求。特別地，有利的是發(fā)現(xiàn)當(dāng)在化學(xué)限定的或者低有機(jī)碳生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，表現(xiàn)出改進(jìn)的生長(zhǎng)特性和高生物燃料產(chǎn)率的新產(chǎn)乙醇梭菌屬。具體而言，認(rèn)為從細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基中去除復(fù)雜的有機(jī)碳源例如酵母提取物、牛肉提取物、玉米漿或大豆胰蛋白胨，對(duì)于通過(guò)合成氣體發(fā)酵產(chǎn)生生物燃料是有利的，因?yàn)?I)這些組分增加了生物燃料產(chǎn)生花費(fèi)的額外開(kāi)支，和(2)復(fù)雜的有機(jī)碳源支持了生物燃料生產(chǎn)發(fā)酵罐中外源細(xì)菌的生長(zhǎng)，所述外源細(xì)菌的生長(zhǎng)不利地影響了生物燃料產(chǎn)率和過(guò)程經(jīng)濟(jì)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及新發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)乙醇梭菌屬物種，Clostridium coskatii (PS02)的生物學(xué)純的培養(yǎng)物。該梭菌屬物種是新的梭菌屬物種，具有不同于其他已知梭菌屬物種的表型特性和遺傳特性。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是該梭菌屬物種從CO和/或H2和/或CO2的氣體來(lái)源中產(chǎn)生乙醇和乙酸的獨(dú)特能力。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，Clostridium coskatii能獨(dú)特地在復(fù)雜有機(jī)碳源，例如酵母提取物不存在的情況下進(jìn)行乙醇生產(chǎn)。附圖簡(jiǎn)述圖I是負(fù)染色/相位的透射電子顯微照片，25，000倍放大倍數(shù)。刻度(Bar)=1. O μ m。圖2是穩(wěn)定期期間，Clostridium coskatii (PS02)細(xì)胞的相差光學(xué)顯微照片，1,000倍放大倍數(shù)?？潭?14. 63 μ m。圖3是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期期間收獲的Clostridium coskatii (PS02)的掃描電子顯微照片，10, 000倍放大倍數(shù)。刻度=1. O μ m。圖 4 圖解了與 Clostridium autoethanogenum 比較，基于 Clostridium coskatii(PS02)的分批培養(yǎng)的光學(xué)密度，pH生長(zhǎng)最佳值。
圖5圖解了基于終產(chǎn)物，乙醇和乙酸的體積濃度，Clostridium coskatii (PS02)的分批培養(yǎng)的pH生長(zhǎng)最佳值。圖6圖解了基于光學(xué)密度，Clostridium coskatii (PS02)的溫度生長(zhǎng)最佳值。圖7a圖解了產(chǎn)乙醇梭菌屬(A)楊氏梭菌PETC ；⑶C. autoethanogenum ； (C)C. ragsdalei ； (D)C. coskatii(PS02)的脂肪酸甲酯譜的比較。化合物和相應(yīng)的峰(I)十二酸甲酯(8. 161分鐘);(2)十四醛(10. 046分鐘)；(3)十四酸甲酯(12. 61分鐘);(4) 1，I-二甲氧基-十二烷(13. 881分鐘);(5) I-甲基十二胺(15. 176分鐘)；(6) (Z)-13-十八醛(17. 638分鐘)；(7)十六酸甲酯(18. 138分鐘)；(8)甲基-6，6-二甲氧基-辛酸(18. 973分鐘)；
(9)1，I-二甲氧基-十四烷(19. 506分鐘)；(10) 2-己基-環(huán)丙烷辛酸甲酯(20. 735分鐘)；
(11)I, I- 二甲氧基-十六燒(22. 113分鐘)；(12) 2-氧-3-甲基_順式_全氧-，I, 3-苯并.嗔嗪(23. 363分鐘)。圖7b提供了總結(jié)圖7a的脂肪酸甲酯譜中線性關(guān)系的強(qiáng)度的相關(guān)系數(shù)的矩陣。圖7c圖解了顯示圖7b的脂肪酸甲酯譜中，線性關(guān)系的強(qiáng)度的散點(diǎn)圖矩陣；a=0. 99。圖8a 圖解了 SEQ ID NO. 3,其是 Clostridium coskatii 的 16S rDNA 序列。通過(guò)與圖Sb中顯示的序列比對(duì)，產(chǎn)生了鄰近序列中的缺口。圖8b圖解了梭菌屬物種的16S rDNA簡(jiǎn)約樹(shù)(parsimony tree)。條形對(duì)應(yīng)于每100個(gè)序列位置I個(gè)核苷酸替換。產(chǎn)乙醇梭菌屬聚類(C. coskatiiPS02)與其他選定的梭菌屬聚類 I 代表者的距離為C. tyrobutyricum :95. 18% ；C. magnum :93. 01% ；C. kluyveri 92. 96% ；C.scatologenes:92. 52%。圖9圖解了顯示產(chǎn)乙醇梭菌屬的16S rDNA的相似性的16S rDNA相鄰系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)距離矩陣得分。

圖10圖解了顯示6種產(chǎn)乙醇的產(chǎn)乙酸菌的16S rDNA序列中高變區(qū)的頻率的熵圖，以及這些高變區(qū)的序列比對(duì)。圖11圖解了產(chǎn)乙醇梭菌屬物種的BOX-PCR比較。泳道排布為(I) IOObp序列梯；(2)C. coskatii (PS02) ； (3)C. ragsdalei ATCC BAA-622 ； (4)C. autoethanogenum DSMZ10061 ； (5)揚(yáng)氏梭菌 PETC DSMZ 13528 ； (6)揚(yáng)氏梭菌 C-01 ATCC55988 ； (7)揚(yáng)氏梭菌ERI-2ATCC 55380 ； (8) IOObp 序列梯；(9) pUC19/Sau3A 標(biāo)記。圖12圖解了用于分析產(chǎn)乙醇梭菌屬物種的通過(guò)BOX-PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增子的簡(jiǎn)約樹(shù)和Pearson UPGMA相似性矩陣得分。圖13圖解了產(chǎn)乙醇梭菌屬物種的REP-PCR比較。泳道排布為(I) IOObp序列梯；(2)C. coskatii (PS02) ； (3)C. ragsdalei ATCC BAA-622 ； (4)C. autoethanogenum DSMZ10061 ； (5)揚(yáng)氏梭菌PETC DSMZ 13528 ； (6)揚(yáng)氏梭菌C-Ol ATCC55988 ； (7)揚(yáng)氏梭菌ERI-2ATCC 55380 ； (8) IOObp 序列梯；(9) pUC19/Sau3A 標(biāo)記。圖14圖解了用于分析產(chǎn)乙醇梭菌屬物種的通過(guò)REP-PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增子的簡(jiǎn)約樹(shù)和Pearson UPGMA相似性矩陣得分。圖15圖解了產(chǎn)乙醇梭菌屬的ERIC-PCR比較。泳道排布為⑴IOObp序列梯；(2)C. coskatii (PS02)； (3)C. ragsdalei ATCC BAA-622 ； (4)C. autoethanogenum DSMZ 10061 ；
(5)揚(yáng)氏梭菌 PETC DSMZ 13528 ； (6)揚(yáng)氏梭菌 C-Ol ATCC55988 ； (7)揚(yáng)氏梭菌 ERI-2 ATCC55380 ； (8) IOObp 序列梯；(9) pUC19/Sau3A 標(biāo)記。圖16圖解了用于分析產(chǎn)乙醇梭菌屬物種的通過(guò)ERIC-PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增子的簡(jiǎn)約樹(shù)和Pearson UPGMA相似性矩陣得分。圖17圖解了使用2. O天的平均細(xì)胞保留時(shí)間，當(dāng)使用Acetogen C5培養(yǎng)基時(shí)和在合成氣體進(jìn)料的CSTR中(a)在預(yù)穩(wěn)定狀態(tài)條件(指數(shù)生長(zhǎng)期)下，和(b)在乙醇產(chǎn)生期(指數(shù)生長(zhǎng)晚期至穩(wěn)定期)，Clostridium coskatii (PS02)的比生長(zhǎng)率測(cè)量。持續(xù)時(shí)間=43. 75天。圖18是顯示在Clostridium coskatii (PS02)細(xì)胞中存在的主要元素的X射線
-i'TfeP曰。
圖19圖解了使用2. O天平均保留時(shí)間和含有Clostridium coskatii (PS02)的Acetogen C5培養(yǎng)基，在合成氣體進(jìn)料的CSTR中產(chǎn)生的乙醇和乙酸的體積濃度。持續(xù)時(shí)間=43. 75 天。圖20圖解了當(dāng)使用2. O天平均細(xì)胞保留時(shí)間和含有Clostridium coskatii(PS02)的Ethanologen C5培養(yǎng)基時(shí)，合成氣體進(jìn)料的CSTR (產(chǎn)物顯示于圖21中)的氣體攝入率。持續(xù)時(shí)間=43. 75天。圖21圖解了在Clostridium coskatii (PS02)的穩(wěn)定狀態(tài)生長(zhǎng)時(shí),在合成氣發(fā)酵的培養(yǎng)基相中存在的揮發(fā)物的GC-MS總離子流(TIC)層析。入口 顯示通過(guò)代謝(甲酸、乙酯)或酸催化化學(xué)反應(yīng)(乙酸乙酯)產(chǎn)生的痕量雜質(zhì)的層析基線的28倍放大。圖22a :在使用2. O天平均細(xì)胞保留時(shí)間和含有Clostridium coskatii (PS02)的Acetogen C5培養(yǎng)基的合成氣體進(jìn)料的CSTR中，470個(gè)小時(shí)穩(wěn)定狀態(tài)期，平均氣體攝入率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。持續(xù)時(shí)間=43. 75天。A) CO攝入，B)H2攝入，和C)C02攝入。圖22b圖解了在使用2. O天平均細(xì)胞保留時(shí)間和含有Clostridium coskatii(PS02)的Acetogen C5培養(yǎng)基的合成氣體進(jìn)料的CSTR中，470個(gè)小時(shí)穩(wěn)定狀態(tài)期，平均氣體攝入率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的繼續(xù)。持續(xù)時(shí)間=43. 75天。A)以mmol/L表示的體積乙醇濃度，B)以mmol/L表示的體積乙醇濃度，和C)以mmol/L表示的從培養(yǎng)基中排出的總乙醇。圖23圖解了有機(jī)碳(酵母提取物)添加物對(duì)通過(guò)含有Clostridium coskatii的合成氣體進(jìn)料的CSTR的乙醇和乙酸產(chǎn)生的影響。(A)在接收了化學(xué)限定的基本培養(yǎng)基(Acetogen C5)或補(bǔ)充了 O. lg/L酵母提取物的相同培養(yǎng)基的2L CSTR (D=每天O. 5)中的乙醇產(chǎn)生。(B)在接收了化學(xué)限定的基本培養(yǎng)基(Acetogen C5)或補(bǔ)充了 O. lg/L酵母提取物的相同培養(yǎng)基的2L CSTR (D=每天O. 5)中的乙酸產(chǎn)生。實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明細(xì)菌是新的產(chǎn)乙醇梭菌屬物種，其顯示出由ATCC號(hào)PTA-10522表示的特性，在本文中稱為 “Clostridium coskatii (PS02)”。已經(jīng)分析了 Clostridium coskatii(PS02)的系統(tǒng)發(fā)生、形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特性，并描述于下文實(shí)施例部分。盡管Clostridiumcoskatii (PS02)的某些特性與其他梭菌屬物種相似,但Clostridium coskatii (PS02)擁有證實(shí)其為該屬的新物種的獨(dú)特特征。在實(shí)施例中包括的數(shù)據(jù)顯示，該細(xì)菌是梭菌屬的新代表。Clostridium coskatii (PS02)具有在厭氧條件下，從底物 C0+H20 或 H2+C02 或C0+H2+C02中產(chǎn)生乙酸和乙醇的能力。對(duì)于產(chǎn)生乙酸和乙醇的反應(yīng)，CO或CO2提供了碳源，并且H2或CO提供了電子源。根據(jù)以下反應(yīng),通過(guò)由Clostridium coskatii (PS02)發(fā)酵CO和/或H2和CO2產(chǎn)生的主要產(chǎn)物是乙醇6C0+3H20 — C2H50H+4C02 (I)
6H2+2C02 — C2H50H+3H20 (2)Clostridium coskatii (PS02)還可以產(chǎn)生乙酸。乙酸產(chǎn)生通過(guò)以下反應(yīng)發(fā)生4C0+2H20 — CH3C00H+2C02 (3)4H2+2C02 — CH3C00H+2H20 (4)本發(fā)明的梭菌屬可以利用C0、C02和H2的許多來(lái)源。例如，這些底物的優(yōu)選來(lái)源包括“廢”氣，例如合成氣、煉油廠廢氣、鋼鐵生產(chǎn)廢氣、天然氣的自熱改造，以及煤的氣化。來(lái)源還包括由酵母、梭菌屬發(fā)酵，以及氣化的纖維素物質(zhì)產(chǎn)生的氣體(含有一些H2)。備選地，此類氣體底物并不必需作為其他工藝的副產(chǎn)物產(chǎn)生，但可以特定地用于使用Clostridiumcoskatii (PS02)的本發(fā)明發(fā)酵反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以將底物氣體的任一來(lái)源用于本發(fā)明的實(shí)踐，只要其可以在適合于細(xì)菌實(shí)施發(fā)酵反應(yīng)的條件下，為Clostridiumcoskatii提供足夠量的底物氣體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，CO、CO2和H2的來(lái)源是合成氣。用作為底物的合成氣可以例如作為煤的氣化的氣體副產(chǎn)物獲得。備選地，合成氣可以通過(guò)明確用于細(xì)菌發(fā)酵為目的的容易獲得的廉價(jià)農(nóng)業(yè)原材料的氣化產(chǎn)生，從而提供了將生物質(zhì)間接發(fā)酵成燃料乙醇的途徑。存在可以將原材料轉(zhuǎn)化成合成氣的大量實(shí)例，因?yàn)榇蠖鄶?shù)類型的植物都可以用于該目的。優(yōu)選的原材料包括但不限于，多年生草例如柳枝稷、作物殘余物例如玉米秸桿、加工廢物例如鋸屑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉從此類起始物質(zhì)中產(chǎn)生合成氣?？傊铣蓺庵饕ㄟ^(guò)熱解、部分氧化和蒸汽轉(zhuǎn)化，在氣化器中從干的生物質(zhì)中產(chǎn)生，主要的產(chǎn)物為CO、H2和C02。術(shù)語(yǔ)“氣化”和“熱解”指相似的工藝；兩種工藝都限制生物質(zhì)所暴露的氧的量。有時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)“氣化”包括氣化和熱解二者。還可以將用于注入間接發(fā)酵方法的底物氣體源的組合用于改變來(lái)自生物反應(yīng)器的通風(fēng)口蒸汽中組分的濃度。例如，CO、CO2和H2的主要來(lái)源可以是合成氣，其一般表現(xiàn)出37%0)、35%!12和18%C02的濃度比，但可以用來(lái)自其他來(lái)源的氣體補(bǔ)充合成氣，以富集CO(如，鋼鐵廠廢氣富含CO)或H2的水平。本發(fā)明的Clostridium coskatii必需在厭氧條件下培養(yǎng)?！皡捬鯒l件”意為在氣相中，氧(O2)的水平低于百萬(wàn)分之零點(diǎn)五。用于由等式(I)或(3)所表示的反應(yīng)的H2O的來(lái)源一般為其中培養(yǎng)生物的含水培養(yǎng)基?？傊?，用于培養(yǎng)本發(fā)明的產(chǎn)乙酸菌的經(jīng)優(yōu)化的乙醇產(chǎn)生培養(yǎng)基是化學(xué)限定的液體培養(yǎng)基。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為，可以使用備選的培養(yǎng)基，例如在H2 = CO2和C0:C02大氣下，初始PH為6的ATCC培養(yǎng)基1045。此外，對(duì)于任意的幾種目的，可以加入多種培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，例如，緩沖劑、金屬、維生素和鹽。特別地，作為營(yíng)養(yǎng)操作和生理適應(yīng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉此類技術(shù)，其導(dǎo)致了生物產(chǎn)物增加的或優(yōu)化的產(chǎn)率。例如，在“限制生長(zhǎng)”條件(即減緩細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的速率的條件)下培養(yǎng)產(chǎn)溶劑的微生物導(dǎo)致了高度還原的發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇的增強(qiáng)的產(chǎn)生。這可能是因?yàn)樵谙拗粕L(zhǎng)條件下，增加了可用的還原等價(jià)物(還原的鐵氧還蛋白、NADH或NADPH)與可用的碳的比率，并且增加的還原能力轉(zhuǎn)向了乙酰輔酶A或有機(jī)酸的化學(xué)還原，從而形成了醇。限制生長(zhǎng)條件的實(shí)例包括，例如在非最佳溫度或PH下維持培養(yǎng)物，和限制營(yíng)養(yǎng)物和碳源。通常，在培養(yǎng)物中達(dá)到期望的細(xì)菌密度后施行非生長(zhǎng)條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于優(yōu)化產(chǎn)生期望的產(chǎn)物的方法，并且本發(fā)明意圖包括使用Clostridium coskatii (PS02)的全部此類經(jīng)優(yōu)化的方法。特別地，可以使用Balch 技術(shù)(Balch 和 Wolfe, 1976, Appl. Environ.Microbiol. 32 :781-791 ;Balch 等人，1979，Microbiol. Rev. 43 :260-296)培養(yǎng) Clostridiumcoskatii (PS02)。其需要用于制備培養(yǎng)物質(zhì)的厭氧培養(yǎng)室和氣體交換歧管的幫助，以建立期望在密封的管或器皿中的培養(yǎng)的任何氣相。有關(guān)培養(yǎng)產(chǎn)生產(chǎn)乙酸菌的溶劑的更具體的細(xì)節(jié)，例如酸性 pH 的使用，顯示于 Tanner 等人，1993, Int. J. Syst. Bacteriol. 43 :232-236 和Liou 等人，2005，Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55 :2085-2091 中。增強(qiáng)乙醇產(chǎn)生的方法包括優(yōu)化關(guān)鍵的培養(yǎng)基組分(例如鐵、磷酸鹽和維生素)、控制培養(yǎng)pH、隨機(jī)誘變細(xì)菌然后克隆篩選或者細(xì)菌的遺傳改造。可以在另外修飾或者不另外修飾的情況下，在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意幾種類型的裝置中或者在當(dāng)前正在研發(fā)的其他類型的發(fā)酵設(shè)備中，實(shí)施提供給Clostridium coskatii (PS02)發(fā)酵的氣體(CO和/或H2和CO2)的代謝。實(shí)例包括但不限于泡罩塔反應(yīng)器、兩級(jí)生物反應(yīng)器、滴流床反應(yīng)器、膜反應(yīng)器、含有固定化細(xì)胞的填充床反應(yīng)器等。此類裝置的主要要求包括(I)Axenicity ；(2)厭氧條件；(3)維持溫度、壓力和pH的合適條件；(4)提供給培養(yǎng)物的底物的足夠數(shù)量；(5)可以容易地從細(xì)菌培養(yǎng)液中回收發(fā)酵的終產(chǎn)物。反應(yīng)器可以例如是，常規(guī)的攪拌釜反應(yīng)器、具有固定化的或者懸浮的細(xì)胞的柱發(fā)酵罐、連續(xù)流動(dòng)型反應(yīng)器、高壓反應(yīng)器、具有細(xì)胞再循環(huán)的懸浮細(xì)胞反應(yīng)器，以及以前所列的其他實(shí)例。此外，反應(yīng)器可以是以串聯(lián)和/或并聯(lián)排列的反應(yīng)器系統(tǒng)，其含有任意的上述反應(yīng)器。例如，可以將多個(gè)反應(yīng)器用于在一種設(shè)定條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并在另一種設(shè)定條件下，在最低生長(zhǎng)的情況下產(chǎn)生乙醇(或其他產(chǎn)物)。總之，允許進(jìn)行發(fā)酵，直到在培養(yǎng)基中產(chǎn)生了期望水平的產(chǎn)物例如乙醇。通常，該水平的乙醇在至少15克/升至50克/升培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，其中優(yōu)選的是至少30克/升的水平。Clostridiumcoskatii (PS02)仍是存活的,并且可以在至少60克/升的乙醇濃度中生長(zhǎng)。備選地，當(dāng)實(shí)現(xiàn)了一定速率的產(chǎn)生時(shí)，例如，當(dāng)由于例如細(xì)菌廢產(chǎn)物的積累、底物可用性的降低、產(chǎn)物的反饋抑制、存活細(xì)菌的數(shù)目降低或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一幾種其他原因，期望產(chǎn)物的產(chǎn)生速率降低時(shí)，可以中止生產(chǎn)。此外，存在連續(xù)的培養(yǎng)技術(shù)，其允許連續(xù)補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)去除已使用的培養(yǎng)基，包括其中的任一液體產(chǎn)物的情況下(即恒化器模式)。可以從培養(yǎng)物中去除由本發(fā)明的細(xì)菌產(chǎn)生的產(chǎn)物，并通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一幾種方法純化。例如，可以去除乙醇并進(jìn)一步加工，例如通過(guò)溶劑提取；蒸餾至共沸混合物然后共沸蒸餾；分子篩脫水；全蒸發(fā)；或流經(jīng)沸石管。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在工業(yè)中用于乙醇脫水然后蒸餾的兩種主要技術(shù)是共沸蒸餾和分子篩脫水。此外，取決于產(chǎn)物的數(shù)量，需要應(yīng)用幾種分離技術(shù)，以獲得若干純的產(chǎn)物。同樣地，可以通過(guò)相似的方法去除乙酸鹽并進(jìn)一步加工。Clostridium coskatii (PS02)獲自在 125mL 血清管中，在 C0:H2:N2:C02(7:37:33:23摩爾%)的大氣和初始ρΗ6· O下，使用Acetogen C3培養(yǎng)基，例如下文所述，通過(guò)以前所述的方法(Bryant, 1972),用收集自 Coskata-Coatue Wildlife Refuge inNantucket,Massachusetts的河口沉積物接種的厭氧富集物。使用Acetogen C3培養(yǎng)基和H2 (5%)、C02 (10%)和隊(duì)(85%)的大氣，從挑選自含瓊脂的(15%w: V)培養(yǎng)皿的單個(gè)菌落分離物中獲得的生物質(zhì)中，制備主細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)菌在2009年12月10日，作為菌株ATCC號(hào)PTA-10522保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)。幾種系統(tǒng)發(fā)生不同組別的厭氧細(xì)菌具有將CO、CO2和H2轉(zhuǎn)化成多種商業(yè)上重要的產(chǎn)物，包括乙酸、乙醇、丁酸、丁醇和氫的能力。選定的亞組，產(chǎn)乙醇梭菌屬表現(xiàn)出同時(shí)利用氫和一氧化碳形成乙醇(當(dāng)使用二氧化碳作為碳源時(shí)，形成少量乙酸)的獨(dú)特能力。已經(jīng)分析了 Clostridium coskatii (PS02)的系統(tǒng)發(fā)生、形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特性,并與其他相似的梭菌屬物種進(jìn)行了比較。 在該比較研究中使用的其他梭菌屬物種包括揚(yáng)氏梭菌PETC (ATCC號(hào)49587或DSMZ 號(hào) I3528) ；C. ragsdalei (ATCC BAA-622) ；C. autoethanogenum (DSMZ 號(hào) ΙΟΟΘΙ);揚(yáng)氏梭菌(C. Ijundgahlii)ERI-2 (ATCC 號(hào) 55380);和揚(yáng)氏梭菌 C-Ol (ATCC 號(hào) 55988)。ATCC樣品獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC ;Manassas，VA)。DSMZ樣品獲自德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) (DSMZ) GmbH(Braunschweig,德國(guó))。然而，自2010年2月I日起,揚(yáng)氏梭菌0_52不再是公共可獲得的，因?yàn)楸２卣呓K止了對(duì)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的供應(yīng)活動(dòng)。實(shí)施例I-細(xì)胞形態(tài)學(xué)Clostridium coskatii (PS02)的菌落表現(xiàn)為環(huán)形,顏色為白色至半透明，并且在Acetogen C3瓊脂板的中央輕微凸起。當(dāng)菌落齡期超過(guò)6_7天,顏色加深至褐色或者淺褐色。Clostridium coskatii (PS02)的細(xì)胞很少移動(dòng)，棒狀、革蘭氏染色陽(yáng)性，并且單獨(dú)地或者成串地出現(xiàn)。在C. coskatii細(xì)胞的薄切片的電子顯微照片中，可以看見(jiàn)與40-45nm細(xì)胞壁一致的外層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其支持了革蘭氏陽(yáng)性分配。在指數(shù)生長(zhǎng)早期中，細(xì)胞為O. 75μπιΧ3-4μπι并且是有周生鞭毛的(圖I)。孢子偶爾存在，但當(dāng)存在時(shí)，表現(xiàn)為中部-末端至末端膨脹，并且通常為球棒狀外型(圖2)。孢子形態(tài)學(xué)的該特性與熱醋穆?tīng)柺暇?Moorella thermoacetica) (Drake 等人，2006)相似，但顯著不同于 Clostridiumautoethanogenum (Abrini 等人，1994)或者 Clostridium ragsdalei (Huhnke 等人,2008)所觀察到的未膨脹的孢子形態(tài)學(xué)。對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)早期和晚期中細(xì)胞的電子顯微照片的比較顯示，細(xì)胞在生長(zhǎng)的晚期增加了其長(zhǎng)度(圖3)。對(duì)于表現(xiàn)出高體積乙醇濃度的老化批培養(yǎng)物(aged batch culture),觀察到了伸長(zhǎng)多達(dá)20-30 μ m的細(xì)胞,并顯示出與生理脅迫相關(guān)，因?yàn)楫?dāng)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基時(shí)，這些細(xì)胞并不容易回收。在伸長(zhǎng)的細(xì)胞中沒(méi)有觀察到孢子形成，其可能促進(jìn)不能回收這些細(xì)胞。將Acetogen C3培養(yǎng)基用于啟動(dòng)取自凍干的或者冰凍的主細(xì)胞庫(kù)(ImL當(dāng)量體積)的經(jīng)保存的培養(yǎng)物。在37°C溫度下，在100轉(zhuǎn)/分鐘的定軌搖床(5cm搖動(dòng)振幅)上培養(yǎng)該實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)物。使用由Balch和Wolfe (1976)所述的嚴(yán)格厭氧技術(shù)制備培養(yǎng)基，如在下表A、B、D和E中所詳述。滅菌后，將無(wú)氧的維生素溶液(表C)無(wú)菌地加入到瓶中，并使用104kPa (15psig)的最終壓力，將每一瓶的頂部空間用由C0:H2:N2:C02 ( 7 : 37 : 33 : 23摩爾％)組成的氣體混合物交換。標(biāo)準(zhǔn)接種量為10% (v/v),其轉(zhuǎn)移自生長(zhǎng)于指數(shù)期中期至晚期的儲(chǔ)用培養(yǎng)物。使用濃度為20g/L (pH 6. O)的 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES ;在 37V, pK=5. 97)控制分批發(fā)酵的pH。作為MES的替代物，可以使用濃度為20g/L的以下緩沖液來(lái)進(jìn)行pH生長(zhǎng)最適值研究MES (pH 4-6. 5)、哌嗪-N，N’ - 二(2-乙磺酸(PIPES ；pH 6. 6-7. 5 ;在 37°C下，pKa=6. 66)和三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS ；pH7. 5-8. 5 ;在 37°C,pKa=7. 72)。表A:礦物質(zhì)貯存液
項(xiàng)目組分量，g/L
~ NaCl80
2NH4Cl
3KCl10 ~ KH2PO4 10
5MgSO4. 7H20 20
~6CaCl2. 2H20 4表B:痕量金屬貯存液
項(xiàng)目組分量，g/L
~鹽酸，12. IN2.360
2MnSO4. H2O170
3FeSO4. 7H20~2~CoCl2.6H200 2
5ZnSO4. 7Η20Γ0
~6NiCl2.6Η200 2
~Na2MoO4. 2Η200 02
8Na2SeO4O. I
~9Na2WO402表C :維生素貯存液
權(quán)利要求
1.微生物Clostridiumcoskatii的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其具有ATCC號(hào)PTA-10522的全部鑒定特征。
2.微生物Clostridiumcoskatii, ATCC號(hào)PTA-10522的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其具有在厭氧條件下從選自一氧化碳、二氧化碳和氫或它們的組合的氣體底物中產(chǎn)生乙醇的能力。
3.權(quán)利要求2的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其中所述氣體底物通過(guò)合成氣提供。
4.微生物Clostridiumcoskatii, ATCC號(hào)PTA-10522的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其具有在厭氧條件下從選自一氧化碳、二氧化碳和氫或它們的組合的氣體底物中產(chǎn)生乙酸的能力。
5.權(quán)利要求4的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其中所述氣體底物通過(guò)合成氣提供。
6.微生物Clostridiumcoskatii, ATCC號(hào)PTA-10522的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其具有從包含碳源的厭氧含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生乙醇的能力。
7.權(quán)利要求6的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其中所述碳源不是有機(jī)復(fù)雜碳源。
8.權(quán)利要求6的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其中所述碳源不是酵母提取物。
9.微生物Clostridiumcoskatii, ATCC號(hào)PTA-10522的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其具有從由有機(jī)碳源組成的厭氧含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生物合成乙酸的能力。
10.微生物Clostridiumcoskatii的生物學(xué)純的培養(yǎng)物，其具有如SEQ ID NO. I、SEQID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 中給出的 16S rDNA 序列。
11.微生物Clostridiumcoskatii的生物學(xué)純的培養(yǎng)物,其具有在每毫升100 μ g氯霉素抗生素存在下生長(zhǎng)的能力。
12.產(chǎn)生乙醇的方法,其包括在允許Clostridiumcoskatii將碳源轉(zhuǎn)化成乙醇的條件下，組合碳源、電子源和Clostridium coskatii的步驟。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述碳源是C02。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述碳源是有機(jī)碳。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述電子源是H2或CO。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的梭菌屬細(xì)菌物種(Clostridium coskatii ATCC號(hào)PTA-10522，“PS02”)。在厭氧條件下，C.coskatii可以將CO和/或H2和/或CO2轉(zhuǎn)化成乙醇或乙酸。從而，該新的細(xì)菌能將廢氣(例如，合成氣和煉油廠廢氣)轉(zhuǎn)變成有用的產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12R1/145GK102939372SQ201180014236
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
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