專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)氣莢膜梭菌甘油脫水酶基因及其1,3－丙二醇的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行3-羥基丙醛和1，3-丙二醇生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇是生產(chǎn)聚對(duì)苯二甲酸丙二酯(PPT)的主要原料，也可用作合成增塑劑、洗滌劑、防腐劑、乳化劑的原料。特別是制造性能優(yōu)異的PTT纖維，既具有聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(PET)的性能，又具有尼龍良好的回彈性和抗污染性。在地毯、工程塑料、服裝面料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，成為目前國(guó)際上合成纖維開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。目前1，3-丙二醇的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法，如以乙烯為原料，在高溫(280□)下用銀作催化劑氧化成環(huán)氧乙烷，然后加氫和一氧化碳轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛，最后氫化成產(chǎn)品1，3-丙二醇；或者以丙烯為原料，在350□，0.2MPa下以鉬作催化劑氧化為丙烯醛，再水化為3-羥基丙醛，然后氫化成1，3-丙二醇。這些方法都需要在高溫和貴重催化劑作用下進(jìn)行，產(chǎn)品除1，3-丙二醇外還有1，2-丙二醇及其二聚體、三聚體等性質(zhì)相近的副產(chǎn)物，致使產(chǎn)品分離純化較困難，生產(chǎn)成本較高，而且會(huì)照成環(huán)境的污染，因此現(xiàn)在人們把目光轉(zhuǎn)移到生物法生產(chǎn)上。目前發(fā)現(xiàn)的能以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的天然菌主要有乳桿菌屬(Lactobacillus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、梭菌屬(Clostridium)等。微生物在以甘油為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1，3-丙二醇的過(guò)程中，起主要反應(yīng)的關(guān)鍵酶為甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶。第一步，甘油脫水酶催化甘油轉(zhuǎn)化成3-羥基丙醛和水(反應(yīng)式1)，第二，3-羥基丙醛被NAD+偶聯(lián)的氧化還原酶還原成1，3-丙二醇(反應(yīng)式2)。
甘油→3-羥基丙醛+水 (反應(yīng)式1)3-羥基丙醛+NADH+H+→NAD++1，3-丙二醇(反應(yīng)式2)反應(yīng)第一步的甘油脫水酶是1，3-丙二醇生產(chǎn)的限速酶，對(duì)1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率起著至關(guān)重要的作用，無(wú)疑，提高它的酶活力有助于提高生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率。甘油脫水酶主要分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是依賴(lài)輔酶B12共同作用才有活力；另一類(lèi)是不依賴(lài)輔酶B12也有活力。目前，據(jù)報(bào)道只有丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)的甘油脫水酶是不依賴(lài)輔酶B12，其它細(xì)菌的甘油脫水酶都是依賴(lài)輔酶B12的，本發(fā)明所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌甘油脫水酶也是必須和輔酶B12共同作用才顯不活力。
在目前的公開(kāi)文獻(xiàn)中，我們檢索到一些有關(guān)甘油脫水酶的公開(kāi)報(bào)道如下題名克氏桿菌gldA基因亞克隆及其原核表達(dá)載體構(gòu)建作者邵敬偉[1]郭養(yǎng)浩[1]吳志香[2]劉長(zhǎng)江[3]機(jī)構(gòu)[1]福州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，福州350002[2]遼寧中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，沈陽(yáng)110032[3]沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，刊名農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).2005，13(2).-260-2文摘甘油脫水酶(glycerol dehydratase EC 4.2.1.30)是控制甘油分解和產(chǎn)生1，3-丙二醇的關(guān)鍵性限速酶。甘油脫水酶是由α、β和γ3個(gè)亞基組成的復(fù)合物(α2β2γ2)，分別由gldA、gldB和gldC基因編碼。研究(Frank et al.1998；Macis et al.，1998；Markus et al.，1996)認(rèn)為甘油脫水酶α亞基無(wú)論在甘油脫水酶的結(jié)構(gòu)上還是功能上都起到重要的作用。本研究克隆了克氏桿菌的甘油脫水酶α亞基基因(gldA)并構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，為甘油脫水酶基因的進(jìn)一步表達(dá)研究及探索其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
題名重組甘油脫水酶的活性鑒定作者陳永勝[1]劉長(zhǎng)江[2]李長(zhǎng)彪[2]翟景波[3]機(jī)構(gòu)[1]內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，寶生物工程大連有限公司，刊名內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版.2005，20(2).-172-1文摘通過(guò)MBTH方法對(duì)重組甘油脫水酶活性進(jìn)行檢測(cè)。確定穩(wěn)定的酶活檢測(cè)系統(tǒng).結(jié)果顯示重組甘油脫水酶的活性明顯高于野生菌.此外，甘油脫水酶單個(gè)亞基及亞基兩兩組合未檢測(cè)到酶活性.這一結(jié)果將對(duì)酶活性研究具有重要的意義.
題名甘油脫水酶gldC基因克隆、表達(dá)與鑒定作者陳永勝[1]劉長(zhǎng)江[2]劉春萍[2]邵敬偉[2]翟景波[3]機(jī)構(gòu)[1]內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，[2]沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110161[3]寶生物工程大連有限公司，刊名生物技術(shù).2005，15(1).-1-文摘目的表達(dá)及純化甘油脫水酶γ亞基蛋白。方法使用PCR及DNA重組技術(shù)，將甘油脫水酶7亞基基因gldC重組到含麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的融合蛋白表達(dá)載體pMAL-c2x中，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pMAL/gldC的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析顯示表達(dá)出的MBP-gldC融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約66kD，與預(yù)期大小一致，并經(jīng)Western blot分析證實(shí)。用直鏈淀粉樹(shù)脂親和層析純化得到電泳均一的融合蛋白。結(jié)論成功地獲得甘油脫水酶γ亞基融合蛋白，以便進(jìn)一步研究其生物學(xué)性能。
題名微生物源甘油脫水酶的研究進(jìn)展作者邵敬偉機(jī)構(gòu)福州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，刊名鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào).2004，25(4).-85-88關(guān)鍵詞脫水酶 甘油 微生物源 失活 酶活測(cè)定 發(fā)酵 研究前景 研究進(jìn)展 自殺 酶基因文摘綜述了甘油脫水酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、酶活測(cè)定及其在甘油發(fā)酵中的作用機(jī)理等研究情況，介紹了甘油脫水酶基因工程的研究進(jìn)展，并對(duì)其參與甘油脫水酶自殺性失活的再生反應(yīng)進(jìn)行了介紹，探討了甘油脫水酶的研究前景并提出一些建議。
題名能量驅(qū)動(dòng)對(duì)Klebsiella pneumoniae發(fā)酵甘油合成1，3-丙二醇的影響作者張延平 饒治 杜晨宇 李春 曹竹安機(jī)構(gòu)清華大學(xué)化工系生物化工研究所，刊名過(guò)程工程學(xué)報(bào).2004，4(6).-567-5文摘考察了外加能量對(duì)Klebsiella pneumoniae合成1，3-丙二醇的影響，結(jié)果表明，外加0.6～0.8g/L三磷酸腺苷(ATP)可以有效促進(jìn)Klebsiella pneumoniae發(fā)酵甘油的還原代謝，1，3-丙二醇產(chǎn)量提高了50％～70％，得率在發(fā)酵后期仍能維持在較高水平.利用休止細(xì)胞研究了甘油脫水酶催化失活后能量刺激復(fù)活的情況，結(jié)果表明外加三磷酸腺苷(ATP)對(duì)休止細(xì)胞中甘油脫水酶的復(fù)活有明顯的驅(qū)動(dòng)作用，經(jīng)多次失活/驅(qū)動(dòng)復(fù)活后甘油脫水酶活性可維持不變.
題名途徑工程生產(chǎn)1，3-丙二醇的研究進(jìn)展作者楊登峰 韋宇拓 杜麗琴 黃日波機(jī)構(gòu)廣西大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心，刊名現(xiàn)代化工.2004，24(11).-24-2文摘利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)1，3-丙二醇，特別是途徑工程的利用已取得了重大突破。利用生物技術(shù)生產(chǎn)1，3-丙二醇的成本比化學(xué)法的低25％，它將逐步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。介紹了一步法生產(chǎn)1，3-丙二醇的超級(jí)基因工程菌所需的3-磷酸甘油脫氫酶(GPD1)、甘油3-磷酸酶(GPP2)、甘油脫水酶(dhaB)和1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)，并對(duì)關(guān)鍵酶dhaB進(jìn)行了分析，同時(shí)介紹了穿梭質(zhì)粒和甘油-3-磷酸酶積累對(duì)生產(chǎn)的影響。最后，對(duì)今后的研究重點(diǎn)和策略進(jìn)行了探討。
題名編碼1，3-丙二醇氧化還原酶基因的克隆和表達(dá)作者遲乃玉[1]劉長(zhǎng)江[2]劉英昊[3]張慶芳[1]鄭學(xué)仿[4]機(jī)構(gòu)[1]大連大學(xué)生物工程學(xué)院[2]沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院沈陽(yáng)110161[3]中國(guó)科學(xué)院微生物研究所[4]大連大學(xué)生命科學(xué)工作刊名微生物學(xué)報(bào).2003，43(6).-717-文摘采用PCR法克隆了巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)CpN-86菌株編碼1，3-丙二醇氧化還原酶基因(dhaT基因)；完成了dhaT基因測(cè)序、表達(dá)載體構(gòu)建和在大腸桿菌中表達(dá)；分離和純化了dhaT基因表達(dá)的重組蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)PCR法克隆的dhaT基因和肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonine菌株dhaT基因的序列同源性為82.9％；(2)dhaT基因表達(dá)蛋白的酶活為108U/mg；(3)dhaT基因表達(dá)的蛋白分子量為43kD；(4)Western blot確定了dhaT基因表達(dá)的蛋白和CpN-86菌株天然蛋白有相同的抗原反應(yīng)。
8題名克雷伯氏菌1，3-丙二醇氧化還原酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)作者周文廣 黃日波機(jī)構(gòu)廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，蛋白質(zhì)與酶工程發(fā)酵所，刊名廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué).2004，23(2).-145-148文摘以基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)從克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中擴(kuò)增得到含有1，3-丙二醇氧化還原酶基因(dhaT)的DNA片段，將其定向連接到克隆質(zhì)粒pGEM-3xf上，得到重組質(zhì)粒pGEM-dhaT。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌Escherichia coli DH5α中，通過(guò)藍(lán)白斑鑒定挑選出陽(yáng)性菌株。DNA序列分析表明其基因全長(zhǎng)為1185bp。將該片段插入表達(dá)載體pSE380，構(gòu)建成重組子pSE-dhaT，并在E.coli JM109中獲得表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量與天然純1，3-丙二醇氧化還原酶(DHAT)相同，約為43ku。
9題名克雷伯桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇關(guān)鍵酶發(fā)酵條件研究作者陳宏文[1]王蔚[2]方柏山[2]胡宗定[1]機(jī)構(gòu)[1]天津大學(xué)化工學(xué)院生化工程系，[2]華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系，福建泉州刊名高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào).2004，18(5).-621-62文摘研究了克雷伯桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇關(guān)鍵酶(甘油脫氫酶、1，3-丙二醇氧化還原酶、甘油脫水酶)的發(fā)酵條件。研究各種碳源、無(wú)機(jī)氮源、有機(jī)氮源及無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成，結(jié)果為(g·L＾-1)甘油30、KCl 1.6、NH4Cl 6.7、CaCl2 0.28、酵母浸膏2.8。在溫度37℃、初始pH7.0、搖床轉(zhuǎn)速200r·min＾-1和接種量5％條件下，發(fā)酵24h，無(wú)細(xì)胞抽提液中甘油脫氫酶、1，3-丙二醇氧化還原酶和甘油脫水酶活力(U·mg＾-1)分別為9.16、18.72、0.48，發(fā)酵34h，發(fā)酵液中1，3-丙二醇(1，3-PD)最大濃度為7.96g·L＾-1。代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶酶活與1，3-PD峰值出現(xiàn)時(shí)間不一致，且提早于1，3-PD峰值的出現(xiàn)。此外，結(jié)果表明優(yōu)化后的培養(yǎng)基去除了多種微量元素，克雷伯桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇關(guān)鍵酶可以在微氧條件下進(jìn)行。
10題名克雷伯桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇關(guān)鍵酶發(fā)酵條件研究作者陳宏文[1]王蔚[2]方柏山[2]胡宗定[1]機(jī)構(gòu)[1]天津大學(xué)化工學(xué)院生化工程系，天津300072[2]華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系，刊名高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào).2004，18(5).-621-62文摘研究了克雷伯桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇關(guān)鍵酶(甘油脫氫酶、1，3-丙二醇氧化還原酶、甘油脫水酶)的發(fā)酵條件。研究各種碳源、無(wú)機(jī)氮源、有機(jī)氮源及無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成，結(jié)果為(g·L＾-1)甘油30、KCl 1.6、NH4Cl 6.7、CaCl2 0.28、酵母浸膏2.8。在溫度37℃、初始pH7.0、搖床轉(zhuǎn)速200r·min＾-1和接種量5％條件下，發(fā)酵24h，無(wú)細(xì)胞抽提液中甘油脫氫酶、1，3-丙二醇氧化還原酶和甘油脫水酶活力(U·mg＾-1)分別為9.16、18.72、0.48，發(fā)酵34h，發(fā)酵液中1，3-丙二醇(1，3-PD)最大濃度為7.96g·L＾-1。代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶酶活與1，3-PD峰值出現(xiàn)時(shí)間不一致，且提早于1，3-PD峰值的出現(xiàn)。此外，結(jié)果表明優(yōu)化后的培養(yǎng)基去除了多種微量元素，克雷伯桿菌生產(chǎn)1，3-丙二醇關(guān)鍵酶可以在微氧條件下進(jìn)行。
1題名Klebsiella pneumoniae甘油脫水酶α亞基基因的克隆與序列分析作者邵敬偉劉長(zhǎng)江機(jī)構(gòu)沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，刊名無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào).2004，23(2).-27-30文摘甘油脫水酶是1，3-丙二醇發(fā)酵過(guò)程中的重要限速酶，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景.其中α亞基為甘油脫水酶的主要組成部分，該基因的正確克隆與分析對(duì)甘油脫水酶的正確表達(dá)起重要作用.作者采用PCR技術(shù)，從肺炎克雷伯氏桿菌A.S.1.1736基因組中擴(kuò)增得到了編碼甘油脫水酶α亞基的gldA基因，并將其克隆至pMD18-T載體中.經(jīng)核苷酸序列分析證實(shí)，gldA基因開(kāi)放閱讀框架由1668bp組成.經(jīng)GenBank檢索對(duì)照分析，gld基因序列與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的同源性達(dá)99.34％，表明所克隆的gldA基因即為克雷伯氏甘油脫水酶α亞基基因.
1題名重組依賴(lài)輔酶B12的甘油脫水酶基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建作者邵敬偉[1]劉長(zhǎng)江[1]呂淑霞[2]吳志香[3]機(jī)構(gòu)[1]沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，[2]沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，[3]遼寧中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，刊名生物技術(shù)通訊.2004，15(1).-13-1文摘采用PCR方法從肺炎克雷伯氏桿菌基因組中分別擴(kuò)增得到了編碼依賴(lài)輔酶B12的甘油脫水酶α、β、γ三個(gè)亞基的基因gldA、gldB、gld將gldBC基因克隆至pSIM-T載體上，經(jīng)測(cè)序正確后亞克隆至pGEX-4T-1載體中。將gldA進(jìn)行T-A克隆后測(cè)定核苷酸序列正確，亞克隆至連有g(shù)ldBC基因的pGEX-4T-1載體中。從而成功的構(gòu)建了gldABC基因的同向串聯(lián)原核融合表達(dá)載體pGEX-gldABC。
1題名MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建作者邵敬偉[1]劉長(zhǎng)江[1]陳永勝[1]葉秀秀[2]機(jī)構(gòu)[1]沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，[2]浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，刊名生物技術(shù).2003，13(6).-1-文摘目的構(gòu)建可高效生產(chǎn)甘油脫水酶的大腸桿菌工程菌，方法將編碼甘油脫水酶的三個(gè)基因gldA、gldB、gldC，分別克隆至克隆載體pMD18-T和pSIM-T中，經(jīng)測(cè)序正確后，再亞克隆至表達(dá)融合蛋白的高效表達(dá)載體pMAL-c2X上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pMAL-gldABC，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α。結(jié)果成功地將甘油脫水酶基因gldABC以同向串聯(lián)方式克隆到大腸桿菌融合表達(dá)載體pMAL-c2X中，結(jié)論得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表達(dá)載體，為研究甘油脫水酶基因(gldABC)的在原核表達(dá)載體中的串聯(lián)表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
上述有的文獻(xiàn)是本發(fā)明人的前期研究，公開(kāi)了選用克雷伯氏菌，培養(yǎng)并分離得到編碼甘油脫水酶基因，并將其克隆至表達(dá)載體中，然后導(dǎo)入大腸桿菌中生產(chǎn)1，3-丙二醇，但這些文獻(xiàn)介紹的研究還存在一些問(wèn)題，如僅僅是對(duì)克雷伯氏菌脫水酶酶學(xué)性質(zhì)和在大腸桿菌中表達(dá)的研究，而沒(méi)有對(duì)其它可能具有更高酶活性和更有利用前途的甘油脫水酶的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在分析上百種微生物的基因組時(shí)，發(fā)現(xiàn)可以用生物信息學(xué)的方法在一系列未注釋的脫氧核糖核酸中發(fā)現(xiàn)非常有用的信息。結(jié)合基因的克隆和異源基因表達(dá)技術(shù)，以及通過(guò)對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行特性特征鑒定，發(fā)現(xiàn)了在蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank中注釋為“未知蛋白”或推測(cè)是蛋白質(zhì)”的極為有用基因，其中包括至今為止人們并未發(fā)現(xiàn)的甘油脫水酶基因，并把這種脫水酶基因經(jīng)過(guò)克隆到大腸桿菌中表達(dá)，在宿主中表達(dá)出酶活很高的甘油脫水酶，使基因工程菌能以甘油、葡萄糖等碳源發(fā)酵得到1，3-丙二醇，是一種有利用前途的甘油脫水酶基因。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)類(lèi)似，首先是選擇可以分離出具有甘油脫水酶的菌種，并擴(kuò)大培養(yǎng)菌種，從該菌克隆出甘油脫水酶基因，將甘油脫水酶基因及其它相關(guān)基因在大腸桿菌中表達(dá)，然后再以碳源為底物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇。
本發(fā)明所述的選擇可以分離出甘油脫水酶的菌種是產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridium perfringensCVCC 2015)，該菌種可以從微生物菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)，也可以通過(guò)野外采集和其他途徑獲得。
本發(fā)明所述的甘油脫水酶生產(chǎn)1，3丙二醇代謝工程菌的構(gòu)建，是先克隆到釀酒酵母的3-磷酸甘油脫氫酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大腸桿菌例如BL21(DE3)菌株中進(jìn)行高效表達(dá)；構(gòu)建得到能轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)甘油的工程菌，把克隆得到的甘油脫水基因轉(zhuǎn)化到上述工程菌進(jìn)行多個(gè)基因共表達(dá)，獲得生產(chǎn)1，3-丙二醇的代謝工程菌。
本發(fā)明所述的從產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridium perfringens)克隆出甘油脫水酶基因的方法是設(shè)計(jì)以下引物1、正向引物(Sense primer)5’-ACTCATATGAAATCTAAAAGATTCCAAGTAT-3’2、反向引物(Antisense Primer)5’-ATAGGATCC TTACTCTTCTATTCTTAATTTATTT-3’然后用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從基因組里獲得目的基因，然后用的專(zhuān)用試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行初步純化。首先94℃2分鐘；然后按以下條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃30秒，56℃30秒，72℃2分30秒；最后72℃10min。市售的PCR產(chǎn)物純化試劑盒都可以用于純化，如Takara，Promega，Invitrogen等公司的專(zhuān)用試劑盒都可以用于PCR產(chǎn)物的純化。純化后用NdeI和BamHI限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再與同樣用NdeI和BamHI雙酶切過(guò)的pET22b+質(zhì)粒連接，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET22b-dhaB。
產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridium perfringens)分離得到的甘油脫水酶具有以下特征1、有大、中、小三個(gè)亞基，分子量分別為61.0kD，20.9kD，16.3kD。
2、大、中、小三個(gè)亞基的等電點(diǎn)分別為4.72，6.67，5.11。
3、酶的最適反應(yīng)溫度為35～50℃，優(yōu)選40～45℃。
4、酶的反應(yīng)的pH是8.0～10.0，優(yōu)選pH9.0～9.5。
5、當(dāng)輔酶B12不存在下，該酶沒(méi)有活力。
6、加入輔酶B12后，該酶在有氧氣或在甘油存在的情況，活性急劇下降。
本發(fā)明所述的將甘油脫水酶基因及其它相關(guān)基因在大腸桿菌中表達(dá)的方法為將甘油脫水酶基因(dhaB)在大腸桿菌中表達(dá)的工藝是制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，然后用重組質(zhì)粒pET22b-dhaB轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，得重組大腸桿菌pET22b-dhaB。
按《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(1989年第二版)所述的方法，制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，然后用pET22b+-dhaB轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，于32-38℃培養(yǎng)10～20小時(shí)，挑出單菌落接入含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，32-38℃、220rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)10-20小時(shí)，取培養(yǎng)物200μl接入20ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，32-38℃、220rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)直到OD值為0.4～0.6，然后加入IPTG至終濃度為1mM，再繼續(xù)于32-38℃培養(yǎng)10～20小時(shí)。離心收集菌體后，即可進(jìn)行蛋白質(zhì)變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳和酶活的測(cè)定。
在可使甘油脫水酶基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)該重組菌，把細(xì)胞破碎后用1，2-丙二醇做底物，在添加輔酶B12的條件下，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定甘油脫水酶的酶活性，證明該重組菌具有甘油脫水酶活性。
本發(fā)明所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌甘油脫水酶核苷酸序列SEQ ID NO.1。甘油脫水酶基因全長(zhǎng)2687bp，通過(guò)對(duì)這個(gè)序列的分析顯示，存在大小分別為1662bp、570bp和423bp三個(gè)讀碼框；這個(gè)基因和其它菌的相應(yīng)基因比較，其最高相似性低于74％。根據(jù)核苷酸序列SEQ ID NO1，推測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌甘油脫水酶蛋白含有三個(gè)不同的亞基，分為大亞基、中亞基、小亞基。大亞基由554個(gè)氨基酸組成，分子量為60,960Da；中亞基由190個(gè)氨基酸組成，分子量為20,859Da；小亞基由141個(gè)氨基酸組成，分子量為16,282Da，其氨基酸序列分別見(jiàn)SEQ ID NO2、SEQ IDNO3和SEQ ID NO4。通過(guò)對(duì)本發(fā)明涉及的甘油脫水酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其它菌的甘油脫水酶氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明菌株CVCC 2015的甘油脫水酶屬于依賴(lài)輔酶B12的脫水酶家族的一員，與其它報(bào)道的甘油脫水酶的氨基酸序列相比，其相同性小于80％。
編碼本發(fā)明所述的甘油脫水酶基因，以前功能未確定的DNA片段，長(zhǎng)度為2687個(gè)堿基對(duì)，其中包含3個(gè)ORF分別編碼三個(gè)亞基，氨基酸?；虻膲A基組成是1 GTGAAATCTA AAAGATTCCA AGTATTATCA GAACGTCCTG TAAACCAAGA51 TGGACTTATA GGAGAGTGGG CTGATGAAGG CTTAATAGCT TTAGATAGTC101 CAAATGATCC AAAATCATCA ATAAAAATAG AAAATGGAAT AATTACTGAA151 TTAGACGGCA GATCAAGAGA TGAGTTTGAT ATGATAGATA AATTTATAGC201 AGAGTACGCT ATAAATATAG AAGACGCAGA AGCATCTATG AAACTTTCAT251 CTAAAGAAAT AGCAAGAAGA TTAGTTGATA TAAATGTTAG TAGAGATGAA301 ATAGTAAAAA TCACTACTTC AATAACACCA ATGAAGGCTG TAGAAGTTAT351 TCAAGAAATG AACGTTGTTG AAATGATGAT GGCTCTTCAA AAAATGAGAG401 CAAGAAGAAC ACCTGCTAAC CAATGTCACG TTACTAACGT AAAAGACAAC451 CCAGTTCAAA TAGCAGCAGA TGCTGCAGAG GCTGCTTTAA GAGGATTCGC501 AGAGCAAGAA ACTACAGTAG GTATAGTTAG ATATGCACCT TTTAATGCAT551 TAGCTATCTT AGTAGGTTCA CAAGTAGGTA GAGGAGGAGT TTTAACTCAA
601 TGTGCAGTTG AGGAAGCTAC TGAACTTGAC CTAGGAATGA GAGGACTTAC651 AAGTTATGCA GAAACAGTTT CAGTTTATGG AACAGAATCA GTATTTACAG701 ATGGAGATGA TACTCCATGG TCAAAAGCAT TCTTAGCATC AGCTTATGCT751 TCAAGAGGAC TTAAGATGAG ATTTACATCA GGTTCAGGTT CAGAAGCATT801 AATGGGATAC TCAGAAGGTA GATCAATGCT TTACTTAGAA TCAAGATGTA851 TATATATAAC TAAGGGAGCT GGAGTTCAAG GATTACAAAA TGGTGCAGTT901 AGTTGTATAG GTATGACAGG AGCAGTTCCA TCAGGAATAA GAGCAGTTCT951 TGGAGAAAAC TTAATAGCTG CAATGCTTGA TATAGAGGTT GCATCAGCAA1001 ATGACCAAAC ATTCTCACAC TCAGACATAA GAAGAACAGC AAGAATGTTA1051 ATGCAAATGC TTCCAGGAAC AGACTTCATA TTCTCAGGAT ATAGTGCAGT1101 TCCAAACTAC GATAACATGT TTGCTGGATC AAACTTTGAT GCAGAAGACT1151 TTGATGATTA CAACATACTT CAAAGAGACT TAAAAGTTGA CGGTGGATTA1201 AGACCAGTTA CAGAAGAAGA AACTATAAAG GTTAGAAATA AAGCTGCTAA1251 ATGCATACAA ATAATCTTTA GAGAATTAGG ATTCCCAGAA GTTACTGATG1301 AAGAAGTAGA AGCTGCAACT TACTGTCACG GAAGTAAGGA AATGCCAAAC1351 AGAAATGTAG TTGAAGATTT AAAGGCTGCA GAAGAAATGT TAGAAAGAAG1401 AATAACAGGA TTAGATATAA TAAAAGCTTT AAGCAAAAAT GGTATGGAAG1451 ATATAGCAAA CAACTTATTA AACATGCTTA AGCAAAGAGT TACTGGAGAT1501 TATCTTCAAA CTTCAGCAAT TTTAGATAAA GATTTCAATG TTATAAGTGC1551 TGTTAATGAT GTAAATGACT ATATGGGACC TGGAACAGGA TATAGACTAG1601 ATGGTCAAAG ATGGGAAGAA ATCAAAAAAG TTCCTACAGT AATGAGACCA1651 GAGGATATAG AGTAGGGGGA GAATGACAAT GGAAGAAAGA ACTTTTATAC1701 CAGAAATAAC AGTTGAAGAA GTTGGAGAAG CTAAGGTTGG TTTAAGATCA1751 GATGAAGTTG TTATAGGATT AGCACCTGCA TTTTTAAAAT ATCAAAATAA1801 AACAATAGTA GATGTTCCTC ATACTGAAAC TTTACTTGAA ATTATAGCAG1851 GTATTGAAGA AGAAGGATTA CATGCAAGAG TAGTTAGAAT TTTAAGAACA1901 TCTGATGTAT CTTTTATAGC TCATGATGCA GCTTGTTTAA GTGGATCAGG1951 AATAGGTATA GGAATACAAT CAAAAGGTAC TACAGTAATA CATCAAAAAG2001 ATTTATTACC ATTAAATAAC TTAGAATTAT TCTCACAAGC TCCGCTTTTA2051 ACTACAGAAA CATATAGATT AATCGGAAAA AATGCTGCTA AATATGCTAA2101 AGGTGAGTCA CCAACACCAG TACCAGTAAA AAATGACCAA ATGGTTAGAC2151 CTAAATTCAT GGCAAAGGCA GCTTTATTAC ACATAAAAGA AACTAAACAC2201 GTTGAACCAG GTAAAAAGCC AGTTCAATTA GAAGTTAAGT TTTAATTTAG2251 AAAGGATTGA AATCATGGAA AATAAGAGAA TGACTGCTGC AGATTATCCT2301 TTAACTTCTA AGAGAAAAGG AGATATAAAA ACTCCTACAG GAAAAGCTTT2351 AGAAGATATA ACTTTAGAAA AAGTTTTAAG TGGAGAAATC AATGCAGATG2401 ATATAAGAAT TTCACCAGAA ACTTTAGAAA TGCAAGCTCA AATAGCTGAA2451 AGCATGAACA GAGATGCTAT AGCTAGAAAC TTTAGAAGAG CTGCGGAGCT2501 TATAAGAGTT CCAGACGATA GAATATTAGA GATGTACAAT GCTTTAAGAC
2551 CATATCGTTC AACAAAAGAA GATTTATTCA AAATAGCTGA TGAACTTGAA2601 ACAAAATATG ATGCTAAAGT TAATGCTGAT TTTGTTAGAG AAGCAGCTGA2651 AGTATATGAA ACTAGAAATA AATTAAGAAT AGAAGAG編碼本發(fā)明所述的甘油脫水酶的氨基酸序列第一個(gè)亞基為554個(gè)氨基酸1 VKSKRFQVLS ERPVNQDGLI GEWADEGLIA LDSPNDPKSS IKIENGIITE51 LDGRSRDEFD MIDKFIAEYA INIEDAEASM KLSSKEIARR LVDINVSRDE101 IVKITTSITP MKAVEVIQEM NVVEMMMALQ KMRARRTPAN QCHVTNVKDN151 PVQIAADAAE AALRGFAEQE TTVGIVRYAP FNALAILVGS QVGRGGVLTQ201 CAVEEATELD LGMRGLTSYA ETVSVYGTES VFTDGDDTPW SKAFLASAYA251 SRGLKMRFTS GSGSEALMGY SEGRSMLYLE SRCIYITKGA GVQGLQNGAV301 SCIGMTGAVP SGIRAVLGEN LIAAMLDIEV ASANDQTFSH SDIRRTARML351 MQMLPGTDFI FSGYSAVPNY DNMFAGSNFD AEDFDDYNIL QRDLKVDGGL401 RPVTEEETIK VRNKAAKCIQ IIFRELGFPE VTDEEVEAAT YCHGSKEMPN451 RNVVEDLKAA EEMLERRITG LDIIKALSKN GMEDIANNLL NMLKQRVTGD501 YLQTSAILDK DFNVISAVND VNDYMGPGTG YRLDGQRWEE IKKVPTVMRP551 EDIE第二個(gè)亞基為190個(gè)氨基酸1MTMEERTFIP EITVEEVGEA KVGLRSDEVV IGLAPAFLKY QNKTIVDVPH51 TETLLEIIAG IEEEGLHARV VRILRTSDVS FIAHDAACLS GSGIGIGIQS101 KGTTVIHQKD LLPLNNLELF SQAPLLTTET YRLIGKNAAK YAKGESPTPV151 PVKNDQMVRP KFMAKAALLH IKETKHVEPG KKPVQLEVKF第三個(gè)亞基為141個(gè)氨基酸1 MENKRMTAAD YPLTSKRKGD IKTPTGKALE DITLEKVLSG EINADDIRIS51 PETLEMQAQI AESMNRDAIA RNFRRAAELI RVPDDRILEM YNALRPYRST101 KEDLFKIADE LETKYDAKVN ADFVREAAEV YETRNKLRIE E本發(fā)明所述工程菌發(fā)酵的碳源是淀粉水解得到的葡萄糖或甘油，所述的淀粉包括稻米淀粉、小麥淀粉、玉米淀粉、紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉或者其它谷類(lèi)和薯類(lèi)淀粉。
本發(fā)明所述的發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法是
以淀粉水解成葡萄糖或甘油等碳源為出發(fā)原料，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇，首先將碳源用水稀釋后加入到LB液體培養(yǎng)基中使糖的終濃度為1％，然后接種含有甘油脫水酶的1，3-丙二醇的代謝工程菌，在35℃，200rpm，通風(fēng)量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，8小時(shí)后開(kāi)始流加葡萄糖，并通過(guò)流加氨水和檸檬酸來(lái)保持pH的穩(wěn)定。連續(xù)發(fā)酵32-40小時(shí)后用高效液相來(lái)分析發(fā)酵液中的葡萄糖和1，3-丙二醇的含量，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖量不再減少及1，3-丙二醇的量不再增加時(shí)停止發(fā)酵。
如果是淀粉，需要經(jīng)α-淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成的葡萄糖，將獲得的葡葡萄糖作為碳源加入培養(yǎng)基使糖的終濃度為1％，然后進(jìn)行上述含有甘油脫水酶的1，3-丙二醇的代謝工程菌發(fā)酵。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是1、有大、中、小三個(gè)亞基，分子量分別為61.0kD，20.9kD，16.3kD。
2、大、中、小三個(gè)亞基的等電點(diǎn)分別為4.72，6.67，5.11。
3、酶的最適反應(yīng)溫度為35～50℃，優(yōu)選40～45℃。工業(yè)化生產(chǎn)中可節(jié)省能源。
4、酶的反應(yīng)的pH是8.0～10.0，優(yōu)選pH9.0～9.5。
5、當(dāng)輔酶B12不存在情況下，該酶沒(méi)有活力。
6、在厭氧的條件下能將甘油轉(zhuǎn)化成3-羥基丙醛。
7、純化的酶在體外保存30天，活力幾乎不損失。
本發(fā)明的甘油脫水酶基因制備1，3-丙二醇的方法，包括以下工藝步驟1)具體實(shí)施方式
以下是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)和實(shí)例，下述實(shí)驗(yàn)和實(shí)例所述內(nèi)容屬于本發(fā)明的主要內(nèi)容，但并不僅僅限于這些內(nèi)容。有些可以顯而易見(jiàn)地?cái)U(kuò)展的內(nèi)容雖然并未在本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中出現(xiàn)，但也應(yīng)屬于本發(fā)明的專(zhuān)利請(qǐng)求保護(hù)范圍。
實(shí)施例1一、產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA的提取采用產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC 2015(購(gòu)于中國(guó)中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)，接種產(chǎn)氣莢膜梭菌在20ml皰肉培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱里37□培養(yǎng)過(guò)夜。取1.5ml培養(yǎng)物離心2min，于沉淀物中加入567μl的TE緩沖液和20μl(100mg/ml)溶菌酶，重懸混勻后于37□放置2小時(shí)；之后加入30μl10％的SDS和3μl20mg/ml的蛋白酶K，混勻，于37□溫育1小時(shí)。然后加入100μl5mol/L的NaCl，充分混勻，再加入80μlCTAB/NaCl溶液，混勻，于65□溫育10分鐘。該溶液用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，然后再用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，取上清用0.6倍體積的異丙醇沉淀，收DNA，70％乙醇洗滌2次，沉淀溶于100μlTE緩沖液中。
二、甘油脫水酶基因的克隆設(shè)計(jì)以下引物1、正向引物(Sense primer)5’-ACTCATATGAAATCTAAAAGATTCCAAGTAT-3’2、反向引物(Antisense Primer)5’-ATAGGATCCTTACTCTTCTATTCTTAATTTATTT-3’然后按PCR Cloning Protocols中所講的步驟進(jìn)行首先94℃2分鐘；然后按以下條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃30秒，56℃30秒，72℃2分30秒；最后72℃10min。
用Takara的專(zhuān)用試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行初步純化，然后用NdeI和BamHI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再與同樣用NdeI和BamHI酶切過(guò)的pET22b+質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒pET22b+-dhaB。
三、甘油脫水酶基因(dhaB)在大腸桿菌中的表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b+-dhaB構(gòu)建完畢，先轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，大量制備pET22b+-dhaB表達(dá)質(zhì)粒，所得質(zhì)粒可用一部分用于DNA測(cè)序以確認(rèn)讀碼框的正確性，另一部分則可以用來(lái)進(jìn)行甘油脫水酶基因表達(dá)試驗(yàn)。
按《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(1989年第二版)所述的方法，制備大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，然后用pET22b+-dhaB轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，于32-38℃培養(yǎng)10～20小時(shí)，挑出單菌落接入含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，32-38℃、220rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)10-20小時(shí)，取培養(yǎng)物200μl接入20ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，32-38℃、220rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)直到OD值為0.4～0.6，然后加入IPTG至終濃度為1mM，再繼續(xù)于32-38℃培養(yǎng)10～20小時(shí)。離心收集菌體后，即可進(jìn)行蛋白質(zhì)變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳和酶活的測(cè)定。
四、生產(chǎn)1，3-丙二醇代謝工程菌的構(gòu)建(1)克隆到釀酒酵母的3-磷酸甘油脫氫酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中進(jìn)行高效表達(dá)；構(gòu)建得到能轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)甘油的工程菌。(2)把克隆得到的甘油脫水基因轉(zhuǎn)化到上述工程菌進(jìn)行多個(gè)基因共表達(dá)，獲得生產(chǎn)1，3-丙二醇的代謝工程菌。
五、利用工程發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇實(shí)施例1將獲得的工程菌單菌落接種到5ml含有氨芐青霉素50μg/mlLB液體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)12小時(shí)，然后接種到1升的下述培養(yǎng)基中氨芐青霉素50μg/ml，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L。在30℃培養(yǎng)13小時(shí)，然后按4％的接種量種子接種到含20升下述發(fā)酵培養(yǎng)基的30升發(fā)酵罐中，每升發(fā)酵培養(yǎng)基含有氨芐青霉素50mg，K2HPO4g/L7克，檸檬酸2克，7水硫酸鎂2克，98％的硫酸2ml，檸檬酸鐵銨，乳糖4克，葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉20g/L，用氨水調(diào)節(jié)pH為6.7。在35℃，200rpm，通風(fēng)量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，8小時(shí)后開(kāi)始流加葡萄糖，并通過(guò)流加氨水和檸檬酸來(lái)保持pH的穩(wěn)定。連續(xù)發(fā)酵32-40小時(shí)后用高效液相來(lái)分析發(fā)酵液中的葡萄糖和1，3-丙二醇的含量，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖量不再減少及1，3-丙二醇的量不再增加時(shí)停止發(fā)酵。經(jīng)HPLC檢測(cè)，工程菌發(fā)酵32-40小時(shí)后消耗葡萄糖約2.5kg，1，3-丙二醇的產(chǎn)量可以達(dá)到25～30克/每升發(fā)酵液，共得到約500克1，3-丙二醇，轉(zhuǎn)化效率約為20％。
實(shí)施例2以甘油為出發(fā)原料，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇，在實(shí)施例1中的培養(yǎng)基中添加甘油濃度為1％，在35℃，200rpm，通風(fēng)量為0.9vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，8小時(shí)后開(kāi)始流加甘油，并通過(guò)流加氨水和檸檬酸來(lái)保持pH穩(wěn)定在6-7。連續(xù)發(fā)酵32-40小時(shí)后用高效液相來(lái)分析發(fā)酵液中的甘油和1，3-丙二醇的含量，當(dāng)發(fā)酵液中甘油量不再減少及1，3-丙二醇的量不再增加時(shí)停止發(fā)酵。經(jīng)HPLC檢測(cè)，工程菌發(fā)酵32-40小時(shí)后消耗甘油約1.5kg，1，3-丙二醇的產(chǎn)量可以達(dá)到30～35克/每升發(fā)酵液，共得到約600克1，3-丙二醇，轉(zhuǎn)化效率約為40％。
實(shí)施例3以淀粉為出發(fā)原料，經(jīng)α-淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成的葡萄糖，將獲得的葡葡萄糖按實(shí)例1進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇，實(shí)驗(yàn)表明每3公斤淀粉經(jīng)α淀粉酶液化后再由糖化酶作用后生成葡萄糖用于工程菌的發(fā)酵，在32-38℃C，pH6-7的條件下發(fā)酵32-40個(gè)小時(shí)，可以得到約500克的1，3-丙二醇。除去淀粉中水份和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)化效率和直接用葡萄糖做底物的轉(zhuǎn)化效率相同。
權(quán)利要求
1.一種甘油脫水酶基因，其特征在于該甘油脫水酶基因是產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)中獲得，是所述的核苷酸序列包含在SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列中，其基因的DNA序列和氨基酸序列如下所示產(chǎn)氣莢膜梭菌甘油脫水酶基因的DNA序列1 GTGAAATCTA AAAGATTCCA AGTATTATCA GAACGTCCTG TAAACCAAGA51 TGGACTTATA GGAGAGTGGG CTGATGAAGG CTTAATAGCT TTAGATAGTC101 CAAATGATCC AAAATCATCA ATAAAAATAG AAAATGGAAT AATTACTGAA151 TTAGACGGCA GATCAAGAGA TGAGTTTGAT ATGATAGATA AATTTATAGC201 AGAGTACGCT ATAAATATAG AAGACGCAGA AGCATCTATG AAACTTTCAT251 CTAAAGAAAT AGCAAGAAGA TTAGTTGATA TAAATGTTAG TAGAGATGAA301 ATAGTAAAAA TCACTACTTC AATAACACCA ATGAAGGCTG TAGAAGTTAT351 TCAAGAAATG AACGTTGTTG AAATGATGAT GGCTCTTCAA AAAATGAGAG401 CAAGAAGAAC ACCTGCTAAC CAATGTCACG TTACTAACGT AAAAGACAAC451 CCAGTTCAAA TAGCAGCAGA TGCTGCAGAG GCTGCTTTAA GAGGATTCGC501 AGAGCAAGAA ACTACAGTAG GTATAGTTAG ATATGCACCT TTTAATGCAT551 TAGCTATCTT AGTAGGTTCA CAAGTAGGTA GAGGAGGAGT TTTAACTCAA601 TGTGCAGTTG AGGAAGCTAC TGAACTTGAC CTAGGAATGA GAGGACTTAC651 AAGTTATGCA GAAACAGTTT CAGTTTATGG AACAGAATCA GTATTTACAG701 ATGGAGATGA TACTCCATGG TCAAAAGCAT TCTTAGCATC AGCTTATGCT751 TCAAGAGGAC TTAAGATGAG ATTTACATCA GGTTCAGGTT CAGAAGCATT801 AATGGGATAC TCAGAAGGTA GATCAATGCT TTACTTAGAA TCAAGATGTA851 TATATATAAC TAAGGGAGCT GGAGTTCAAG GATTACAAAA TGGTGCAGTT901 AGTTGTATAG GTATGACAGG AGCAGTTCCA TCAGGAATAA GAGCAGTTCT951 TGGAGAAAAC TTAATAGCTG CAATGCTTGA TATAGAGGTT GCATCAGCAA1001 ATGACCAAAC ATTCTCACAC TCAGACATAA GAAGAACAGC AAGAATGTTA1051 ATGCAAATGC TTCCAGGAAC AGACTTCATA TTCTCAGGAT ATAGTGCAGT1101 TCCAAACTAC GATAACATGT TTGCTGGATC AAACTTTGAT GCAGAAGACT1151 TTGATGATTA CAACATACTT CAAAGAGACT TAAAAGTTGA CGGTGGATTA1201 AGACCAGTTA CAGAAGAAGA AACTATAAAG GTTAGAAATA AAGCTGCTAA1251 ATGCATACAA ATAATCTTTA GAGAATTAGG ATTCCCAGAA GTTACTGATG1301 AAGAAGTAGA AGCTGCAACT TACTGTCACG GAAGTAAGGA AATGCCAAAC1351 AGAAATGTAG TTGAAGATTT AAAGGCTGCA GAAGAAATGT TAGAAAGAAG1401 AATAACAGGA TTAGATATAA TAAAAGCTTT AAGCAAAAAT GGTATGGAAG1451 ATATAGCAAA CAACTTATTA AACATGCTTA AGCAAAGAGT TACTGGAGAT1501 TATCTTCAAA CTTCAGCAAT TTTAGATAAA GATTTCAATG TTATAAGTGC1551 TGTTAATGAT GTAAATGACT ATATGGGACC TGGAACAGGA TATAGACTAG1601 ATGGTCAAAG ATGGGAAGAA ATCAAAAAAG TTCCTACAGT AATGAGACCA1651 GAGGATATAG AGTAGGGGGA GAATGACAAT GGAAGAAAGA ACTTTTATAC1701 CAGAAATAAC AGTTGAAGAA GTTGGAGAAG CTAAGGTTGG TTTAAGATCA1751 GATGAAGTTG TTATAGGATT AGCACCTGCA TTTTTAAAAT ATCAAAATAA1801 AACAATAGTA GATGTTCCTC ATACTGAAAC TTTACTTGAA ATTATAGCAG1851 GTATTGAAGA AGAAGGATTA CATGCAAGAG TAGTTAGAAT TTTAAGAACA1901 TCTGATGTAT CTTTTATAGC TCATGATGCA GCTTGTTTAA GTGGATCAGG1951 AATAGGTATA GGAATACAAT CAAAAGGTAC TACAGTAATA CATCAAAAAG2001 ATTTATTACC ATTAAATAAC TTAGAATTAT TCTCACAAGC TCCGCTTTTA2051 ACTACAGAAA CATATAGATT AATCGGAAAA AATGCTGCTA AATATGCTAA2101 AGGTGAGTCA CCAACACCAG TACCAGTAAA AAATGACCAA ATGGTTAGAC2151 CTAAATTCAT GGCAAAGGCA GCTTTATTAC ACATAAAAGA AACTAAACAC2201 GTTGAACCAG GTAAAAAGCC AGTTCAATTA GAAGTTAAGT TTTAATTTAG2251 AAAGGATTGA AATCATGGAA AATAAGAGAA TGACTGCTGC AGATTATCCT2301 TTAACTTCTA AGAGAAAAGG AGATATAAAA ACTCCTACAG GAAAAGCTTT2351 AGAAGATATA ACTTTAGAAA AAGTTTTAAG TGGAGAAATC AATGCAGATG2401 ATATAAGAAT TTCACCAGAA ACTTTAGAAA TGCAAGCTCA AATAGCTGAA2451 AGCATGAACA GAGATGCTAT AGCTAGAAAC TTTAGAAGAG CTGCGGAGCT2501 TATAAGAGTT CCAGACGATA GAATATTAGA GATGTACAAT GCTTTAAGAC2551 CATATCGTTC AACAAAAGAA GATTTATTCA AAATAGCTGA TGAACTTGAA2601 ACAAAATATG ATGCTAAAGT TAATGCTGAT TTTGTTAGAG AAGCAGCTGA2651 AGTATATGAA ACTAGAAATA AATTAAGAAT AGAAGAG產(chǎn)氣莢膜梭菌甘油脫水酶的氨基酸序列第一個(gè)亞基為554個(gè)氨基酸VKSKRFQVLS ERPVNQDGLI GEWADEGLIA LDSPNDPKSS IKIENGIITELDGRSRDEFD MIDKFIAEYA INIEDAEASM KLSSKEIARR LVDINVSRDEIVKITTSITP MKAVEVIQEM NVVEMMMALQ KMRARRTPAN QCHVTNVKDNPVQIAADAAE AALRGFAEQE TTVGIVRYAP FNALAILVGS QVGRGGVLTQCAVEEATELD LGMRGLTSYA ETVSVYGTES VFTDGDDTPW SKAFLASAYASRGLKMRFTS GSGSEALMGY SEGRSMLYLE SRCIYITKGA GVQGLQNGAVSCIGMTGAVP SGIRAVLGEN LIAAMLDIEV ASANDQTFSH SDIRRTARMLMQMLPGTDFI FSGYSAVPNY DNMFAGSNFD AEDFDDYNIL QRDLKVDGGLRPVTEEETIK VRNKAAKCIQ IIFRELGFPE VTDEEVEAAT YCHGSKEMPNRNVVEDLKAA EEMLERRITG LDIIKALSKN GMEDIANNLL NMLKQRVTGDYLQTSAILDK DFNVISAVND VNDYMGPGTG YRLDGQRWEE IKKVPTVMRPEDTE第二個(gè)亞基為190個(gè)氨基酸MTMEERTFIP EITVEEVGEA KVGLRSDEVV IGLAPAFLKY QNKTIVDVPHTETLLEIIAG IEEEGLHARV VRILRTSDVS FIAHDAACLS GSGIGIGIQSKGTTVIHQKD LLPLNNLELF SQAPLLTTET YRLIGKNAAK YAKGESPTPVPVKNDQMVRP KFMAKAALLH IKETKHVEPG KKPVQLEVKF第三個(gè)亞基為141個(gè)氨基酸MENKRMTAAD YPLTSKRKGD IKTPTGKALE DITLEKVLSG EINADDIRISPETLEMQAQI AESMNRDAIA RNFRRAAELI RVPDDRILEM YNALRPYRSTKEDLFKIADE LETKYDAKVN ADFVREAAEV YETRNKLRIE E。
2.如權(quán)利要求1所述的甘油脫水酶，其特征在于三個(gè)亞基，分子量分別為61.0kD，20.9kD，16.3kD，三個(gè)亞基的等電點(diǎn)分別為4.72，6.67，5.11，酶的最適反應(yīng)溫度為35～50℃，工酶的反應(yīng)的pH是8.0～10.0，當(dāng)輔酶B12不存在下，該酶沒(méi)有活力，在厭氧的條件下能將甘油轉(zhuǎn)化成3-羥基丙醛，純化的酶在體外保存30天，活力幾乎不損失。
3.如權(quán)利要求1所述的甘油脫水酶生產(chǎn)1，3丙二醇代謝工程菌的構(gòu)建，其特征在于克隆到釀酒酵母的3-磷酸甘油脫氫酶和3-磷酸甘油脂酶基因，并在大腸桿菌菌株中進(jìn)行高效表達(dá)；構(gòu)建得到能轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)甘油的工程菌，把克隆得到的甘油脫水基因轉(zhuǎn)化到上述工程菌進(jìn)行多個(gè)基因共表達(dá)，獲得生產(chǎn)1，3-丙二醇的代謝工程菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用工程菌制備1，3丙二醇的方法，其特征在于包括以下步驟1)對(duì)選定的菌種接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；2)從所獲得的擴(kuò)大菌種中克隆甘油脫水酶基因；3)將甘油脫水酶基因及其它相關(guān)基因在大腸桿菌中表達(dá)；4)以淀粉水解物、葡萄糖或甘油或其它碳源為底物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用工程菌制備1，3丙二醇的方法，其特征在于用木薯淀粉制造1.3丙二醇的工藝是以葡萄糖漿或淀粉漿的水解物為原料，先加去離子水兌成含30％的溶液，然后用于工程菌發(fā)酵過(guò)程中流加，在32-38℃，pH6-7的條件下發(fā)酵32-40個(gè)小時(shí)，同時(shí)流加氨水和檸檬酸維持pH的穩(wěn)定，發(fā)酵液用高效液相進(jìn)行測(cè)定其1，3丙二醇含量不再增加后停止發(fā)酵，即可得到1，3丙二醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用工程菌制備1，3丙二醇的方法，其特征在于以葡萄糖為出發(fā)原料，以1％的葡萄糖為底物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇，在32-38℃，pH6-7的條件下發(fā)酵32-40個(gè)小時(shí)，發(fā)酵液用高效液相進(jìn)行測(cè)定其1，3丙二醇含量不再增加后停止發(fā)酵，即可得到1，3丙二醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用工程菌制備1，3丙二醇的方法，其特征在于以甘油為出發(fā)原料，以1％的甘油為底物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇，在32-38℃，pH6-7的條件下發(fā)酵32-40個(gè)小時(shí)，發(fā)酵液用高效液相進(jìn)行測(cè)定其1，3丙二醇含量不再增加后停止發(fā)酵，即可得到1，3丙二醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種全新的甘油脫水酶基因的克隆及其在相關(guān)宿主中的表達(dá)，該酶的基因系克隆自產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridium perfringens)，它能夠在正常的生化反應(yīng)條件下將甘油轉(zhuǎn)化為3－羥基丙醛。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步把1，3－丙二醇氧化還原酶等相關(guān)酶基因一起重組到大腸桿菌中，獲得一個(gè)新的代謝工程菌，這個(gè)代謝工程菌可以通過(guò)發(fā)酵將木薯淀粉的水解物、葡萄糖或甘油轉(zhuǎn)化為1，3－丙二醇。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1935991SQ20061001945
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日
發(fā)明者黃日波, 韋宇拓, 吳杰群, 齊向輝, 孟曉蕾, 杜麗琴, 韋旭欽, 王青艷, 盧福燊, 盧運(yùn)琨 申請(qǐng)人:南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司