專利名稱：用于檢測(cè)分枝桿菌的引物和pcr-dhplc試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種分枝桿菌通用的PCR-DHPLC快速檢測(cè)方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
分枝桿菌屬(Mycobacterium)，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)和麻風(fēng)分枝桿菌外，統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌。據(jù)目前所知，自然界中有致病性和非致病分枝桿菌共200多種。結(jié)核病是威脅人類及動(dòng)物健康的重大傳染病。世界衛(wèi)生組織(WHO)專門(mén)發(fā)布了全球結(jié)核控制戰(zhàn)略，并把每年的3月M號(hào)定為世界防治結(jié)核病日。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群 (Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)是人及哺乳動(dòng)物的結(jié)核病原菌，包括結(jié)核 ^feff · ( X^AM^WM^tfM, Mycobacteriumtuberculosis, Μ. tuberculosis), 41^ 枝桿菌(牛型結(jié)核分枝桿菌，Mycobacteriumbovis, M. bovis)，卡介苗 BCG (Mycobacterium bovis BCG，BCG)，非洲分枝桿菌(Mycobacterium africanum, Μ. africanum)和田鼠分枝桿菌(Mycobacteriummicroti，M. microti)。其中，結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌為主要的人畜結(jié)核致病菌。與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對(duì)應(yīng)的是各種非結(jié)核分枝桿菌，目前已發(fā)現(xiàn)上百種，廣泛存在于土壤、環(huán)境、動(dòng)物中。臨床上，各種非結(jié)核分枝桿菌感染患者的臨床癥狀及病理變化與MTC引起的結(jié)核病極為相似，但多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物有天然耐藥性；因此， 鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌感染在臨床診療中就有著非常重要的作用。由于非結(jié)核分枝桿菌感染可造成結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)或血清學(xué)檢測(cè)假陽(yáng)性，因此準(zhǔn)確鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌感染對(duì)動(dòng)物結(jié)核病確診也非常重要。2000年第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核患者451萬(wàn)，菌陽(yáng)肺結(jié)核患者196萬(wàn)。分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性者中，結(jié)核分枝桿菌占86. 4%，牛結(jié)核分枝桿菌占2. 5%，非結(jié)核分枝桿菌占11. 1%。而1990年第三次全國(guó)結(jié)核病流調(diào)時(shí)非結(jié)核分枝桿菌僅占4. 9%，由此可見(jiàn)，非結(jié)核分枝桿菌的比率較前明顯增加。非結(jié)核分枝桿菌患者對(duì)大多數(shù)一線抗結(jié)核藥物耐藥，采用目前標(biāo)準(zhǔn)的化療方案治療無(wú)效。傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)方法建立在培養(yǎng)基礎(chǔ)上，煩瑣、費(fèi)時(shí)，需1 2月時(shí)間，不能滿足臨床開(kāi)展早期有效化療的需要，使非結(jié)核分枝桿菌患者經(jīng)長(zhǎng)期規(guī)則化療而療效不佳，療程延長(zhǎng)，成為難治、復(fù)治患者，細(xì)菌可能在局部播散。因此，分枝桿菌的快速鑒定對(duì)結(jié)核病的早期診斷、 鑒別診斷、有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。目前國(guó)內(nèi)外用于診斷分枝桿菌的檢驗(yàn)方法，大體上可分為3類第一類是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法，如染色鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)和動(dòng)物接種等；第二類是采用免疫學(xué)方法檢測(cè)結(jié)核菌的特異性抗體，如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(CF)方法等；第三類是采用分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探針、多重PCR等。由于分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，細(xì)菌分離培養(yǎng)周期長(zhǎng)(常需數(shù)周時(shí)間)，傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢查方法難于適應(yīng)進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫快速通關(guān)需求，也不利于疾病臨床診療。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的牛結(jié)核病診斷方法，也是目前在進(jìn)出境動(dòng)物檢疫、牛結(jié)核病疾病防控、根除等方面常采用的方法，但由于試劑質(zhì)量以及非典型分枝桿菌的干擾等原因，常造成非特異性反應(yīng)。ELISA和CF方法等免疫學(xué)方法在特異性方面尚存在爭(zhēng)議，國(guó)內(nèi)目前尚缺乏可靠的免疫學(xué)診斷試劑。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外眾多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了結(jié)核、副結(jié)核PCR方法研究，但檢測(cè)方法和試劑盒缺乏規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化是影響PCR結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。世界衛(wèi)生組織于2006年10月發(fā)表報(bào)告指出，世界迫切需要投資研究更有效和費(fèi)用更低的結(jié)核病診斷方法，盡早發(fā)現(xiàn)病情盡早治療，以減少這種疾病對(duì)人類、特別是對(duì)發(fā)展中國(guó)家人口的危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于，提供一組檢測(cè)分枝桿菌的核苷酸序列。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種針對(duì)分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒，具體而言，提供一種分枝桿菌pcr-dhplc檢測(cè)試劑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一對(duì)用于檢測(cè)分枝桿菌的引物，其特征在于，其中的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。一組用于檢測(cè)分枝桿菌的核酸，其特征在于，該組核酸包括核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物對(duì)，以及作為陽(yáng)性對(duì)照的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；一種用于檢測(cè)分枝桿菌的PCR-DHPLC試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括PCR 緩沖液；檢測(cè)分支桿菌的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；檢測(cè)分支桿菌的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；dNTP ；MgCl2 ；Taq DNA 聚合酶；雙蒸水； 陰性對(duì)照滅菌生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照攜帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQID No. 3所示。如上所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒在應(yīng)用時(shí)，按照以下終濃度配置PCR 反應(yīng)液10 X PCR 緩沖液；0. 2 μ mol/L檢測(cè)分支桿菌的上游引物；0. 2 μ mol/L檢測(cè)分支桿菌的上游引物；0.2 μ mol/L 探針；0. 2mmol/L dNTP ；2. 5mmol/L MgCl2。
通過(guò)對(duì)引物、Mg2+濃度、Taq酶濃度以及PCR變性和退火溫度的優(yōu)化，建立了最適的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件。PCR-DHPLC檢測(cè)試劑盒最適PCR反應(yīng)體系見(jiàn)下表1。
表1PCR-DHPLC檢測(cè)試劑盒最適PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一對(duì)用于檢測(cè)分枝桿菌的引物，其特征在于，其中的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
2.一組用于檢測(cè)分枝桿菌的核酸，其特征在于，該組核酸包括核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物對(duì)，以及作為陽(yáng)性對(duì)照的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.一種用于檢測(cè)分枝桿菌的PCR-DHPLC試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 PCR緩沖液；檢測(cè)分支桿菌的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 檢測(cè)分支桿菌的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； dNTP ； MgCl2 ；Taq DNA聚合酶； 雙蒸水；陰性對(duì)照滅菌生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照攜帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQID No. 3所7J\ ο
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒在應(yīng)用時(shí)，按照以下終濃度配置PCR反應(yīng)液10XPCR緩沖液；.0. 2 μ mol/L檢測(cè)分支桿菌的上游引物； 0. 2 μ mol/L檢測(cè)分支桿菌的上游引物； 0. 2 μ mol/L 探針； 0. 2mmol/L dNTP ； 2. 5mmol/L MgCl20
全文摘要
本發(fā)明涉及一對(duì)用于檢測(cè)分枝桿菌的引物，其中的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。一種用于檢測(cè)分枝桿菌的PCR-DHPLC試劑盒，包括PCR緩沖液；檢測(cè)分支桿菌的引物對(duì)；dNTP；MgCl2；Taq DNA聚合酶；雙蒸水；陰性對(duì)照滅菌生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照攜帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)分枝桿菌感染的試劑盒及應(yīng)用該試劑盒的PCR-DHPLC檢測(cè)方法，其特異性好，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，高通量，對(duì)于臨床辨別分枝桿菌感染與其它致病原具有重要實(shí)用意義。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102433384SQ20111042799
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者劉志玲, 林志雄, 畢英佐, 羅瓊, 陳茹, 高小博 申請(qǐng)人:北京盈九思科技發(fā)展有限公司, 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心