專利名稱：嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用與飼料添加劑和預(yù)混料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus) 及其應(yīng)用與其飼料添加劑和預(yù)混料。
背景技術(shù)：
在動物的腸道內(nèi)棲息著各種細菌，根據(jù)與宿主的作用關(guān)系可分為有益菌、中性菌和致病菌。在健康動物的腸道內(nèi)，各種菌群維持一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，但是當某些環(huán)境改變時，腸道內(nèi)的致病菌會大量繁殖并同時產(chǎn)生細菌毒素，引起動物疾病，如細菌性痢疾等。嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)是動物腸道的常駐菌群之一，其能夠在胃液中存在并分泌乳酸、乙酸等促進胃部的消化能力；另外，嗜酸乳桿菌能夠調(diào)整腸道菌群平衡，抑制腸道不良微生物的增殖，嗜酸乳桿菌能分泌抗生物素類物質(zhì)(嗜酸乳菌素 (acidolin)、嗜酸桿菌素(acidophilin)、乳酸菌素(laetocidon))，對腸道致病菌產(chǎn)生拮抗作用。但由于目前動物飼養(yǎng)過程中長期、大量使用抗生素，使致病菌耐藥性增強、動物腸道菌群失調(diào)、免疫力下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株抗逆性強、產(chǎn)酸能力強、益生功能優(yōu)秀的益生菌-—嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)，此菌具有良好的產(chǎn)酸功能和益生功能 耐人工胃酸、耐膽汁液、對大腸桿菌K88、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌有較強抑制作用。本發(fā)明的另一目的在于提供該菌在制備禽畜或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了包含該嗜酸乳桿菌的飼料添加劑和其預(yù)混料。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一株新的嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)，其保藏編號為 CGMCCNo. 5093。進一步，該菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID No 1所示。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌可用于制備禽畜或水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料添加劑。本發(fā)明還提供了包含所述的嗜酸乳桿菌的飼料添加劑，其特征在于飼料添加劑中嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)為109-101QCfU/g。其中，本發(fā)明的飼料添加劑中的嗜酸乳桿菌為經(jīng)如下工藝制備而成(1)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為35-40°C、罐壓為0. 03-0. 05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速為60_100rpm，每30-60 分鐘攪拌一次，每次攪拌時間為10-20分鐘，得嗜酸乳桿菌發(fā)酵液；所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及質(zhì)量體積比為蔗糖1_2%，大豆蛋白胨1-2%，酵母膏1-2%，硫酸銨0. 5-1. 0%，磷酸二氫鉀0. 2-0. 5%、檸檬酸鈉0. 2-0. 8%，硫酸鎂0. 01-0. 05% ； (2)將得到的嗜酸乳桿菌發(fā)酵液3500-5000rpm離心，得到菌泥，加入與菌泥的重量體積比為15-20%的凍干保護劑，混勻，于-25°C -45°C冷凍干燥，至水分含量小于5% ；所述的凍干保護劑的組成成分及質(zhì)量體積比為脫脂牛奶5-10%、麥芽糊精5-15%、海藻糖5-15%、維生素C 0. 5-2. 5%谷氨酸鈉 0. 5-2. 5 %、硫酸錳 0. 4-1 %、甘油 2-5 %。進一步，嗜酸乳桿菌高密度發(fā)酵的培養(yǎng)條件為37°C、罐壓為0. 05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速為 60rpm，每45分鐘攪拌一次，每次攪拌時間為15分鐘；所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及質(zhì)量體積比為蔗糖2 %，大豆蛋白胨1. 5 %，酵母膏1.5%，硫酸銨0.8%，磷酸二氫鉀0.4%，檸檬酸鈉0.6%，硫酸鎂0.01-0. 05% ；所述的凍干保護劑的組成成分及質(zhì)量體積比為脫脂牛奶 8 %、麥芽糊精8 %、海藻糖10 %、維生素C 0. 8 %、谷氨酸鈉2 %、硫酸錳0. 8 %、甘油2 %。本發(fā)明也提供了包含所述的嗜酸乳桿菌的飼料添加劑的預(yù)混料，其特征在于預(yù)混料中飼料添加劑的添加質(zhì)量體積比為0. 5-10%。，預(yù)混料中嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)為 106-108cfu/g。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)為申請人從豬糞便中分離得到，其生物學(xué)特征如下菌落圓整，表面光滑，不透明，乳白色，邊緣光滑，革蘭氏陽性菌; 單個菌體為桿狀。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌經(jīng)過人工胃液、膽汁液及抗逆性的篩選；可以耐受 pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工膽汁液，也可以抑制致病性大腸桿菌K88，痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌，具有較強的產(chǎn)酸和抑菌能力。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌 (Lactobacillusacidophilus)申請人已于2011年7月沈日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 5093。有益效果(1)本發(fā)明的嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093的抗逆性強，可以耐受人工胃液，人工膽鹽，因此在經(jīng)過動物胃腸道環(huán)境后，能夠保證大量活菌可以順利進入動物的腸道，在腸道中發(fā)揮益生功能，提高動物免疫力，降低養(yǎng)殖成本。(2)本發(fā)明的嗜酸乳桿菌可以有效抑制動物腸道內(nèi)常見致病菌大腸桿菌K88，痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌。(3)本發(fā)明的嗜酸乳桿菌可以大量的產(chǎn)酸，能夠降低腸道內(nèi)的PH抑制有害菌的生長和繁殖，同時也有助于消化。(4)本發(fā)明的嗜酸乳桿菌經(jīng)過培養(yǎng)和高密度發(fā)酵及添加的保護劑等，得到的產(chǎn)品嗜酸乳桿菌活菌含量高，可作為生物飼料添加劑添加到養(yǎng)殖動物的飲水或者飼料中，可制備成預(yù)混料等飼料，減少抗生素的添加，真正改善動物腸道健康，提升動物免疫力，增加動物的生產(chǎn)性能。


圖1 嗜酸乳桿菌抑菌試驗結(jié)果。通過下列實施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例1嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093的篩選與鑒定1、初篩取新鮮豬糞便樣品各5g，浸泡于20ml無菌0. 85%生理鹽水中，震蕩打散樣品，使樣品充分與生理鹽水接觸，將離心后的菌體沉淀加入IOml人工胃液中，37°C靜置2h，然后離心，收集菌體后，將菌體沉淀加入IOml人工膽鹽中，37°C靜置4h，收集菌體，稀釋涂布于 LB培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-24h后，對菌落進行純化分離。對得到的菌進行保存，并進
一步復(fù)篩。菌落形態(tài)菌落圓整，表面光滑，不透明，乳白色，邊緣光滑，革蘭氏陽性菌；經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，單個菌體為細長桿狀。生理鹽水的配制方法是0. 85%氯化鈉溶液，高壓滅菌后備用。2、復(fù)篩將1中挑出來的菌落進行進一步分離純化，并將活化后菌落分別劃線至含有2% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基的平皿上，37°C，恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，24h后，挑取鈣圈較大的菌落，進行進一步的保存和鑒定。3、嗜酸乳桿菌的分子鑒定利用細菌的通用引物對篩選到的菌株進行PCR鑒定按細菌DNA提取試劑盒操作說明書提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5，-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3，，見 SEQID No. 2 和下游引物 5，_GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3，見 SEQ ID No. 3 擴增細菌16s rRNA基因片段。經(jīng)過測序進一步鑒定該菌為嗜酸乳桿菌，擴增片段的測序結(jié)果見 SEQ ID No. 1。實施例2嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093的益生功能及抗逆性能實驗利用MRS培養(yǎng)基，對得到的嗜酸乳桿菌CGMCC No. 5093進行了耐酸性、耐膽鹽和抑菌活性實驗。(1)嗜酸乳桿菌耐酸性試驗人工胃液的配制人工胃液的配制方法是胃蛋白酶，0.85%氯化鈉，用濃鹽酸調(diào)PH值到2. 0,3. 0,4. 0，經(jīng)細菌過濾器過濾除菌后備用；試驗結(jié)果如表1。表1嗜酸乳桿菌耐酸性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，其保藏編號為 CGMCC No. 5093。
2.權(quán)1所述的嗜酸乳桿菌，其特征在于該菌的16SrRNA基因序列如SEQ ID No 1所7J\ ο
3.權(quán)1所述的嗜酸乳桿菌在制備禽畜或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑中的應(yīng)用。
4.一種包含權(quán)1所述的嗜酸乳桿菌的飼料添加劑，其特征在于飼料添加劑中嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)為109-101QCfU/g。
5.權(quán)4所述的嗜酸乳桿菌的飼料添加劑，其特征在于飼料添加劑中的嗜酸乳桿菌為經(jīng)如下工藝制備而成(1)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為35-40°C、罐壓為0.03-0. 05Mpa， 攪拌轉(zhuǎn)速為60-100rpm，每30-60分鐘攪拌一次，每次攪拌時間為10-20分鐘，得嗜酸乳桿菌發(fā)酵液；所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及質(zhì)量體積比為蔗糖1_2%，大豆蛋白胨1-2%， 酵母膏1_2%，硫酸銨0. 5-1. 0%，磷酸二氫鉀0. 2-0. 5 %、檸檬酸鈉0. 2-0. 8 %，硫酸鎂 0. 01-0. 05 % ； (2)將得到的嗜酸乳桿菌發(fā)酵液3500-5000rpm離心，得到菌泥，加入與發(fā)酵液的重量體積比為15-20%的凍干保護劑，混勻，于-25 V -45°C冷凍干燥，至水分含量小于5% ；所述的凍干保護劑的組成成分及質(zhì)量體積比為脫脂牛奶5-10%、麥芽糊精 5-15%、海藻糖5-15%、維生素C 0. 5-2. 5%谷氨酸鈉0. 5-2. 5%、硫酸錳0. 4-1 %、甘油 2-5%。
6.權(quán)5所述的嗜酸乳桿菌的飼料添加劑，其特征在于培養(yǎng)條件為37°C、罐壓為 0. 05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速為60rpm，每45分鐘攪拌一次，每次攪拌時間為15分鐘；所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及質(zhì)量體積比為蔗糖2%，大豆蛋白胨1.5%，酵母膏1.5%，硫酸銨0.8%，磷酸二氫鉀0. 4%，檸檬酸鈉0. 6%，硫酸鎂0. 01-0. 05% ；所述的凍干保護劑的組成成分及質(zhì)量體積比為脫脂牛奶8%、麥芽糊精8%、海藻糖10%、維生素C ^^、谷氨酸鈉？^^硫酸錳0.8%、甘油2%。
7.一種包含權(quán)4-6任一項所述的嗜酸乳桿菌的飼料添加劑的預(yù)混料，其特征在于預(yù)混料中飼料添加劑的添加質(zhì)量體積比為0. 5-10%。，預(yù)混料中嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)為 106-108cfu/g。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)及其應(yīng)用與其飼料添加劑和預(yù)混料。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌抗逆性強，可以耐受人工胃液，人工膽鹽，因此在經(jīng)過動物胃腸道環(huán)境后，能夠保證大量活菌可以順利進入動物的腸道，在腸道中發(fā)揮益生功能，提高動物免疫力，降低養(yǎng)殖成本。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌經(jīng)過培養(yǎng)和高密度發(fā)酵及添加的保護劑等，得到的產(chǎn)品嗜酸乳桿菌活菌含量高，可作為生物飼料添加劑添加到養(yǎng)殖動物的飲水或者飼料中，可制備成預(yù)混料等飼料，減少抗生素的添加，真正改善動物腸道健康，提升動物免疫力，增加動物的生產(chǎn)性能。
文檔編號C12R1/23GK102559539SQ20111039654
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者付維來, 杜建濤, 王麗英, 王凡, 王安如, 王松 申請人:內(nèi)蒙古四季春飼料有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 湖南大北農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司