專(zhuān)利名稱(chēng)：一種安全性慢病毒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種安全性慢病毒載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β地中海貧血(簡(jiǎn)稱(chēng)β地貧)是一類(lèi)由于血紅蛋白(HbA)生成障礙導(dǎo)致的遺傳性疾病。HbA生成過(guò)程中3Hb合成受到抑制，破壞了血紅蛋白兩類(lèi)亞基的平衡狀態(tài)，相對(duì)過(guò)剩的α Hb在紅細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生毒性沉積導(dǎo)致溶血性貧血。針對(duì)β地貧的發(fā)病環(huán)節(jié)，王寶斌等構(gòu)建了可專(zhuān)一性地結(jié)合游離α Hb的α血紅蛋白穩(wěn)定蛋白(AHSP)基因表達(dá)載體并將其導(dǎo)入β 6Μ地貧小鼠體內(nèi)，以期阻止過(guò)剩的α Hb產(chǎn)生毒性沉積。通過(guò)分子生物學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)和血液學(xué)等技術(shù)手段檢測(cè)小鼠后發(fā)現(xiàn)其地貧表型有所改善(Transgenic Human α -Hemoglobin Stabilizing Protein Could PartiallyRelieve β ws+654-Thalassemia Syndrome in Model Mice. Human Gene Therapy. 201 0 February, 21(2) :149-156.)。這是一個(gè)利用慢病毒介導(dǎo)方式治療血液性疾病的成功范例。但是要將該慢病毒載體真正用于臨床治療，還需要解決一些安全性的問(wèn)題。①盡管人們已經(jīng)花了大量精力使慢病毒載體很安全(最低限度保留了約5%的原HIV序列，使之難以形成重組相適應(yīng)性病毒)，但仍不能保證殘留的序列不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。②HIV具有強(qiáng)有力polyA斷裂加尾功能，但是經(jīng)過(guò)刪減后的Δυ3的慢病毒載體卻會(huì)出現(xiàn)“通讀”(Readthrough)，轉(zhuǎn)錄下游基因，造成安全隱患(Anne-Kathrin Zaiss et al.，(2002). RNA 3，Readthrough ofOncoretrovirus and Lentivirus Implications for Vector Safety and Efficacy. Journal of Virology. July ；76(14) :7209-19.)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)目前的慢病毒載體具有安全隱患的不足，提供一種安全性高的慢病毒載體。本發(fā)明的解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是一種安全性慢病毒載體，該慢病毒載體攜帶了整合酶 Cre基因表達(dá)盒，并且在3’ LTR的U3區(qū)含有LoxP位點(diǎn)序列，在U3區(qū)中并在LoxP位點(diǎn)的下游含有用于導(dǎo)入外源基因的限制性酶切位點(diǎn)。其中，整合酶Cre表達(dá)盒在慢病毒載體的位置是任何位置，只要不影響慢病毒載體的其他功能即可。較佳的如在慢病毒載體FUGW中為原GFP(熒光蛋白)的位置，將原GFP 基因替換為整合酶Cre基因，仍然使用原來(lái)的表達(dá)元件即可。所述的整合酶Cre基因是常規(guī)的，較佳的其序列如SEQID N0:2所示。LoxP在U3區(qū)的位置可以是任何位置，較佳的是 U3區(qū)的兩個(gè)EcoRV酶切位點(diǎn)之間。所述的LoxP位點(diǎn)序列是常規(guī)的，較佳的其序列如序列表中 SEQ ID NO 1 所示。優(yōu)選的，本發(fā)明的安全性慢病毒載體進(jìn)一步在3，LTR的U3區(qū)含有cHS4的400bp
3核心序列和SV40的2XUSE兩種元件中的任何一種或兩種。這可以使載體的通讀率下降。本發(fā)明中，所含片段優(yōu)選反向接入的cHS4元件和/或正向接入的2 XUSE元件。更優(yōu)選反向接入的cHS4元件和正向接入的2XUSE元件疊加。最優(yōu)選5’方向至3’方向依次是反向接入的cHS4元件和正向接入的2XUSE元件。cHS4反向和2XUSE正向相連接入到 3’ LTR的U3區(qū)兩個(gè)EcoRV位點(diǎn)之間，通讀率降低效果最為明顯。本發(fā)明中，所述的CHS4的400bp核心序列為常規(guī)，較佳的是序列表中SEQ ID NO 3所示的序列。所述的SV40的2XUSE是指2個(gè)串聯(lián)的USE元件，為常規(guī)，較佳的是序列表中SEQ ID NO 4所示的序列。本發(fā)明中，所述的CHS4的400bp核心序列和/或SV40的2 X USE在U3區(qū)的位置可以是任何位置，較佳的是在U3區(qū)中并在LoxP位點(diǎn)序列的下游。本發(fā)明中，所述的慢病毒載體可以是現(xiàn)有的任何慢病毒載體，較佳的是慢病毒載體FUGW。本發(fā)明的方法對(duì)所有3’ LTR都有作用，對(duì)FUGW的3’ LTR效果最佳。本發(fā)明的一較佳實(shí)施方式為一種安全性慢病毒載體，是改良的FUGW慢病毒載體，在出發(fā)慢病毒載體FUGW的3’ LTR的U3區(qū)含有LoxP位點(diǎn)序列，將GFP基因替換為整合酶Cre基因，并且在U3區(qū)中LoxP位點(diǎn)的下游含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2XUSE 兩種元件中的任何一種或兩種。更佳的，在U3區(qū)中LoxP位點(diǎn)的下游構(gòu)建了一個(gè)用于導(dǎo)入外源基因的限制性酶切位點(diǎn)。根據(jù)慢病毒載體FUGW全序列，該限制性酶切位點(diǎn)優(yōu)選Nhe I 酶切位點(diǎn)。Nhe I酶切位點(diǎn)在改良了的慢病毒載體FUGW中沒(méi)有第二個(gè)，因此有利于外源基因的插入。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是一種上述安全性慢病毒載體的制備方法，包括以下步驟，1)構(gòu)建攜帶了整合酶Cre基因表達(dá)盒，并且在3，LTR的U3區(qū)插入了 LoxP位點(diǎn)序列得慢病毒載體；幻在U3區(qū)中LoxP位點(diǎn)的下游位置插入cHS4的400bp核心序列和/或SV40的 2 X USE ；3)在U3區(qū)中LoxP位點(diǎn)的下游位置引入用于插入外源基因的酶切位點(diǎn)。步驟3)所述的用于插入外源基因的酶切位點(diǎn)只要是在U3區(qū)中并在LoxP位點(diǎn)的下游且在cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2 X USE的上游。本發(fā)明的一較佳實(shí)施方式為一種安全性慢病毒載體的制備方法，是對(duì)FUGW慢病毒載體的改良，包括在出發(fā)慢病毒載體FUGW的3’LTR的U3區(qū)插入LoxP位點(diǎn)序列，將GFP基因替換為整合酶Cre基因；在LoxP位點(diǎn)后引入Nhe I酶切位點(diǎn)；在Nhe I酶切位點(diǎn)插入cHS4的400bp核心序列或2 XUSE，在cHS4的400bp核心序列或2XUSE前后(或后前)各引入Nhe I酶切位點(diǎn)和 EcoR V酶切位點(diǎn)；在EcoR V酶切位點(diǎn)插入的2 XUSE。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案之三是一種攜帶外源基因的重組慢病毒載體，該慢病毒載體攜帶了整合酶Cre基因表達(dá)盒，并且在3’ LTR的U3區(qū)含有LoxP位點(diǎn)序列，在U3區(qū)中并在LoxP位點(diǎn)的下游含有外源基因。所述的外源基因是任何需要轉(zhuǎn)移的基因，優(yōu)選如AHSP基因。本發(fā)明的一較佳實(shí)施方式為所述安全性慢病毒載體是改良的慢病毒載體FUGW， 在Nhe I酶切位點(diǎn)插入了外源基因AHSP。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。本發(fā)明所述的安全性慢病毒載體可以應(yīng)用于基因克隆或表達(dá)。特別是在基因治療，由本發(fā)明的慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因具有更高的安全性。本發(fā)明的慢病毒載體介導(dǎo)基因， 所產(chǎn)生的假病毒在整合后發(fā)生“自殺效應(yīng)”，將大部分慢病毒基本骨架刪除，進(jìn)一步消除其發(fā)生重組相適應(yīng)性病毒(LCV)存在的可能性。僅僅留下一個(gè)完整的LTR和所要被整合到染色體的表達(dá)元件。通過(guò)這種方法使慢病毒載體在用于人類(lèi)基因治療方面又邁出了一大步。 并且本發(fā)明的慢病毒載體通讀率降低，進(jìn)一步提高了安全性。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。
圖1是載體FW-AHSP的構(gòu)建圖。圖2是載體FCLA的構(gòu)建圖。圖3是載體FCLAC㈠U⑴的構(gòu)建圖。圖4是慢病毒通讀示意圖。圖5是安全性慢病毒載體感染細(xì)胞后發(fā)生自刪除的示意圖。圖6是用雙重PCR方法鑒定Cre的自刪除過(guò)程的PCR產(chǎn)物電泳圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種安全性慢病毒載體，該慢病毒載體攜帶了整合酶Cre基因表達(dá)盒，并且在3’LTR的U3區(qū)含有LoxP位點(diǎn)序列，在U3區(qū)中并在LoxP位點(diǎn)的下游含有用于導(dǎo)入外源基因的限制性酶切位點(diǎn)。慢病毒在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中3’ U3躍遷至5’端，5’ U5躍遷至 3’端，最后會(huì)在原病毒形成兩個(gè)相同LTR。而兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的序列在整合酶Cre的作用下會(huì)被刪除。因此，本發(fā)明提供的慢病毒載體在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中會(huì)形成兩個(gè)LoxP位點(diǎn)，這兩個(gè)LoxP位點(diǎn)的序列即大部分的慢病毒載體的骨架序列會(huì)被刪除，從而大大降低慢病毒發(fā)生重組產(chǎn)生適應(yīng)性病毒(LCV)的可能性。本發(fā)明的慢病毒載體在3’ LTR的U3區(qū)還進(jìn)一步含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2XUSE兩種元件中的任何一種或兩種，這可以使載體的通讀率大大下降，進(jìn)一步提高載體的安全性。本發(fā)明的慢病毒載體所產(chǎn)生的假病毒在整合后發(fā)生“自殺效應(yīng)”，將大部分慢病毒基本骨架刪除，進(jìn)一步降低產(chǎn)生適應(yīng)性病毒(LCV)的可能性，只留下一個(gè)完整的LTR和外源基因，是一種既能發(fā)生自刪除又降低了通讀率的安全性慢病毒載體。Cre/loxP 重組系統(tǒng)Cre/loxP重組系統(tǒng)可以介導(dǎo)位點(diǎn)特異的DNA重組。該系統(tǒng)含有兩種成分①一段長(zhǎng)34bp的DNA序列，含有兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的核心序列。這段34bp序列是Cre重組酶識(shí)別的位點(diǎn)，被稱(chēng)為IoxP位點(diǎn)(locus of X-over in PI)。②Cre重組酶 (cyclizationrecombination)，它是一種由343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā)IoxP位點(diǎn)的DNA重組。任何序列的DNA，當(dāng)其位于兩個(gè)IoxP位點(diǎn)之間的時(shí)候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失(兩個(gè)IoxP位點(diǎn)的方向相同)，要么方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)(兩IoxP位點(diǎn)的方向相反)。該系統(tǒng)不需要細(xì)胞或者生物體提供其他的輔助因子。IoxP位點(diǎn)是一段較短的DNA 序列，非常容易合成。Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，因此可以在生物體不同的組織、 不同的生理?xiàng)l件下發(fā)揮作用。Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動(dòng)子的調(diào)控之下， 從而使這種重組酶在生物體不同的細(xì)胞、組織、器官，以及不同的發(fā)育階段或不同的生理?xiàng)l件下產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮作用。本發(fā)明在慢病毒載體5’端U3區(qū)序列中插入LoxP位點(diǎn)。使之在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中跳躍至5’端，在慢病毒載體兩端形成兩個(gè)相同LTR，也就是形成了兩個(gè)LoxP位點(diǎn)。在Cre整合酶的作用下，IoxP位點(diǎn)發(fā)生DNA重組，該兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間所有的DNA都被刪除，僅留下一個(gè)LTR和表達(dá)元件。這樣的結(jié)果，使因任何原因而實(shí)際存在的病毒其他元件，不能與慢病毒載體的基本骨架發(fā)生重組，造成LCV產(chǎn)生的可能性，從而解決了慢病毒載體生物安全性的一個(gè)很大問(wèn)題。本發(fā)明同時(shí)使慢病毒載體內(nèi)部可以表達(dá)Cre整合酶，從而使IoxP位點(diǎn)發(fā)生DNA重組。慢病毒載體慢病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒中的一屬，反轉(zhuǎn)錄病毒的共性，是在胞漿內(nèi)有一個(gè)將其RNA 反轉(zhuǎn)錄成DNA進(jìn)而整合到染色體的過(guò)程。而在這反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中有一個(gè)3’ U3躍遷至5’端， 而5’端U5躍遷至3’端的過(guò)程，最終造成原病毒兩端都帶有相同的LTR。本發(fā)明中，所述的慢病毒載體可以是現(xiàn)有的任何慢病毒載體，較佳的是慢病毒載體 FUGW。3，LTR任何慢病毒或慢病毒載體都具有3’ LTR。慢病毒載體的3’LTR元件依次包括U3，R， U5三個(gè)區(qū)域。本發(fā)明對(duì)所有3，LTR有作用，對(duì)FUGW的3，LTR效果最佳。對(duì)FUGW的3，LTR 效果最佳。cHS4 元件本發(fā)明中，所述的cHS4元件是雞珠蛋白超敏區(qū)域4(Hypersensitivessite 4 of the chicken-globin locus)的400bp核心序列，較佳的是序列表中SEQ ID NO :3所示的序列。2 X USE 元件本發(fā)明中，所述的USE元件是猴空泡病毒40 (Simian virus 40)的轉(zhuǎn)錄終止上游序列元件(Upstream sequence elements)。2XUSE是指2個(gè)串聯(lián)的USE元件，較佳的是序列表中SEQ ID NO :4所示的序列。AHSP地中海貧血是由于血紅蛋白的珠蛋白鏈合成速率降低，血紅蛋白產(chǎn)量減少所引起的一組遺傳性溶血性貧血。血紅蛋白內(nèi)含有兩種珠蛋白——α珠蛋白和β珠蛋白，二種珠蛋白比例失衡就會(huì)導(dǎo)致地中海貧血。任何一種珠蛋白含量過(guò)高都會(huì)產(chǎn)生毒性，引起包括發(fā)育不良、疲乏、骨損傷或皮膚潰瘍等地中海貧血癥狀。
α 血紅蛋白穩(wěn)定蛋白(lpha hemoglobin stabilizing protein，AHSP)，原稱(chēng)紅細(xì)胞系分化相關(guān)因子(erythroid differentiation-related factor, EDRF)。AHSP 是 α 血紅蛋白分子伴侶，它能與α血紅蛋白結(jié)合，但不能與β珠蛋白或血紅蛋白四聚體結(jié)合。 AHSP能維持α血紅蛋白的穩(wěn)定性，保持α血紅蛋白可溶性，減弱α珠蛋白沉積對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用。本發(fā)明中，利用本發(fā)明的安全性慢病毒載體攜帶AHSP基因，從而將AHSP基因?qū)胨拗髦小?dòng)物試驗(yàn)證明了用本發(fā)明的安全性慢病毒載體攜帶AHSP基因，與常規(guī)慢病毒載體相比，所獲得的治療效果是類(lèi)似的。下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。實(shí)施例1一、片段合成a) AHSP片段的擴(kuò)增。用上游引物AHSP-F :5，-TGGCTCTTGCCTTGCATTTCC-3，，下游弓 I 物 AHSP-R 5’ -GGTAGAGTGGCAGGAGCACAG-3’，以人外周血細(xì)胞基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下
IOx PCRbuffer2.5 pL
dNTPs(2.5mM)2 μL
AHSP-F (IOpmol^L)1 μ
AHSP-R (IOpmol^L)1 μι t^ ^
人血 DNA (約 50ng/pL)1 μL
Pyrobest Taq E (5U^L)0.2 gL
H2O_mjiL^
V 總_25 μL總共做4 個(gè)反應(yīng)管，反應(yīng)條件為 94 "C 5min ； (94 "C 45sec，56 "C 45sec， 72°C lmin) X 32個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0擴(kuò)出約Ikb的AHSP片段(包括AHSP表達(dá)盒，即包括啟動(dòng)子、編碼序列、終止子)，將反應(yīng)液混合后，取5μ L送至上海博尚生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。然后將測(cè)序所得序列與NC_000016. 9序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)完全一致。將剩余所有PCR產(chǎn)物加入2倍體積乙醇沉淀后，溶于10 μ L TE,進(jìn)行補(bǔ)平。反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種安全性慢病毒載體，其特征在于，該慢病毒載體攜帶了整合酶Cre基因表達(dá)盒， 并且在3’ LTR的U3區(qū)含有LoxP位點(diǎn)序列，在U3區(qū)中并在LoxP位點(diǎn)的下游含有用于導(dǎo)入外源基因的限制性酶切位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的安全性慢病毒載體，其特征在于，在3’LTR的U3區(qū)還含有cHS4 的400bp核心序列和SV40的2 XUSE兩種元件中的任何一種或兩種。
3.如權(quán)利要求7所述的安全性慢病毒載體，其特征在于，在3’LTR的U3區(qū)含有5’方向至3’方向依次為反向接入的cHS4元件和正向接入的2XUSE元件。
4.如權(quán)利要求7所述的安全性慢病毒載體，其特征在于，所述的cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2 XUSE在U3區(qū)的位置是在U3區(qū)中LoxP位點(diǎn)序列的下游。
5.如權(quán)利要求1所述的安全性慢病毒載體，其特征在于，所述的慢病毒載體是慢病毒載體FUGW。
6.如權(quán)利要求4所述的安全性慢病毒載體，其特征在于，所述的整合酶Cre基因在慢病毒載體FUGW中的位置是原GFP熒光蛋白基因的位置。
7.—種如權(quán)利要求1所述的安全性慢病毒載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟，1)構(gòu)建攜帶了整合酶Cre基因表達(dá)盒，并且在3’LTR的U3區(qū)插入了LoxP位點(diǎn)序列得慢病毒載體；2)在U3區(qū)中LoxP位點(diǎn)的下游位置插入cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2X USE ；3)在U3區(qū)中LoxP位點(diǎn)的下游位置引入用于插入外源基因的酶切位點(diǎn)。
8.一種攜帶外源基因的重組慢病毒載體，其特征在于，該慢病毒載體攜帶了整合酶 Cre基因表達(dá)盒，并且在3’ LTR的U3區(qū)含有LoxP位點(diǎn)序列，在U3區(qū)中并在LoxP位點(diǎn)的下游含有外源基因。
9.如權(quán)利要求8所述的重組慢病毒載體，其特征在于，所述的外源基因是AHSP基因。
10.如權(quán)利要求1安全性慢病毒載體或8所述的重組慢病毒載體在基因克隆或表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種安全性慢病毒載體及其應(yīng)用。本慢病毒載體攜帶了整合酶Cre基因表達(dá)盒，并且在3’LTR的U3區(qū)含有LoxP位點(diǎn)序列，在U3區(qū)中并在LoxP位點(diǎn)的下游含有用于導(dǎo)入外源基因的限制性酶切位點(diǎn)。本慢病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，所產(chǎn)生的假病毒在整合后發(fā)生“自殺效應(yīng)”，將大部分慢病毒基本骨架刪除，消除了發(fā)生重組相適應(yīng)性病毒(LCV)存在的可能性。并且本發(fā)明的慢病毒載體通讀率降低，進(jìn)一步提高了安全性。本安全性慢病毒載體可以應(yīng)用于基因克隆或表達(dá)，特別是在基因治療，由本發(fā)明的慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因具有更高的安全性。
文檔編號(hào)C12N15/867GK102443604SQ201110385219
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者張敬之, 方彧聃, 曾溢滔 申請(qǐng)人:上海市兒童醫(yī)院