專利名稱：一種n-乙酰基谷氨酸甘油酯的酶合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種N-乙?；劝彼岣视王サ暮铣煞椒ǎ貏e涉及一種N-乙?；劝彼岣视王サ拿负铣煞椒?。背景技術(shù)：
卵磷脂和溶血卵磷脂是藥品、高檔食品和化妝品中最常用、最典型的乳化劑，其源于天然、環(huán)境友好，毒性低、生物降解性高，并和許多藥物成分相容性好。其主要缺點是水溶解度低，來源有限(菜籽油、大豆油中磷脂含量僅為0.3-2.5%)，價格昂貴。目前使用的多數(shù)表面活性劑為化學(xué)合成，對水環(huán)境影響不利，生物降解性、生物相容性差。因此，高效、易生物降解、生物相容性好的表面活性劑的開發(fā)需求日益迫切。開發(fā)以氨基酸為原料的經(jīng)濟的、具有卵磷脂類似性質(zhì)的，同時具有明顯水溶性或抗微生物活力的表面活性劑，無疑具有明顯的優(yōu)勢。
目前基于氨基酸型的磷脂表面活性劑類似物主要有線性結(jié)構(gòu)(單鏈)，雙鏈結(jié)構(gòu) (或雙子)及類甘油酯結(jié)構(gòu)(磷脂模擬物)三類。目前國內(nèi)外氨基酸型表面活性劑的開發(fā)主要集中在前兩類，以天然飽和脂肪酸、醇、胺及不同氨基酸通過酯鍵、酰胺鍵連接縮合獲得。其極性頭和疏水尾各一個，因此其HLB值調(diào)整空間不大。而類甘油酯結(jié)構(gòu)可看作是單甘酯、二甘酯和磷脂的類似物，這類表面活性劑由1分子極性頭和2分子或1分子疏水尾通過甘油碳骨架連接構(gòu)成，通過改變結(jié)合的氨基酸(極性頭)種類或脂肪酸(疏水尾)種類及個數(shù)，可方便地調(diào)節(jié)其HLB值及在水、油中的溶解度。
現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)于含羥基的甘氨酸，酪氨酸和堿性的精氨酸的化學(xué)\酶法報道， 無二羧基的谷氨酸甘油酯合成報道。本發(fā)明選擇水溶解度高、來源經(jīng)濟的谷氨酸作為極性頭，采用酶法無溶劑體系中合成氨基酸甘油酯，為基于氨基酸原料的天然磷脂類似物的合成提供中間體。本發(fā)明的特點是反應(yīng)條件溫和，不使用有機溶劑、原料經(jīng)濟、產(chǎn)品生物相容性高、質(zhì)量好，易于規(guī)模化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種N-乙酰基谷氨酸甘油酯的酶合成方法，該方法反應(yīng)條件溫和，不使用有機溶劑、原料經(jīng)濟、產(chǎn)品生物相容性高、質(zhì)量好，易于規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
—種N-乙?；劝彼岣视王サ拿负铣煞椒ǎ龇椒橐訬-?；被岷透视蜑榈孜?，無溶劑條件下，在酶的作用下，30 80°C，反應(yīng)1 96h，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液后處理， 獲得所述的N-乙酰基谷氨酸甘油酯；所述酶為固定化脂肪酶Novozyme 435、固定化脂肪酶 Lipozyme RM IM、固定化脂肪酶Lipozyme TL IM、木瓜蛋白酶、脂肪酶FAP15 (日本田野制藥公司)、酰基轉(zhuǎn)移酶(Acylase)或胰蛋白酶。
所述底物中N-?；被崤c甘油的物質(zhì)的量比為1 5 30。
所述酶優(yōu)選為固定化脂肪酶Novozyme 435或固定化脂肪酶Lipozyme RM IM0
所述酶的質(zhì)量用量以底物總質(zhì)量計為0.5 10%，所述酶的種類不同，活力范圍亦不相同，酶活力的定義標準也不相同。
所述反應(yīng)液后處理方法為反應(yīng)結(jié)束后，分別加入反應(yīng)液體積1. 5倍的5% NaCl 溶液和反應(yīng)液體積2倍的0. 5mol/L碳酸氫鈉溶液，攪拌至無氣泡生成，過濾，濾液冷卻至室溫用有機溶劑萃取，收集有機相，干燥至恒重，獲得所述的N-乙?；劝彼岣视王?；所述有機溶劑為正己烷、氯仿或乙酸乙酯。
進一步，所述的N-乙酰基谷氨酸甘油酯的酶合成方法，所述方法按以下步驟進行將N-?；被岷透视鸵晕镔|(zhì)的量比為1 20 30混合后作為底物，升溫至70°C， 無溶劑條件下，在固定化脂肪酶Novozyme 435的作用下，pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖溶液中， 30 70°C，反應(yīng)96h，反應(yīng)結(jié)束后，分別加入反應(yīng)液體積1. 5倍的5% NaCl溶液和反應(yīng)液體積2倍的0. 5mol/L碳酸氫鈉溶液，攪拌至無氣泡生成，過濾，濾液冷卻至室溫用有機溶劑萃取，收集有機相，干燥至恒重，獲得所述的N-乙?；劝彼岣视王?；所述固定化脂肪酶 Novozyme 435的質(zhì)量用量以N-酰基氨基酸和甘油總質(zhì)量計為5 10%，所述有機溶劑為氯仿或乙酸乙酯，所述磷酸緩沖液的質(zhì)量用量為N-?；被岷透视涂傎|(zhì)量的10 50%， 優(yōu)選20%.
本發(fā)明是無溶劑體系，甘油既為反應(yīng)物又作溶劑，50 70度粘度大大降低。
本發(fā)明所述酯化率按如下方法計算
酯化率=(酯化的氨基酸量/反應(yīng)前總氨基酸量)*100%
反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液中加入5% NaCl溶液用以提高溶液的極性，減少產(chǎn)物氨基酸甘油酯的溶解度，同時加入0. 5mol/L碳酸氫鈉溶液用于中和未反應(yīng)的N-酰基谷氨酸，生成鈉鹽，過濾，濾液用有機溶劑萃取，N-?；劝彼徕c鹽和甘油進入NaCl水溶液中，而產(chǎn)物 N-?；劝彼岣视王マD(zhuǎn)入有機相中實現(xiàn)富集。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明選擇水溶解度高、來源經(jīng)濟的N-乙?；劝彼嶙鳛槿榛瘎┑臉O性部分，采用酶法無溶劑體系中合成氨基酸甘油酯， 為基于氨基酸原料的天然磷脂類似物的合成提供中間體，本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，不使用有機溶劑、原料經(jīng)濟、產(chǎn)品生物相容性高、質(zhì)量好，易于規(guī)?；a(chǎn)。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此
N-乙?；劝彼?，N-乙?；劝滨０?，N-苯甲?；彼?99% )均為上海晶純試劑有限公司。甘油，AR，國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；脂肪酶Lipozyme RM IM，脂肪酶Lipozyme TL IM，脂肪酶Novozyme 435均為諾維信酶制劑有限公司，木瓜蛋白酶(廣西南寧生物工程有限公司)，脂肪酶FAP15(日本天野制藥公司)，Acylase (日本天野制藥公司)；胰蛋白酶(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)。
實施例1
將0. 9458g(5mmol)N-?；被嶂糜趭A層燒杯中，加入9. 2g(100mmol)甘油， 升溫至50°C，無溶劑條件下，分別添加0.2029g酯化酶(固定化脂肪酶Novozyme 435、固定化脂肪酶Lipozyme RM IM、固定化脂肪酶Lipozyme TL IM、木瓜蛋白酶、?；D(zhuǎn)移酶(Acylase)或胰蛋白酶)，反應(yīng)Mh，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液中分別加入5% NaCl溶液30ml 和0. 5mol/L碳酸氫鈉溶液40ml，攪拌20 30min至無氣泡生成，過濾，濾液冷卻至室溫 (250C )后用乙酸乙酯萃取，收集有機相，干燥至恒重，獲得所述的N-乙?；劝彼岣视王ィ?將產(chǎn)物用流動相適當(dāng)稀釋，采用Waters 1525高效液相色譜分析，測定酯化的N-?；被崃?，并計算酯化率，結(jié)果見表1 ；色譜柱為Lichrosher 100 RP-18(5ym), Lichro CART 250-4的柱子在系統(tǒng)中分析，流動相為0. 05%的乙酸水溶液，流速0. 8mL/min，柱溫30°C，紫外檢測器，檢測波長215nm。
表1不同來源商品酶對底物酯化率的比較
權(quán)利要求
1.一種N-乙?；劝彼岣视王サ拿负铣煞椒?，其特征在于所述方法為以N-酰基氨基酸和甘油為底物，無溶劑條件下，在酶的作用下，30 80°C，反應(yīng)1 96h，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液后處理，獲得所述的N-乙?；劝彼岣视王?；所述酶為固定化脂肪酶Novozyme 435、 固定化脂肪酶Lipozyme RM IM、固定化脂肪酶Lipozyme TL IM、木瓜蛋白酶、脂肪酶FAP15、 ?；D(zhuǎn)移酶或胰蛋白酶。
2.如權(quán)利要求1所述的N-乙酰基谷氨酸甘油酯的酶合成方法，其特征在于所述N-酰基氨基酸與甘油的物質(zhì)的量比為1 5 30。
3.如權(quán)利要求1所述的N-乙酰基谷氨酸甘油酯的酶合成方法，其特征在于所述酶為固定化脂肪酶Novozyme435或固定化脂肪酶Lipozyme RM IM0
4.如權(quán)利要求1所述的N-乙酰基谷氨酸甘油酯的酶合成方法，其特征在于所述酶的質(zhì)量用量以底物總質(zhì)量計為0. 5 10%。
5.如權(quán)利要求1所述的N-乙?；劝彼岣视王サ拿负铣煞椒?，其特征在于所述反應(yīng)液后處理方法為反應(yīng)結(jié)束后，分別加入反應(yīng)液體積1. 5倍的5% NaCl溶液和反應(yīng)液體積2 倍的0. 5mol/L碳酸氫鈉溶液，攪拌至無氣泡生成，過濾，濾液冷卻至室溫用有機溶劑萃取， 收集有機相，干燥至恒重，獲得所述的N-乙?；劝彼岣视王ィ凰鲇袡C溶劑為正己烷、氯仿或乙酸乙酯。
6.如權(quán)利要求1所述的N-乙?；劝彼岣视王サ拿负铣煞椒?，其特征在于所述方法按以下步驟進行將N-?；被岷透视鸵晕镔|(zhì)的量比1 20 30混合后作為底物，升溫至70°C，無溶劑條件下，在固定化脂肪酶Novozyme 435的作用下，pH6. O 9. O磷酸緩沖溶液中，30 70°C反應(yīng)96h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液中加入反應(yīng)液體積1. 5倍的5% NaCl溶液和反應(yīng)液體積2倍的0. 5mol/L碳酸氫鈉溶液，攪拌至無氣泡生成，過濾，濾液冷卻至室溫用有機溶劑萃取，收集有機相，干燥至恒重，獲得所述的N-乙?；劝彼岣视王ィ凰龉潭ɑ久窷ovozyme 435的質(zhì)量用量以N-?；被岷透视涂傎|(zhì)量計為5 10%，所述有機溶劑為氯仿或乙酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種N-乙酰基谷氨酸甘油酯的酶合成方法，所述方法為以N-?；被岷透视蜑榈孜?，30～80℃，反應(yīng)1～96h，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液后處理，獲得所述的N-乙?；劝彼岣视王?；所述酯化酶為固定化脂肪酶Novozyme 435、固定化脂肪酶Lipozyme RMIM、固定化脂肪酶Lipozyme TL IM、木瓜蛋白酶、脂肪酶FAP15(日本田野制藥公司)、酰基轉(zhuǎn)移酶(Acylase)或胰蛋白酶；本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，不使用有機溶劑、原料經(jīng)濟、產(chǎn)品生物相容性高、質(zhì)量好，易于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C12P7/62GK102492736SQ20111038428
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者孟祥河, 潘秋月, 陸麗梅 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)