專利名稱：Kit信號相關(guān)基因qpcr芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于KIT信號相關(guān)基因檢測的QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人KIT原癌基因起源于HZ4貓肉瘤病毒，位于人染色體4ql2，在4號染色體長臂中心體周圍區(qū)域，是白色斑點顯性基因的等位基因。在小鼠中該基因位于第5號染色體距著絲粒約42cM處。人類KIT基因組DNA全長大約89kb，包括21個外顯子。KIT基因編碼 的蛋白質(zhì)被稱為KIT或c-kit受體，是一個分子量為145kD的I型跨膜性糖蛋白，屬于III型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員，分布于細胞膜表面。其結(jié)構(gòu)類似于巨噬細胞集落刺激因子和血小板源生長因子受體，由胞外結(jié)構(gòu)域、單一跨膜區(qū)及胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域三部分組成。胞外區(qū)包含5個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，開始的3個是SCF(干細胞因子)結(jié)合區(qū)，第4、5個結(jié)構(gòu)域在穩(wěn)定SCF及誘導(dǎo)KIT受體二聚化方面起重要作用。Broudy等研究發(fā)現(xiàn)第5個結(jié)構(gòu)域還與KIT受體從細胞膜上的溶蛋白性裂解有關(guān)。胞內(nèi)部分則包含了由ATP結(jié)合區(qū)和磷酸轉(zhuǎn)移酶區(qū)組成的具有酪氨酸激酶活性的結(jié)構(gòu)域。其配體為肥大細胞生長因子、干細胞生長因子、steel因子等，以分泌型和膜結(jié)合型兩種方式與KIT受體結(jié)合。分泌型可使KIT受體激活、內(nèi)化、降解；膜結(jié)合型則能維持KIT受體較長的激活狀態(tài)。KIT受體與配體特異性結(jié)合可觸發(fā)其同源二聚化和細胞膜內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化，產(chǎn)生停泊位點，捕獲含SH2結(jié)構(gòu)域的信號分子，還能直接激活蛋白激酶C、MAP激酶、RacUJNK, Raf-I、JAK2等，通過多種信號因子的參與將細胞外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)部，引發(fā)某些基因的特異性表達。SCF/KIT共同參與多種細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，如Jak/STAT信號途徑、PI3K途徑、Src家族激酶途徑、Ras/Raf/MEK/ERK信號途徑等，是各種底物激酶的酪氨酸磷酸化和絲/蘇氨酸激酶磷酸化的整合步驟，并且存在著多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的交互作用(cross-talking)，從而精確地調(diào)控細胞的增殖和分化。Kit基因突變不僅僅影響黑素細胞的遷徙與分化而導(dǎo)致斑駁病的產(chǎn)生，也會影響原始生殖細胞的發(fā)育而導(dǎo)致不孕不育，以及影響造血細胞生成而導(dǎo)致貧血及肥大細胞缺乏等，嚴重的Kit基因突變還會導(dǎo)致純合致死，同時，Kit基因是一個重要的原癌基因，Kit基因高表達會導(dǎo)致粒細胞白血病、精原細胞瘤及消化系統(tǒng)間質(zhì)腫瘤。SCF/KIT共同參與的多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與上述病變密切相關(guān)，這些疾病病理發(fā)育過程中相關(guān)信號過程的變化是近年來kit信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的熱點問題。QPCR(Real-Time Quantitative PCR)在基因表達水平、病原體及產(chǎn)前診斷等方面得到廣泛運用。其原理是在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，常用的兩種方法為SYBR Green (熒光染料摻入法)和Taqman probe (探針法)。SYBR Green熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號。熒光染料的優(yōu)勢在于它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設(shè)計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA (如引物二聚體)結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線(melting curve)分析的軟件加以解決。相關(guān)論文最早發(fā)表于1996年，隨后在實驗方法、儀器設(shè)備上進行了一系列改善，已經(jīng)在科研和臨床診斷領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。近年來，對于熒光定量PCR的要求越來越規(guī)范化。從RNA的提取一RNA完整性和純度的鑒定一逆轉(zhuǎn)錄一反應(yīng)體系的優(yōu)化一最后的數(shù)據(jù)分析都有一套嚴格的標準，從而增加了熒光定量PCR結(jié)果的可靠程度，也使實驗的可重復(fù)性得到提高。QPCR芯片是在儀器設(shè)備更新的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，將近百個或數(shù)百個QPCR反應(yīng)設(shè)計在一塊板子上同時進行擴增，以檢測相關(guān)基因的表達豐度?；蛐酒恰案咄俊爆F(xiàn)代生物技術(shù)的標志，其原理是基于核酸分子雜交，用熒光染料標記樣本DNA或cDNA，與基因芯片雜交，經(jīng)激光共聚焦熒光顯微鏡檢出雜交信號，通過計算機處理、分析，得到所需信息。突出特點在于高通量、微型化和自動化。但它存在三個方面的缺點1、費用高；2、難以檢測低豐度表達的基因；3、偏重高通量(一次檢測上萬個甚至幾萬個基因)，缺少針對如皮膚、海馬組織或某種腫瘤等特定組織類型的表達“芯片”。與基因芯片相比，QPCR芯片的通量顯著減低，一次至多檢測96個或384個基因，基本相當(dāng)于基因芯片通量的I %，但是QPCR芯片的擴增對象經(jīng)過仔細選擇，是某一組織或病變類型高度相關(guān)的基因，更便于數(shù)據(jù)的分析處理，檢測基因還可以隨研究需要加以改動，便于操作，而且價格低廉?；蛐酒蚎PCR芯片的原理不同，但對于基因表達譜而言，他們的檢測對象(mRNA或cDNA)到實驗結(jié)果(表達豐度)，QPCR芯片與基因芯片都高度一致，許多研究者都把這兩種方法作為互相印證的手段，而對于幾十個甚至幾百個基因的表達豐度檢測，QPCR技術(shù)完全可以取代基因芯片。計算機預(yù)測是將基因表達水平的數(shù)據(jù)與分子信號過程進行聯(lián)系的關(guān)鍵步驟，廣泛運用的軟件是PathwayStudio。根據(jù)基因表達量的變化，計算機結(jié)合已知信號通路的信息，將“宏觀表型”與分子信號過程結(jié)合。由于這一軟件預(yù)測的基礎(chǔ)是已知信號過程，并不能預(yù)測新的未知信號過程，所以對基因芯片的海量數(shù)據(jù)的利用率有限。而在QPCR芯片的設(shè)計過程中，研究者依據(jù)已知的信號過程選擇檢測對象，盡管選擇的基因總數(shù)不多，但可能都是預(yù)測軟件的參考基因，同樣會得到較好的結(jié)果。也就是說，被檢測基因的“質(zhì)量”而不是基因信息的通量才是信號通路預(yù)測的關(guān)鍵。人類斑駁病的研究受到很多限制，易受到諸如醫(yī)學(xué)倫理、發(fā)病率低和連續(xù)觀察困難等問題的困擾，動物模型可以很好的解決這些問題。小鼠由于世代周期較短又易于飼養(yǎng)繁殖，其組織形態(tài)和生理生化特征與人相似，與人類基因的同源性、同線性高，已作為應(yīng)用最廣泛的實驗動物之一，成為建立人類疾病模型最重要的實驗材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷提供一種KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用。 本發(fā)明的上述技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案得以實施的一種KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用，所述芯片以Aktl、Bcl2、Cbl、Ccnd3、Ccnd3_ps、CsfI、Crk、Ecml、Fes、Fyn、Grb7、HrasI、Jakl、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrkl、Pdgfa、Pik3ca、Ppplrl3b、Prkcc、Rafl、Sh2b2、Shcl、Snai2、Soatl、StatI、Zhx2基因為檢測位點，以Actb為內(nèi)參，以以下32個基因的上游引物和下游引物為基礎(chǔ)檢測特定基因的表達水平
權(quán)利要求
1.一種KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用，其特征在于所述的KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片是以從之、Cbl、Ccnd3、Ccnd3_ps、Csfl、Crk、Ecml、Fes、Fyn、Grb7、Hrasl、Jakl、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、NrOb2、Ntrkl、Pdgfa、Pik3ca、Ppplrl3b、Prkcc、Rafl、Sh2b2^ Shcl、Snai2、Soatl、Statl、Zhx2 基因為檢測位點，以為內(nèi)參，以以下32個基因的上游引物和下游引物為基礎(chǔ)檢測特定基因的表達水平基因名稱I上游引物I下游引物Actb_F: AGATGACCCAGATCATGTTTGAGAR: AGATGACCCAGATCATGTTTGAGAAktlF:TGAGGAGCGGGAAGAATGGRiGGTGAGCCTGATCGGAAGTCBe 12F:GAGGCTGGGATGCCTTTGTRicCAGGTATGCACCCAGAGTGACblF:GAGCGCCGGCGGTGGTTGCRiGGAATGGAGCCGGGCGAGAAGGACcndSF:TGCGTGCAAAAGGAGATCAARicACACACCTCCAGCATCCAGTACcnd3-psF:CCTGTCTCTGCCCAGTGGTTRicCAAAAAGTCTGGGCATGCTCrkF:CCAACCCAGCGTCAACACTRiGCTCACCGACCTCCAAAGCCsflF:GCAGCAGTTGATCGACAGTCARicGCATGGTCTCATCTATTATGTCTTGEcmlF:TGCCGCAGCGACACAArIcATTGCATCCTCCCACACAAGFesF:AGCAAGGATCCTGAAACAGTACAAR TGTGCAGACCCCGATGAGAFynF:CCATACCCAGGCATGAACAACRiGTGGGCAGGGCATCCTATAGGrb7F:CTGGATGCACAAACAGGCATARiTGCAGGAAGCCCTGGATCTHraslF:CAAGCTGGCGTGGAGGATRicGCAATTTATGCTGCCGAATJaklF:CCGCATGAGGTTCTACTTTACCARiTGTCGCCATACAGACTGTTCGTKi tlF:GCACAGTGGCTGGTAACAGTTCRiGAACAGGTAAGGATGAGGTCTGTCALynF:CTACGTGGCCAAGGTCAACARicTGTCGCTCTGCATCTTTCCTMap2kF:ACAGAGATGTGAAGCCCTCCAARicCCCGAAGTCACACAGCTTAAMatkF:GCAGTTTGCTCTTCATGTTGCTRicAAGTCCTCAGAGACCAGGATGTMybF:CTGAACCCTGAACTCATCAAAGGRiGACCAACGCTTCGGACCATANrOb2F:GAGCTGGGTCCCAAGGAGTATRiGCACATCTGGGTTGAAGAGGATNtrklF:TCTGGGAGATCTTCACCTATGGARicGATCGCCTCAGTGTTGGAPdgfaF:GTGCGACCTCCAACCTGAARiGCTCATCTCACCTCACATCTGTCTPikScaF:CGAGATATATGATGCAGCCATTGRiAGATAAAGGTTGCCACGCAGTACPpplrlSbF:TGCTGGACTTTGGTGTCAATGRi CAAGAGGCAGCACAATGCPrkccF:AGCAACTGGGCAAGTTTAAGGARiGAAGAAGAGGCCTATGGCGATTRaflF:AGCTTCCCTACGCCCACATRiACCCACGGCCTACCATGASerpinalcF:CTGGACCAAGACACAGTTTTCGRiGCTTCTTCCATTTGCCTTTAAAGASh2b2F:TCCGCCTGGAGTTCTTCGTRi TGTTGTCCTTTTCAGGCATTTCShclF:GCCGACTGCAAACAGATCATTRicCACCGGACGCGAAAGSnai2F:CACACAGTTATTATTTCCCCATATCTCTRicGAGGTGAGGATCTCTGGTTTTSoatlF:AGAATATCCCACGAGTACTAAATGCARiGGTACTGGTTGACTGTGGGTAGTGStatlF:TGAGCCCGACCCTATTACAAAARicCACGAAGGAGCTCTGAATGAZhx2IF:AACTCACAGCAGACACTGATAGGAA| R:TCAGAAGGATTTCAGCACAGACA 根據(jù)權(quán)利要求I所述的KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用，其特征在于所述32個基因的上游引物和下游引物分別放置在同一塊96孔板的各孔內(nèi)，每個基因做3個復(fù)孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用，其特征在于32個基因的上游引物和下游引物分別放置在同一塊384孔板的各孔內(nèi)，每個基因做3個復(fù)孔，每塊板檢測4個標本。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于KIT信號相關(guān)基因檢測的QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用。一種KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應(yīng)用，所述芯片以Akt1、Bcl2、Cbl、Ccnd3、Ccnd3-ps、Csf1、Crk、Ecm1、Fes、Fyn、Grb7、Hras1、Jak1、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrk1、Pdgfa、Pik3ca、Ppp1r13b、Prkcc、Raf1、Sh2b2、Shc1、Snai2、Soat1、Stat1、Zhx2基因為檢測位點，以Actb為內(nèi)參，該QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中用于QPCR反應(yīng)的擴增。與基因芯片相比，本發(fā)明的KIT信號相關(guān)基因QPCR芯片具有以下優(yōu)勢1、費用低；2、所涉及基因是針對某一信號通路或某一組織設(shè)計而成的，具有一定的特異性；3、操作及數(shù)據(jù)分析相對簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102776272SQ20111036528
公開日2012年11月14日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者吳寶金 申請人:杭州師范大學(xué)