專利名稱：提高黑曲霉木聚糖酶表達(dá)量的基因及其重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，尤其涉及一種改進(jìn)的黑曲霉木聚糖酶基因及其重組質(zhì)粒和重組質(zhì)粒后的畢赤酵母細(xì)胞。
背景技術(shù)：
木聚糖是闊葉植物和禾本科植物細(xì)胞壁的主要成分之一，廣泛存在于水果、谷物以及秸稈中。木聚糖酶的全稱為β_1，4-木聚糖內(nèi)切酶或1，4-β-木聚糖木糖水解酶(EC 3. 2. 1.8)，其功能是水解木聚糖主干鏈內(nèi)部的1，4糖苷鍵產(chǎn)生低聚木糖或帶有側(cè)枝的寡聚糖(Curr Opin Biotechnol，1996，7(3) :337-342)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到木聚糖酶在造紙工業(yè)、生物化工，以及食品和飼料等工業(yè)中有著非常廣闊的應(yīng)用前景。在造紙過程中，沉積在纖維上的木聚糖是木質(zhì)素抽提的主要障礙，木聚糖酶的應(yīng)用能提高木質(zhì)素的抽提率；用木聚糖酶處理草漿可顯著改進(jìn)草漿的濾水性，脆性等性能，提高紙漿白度和強(qiáng)度，使草漿可用于生產(chǎn)高質(zhì)量的紙制品；同時(shí)，木聚糖酶的前處理可以降低漂白中的氯和含氯化合物的用量，從而減輕對(duì)環(huán)境的污染。生化產(chǎn)品低聚木糖是重要的食品或醫(yī)藥產(chǎn)品添加劑，目前廣泛應(yīng)用的制備方法是從玉米芯中提取木聚糖，再以木聚糖酶水解產(chǎn)生低聚糖。食品加工時(shí)，應(yīng)用木聚糖酶水解面粉中的木聚糖使水在戊聚糖相和谷蛋白相重新分布，能夠大大地改善面制品的質(zhì)地、結(jié)構(gòu)、松軟度和保質(zhì)期；果汁和啤酒中含有的多糖類物質(zhì)影響了清純度，木聚糖酶可以降解這些多糖使之澄清。木聚糖酶的使用還能改善農(nóng)作物青貯飼料的營養(yǎng)成分，有利于動(dòng)物的消化吸收(中國食品學(xué)報(bào)，2005，5(1) :1-8)。對(duì)于木聚糖酶及其基因的研究已經(jīng)形成熱點(diǎn)。但是，雖然已有上百種木聚糖酶被提純或基因克隆，木聚糖酶的產(chǎn)量并不高；即使使用了基因工程菌，目前世界上能夠提供木聚糖酶的生物公司仍然很少。同時(shí)，不同來源的木聚糖酶具有不同的性質(zhì)。而真菌來源的木聚糖酶相對(duì)于細(xì)菌來源的木聚糖酶具有酶活力高和分子量較小的特點(diǎn)，更容易滲透進(jìn)木質(zhì)纖維原料，從而提高水解效率(Appl Microbiol Biotechnol，2005，64 1412-1419)。黑曲霉是木聚糖酶的生產(chǎn)菌株。但是，通過營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，黑曲霉的木聚糖酶活力仍不能滿足工業(yè)上的需要，而且成本較高。研究表明，對(duì)木聚糖酶的基因進(jìn)行克隆、改造和重組表達(dá)被認(rèn)為可以從根本上顯著提高木聚糖酶活力的最有效方法。研究表明，外源蛋白表達(dá)的差異，一方面是受到表達(dá)條件的影響，另一方面，由外源基因本身的特性決定。從現(xiàn)有的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀來看，對(duì)外源基因表達(dá)的優(yōu)化基本上集中在發(fā)酵條件的優(yōu)化。主要包括(1)酵母菌的生長密度，培養(yǎng)溫度和PH ； (2)甲醇誘導(dǎo)的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。 通過這些培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高了外源目的蛋白的表達(dá)量。但實(shí)際上，要顯著提高外源目的蛋白的表達(dá)量，其上游技術(shù)至關(guān)重要。其技術(shù)主要包括(1)基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。外源基因在巴斯德畢赤酵母中能否表達(dá)或表達(dá)高低首先受到外源基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，也是表達(dá)成功的前提和首要因素。其中，外源基因在宿主中表達(dá)時(shí)，同一種氨基酸可有1 6個(gè)密碼子，但不同的宿主對(duì)編碼同一氨基酸的密碼子使用頻率不同，有些密碼子使用頻率很高，有些幾乎不使用，高效表達(dá)的基因傾向于使用部分特定的同義密碼子，這些密碼子即為改種生物高效表達(dá)基因的優(yōu)越密碼子。這就是密碼子的偏愛性。目前，國內(nèi)外都有學(xué)者對(duì)畢赤酵母部分密碼子的用法進(jìn)行了分析。以Arg為例，編碼6種密碼子在酵母高效表達(dá)基因、低效表達(dá)基因使用頻率明顯不同，密碼子CGA和CGG使用頻率為0，密碼子CGC幾乎不使用， 而AGA使用頻率最高。研究表明，在酵母中表達(dá)較高的基因往往是采用酵母本身所偏愛的密碼子；那些富含畢赤酵母稀有密碼子的外源基因在畢赤酵母中很難得到高效表達(dá)。在不改變氨基酸組成的前提下，將編碼外源蛋白的密碼子優(yōu)化為酵母的偏愛密碼子，可以實(shí)現(xiàn)外源蛋白在酵母體內(nèi)表達(dá)或表達(dá)量的顯著提高。到目前為止，對(duì)黑曲霉木聚糖酶基因進(jìn)行定向改造實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母中的超量表達(dá)在國內(nèi)外還未見研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是大幅度提高黑曲霉木聚糖酶基因表達(dá)水平，獲得在畢赤酵母中超量表達(dá)的黑曲霉木聚糖酶基因xynBT，并進(jìn)行高效表達(dá)。因此提供了一種改進(jìn)的木聚糖基因及其重組質(zhì)粒和重組質(zhì)粒后的畢赤酵母細(xì)胞。技術(shù)方案提高黑曲霉木聚糖酶表達(dá)量的基因，核苷酸序列xynBT如SEQ ID NO. 1所述。包含上述SEQ ID NO. 1核苷酸序列的重組質(zhì)粒。包含上述SEQ ID NO. 1核苷酸序列的重組質(zhì)粒pPICZ α -xynBT。包含SEQ ID NO. 1所述黑曲霉木聚糖酶基因的重組質(zhì)粒制備方法，步驟為(l)xynBT的合成設(shè)計(jì)一組28條寡核苷酸，所述28條寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 SEQ ID N0.四所述；黑曲霉的木聚糖酶基因xynBT的獲得采取兩步PCR擴(kuò)增技術(shù)，第一步，反應(yīng)體系50yL，其中5yL的全部觀條寡核苷酸引物100ηΜ，4μ dNTP Mixture (包括 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2. 5mM, 5 μ L 10XPCR Buffer, 2. 5U Ex Taq, 加水補(bǔ)足50 μ L，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min, 94°C變性30s, 59°C退火30s, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin;第二步，PCR擴(kuò)增基因xynBT，反應(yīng)體系50 μ L 包含第一步的反應(yīng)產(chǎn)物 2yL，引物 SEQ ID N0. 2 :10μΜ IyL,引物 SEQ ID NO. 29 :10μΜ 1 μ L,4y L dNTP Mixture 各 2. 5mM，5XPCR Buffer 10μ L,2. 5U Ex Taq，加水補(bǔ)足 50 μ L，反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 5min, 94°C變性 30s, 59°C退火 30s, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin ；(2)重組質(zhì)粒pPICZ α -xynBT的構(gòu)建將獲得的改造后的基因xynBT和pPICZ α -A 分別用內(nèi)切酶EcoR I.Sac II進(jìn)行分步酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C反應(yīng)過夜，宿主菌使用ToplOF’的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在LLB平板，LLB平板含25 μ g/mL Zeocin,倒置平板過夜，挑選單菌落到5mL液體LLB中，LLB中含25 μ g/mL Zeocin, 37°C，200rpm培養(yǎng)8h，得到重組質(zhì)粒 pPICZ α -xynBT。含有上述重組質(zhì)粒的畢赤酵母宿主細(xì)胞。具體方案內(nèi)容為包括原始基因的克隆、基因的分析和定向改造以及高效表達(dá)。1.參照Genebank上已發(fā)表的黑曲霉木聚糖酶的基因序列(登錄號(hào)為AF490982) 設(shè)計(jì)引物，以提取的黑曲霉的DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得基因全序列，在通過去除內(nèi)含子得到目的基因，并將基因克隆到PMD19-T載體，得到重組質(zhì)粒pMD19-T-xynB(具體見實(shí)施例 1)。2.根據(jù)以下原則對(duì)黑曲霉木聚糖酶基因xynB序列進(jìn)行定向改造1)選用在畢赤酵母中使用頻率較高的密碼子；2)由于畢赤酵母糖基化程度較低，xynB基因中的糖基化位點(diǎn)保持不變；3)為降低mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能(MFE)，在堿基編排過程中去除了富含 GC區(qū)和富含AT區(qū)域；4)使得GC含量接近畢赤酵母自身實(shí)際含量力)提高翻譯終止效率。 在DNAWorks軟件的輔助下，以畢赤酵母密碼子使用頻率表為基準(zhǔn)，以提高該基因密碼子使用頻率為主要目的，采用高度或中度使用頻率的密碼子對(duì)xynB的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。并通過設(shè)計(jì)一組觀條用于新基因合成的寡核苷酸以為，運(yùn)用DNA合成儀經(jīng)過化學(xué)合成獲得這組寡核苷酸引物，該組寡核苷酸引物在同一條鏈上是相鄰的，而與其互補(bǔ)的鏈有若干堿基是重疊的，重疊區(qū)域的解鏈溫度控制在55°C左右。用兩步PCR獲得全新的黑曲霉木聚糖酶基因 xynBT,并最終獲得在畢氏酵母中超量表達(dá)的重組質(zhì)粒pPICZ α -xynBT (具體見實(shí)施例2)。3.黑曲霉木聚糖酶的高效表達(dá)3. 1利用BMGY和BMMY在250mL三角瓶振蕩培養(yǎng)對(duì)重組畢氏酵母進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵。 將陽性轉(zhuǎn)化子接種到Y(jié)PD平板上活化，28°C培養(yǎng)2d，接單菌落到IOmL BMGY液體培養(yǎng)基中， 300C，200rpm搖床培養(yǎng)48h，當(dāng)0D600達(dá)到2 6之間時(shí)，離心，棄上清，用無菌超純水洗滌菌體1 2次。將用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋菌體至0D600 = 1，用4層紗布代替棉塞，于30°C， 250rpm搖床培養(yǎng)。定時(shí)取樣ImL菌液，同時(shí)補(bǔ)加ImL ΒΜΜΥ,Ο. 5% (V/V)甲醇，經(jīng)過13天誘導(dǎo)表達(dá)后，重組木聚糖酶的活性達(dá)到1408U/mL。3. 2利用工業(yè)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基對(duì)重組畢氏酵母進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，發(fā)酵條件為發(fā)酵初始pH為6. 0，并分別添加4. 35mL PTM1/L (發(fā)酵液)，濃度3 % wt的組氨酸及ISmL生物素儲(chǔ)備液(生物素質(zhì)量濃度0.02% wt)于發(fā)酵液中。待培養(yǎng)基中的甘油消耗殆盡后，進(jìn)入補(bǔ)加甘油階段，以0. 6mL甘油/min/L(發(fā)酵液)的流速向培養(yǎng)基中流加濃度50% wt的甘油， 同時(shí)添加12mLPTMl/L (濃度50% wt甘油)以及濃度3% wt的組氨酸，直至菌體濕重達(dá)到 M0g/L。停止補(bǔ)加甘油，待甘油消耗盡以后，維持饑餓狀態(tài)池，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段。將pH 調(diào)整為5. 0，首先以3. 6mL甲醇/h/L(發(fā)酵液)的速度加入到發(fā)酵罐中進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)加入 12mLPTMl/L (甲醇)以及3%的組氨酸，維持此階段2_4h。將甲醇流速提高至7. 2mL甲醇/ h/L(發(fā)酵液)，并維持池。將甲醇流速提高至10. 9mL甲醇/h/L(發(fā)酵液)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，重組木聚糖酶表達(dá)量逐漸升高，蛋白含量也逐漸升高，至誘導(dǎo)72h，木聚糖酶活力達(dá)到最高峰。蛋白表達(dá)量達(dá)到584. 4g/L，最大酶活力達(dá)到20424. 2IU/mL(具體見實(shí)施例3)。本發(fā)明的有益效果通過設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，對(duì)原始的黑曲霉木聚糖酶基因進(jìn)行人工改造，獲得在畢赤酵母超量表達(dá)的木聚糖酶基因xynBT。改造后的黑曲霉木聚糖酶基因xynBT在畢氏酵母中的表達(dá)量較原始基因xynB提高了 2. 6倍，在3L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵時(shí)，木聚糖酶基因xynBT在畢赤酵母中的表達(dá)水平達(dá)到20424. 2U/mL。


圖 1 重組質(zhì)粒 pPICZ α -xynBT ；圖2為3L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵結(jié)果，▲表示蛋白濃度，■表示木聚糖酶的活性；圖3為重組酵母表達(dá)木聚糖酶的蛋白電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 黑曲霉木聚糖酶基因的克隆及表達(dá)1.1黑曲霉基因組DNA的提取(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第四版)北京科學(xué)出版社，2005)(1)將活化的黑曲霉菌株接種于液體培養(yǎng)基上，28-300C，150rpm,培養(yǎng)2天。(2)過濾收集菌絲體，用無菌水洗滌3-4次至培養(yǎng)基完全洗凈，抽干后用錫紙包好后放入液氮中冷凍。(3)取2g菌絲體放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮研磨直至黑曲霉菌絲體研磨成粉狀。(4)將菌絲粉末置于若干EP管中，加入預(yù)熱到65°C的CTAB抽提液(加入占抽提液2% wt的巰基乙醇)。震蕩使之充分混勻，于65°C溫浴45-60min，不時(shí)混勻。(5)向EP管中加入等體積的混合液(酚氯仿異戊醇體積比25 24 1)，混勻，12000rpm 離心 20_30min。(6)吸取EP管內(nèi)上層水相，用酚/氯仿/異戊醇混合液重復(fù)抽提。(7)向抽提液中，同時(shí)加入0. 5倍抽提液體積冰冷的5M LiCl和0. 6倍抽提液體積的異丙醇，混勻，室溫靜置20min，12000rpm離心lOmin，棄上清。(8)向離心沉淀中加入ImL 70% vt乙醇，徹底懸浮沉淀，靜置lOmin，12000rpm離心lOmin，棄上清。重復(fù)一次，風(fēng)干，回收沉淀。(9)沉淀重溶于50 μ L含有50 μ g/mL的RNAase的TE緩沖液中，37°C溫育lh。(10)向上步體系中加入0. 1倍體積的3M乙酸鈉(pH 5. 2)和3倍體積的無水乙醇，混勻后_20°C保溫Ih。(11) 12000rpm，4°C，30min 離心，小心倒掉清液。(12)再加入 500yL70% vt 乙醇，室溫靜置 lOmin，4°C，12000rpm 離心 30min。(13)棄凈上清液，在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干。(14)加入50 μ L TE緩沖液重懸，_20°C保存。1.2引物設(shè)計(jì)參照NCBI上公布的黑曲霉木聚糖酶基因，進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)黑曲霉木聚糖酶基因xynB的上下游2條特異性引物XynB prime-fl和XynB prime-rl ；對(duì) xynB基因進(jìn)行序列分析，采用Overlapping Extension PCR方法，合成一對(duì)部分互補(bǔ)的跨過 xynB 內(nèi)含子的引物 XynB prime_f2 和 XynB prime_r2，如表 1 表IPCR擴(kuò)增xynB基因引物及去除內(nèi)含子引物
權(quán)利要求
1.提高黑曲霉木聚糖酶表達(dá)量的基因，其特征在于核苷酸序列XynBT如SEQID NO. 1 所述。
2.包含權(quán)利要求1所述SEQID NO. 1核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
3.包含權(quán)利要求1所述SEQID NO. 1核苷酸序列的重組質(zhì)粒pPICZ α -xynBT。
4.包含SEQID NO. 1所述提高黑曲霉木聚糖酶表達(dá)量基因的重組質(zhì)粒制備方法，其特征在于步驟為(lkr/^r的合成設(shè)計(jì)一組觀條寡核苷酸，所述觀條寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO.四所述；黑曲霉的木聚糖酶基因^ i^的獲得采取兩步PCR擴(kuò)增技術(shù)，第一步， 反應(yīng)體系50 PL，其中5μ 的全部觀條寡核苷酸引物100 ηΜ，4 μ dNTP Mixture 各2. 5 mM,5 μ 10 X PCR Buffer, 2. 5 U Ex Taq，加水補(bǔ)足 50μ ，反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 5 min, 94°C變性 30 s，59°C退火 30 s，72°C 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10 min ；第二步，PCR 擴(kuò)增基因xynBT，反應(yīng)體系50 PL 包含第一步的反應(yīng)產(chǎn)物2 μ ，引物SEQ ID NO. 2 10 μΜ μ , 引物 SEQ ID Ν0· 29 :10 μΜ μ Α dNTP Mixture 各 2· 5 mM,5XPCR Buffer 10 μ , 2. 5 U Ex iTaq,加水補(bǔ)足50 μ ，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，59°C退火30 s， 72 °C 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 °C 延伸 10 min ；(2)重組質(zhì)粒pPICZ α -xynBT的構(gòu)建將獲得的改造后的基因和pPICZ α -A分別用內(nèi)切酶I.Sac II進(jìn)行分步酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C反應(yīng)過夜，宿主菌使用ToplOF’的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在LLB平板，LLB平板含25 Pg/mL Zeocin，倒置平板過夜， 挑選單菌落到5 mL液體LLB中，LLB中含25 Pg/mL Zeocin, 37°C, 200 rpm培養(yǎng)8h，得到重組質(zhì)粒 pPICZ α -xynBT。
5.攜帶有權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒的畢赤酵母宿主細(xì)胞。
全文摘要
提高黑曲霉木聚糖酶表達(dá)量的基因及其重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞，涉及對(duì)來源于黑曲霉的木聚糖酶基因進(jìn)行偏愛密碼子的優(yōu)化、GC含量調(diào)整、順式作用元件及順向重復(fù)序列優(yōu)化。通過設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，對(duì)原始的黑曲霉木聚糖酶基因進(jìn)行人工改造，獲得在畢赤酵母超量表達(dá)的木聚糖酶基因xynBT。改造后的黑曲霉木聚糖酶基因xynBT在畢氏酵母中的表達(dá)量較原始基因xynB提高了2.6倍，在3L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵時(shí)，木聚糖酶基因xynBT在畢赤酵母中的表達(dá)水平達(dá)到20424.2U/mL。本發(fā)明可用于木聚糖酶基因的分子改造及其重組木聚糖酶的生產(chǎn)，能顯著提高木聚糖酶的表達(dá)水平。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102424828SQ20111035974
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者李飛, 趙林果 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)