專(zhuān)利名稱(chēng)：重組人IFNα2b乳腺表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是一種重組人IFNa 2b乳腺表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人干擾素2b (IFN α 2b)是一種具有干擾病毒復(fù)制，抑制細(xì)胞分裂增殖，抑制和殺傷腫瘤等生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，是臨床上治療乙肝、丙肝等病毒性疾病和一些癌癥的關(guān)鍵藥物。目前，在臨床上大量使用的重組人IFNa 2b均為大腸桿菌表達(dá)。由于大腸桿菌是原核生物，缺乏與蛋白質(zhì)翻譯后修飾相關(guān)的重要酶類(lèi)，使得所表達(dá)的重組人IFNa 2b缺少?zèng)Q定生物活性的化學(xué)修飾和空間折疊，直接導(dǎo)致了在治療效果上的折扣。更嚴(yán)重的是，錯(cuò)誤折疊的重組人IFN α 2b在對(duì)病人的治療過(guò)程中，會(huì)刺激人體產(chǎn)生能中和IFN α 2b的抗體，進(jìn)一步降低治療效果。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)IFN α 2b，可以生產(chǎn)具有完全生物活性的重組人IFNα 2b，但此種方式的生產(chǎn)成本過(guò)高，且細(xì)胞培養(yǎng)條件要求苛刻，表達(dá)量低，純化工藝復(fù)雜，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足IFNa 2b的市場(chǎng)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種重組人IFNa 2b乳腺表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。解決上述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案重組人IFNa 2b乳腺表達(dá)載體，該乳腺表達(dá)載體是pBCN-IFN-pA-EGFP。pBCN-IFN-pA-EGFP由擴(kuò)增所得的beta-酪蛋白啟動(dòng)子和ployA序列、人IFNa 2b 基因、EGFP的表達(dá)盒按順序ployA-IFN a 2b-酪蛋白啟動(dòng)子-EGFP表達(dá)盒插入到pMD18_T而得。上述重組人IFNa 2b乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建方法，主要包括以下步驟<1>根據(jù)GenBank中收錄的娟姍牛beta-酪蛋白啟動(dòng)子和ployA序列，Genbank accession No. JN559864，設(shè)計(jì)引物，并以娟姍牛血液基因組DNA為模板，擴(kuò)增出beta-酪蛋白啟動(dòng)子和PIoyA序列；<2> 根據(jù) GenBank 中收錄的人 IFN α 2b 基因，Genbank accession No. AY255838. 1， 設(shè)計(jì)引物，并以人血液基因組為模板，擴(kuò)增獲得人IFNa 2b基因；<3>根據(jù)BD Biosciences Clontech公司提供的pEGFP-Cl載體的全序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出EGFP的表達(dá)盒；<4>按順序?qū)⑺鶖U(kuò)增得到的序列插入到PMD18-T中，順序?yàn)閜loyA-IFN α 2b_酪蛋白啟動(dòng)子-EGFP表達(dá)盒，即得乳腺表達(dá)載體pBCN-IFN-pA-EGFP。上述重組人IFNa 2b乳腺表達(dá)載體的應(yīng)用，將該b乳腺表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到哺乳動(dòng)物中，以促使其乳腺高效表達(dá)重組人IFN α 2b。哺乳動(dòng)物為小鼠。
轉(zhuǎn)化是用Pvu I單酶切pBCN-IFN-pA-EGFP表達(dá)載體，切除pMD_18T骨架，回收含有IFN α 2b基因和EGFP基因的片段，回收的基因片段分別溶于無(wú)內(nèi)毒素的TE溶液，調(diào)整溶液濃度至2ng/y L，然后注射到小鼠的受精卵的原核中，再將受精卵抑制到同期發(fā)情的代孕母鼠輸卵管中，產(chǎn)生自代，鑒定，得到轉(zhuǎn)基因小鼠?；厥帐堑腿埸c(diǎn)瓊脂糖凝膠回收，具體是取3 4 μ g酶切的表達(dá)載體DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切下需回收的DNA條帶所在位置的凝膠，采用Qiagen公司可回收101Λ以上的DNA片段的凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。本發(fā)明的重組人IFNa 2b乳腺表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，為利用哺乳動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人IFNa 2b提供了基礎(chǔ)。通過(guò)胚胎顯微操作技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物的基因組中獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺中高效表達(dá)重組人IFNa 2b等其他重要的藥用蛋白。此種方式成本低(轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的飼養(yǎng)條件、飼料構(gòu)成與普通動(dòng)物無(wú)異， 不需額外的投入)，乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)量高和純化方便(乳汁成分明確，蛋白質(zhì)種類(lèi)較少)， 乳汁中的含量為30 μ g/L(約為細(xì)胞系表達(dá)量的10倍)。對(duì)所表達(dá)的重組人IFN α 2b生物活性進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，比活度約為2. SXlO7IU,并且能在WISH細(xì)胞系中顯著刺激抗病毒白 MxA的表達(dá)。因此，應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)的重組人IFNa 2b的生物學(xué)活性高、產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。


圖1是重組人IFN α 2b的乳腺表達(dá)載體pBCN-IFN-pA-EGFP的構(gòu)建過(guò)程。圖2是Pvu I酶切乳腺表達(dá)載體pBCN-IFN-pA-EGFP的電泳圖，其中，Ml表示 λ DNA/Hind ΠΙ DNA marker。泳道1為Pvu I酶切后的結(jié)果，泳道2為環(huán)狀質(zhì)粒。M2為 Supercolied DNA ladder marker。乳腺表達(dá)載體 pBCN-IFN-pA-EGFP 經(jīng) Pvu I 酶切后，可切出兩條帶，一條為11. Ikb的含有IFNα 2b和EGFP的表達(dá)盒。另一條為11Λ的pMD18_T 骨架；圖3是PCR鑒定表達(dá)載體整合的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠的電泳圖，其中M表示DNA Iaddermarker III，泳道1，6，7號(hào)分別為3只轉(zhuǎn)基因Rnmder小鼠PCR結(jié)果，上下兩個(gè)條帶， 分別為兩個(gè)不同檢測(cè)引物的擴(kuò)增結(jié)果。其他泳道為見(jiàn)條帶，均為陰性小鼠對(duì)照；圖4是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中IFN c^b基因整合的Southern blotting雜交圖，其中，M表示11Λ梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1，6，7泳道分別為3只轉(zhuǎn)基因Founder小鼠，其他泳道均為陰性小鼠對(duì)照；圖5是PCR鑒定表達(dá)載體整合的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠的電泳圖，其中M表示DNA Iaddermarker III，泳道1-14號(hào)均為Fl代小鼠PCR結(jié)果，4號(hào)泳道的擴(kuò)增不明顯，判定為轉(zhuǎn)基因陰性。BC泳道為空白對(duì)照。上下兩個(gè)條帶，分別為兩個(gè)不同檢測(cè)引物的擴(kuò)增結(jié)果；圖6是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中IFNc^b基因整合的Southern blotting雜交圖， 其中，M表示11Λ梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，8-13號(hào)泳道分別為Fl代轉(zhuǎn)基因小鼠，NC泳道為陰性小鼠對(duì)照；圖7是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中重組人IFNa沘表達(dá)情況的western blotting圖， 6,8,9,11，12，13泳道分別為轉(zhuǎn)基因小鼠Fl代乳汁的雜交結(jié)果，WT為陰性對(duì)照小鼠乳汁的雜交結(jié)果，分別用鼠抗人IFNa 2b抗體和鼠抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行雜交。均在M-25KD處有雜交條帶出現(xiàn)；圖8是轉(zhuǎn)基因小鼠制備的流程圖。圖9是轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中重組人IFNa 2b的生物學(xué)活性測(cè)定。圖10是轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中重組人IFNa 2b的比活度的定量測(cè)定。
具體實(shí)施例方式以下所用的載體和試劑來(lái)源pMD18_T載體，購(gòu)自TaKaRa公司，pEGFP-Cl載體， 購(gòu)自BD Biosciences Clontech公司，引物合成及序列測(cè)定均由上海生工生物工程有限公司完成，Taq酶、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶及熒光定量相關(guān)試劑均購(gòu)自大連TaKaRa公司，鼠抗人IFN α 2b單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體購(gòu)自Abmart公司，羊抗鼠HRP酶標(biāo)二抗購(gòu)自天根公司。人IFN α 2bELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D公司，人羊膜上皮細(xì)胞系WISH細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。重組人IFN α 2b標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自安徽安科生物。 pGL3-Basic和pRL_TK以及雙擊熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。以下所用到的酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增、基因組提取、RNA提取、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、顯微注射法、Western blotting.Southern blotting等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作的步驟詳見(jiàn)《分子克隆(第三版)》(2000年，科學(xué)出版社)或者相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)；轉(zhuǎn)基因小鼠的制備過(guò)程參見(jiàn)《小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)指南》(A.納吉等著，2004年，科學(xué)出版社)。一、重組人IFN α 2b的乳腺表達(dá)載體pBCN_IFN-pA_EGFP的構(gòu)建1. 1重組人IFN α 2b乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中收錄的娟姍牛beta-酪蛋白基因ployA序列(Genbank accession No. JN559864，見(jiàn)序列表SEQ. ID. No. 1的堿基序列)設(shè)計(jì)引物，ρIoyA F :5，-GGTACCAGAGGATTTCAAAGTGAATG-3，ρIoyA R :5，-GAGCTCCAAAGATAAATTTAAGTTAACAAT-3，
并在上下游引物的5'端和3'端分別引入KpnI和Mc I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并以娟姍牛血液基因組DNA為模板，擴(kuò)增出beta-酪蛋白ployA序列，將PCR產(chǎn)物回收后連接到pMD18-T載體，命名為pMD18-ployA，并進(jìn)行測(cè)序，證明序列正確后利用引入的Kpn I和 Sac I雙酶切，回收1178bp的片段，將回收產(chǎn)物連接到同樣經(jīng)過(guò)Kpn I和Mc I雙酶切的 PMD18-T載體中,將該載體命名為pMD18-ployA construct備用。根據(jù)GenBank 中收錄的人 IFNa 2b 基因(Genbank accession No. AY255838. 1，見(jiàn)序列表SEQ. ID. No. 2的堿基序列)設(shè)計(jì)引物，IFN F :5’ -GGATCCCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTTGTGATCTGCCTCAAACC-3’IFN R 5' -GGTACCTCATTCCTTACTTCTTAAACT-3，并在上下游引物的5'端分別引入BamH和Kpn I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，同時(shí)在上游引物的5'端引入6XHis標(biāo)簽序列和凝血酶識(shí)別序列。并以人血液基因組為模板，擴(kuò)增出人IFNa 2b基因。將PCR產(chǎn)物回收后連接到pMD18_T載體，命名為pMD18_IFN，并進(jìn)行測(cè)序，證明序列正確后利用引入的BamH和IKpn I雙酶切，回收554bp的片段，將回收產(chǎn)物連接到同樣經(jīng)過(guò)BamH和IKpn I雙酶切的pMD18_ployA construct載體中，將該載體命名為 pMD18-IFN-pA 備用。
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根據(jù)GenBank中收錄的娟姍牛beta-酪蛋白啟動(dòng)子序列(Genbank accession No. JN559864，見(jiàn)序列表SEQ. ID. No. 3的堿基序列)設(shè)計(jì)引物，BCNp F :5，-GTCGACGCGCGGCCGCGGAATATTCATTGGAAGGATTGAT-3，BCNp R:5， -GGATCCCTCTCTTGCAAGGGCCAGAGC-3，，并在上下游引物的5'端引入Mil和Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，3'端引入BamHI酶切位點(diǎn)。并以娟姍牛血液基因組DNA為模板，擴(kuò)增出beta-酪蛋白啟動(dòng)子序列，將PCR產(chǎn)物回收后連接到PMD18-T載體，命名為pMD18-BCNp，并進(jìn)行測(cè)序，證明序列正確后利用引入的 Sal I和BamH I雙酶切，回收5260bp的片段，將回收產(chǎn)物連接到同樣經(jīng)過(guò)Ml I和BamH I 雙酶切的pMD18-IFN-pA載體中，將該載體命名為pBCN_IFN-pA備用。根據(jù)BD Biosciences Clontech公司提供的pEGFP_Cl載體的全序列(EGFP序列見(jiàn)序列表SEQ. ID. No. 4的堿基序列)設(shè)計(jì)引物，EGFP F 5' -GTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTGCGTTATCCCCTGATTC-3’EGFP R:5’ -GCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGATACATTGATGAGTTTGGAC-3’并在上下游引物的5'端分別引入Ml I和Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，同時(shí)引入LoxP 序列。以pEGFP-Cl質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出EGFP的表達(dá)盒。將PCR產(chǎn)物回收后連接到pMD18_T 載體，命名為PMD18-EGFP，并進(jìn)行測(cè)序，證明序列正確后利用引入的Ml I和Not I雙酶切， 回收1632bp的片段，將回收產(chǎn)物連接到同樣經(jīng)過(guò)Ml I和Not I雙酶切的pBCN_IFN-pA載體中，將該載體命名為pBCN-IFN-pA-EGFP。表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程如圖1所示。二、表達(dá)重組人IFN α 2b的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及檢測(cè)2. 1顯微注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠用顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，線(xiàn)性載體比環(huán)形載體的整合效率高，因此要先把構(gòu)建好的表達(dá)載體切成線(xiàn)性才能進(jìn)行顯微注射。用Pvu I酶切，切掉PMD8-T載體序列，回收11. Ikb含有人IFN α 2b的片段，回收片段見(jiàn)附圖2。將酶切的載體DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切下DNA條帶所在位置的凝膠，采用可回收101Λ以上DNA片段的凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收?；厥盏幕蚱稳芙庥谠噭┖兴涞臒o(wú)內(nèi)毒素TE溶液中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定^Onm和^Onm下的OD比值，并計(jì)算濃度?；厥盏腄NA片段的質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，以O(shè)D26tl/ OD280比值大于1. 8為達(dá)標(biāo)，即可用于注射小鼠受精卵。將回收的DNA稀釋至終濃度為2ng/ μ L，將注射到受精卵的原核中，再將受精卵移植到同期發(fā)情的代孕母鼠的輸卵管中。2. 2轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)取斷奶的轉(zhuǎn)基因小鼠尾巴組織，提取基因組，以提取的基因組DNA為模板，用 pBCN-IFN-pA-EGFP載體上IFN α 2b基因兩側(cè)的酪蛋白啟動(dòng)子序列和ployA上的序列的引物 (CXF :5，-TACACTATTTCCTCATCTTCCCA-3，，CXR :5，-TCAGTCTGCCTCCAATATCC-3，)和 CMV 檢測(cè)引物( C M V F 5 ‘ -GTTATCCCCTGATTCTGTGG-3 ‘ , C M V R 5' -ATAGACCTCCCACCGTACAC-3 ‘)，在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠中可以同時(shí)擴(kuò)增出780bp和600bp 的兩條片段，以野生型小鼠(非轉(zhuǎn)基因小鼠)基因組為模板的PCR為陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件為95°C，30sec,60°C，30sec, 72°C，Imin ；35個(gè)循環(huán)。然后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察結(jié)果。通過(guò)PCR在FO代8只小鼠中有3只陽(yáng)性，見(jiàn)附圖3。在Fl代13只小鼠中檢測(cè)到12 只陽(yáng)性小鼠，只有4號(hào)為陰性。見(jiàn)圖52. 3 轉(zhuǎn)基因小鼠的 Southern blotting 檢測(cè)將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的FO代3只整合了人IFNa 2b基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，剪取尾尖組織并提取基因組，取10-30 μ g基因組DNA，用BamH I內(nèi)切酶消化過(guò)夜，同時(shí)用BamH I酶切野生型小鼠基因組作為陰性對(duì)照。探針用回收的人IFN α 2b基因片段制備。將各個(gè)樣品在0. 8%的瓊脂糖凝膠上，以30V的低電壓緩慢電泳過(guò)夜(12-1 )。采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移的方法將DNA從瓊脂糖轉(zhuǎn)移至正電尼龍膜上，將尼龍膜上吸附了 DNA的一面朝上，通過(guò)紫外交聯(lián)儀交聯(lián)。交聯(lián)結(jié)束后，清水清洗一遍，將尼龍膜附著DNA的一面向內(nèi)圈成筒狀入雜交管內(nèi)。加入預(yù)雜交液，于45°C預(yù)雜交lh，加入經(jīng)過(guò)加熱變性的地高辛標(biāo)記的探針，45°C雜交12-1他， 充分洗膜后，均勻滴加上CSPD發(fā)光液，保鮮膜包裹后，放進(jìn)暗盒，暗室中壓上X光片曝光Ih 后，沖洗X光片觀(guān)察結(jié)果。Southern blotting結(jié)果如附圖4所示，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠Southern blotting檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。Fl代轉(zhuǎn)基因小鼠的Southern blotting檢測(cè)結(jié)果如附圖6。三、重組人IFN α 2b在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的表達(dá)分析3. 1由實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁的Wfestern blotting檢測(cè)哺乳10天后采集Fl代轉(zhuǎn)基因小鼠6#，8#，9#，11#，12#，13#小鼠的乳汁，陰性小鼠的乳汁做陰性對(duì)照，采集前，將母鼠與仔鼠分離4小時(shí)，并系通過(guò)腹腔注射適量縮宮素， IOmin后，速眠新麻醉，按摩乳頭擠壓出乳汁。全乳經(jīng)脫脂和脫酪蛋白處理后的乳樣用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離。分離后的蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，進(jìn)行Wfestern blotting分析。通過(guò)兩種不同抗體均能檢測(cè)到重組IFN α 2b的表達(dá)，如附圖7所示。在所有的轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中都能檢測(cè)到重組蛋白的表達(dá)，而在陰性小鼠的乳汁中則檢測(cè)不到。3. 2轉(zhuǎn)基因乳汁樣品中重組IFN α 2b的表達(dá)定量檢測(cè)用夾心法ELISA對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的重組IFNa 2b的表達(dá)量進(jìn)行分析。分析試劑盒為R&D公司的人干擾素定量檢測(cè)試劑盒。用試劑盒內(nèi)提供的標(biāo)準(zhǔn)品作為定量的標(biāo)準(zhǔn)。 每次測(cè)量每個(gè)樣品重復(fù)三次。測(cè)定結(jié)果如下表1轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中重組人IFNa 2b的表達(dá)量
Mouse NumberODExpression Ιενε (μ^)
F0-10.20217.2
Fl-90.21929.71
Fl-120.19411.32
Fl-100.1811.8
WT0.062-
BLANK0.05-四、重組人IFN a 2b的生物學(xué)活性檢測(cè)4. 1重組人IFN a 2b的活性測(cè)定
將母鼠與仔鼠分離4小時(shí)后，并系通過(guò)腹腔注射適量縮宮素，IOmin后，速眠新麻醉，按摩乳頭擠壓出乳汁。全乳經(jīng)脫脂和脫酪蛋白處理后，用含10%胎牛血清的DMEM稀釋?zhuān)?并用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾備用。接種人羊膜上皮細(xì)胞系WISH細(xì)胞至35cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于 370C 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)，將無(wú)菌處理的乳汁添加至細(xì)胞中，過(guò)夜培養(yǎng)，同時(shí)做非轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁和空白對(duì)照。提取細(xì)胞總RNA，用無(wú)RNase的DNase充分消化總RNA中殘留的DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)確定無(wú)DNA殘留后，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。并設(shè)計(jì)IFN α 2b的誘導(dǎo)基因MxA 基因(Genbank accession No. NM_001178046. 1)的引物和人 beta-actin 內(nèi)參(Genbank accession No. NM_001101. 3)引物MxAF 5’ -GCAGAAGGTCAGAGAGAAGG-3 ’MxAR :5’ -AGGGATGTGGCTGGAGATG-3’ACTBF 5' -CACCACACCTTCTACAATGAG-3‘ACTBR 5 ‘ -GCGTACAGGGATAGCACAG-3 ‘以 cDNA 為模板，利用以上引物通過(guò) ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析。擴(kuò)增條件為 95°C，5min, 95°C，30sec,60°C，30sec, 72°C， lmin;40個(gè)循環(huán)。72°C延伸結(jié)束后采集熒光。并作溶解曲線(xiàn)。根據(jù)2_Δ 法計(jì)算出MxA基因的相對(duì)表達(dá)量，如附圖9。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁能夠誘導(dǎo)MxA基因的表達(dá)，表達(dá)量約為非轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁的IO6倍。4. 2轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中重組人IFN α 2b的比活度的定量測(cè)定根據(jù)Genbank中收錄的MxA基因啟動(dòng)子的序列(Genbank accession No. ΝΤ_011512. 11)設(shè)計(jì)引物，MxAF 5' -AGATCTTTTTATTTTCCTTCCACACAC-3‘MxAR 5' -AAGCTTCTGACTTGGGTTTGCTTTC-3 ‘并在上下游引物的 5'端分別引入 Bgl II和Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)并以人血液基因組為模板，擴(kuò)增出人MxA啟動(dòng)子序列。將 PCR產(chǎn)物回收后連接到pMDIS-T載體，命名為pMD18-MxA，并進(jìn)行測(cè)序，證明序列正確后利用引入的Bgl II和Hind III雙酶切，回收1084bp的片段，將回收產(chǎn)物連接到同樣經(jīng)過(guò)BglII 和Hind III雙酶切的pGL3-Basic載體中，將重組的載體命名為pGL3_MxA。將母鼠與仔鼠分離4小時(shí)后，并系通過(guò)腹腔注射適量縮宮素，IOmin后，速眠新麻醉，按摩乳頭擠壓出乳汁。全乳經(jīng)脫脂和脫酪蛋白處理后，用含10%胎牛血清的DMEM稀釋?zhuān)?并用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾備用標(biāo)準(zhǔn)品重組人IFN α 2b用含有10%胎牛血清的DMEM稀釋后做梯度稀釋?zhuān)謩e為 1500IU/mL,1000IU/mL,500IU/mL,250IU/mL,125IU/mL, OIU/mL將人羊膜上皮細(xì)胞系WISH細(xì)胞至M孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37°C 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)，將pGL3-MxA質(zhì)粒與對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK按1 1 混合，轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISH細(xì)胞。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，更換過(guò)濾除菌的小鼠奶和重組人IFNa 2b標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)做陰性轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁對(duì)照和空白對(duì)照。每組檢測(cè)設(shè)三個(gè)重復(fù)。M小時(shí)后，收集細(xì)胞， Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶的活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)熒光強(qiáng)度做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠乳汁處理組的熒光素酶值，計(jì)算出活性單位。 在經(jīng)過(guò)乳汁含量換算出比活度。結(jié)果如附圖10。所表達(dá)的重組人IFN α 2b的比活度為 2. 8X107IU/mg。
權(quán)利要求
1.一種重組人IFNa 2b乳腺表達(dá)載體，其特征在于該乳腺表達(dá)載體是 pBCN-IFN-pA-EGFP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人IFNa2b乳腺表達(dá)載體，其特征在于所述 pBCN-IFN-pA-EGFP由擴(kuò)增所得的beta-酪蛋白啟動(dòng)子和ployA序列、人IFN α 2b基因、EGFP 的表達(dá)盒按順序ployA-IFNa 2b-酪蛋白啟動(dòng)子-EGFP表達(dá)盒插入到pMD18_T而得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述重組人IFNa2b乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于主要包括以下步驟<1>根據(jù)GenBank中收錄的娟姍牛beta-酪蛋白啟動(dòng)子和ployA序列，Genbank accessionNo. JN559864,設(shè)計(jì)引物，并以娟姍牛血液基因組DNA為模板，擴(kuò)增出beta-酪蛋白啟動(dòng)子和PIoyA序列；<2> 根據(jù) GenBank 中收錄的人 IFNa 2b 基因，Genbank accession No. AY255838. 1，設(shè)計(jì)引物，并以人血液基因組為模板，擴(kuò)增獲得人IFNa 2b基因；<3>根據(jù)BD Biosciences Clontech公司提供的pEGFP_Cl載體的全序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出EGFP的表達(dá)盒；<4>按順序?qū)⑺鶖U(kuò)增得到的序列插入到pMDIS-T中，順序?yàn)?PloyA-IFNa 2b-酪蛋白啟動(dòng)子-EGFP表達(dá)盒，即得乳腺表達(dá)載體pBCN-IFN-pA-EGFP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述重組人IFNa2b乳腺表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于將該b 乳腺表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到哺乳動(dòng)物中，以促使其乳腺高效表達(dá)重組人IFNa 2b。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組人IFNa2b乳腺表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于所述哺乳動(dòng)物為小鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組人IFNa2b乳腺表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化是用Pvu I單酶切pBCN-IFN-pA-EGFP表達(dá)載體，切除pMD_18T骨架，回收含有IFN α 2b基因和EGFP基因的片段，回收的基因片段分別溶于無(wú)內(nèi)毒素的TE溶液，調(diào)整溶液濃度至2ng/ μ L，然后注射到小鼠的受精卵的原核中，再將受精卵抑制到同期發(fā)情的代孕母鼠輸卵管中，產(chǎn)生自代，鑒定，得到轉(zhuǎn)基因小鼠。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組人IFNa2b乳腺表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于所述回收是低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收，具體是取3 4 μ g酶切的表達(dá)載體DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切下需回收的DNA條帶所在位置的凝膠，采用Qiagen公司可回收101Λ以上的DNA片段的凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人IFNα2b乳腺表達(dá)載體，該乳腺表達(dá)載體是pBCN-IFN-pA-EGFP，它是由擴(kuò)增所得的beta-酪蛋白啟動(dòng)子和ployA序列、人IFNα2b基因、EGFP的表達(dá)盒按順序ployA-IFNα2b-酪蛋白啟動(dòng)子-EGFP表達(dá)盒插入到pMD18-T而得。本發(fā)明還公開(kāi)了該乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明為利用哺乳動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人IFNα2b提供了基礎(chǔ)。而且，應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)的重組人IFNα2b的生物學(xué)活性高、產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102363791SQ20111035966
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者劉慶友, 崔奎青, 李輝, 石德順 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)