專利名稱：GmMYB73在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種GmMYB73在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)境中物理化學(xué)因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等對植物的生長發(fā)育有重要影響，嚴(yán)重時會造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，培育耐逆性作物是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。目前，基因工程育種已經(jīng)成為增強作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細(xì)胞有多種途徑應(yīng)答環(huán)境中的各種逆境脅迫，其中轉(zhuǎn)錄因子起著調(diào)控耐逆相關(guān)效應(yīng)基因表達的作用。植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多類轉(zhuǎn)錄因子與植物耐逆性相關(guān)，例如:EREBP/AP2中的DREB類，bZIP，MYB，WRKY等等。MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是指含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子。MYB結(jié)構(gòu)域是一段約51 53個氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。自從1987年克隆了玉米與色素合成有關(guān)的ZmMYBCl基因后，又從很多植物中分離到功能各異的MYB基因。植物的MYB蛋白大都只含有兩個MYB結(jié)構(gòu)域，它們是一個大轉(zhuǎn)錄因子家族，參與許多生物學(xué)過程，例如，次生代謝的調(diào)節(jié)，控制細(xì)胞分化，應(yīng)答激素刺激和外界環(huán)境脅迫以及抵抗病原菌的侵害。植物中還發(fā)現(xiàn)了含一個MYB結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白以及含3個MYB結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白。它們可能分別在維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和參與細(xì)胞周期的控制和調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化上起重要作用。MYB是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，研究表明，MYB參與非生物脅迫的應(yīng)答。在非生物脅迫調(diào)控信號途徑中，MYB基因存在受ABA誘導(dǎo)和不受ABA誘導(dǎo)或甚至受抑制表達，表明MYB轉(zhuǎn)錄因子對非生`物脅迫應(yīng)答時可能參與ABA調(diào)控途徑，也可參與非ABA調(diào)控途徑。擬南芥MYB家族成員Atmyb2受干旱脅迫快速誘導(dǎo)，并且也受高鹽和外源ABA誘導(dǎo)表達。過量表達能增強轉(zhuǎn)基因植株的干旱耐性；擬南芥MYB成員H0S10的突變植株hoslO-Ι對冷害的適應(yīng)能力急劇減弱，并對脫水和NaCl處理高度敏感；在脫水脅迫條件下，ABA的含量增力口。這表明H0S10對冷害適應(yīng)是必需的，并通過控制ABA生物合成來影響植株的脫水脅迫的耐性。而下列基因是不受ABA誘導(dǎo)，擬南芥HPPBF-1是受鹽誘導(dǎo)表達的單一 MYB類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因；水稻0smyb4受低溫誘導(dǎo)，在擬南芥中過量表達能夠增加轉(zhuǎn)基因植株的冷害和凍害抗性。對擬南芥1500個鹽效應(yīng)基因進行分類，發(fā)現(xiàn)受NaCl誘導(dǎo)的MYB基因僅四個。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供GmMYB73蛋白或其編碼基因或如下表達載體的應(yīng)用。本發(fā)明提供了 GmMYB73蛋白或其編碼基因或如下表達載體在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；本發(fā)明所提供的植物耐逆性相關(guān)調(diào)控蛋白為轉(zhuǎn)錄因子GmMYB73，來源于大豆屬大豆(Glycine max (L.) Merri 11),可以是如下(a)、(b)或(c)的蛋白質(zhì):
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物油脂代謝相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)；
(C)由與序列表中序列2所示的氨基酸序列至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的氨基酸序列組成的且與植物油脂相關(guān)調(diào)控的蛋白質(zhì)。
序列表中的序列2由74個氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第24-72位氨基酸殘基為SANT結(jié)構(gòu)域。
編碼所述蛋白GmMYB73的編碼基因GmMYB73也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述蛋白GmMYB73的編碼基因GmMYB73可為如下I)或2)或3)的DNA分子:
1)序列表中序列I所示的DNA分子，由225個核苷酸組成；
2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼植物油脂代謝相關(guān)調(diào)控蛋白的DNA分子；
3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼所述植物油脂代謝相關(guān)調(diào)控蛋白的DNA分子。
在上述應(yīng)用中,所述耐逆性為耐鹽性和/或耐干旱性。
在上述應(yīng)用中，所述耐鹽性通過提高葉片長度、提高發(fā)芽率和/或降低相對離子滲透率體現(xiàn)；
上述的葉片可以為蓮座的第4片葉也可以為蓮座的第3片葉，在本發(fā)明的實施例中具體統(tǒng)計的是蓮座的第4片葉。
在上述應(yīng)用中，所述耐干旱性通過提高發(fā)芽率和/或降低失水率體現(xiàn)；
在上述應(yīng)用中，所述植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為雙子葉植物，尤其優(yōu)選為擬南芥。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法。
本發(fā)明提供的方法，為將GmMYB73蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物；
在上述方法中，所述GmMYB73蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
在上述方法中，所述GmMYB73蛋白的編碼基因為序列表中的序列I。
在上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性和/或耐干旱性；所述耐鹽性具體通過提高葉片長度、提高發(fā)芽率和/或降低相對離子滲透率體現(xiàn)；
上述的葉片可以為蓮座的第4片葉也可以為蓮座的第3片葉，在本發(fā)明的實施例中具體統(tǒng)計的是蓮座的第4片葉。
在上述方法中，所述耐干旱性具體通過提高發(fā)芽率和/或降低失水率體現(xiàn)。
在上述方法中，所述GmMYB73蛋白的編碼基因通過植物表達載體導(dǎo)入所述目的植物。
在上述方法中，所述植物表達載體在本發(fā)明的實施例中具體為將所述GmMYB73蛋白的編碼基因插入載體PPROKII的BamHI和KpnI的酶切位點間，得到表達GmMYB73蛋白的載體。
在上述方法中，所述目的植物可為單子葉或雙子葉植物，優(yōu)選為雙子葉植物，在本發(fā)明的實施例中，為擬南芥。本發(fā)明的第三個目的是提供一種表達載體。本發(fā)明提供的表達載體，在本發(fā)明的實施例中具體為將所述GmMYB73蛋白的編碼基因插入載體pPROKII的BamHI和KpnI的酶切位點間，得到表達GmMYB73蛋白的載體。可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有GmMYB73基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用GmMYB73構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin))，或組織 特異表達啟動子(如種子特異表達的啟動子)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或植物理解為不僅包含轉(zhuǎn)化過程的最終產(chǎn)物，也包含其轉(zhuǎn)基因子代。本發(fā)明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“編碼序列”、“開放閱讀框(ORF) ”等包括單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個或多個原核序列，cDNA序列，包含外顯子和內(nèi)含子的基因組DNA序列，化學(xué)合成的DNA和RNA序列，以及有義和相應(yīng)的反義鏈。本發(fā)明基因可通過如下方式導(dǎo)入宿主中:將本發(fā)明基因插入表達盒中，再將表達盒通過植物表達載體、非致病自我復(fù)制的病毒或農(nóng)桿菌導(dǎo)入宿主。攜帶本發(fā)明基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。本發(fā)明基因可通過如下方式導(dǎo)入宿主中:將本發(fā)明基因插入表達盒中，再將表達盒通過植物表達載體、非致病自我復(fù)制的病毒或農(nóng)桿菌導(dǎo)入宿主。攜帶本發(fā)明基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。
轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。
轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的植物中，會有相應(yīng)的本發(fā)明的植物油脂代謝相關(guān)調(diào)控蛋白的生物合成，進而使轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的植物產(chǎn)生改良性狀。
本發(fā)明的基因可以在序列I的基礎(chǔ)上進行以下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達到更好的表達效果:
I)為了在轉(zhuǎn)基因植物中表達本發(fā)明核苷酸序列，本發(fā)明核苷酸序列可根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化。如可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性。而且，優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達，其中GC含量可為35%，優(yōu)選為多于45%，更優(yōu)選為多于50%，最優(yōu)選多于約60%。
2)為了翻譯的有效起始，可以修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾。
3)將本發(fā)明基因與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達。所述啟動子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子。啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種。例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定。盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達。
優(yōu)選的組成型啟動子包括CaMV 35S和19S啟動子。所述啟動子還可為來源于在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達的幾種肌動蛋白基因中的啟動子。另一個優(yōu)選的組成型啟動子為泛素啟動子。上述啟動子還可為在根、木髓、葉或花粉中引導(dǎo)表達的啟動子，即組織特異性啟動子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子(美國專利US 6，040，504)、水稻蔗糖合酶啟動子(美國專利US 5，604，121)、夜香樹黃化葉卷曲病毒啟動子(W0 01/73087)。
化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子可為Rab29A啟動子(美國專利US 5，614，395)。
4)將本發(fā)明基因與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率。例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進行連接。
5)可向本發(fā)明基因中引入增強子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例`如來源于TMV, MCMV和AMV)。
在實際操作中，也可以將本發(fā)明基因進行細(xì)胞靶向定位?？衫帽绢I(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)實現(xiàn)。例如，將來源于靶向細(xì)胞器的靶基因序列與本發(fā)明基因序列融合，再導(dǎo)入植物細(xì)胞中，就可定位了。
上述重組載體中的出發(fā)載體可根據(jù)所使用的轉(zhuǎn)化技術(shù)及靶植物物種的特性進行選擇。上述選擇可體現(xiàn)在載體中的抗性標(biāo)記的選擇上。對于一些靶物種，可以優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇性標(biāo)記。通常用在轉(zhuǎn)化中的選擇性標(biāo)記包括賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因，和提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。
在優(yōu)選的實施方式中，將本發(fā)明的核苷酸序列直接轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化的主要優(yōu)點是質(zhì)體通常不需要實質(zhì)修飾就能表達細(xì)菌基因，并且質(zhì)體能表達單啟動子控制下的多個開放讀框。通過同源重組將基因插入每個植物細(xì)胞中存在的所有幾千個環(huán)形質(zhì)體基因組拷貝中的質(zhì)體表達利用了拷貝數(shù)大大高于核表達基因的優(yōu)勢，使得表達水平可以容易地超過總可溶植物蛋白質(zhì)的10%。將本發(fā)明基因插入到質(zhì)體靶向載體中，并且轉(zhuǎn)化進入期望的植物宿主質(zhì)體基因組中。獲得了對于含有本發(fā)明核苷酸序列的質(zhì)體基因組而言屬同質(zhì)的植物,該植物具有高水平地表達核苷酸序列的能力。
本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從大豆中克隆了一個MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子基因GmMYB73，研究發(fā)現(xiàn)，GmMYB73基因的過量表達提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性，對培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要的理論及實際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定。
下面 結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為GmMYB73在干旱、鹽、低溫和ABA處理時的表達特征
圖2為pPR0KI1-GmMYB73植物表達載體示意圖
圖3為GmMYB73轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的RT-PCR鑒定結(jié)果
圖4為GmMYB73與擬南芥MYB蛋白的聚類分析
圖5為CPC和TRY基因在高鹽和干旱脅迫時的表達特征
圖6為GmMYB73過表達植株的耐鹽性鑒定和葉長度比較
圖7為GmMYB73過表達植株和對照種子在鹽脅迫下的發(fā)芽率
圖8為GmMYB73過表達植株和對照在鹽脅迫下的相對離子滲透率
圖9為GmMYB73過表達植株和對照種子在旱脅迫下的發(fā)芽率
圖10為GmMYB73過表達植株和對照在旱脅迫下的失水率具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值或平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
所有植物材料均生長于22°C每天的光照為16h/8h (光照/黑暗)。
pROKII 載體(雙兀表達載體)記載在 D.C.Baulcombe, G.R.Saunders,M.ff.Bevan,M.A.Mayo and B.D.Harrison,Expression of biologically active viral satelliteRNAfrom the nuclear genome of transformed plants.Nature 321 (1986)，pp.446-449 中，公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
農(nóng)桿菌GV3101菌株記載在Clough-SJ，Bent-AF.Floral dip:a simplif iedmethodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743中，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(col-0):種子購自Arabidopsis BiologicalResourceCenter (ABRC),以下簡稱野生型擬南芥。實施例1、大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB73基因的轉(zhuǎn)錄受非生物脅迫誘導(dǎo)將大豆(Glycine max (L.)Merrill)HN44種子播種于裝滿蛭石的盆中，生長于25±2°C，連續(xù)光照，兩周后取出大豆苗，操作時注意避免傷根，進行鹽、干旱、低溫和外源脫落酸ABA處理。每種處理分別在0、1、3、6、12小時收集新鮮葉片Ig在液氮中研碎,懸于4mol/L硫氫酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉淀得到總RNA。處理過程為:鹽處理，將根浸入200mM NaCl溶液中；干旱處理，將苗置于3mM濾紙上暴露于空氣中；外源ABA處理，將根浸入200 μ M ABA溶液中；將大豆苗置于水中作為對照，所有處理均在連續(xù)光照，且25 ± 2 °C下生長。對GmMYB73基因在上述處理時的表達特征進行定量PCR分析，引物為Primer-F和Primer-R0為引物進行RT-PCR分析，大豆GmTubulin基因為內(nèi)標(biāo)，所用引物為Primer-TF和 Primer-TR。Primer-F:5，_atggctgacatagatcgctc_3，Primer-R:5，_ttggctagtcgaaaatc_3，Primer-TF:5，-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3，Primer-TR:5，-TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’Q-PCR得到的值是`基因相對于GmTubulin的表達量。RT-PCR需要先通過調(diào)整模板cDNA的量來使GmTubulin的表達量一致，再進行基因的擴增。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果如圖1所示，GmMYB73基因在干旱、低溫和ABA處理時其轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度升高。在200mM NaCl處理I小時時，GmMYB73的轉(zhuǎn)錄即明顯高于未處理，至3小時達到高峰，之后下降，直至低于未處理水平。實施例2、轉(zhuǎn)錄因子GmMYB73的獲得及耐逆性功能研究一、轉(zhuǎn)錄因子GmMYB73的獲得分別提取大豆(Glycine max(L.)Merrill)HN44(滿為群等，大豆新品種黑農(nóng)44的選育及不同種植方式對其產(chǎn)量和品種的影響，黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)2004年5期，1-5 ；2006年獲自黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所；由黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所2002年經(jīng)黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會審定的大豆品種，第一育成人為杜維廣研究員，專利號為:CNA20020216.2，審定號為:黑審豆2002003，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)根的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板,用如下帶BamhI酶切位點的上游引物和帶KpnI酶切位點的下游引物進行PCR擴增，得到約220bp的PCR產(chǎn)物。根據(jù)GmMYB73的cDNA序列(DQ822927)設(shè)計引物為:(帶BamHI 酶切位點的上游引物)5’ -GGATCC atggctgacatagatc-3’ (序列 3)(帶KpnI 酶切位點的下游引物)5’ -GGTACC ttggctagtcgaaaatc-3’ (序列 4)經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物含225bp，具有序列表中的序列I所示的核苷酸，即為GmMYB73，其編碼的蛋白為GmMYB73，其氨基酸序列為序列表中的序列2。二、GmMYB73的耐逆性研究
1、GmMYB73擬南芥的獲得
I)重組載體的獲得
將步驟一得到的PCR產(chǎn)物(GmMYB73的全長cDNA)連接在pMD_18_T載體上，得到pMD-18-T-GmMYB73，測序得到正確的GmMYB73編碼序列后的pMD-18-T_GmMYB73以BamHI和KpnI對其進行酶切，回收225bp的GmMYB73片段，將酶切產(chǎn)物連接在相同酶切的雙元表達載體pPROKII載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列I插入pPROKII載體的BamHI和KpnI的酶切位點間得到的載體，插入CaMV 35S啟動子下游，形成含有GmMYB73全長的GmMYB73的植物表達載體，命名為pPR0KI1-GmMYB73(其部分結(jié)構(gòu)示意圖如圖2)。
2)、GmMYB73轉(zhuǎn)基因擬南芥及其擬南芥相似基因突變體的獲得
A、GmMYB73轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
以克隆有GmMYB73編碼區(qū)的pPR0KI1-GmMYB73載體用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，挑取轉(zhuǎn)化的GV3101單菌落，提質(zhì)粒并通過BamH1、KpnI酶切，得到225bp為驗證轉(zhuǎn)化成功的GV3101 單菌落，命名為 GV3101/pPR0KI1-GmMYB73。
B、轉(zhuǎn)化擬南芥及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
將GV3101/pPR0KI1-GmMYB73培養(yǎng)至對數(shù)期，然后用抽真空法將其轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(col-0)中，經(jīng)培育后收獲種子，將種子播于含卡那霉素(50mg/L)的MS篩選培養(yǎng)基上，待篩選得到的T1代植株長至6葉時移到蛭石上生長，收獲T1代單株，各單株種子分別播種，用相同的MS篩選培養(yǎng)基繼 續(xù)篩選以觀察T2代的分離情況，如此重復(fù)數(shù)代直至獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)GmMYB73擬南芥純合株系T4代。獲得轉(zhuǎn)基因單株27株，選取RT-PCR檢測表達量不等的10個單株經(jīng)T4代純合。
提取10個T4代純合轉(zhuǎn)GmMYB73擬南芥單株和野生型擬南芥對照的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以Northern鑒定轉(zhuǎn)基因植株。在編號為1、2、3、5、10、11、13、15、17、18的T4代轉(zhuǎn)GmMYB73擬南芥苗中均有目的片段，對照中沒有GmMYB73的表達(圖3)。篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株中目的基因表達較高的2株，GmMYB73-2 (0E-2)和GmMYB73_5 (0E-5)作進一步表型分析。
3)、GmMYB73擬南芥相似基因分析
GmMYB73基因編碼一個單MYB結(jié)構(gòu)的蛋白，屬于R3-MYB類型。為進一步了解GmMYB73的功能，對GmMYB73和其擬南芥中的相似蛋白進行聚類分析，結(jié)果表明GmMYB73與擬南芥CPC類蛋白家族較接近(圖4)。對擬南芥CPC家族中的CPC和TRY等基因在高鹽，200mM NaCl和干旱，300mM甘露醇脅迫下的表達特征分析表明，它們均與GmMYB73相似，受高鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)(圖5)，推測GmMYB73在植物中與擬南芥CPC類蛋白可能有類似功能。從 ABRC(Arabidopsis Biological ResourceCenter)突變體庫中獲得了 2 個擬南芥CPC類基因TRY和CPC的突變體try(目錄號為CS6518)和cpc (目錄號為CS6399)作進一步分析。TRY和CPC的單突變體try和cpc與野生型表型無明顯差異，因此將其雜交構(gòu)建了雙突變體try/cpc。
三、轉(zhuǎn)GmMYB73基因擬南芥的耐逆性分析
I)轉(zhuǎn)GmMYB73基因株系的耐鹽逆鑒定
A、苗期耐鹽性鑒定:
編號為2 (0E-2)和5 (0E-5)的T4代轉(zhuǎn)GmMYB73擬南芥植株、雙突變體try/cpc與野生型擬南芥(對照植株Col-Ο)的種子同時播種在MS平板上，將萌發(fā)后5天的幼苗分別移栽到含有125mM NaCl和150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上生長12天，以正常生長(未處理，不加入NaCl，S卩加入OmMNaCl)的作為對照。每個株系各為30株。結(jié)果如圖6A-C所示，可以看出，在正常條件(未處理)下，編號為2(0E_2)和5 (0E-5)的T4代轉(zhuǎn)GmMYB73植株、雙突變體try/cpc與野生型擬南芥(對照植株Col-Ο)之間在葉片形狀、蓮座大小、株高、抽苔時期和抽苔高度等表型沒有明顯差別。而在125和150mM NaCl處理后，0E_2、0E_5、try/cpc雙突變體與Col-O的表型有顯著差別。0E-2、0E-5的生長狀態(tài)明顯好于對照植株Col-Ο，而try/cpc雙突變體則開始萎蔫，明顯差于對照。具體進行蓮座的第4片葉的葉長統(tǒng)計，結(jié)果如圖6D所示:正常條件下(OmM)，除0E-5葉長較短外，其它植株葉長無明顯差異；經(jīng)125mM NaCl處理后，葉長分別為:對照Col-O為0.21 ±0.02cm、0E-5為0.33 ± 0.03cm、0E-2 為 0.31 ± 0.05cm、try/cpc 雙突變體為 0.17 ± 0.02cm ;經(jīng)150mM NaCl處理后，葉長分別為:對照Col-O為0.18±0.02cm、0E-5為0.31 ±0.03cm、0E-2 為 0.33 ±0.05cm、為 0.19 ±0.01cm。B、發(fā)芽率耐鹽性鑒定:編號為2(0E-2)和5(0E-5)的T4代轉(zhuǎn)GmMYB73擬南芥轉(zhuǎn)GmMYB73植株、雙突變體try/cpc與野生型擬南芥(對照植株Col-Ο)的種子同時在含0、80、120和HOmMNaCl的1/2MS培養(yǎng)基上在4°C春化4天`，最后在22°C ±2°C，16小時光照/8小時黑暗交替的條件下萌發(fā)72小時。統(tǒng)計種子發(fā)芽率。每個株系各為30株。結(jié)果如圖7，在含OmM NaCl處理下，三種植株種子發(fā)芽率均為100%，經(jīng)80mM NaCl處理后，發(fā)芽率分別約為:對照Col-O為90%、0E-5和0E-2均為100 % > try/cpc 雙突變體為 70% ；經(jīng)120mM NaCl處理后，發(fā)芽率分別約為:對照Col-O為78%、0E-5和0E-2均為90% > > try/cpc 雙突變體為 43%。經(jīng)140mM NaCl處理后，發(fā)芽率分別約為:對照Col-O為61%、0E-5為82%、0E-2為87 %、try/cpc雙突變體為18 %?？梢钥闯?，在140mM NaCl處理下，雙突變體try/cpc的發(fā)芽率急劇下降至18 ± 8 %，對照發(fā)芽率也有明顯下降至61 ± 7 %，而0E-2和0E-5分別降至87 ± 5 %和82 ± 5，明顯高于雙突變體try/cpc和對照。C、苗期離子滲漏的檢測:相對電導(dǎo)滲透率是檢測植物在受到逆境脅迫的時候釋放出的相對離子量，表示所鑒定部位的細(xì)胞膜受損傷的程度。一般來說，如果逆境對細(xì)胞膜的損傷大時，細(xì)胞中的離子滲漏也大，則測定出的相對離子滲透率較大，而如果植物具有一定耐逆性，則會較大限度的保存自身的離子，因而釋放出的離子較少，離子滲漏少，則相對離子滲透率較小。因此相對電導(dǎo)滲透率與植物的耐鹽性呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。分別將3周齡無菌幼苗編號為2 (0E-2)和5 (0E-5)的T4代轉(zhuǎn)GmMYB73擬南芥轉(zhuǎn)GmMYB73植株、雙突變體try/cpc與野生型擬南芥(對照植株Col-Ο)浸泡在1/2MS溶液中含200mM NaCl溶液中，12小時，后分別測定4個株系的相對離子滲透率，具體方法為將處理的苗用清水清洗4 6次，充分洗凈植物表皮的離子，將植物置于15ml玻璃管中，加入12ml去離子水，0.1Mpa抽真空20 30分鐘，室溫放置2 3h，測定此時溶液中的電導(dǎo)率。將玻璃管置于沸水中煮20 30分鐘，待葉片完全變黃，取出，溫度降到室溫后再次測定電導(dǎo)率值。相對離子滲透率即為前一次電導(dǎo)率與后一次電導(dǎo)率的比值。以在1/2MS培養(yǎng)基中浸泡作為正常處理。每個株系各為20株。結(jié)果如圖8所示，在1/2MS中，對照、突變體與2個轉(zhuǎn)基因純系間的相對離子滲透率無明顯區(qū)別，均約為 0.5-0.6。在200mM NaCl鹽處理12小時，對照Col-O相對離子滲透率約為0.270、0E_5約為
0.230、0E-2 約為 0.235、try/cpc 約為 0.290。從上述可以看出，在200mM NaCl處理下，2個過量表達純系0E_5和0E_2相對離子滲透率均低于對照，而try/cpc則明顯高于其它3和株系。上述結(jié)果表明，在鹽脅迫后，TRY、CPC的功能缺失加重了細(xì)胞膜的損傷，而GmMYB73的過表達減輕了細(xì)胞膜的損傷，從而提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。2)耐旱性鑒定:A、發(fā)芽率將編號為2 (0E-2)和5 (0E-5)的T4代轉(zhuǎn)GmMYB73植株、雙突變體try/cpc與野生型擬南芥(對照植株Col-Ο)的種子分別播于含0、100、200和300mM甘露醇的1/4MS培養(yǎng)基上，每個株系各為25株。春化4天后72小時統(tǒng)計發(fā)芽率。結(jié)果如圖9所示，可以看出，含O甘露醇(未處理)時所有株系發(fā)芽率約100%，在200和300mM甘露醇脅迫下,所有株系的發(fā)芽率均明顯下降。try/cpc下降最為明顯,發(fā)芽率分別為45%和18%，對照降至發(fā)芽率分別為86%和63%，而0E-5降至發(fā)芽率分別為86和69%，0E-2降至發(fā)芽率分別為89和73%，0E-5和0E-2的發(fā)芽率是高于突變體和野生型對照。B、水分喪失率(失水率)測定了旱脅迫下4種株系的失水率，具體如下:對生長3周編號為2 (0E-2)和5 (0E-5)的T4代轉(zhuǎn)GmMYB73擬南芥轉(zhuǎn)GmMYB73植株、雙突變體try/cpc與野生型擬南芥(對照植株col-Ο)的幼苗移出，暴露于空氣中，在22-23°C下進行空氣干燥處理，分別在20、40、60、80、100和120分鐘測定各株幼苗的鮮重，計算失水率。每個株系各為25株。失水率計算:(處理后鮮重XlOO)/處理前鮮重。結(jié)果如圖10所示，可以看出，在空氣中干燥120分鐘后，統(tǒng)計的失水率如下:0E-2和0E-5約為45.6%和48.5%，野生型對照約為52.9%，而try/cpc植株約為77.7%，明顯高于野生型和OE植株。因此GmMYB73的過表達降低了植株在干旱脅迫下的失水速度，而TRY、CPC功能的缺失加速了植株的失水速度。綜合上述結(jié)果， GmMYB73參與了植物在高鹽和干旱脅迫下的調(diào)控。其編碼基因GmMYB73的過量表達，提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽和耐旱性。
權(quán)利要求
1.GmMYB73蛋白或其編碼基因或如下權(quán)利要求10所述的表達載體在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用； 所述GmMYB73蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述GmMYB73蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I ;所述耐逆性為耐鹽性和/或耐干旱性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述耐鹽性通過提高葉片長度、提高發(fā)芽率和/或降低相對離子滲透率體現(xiàn)； 所述耐干旱性通過提高發(fā)芽率和/或降低失水率體現(xiàn)； 所述植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為雙子葉植物，尤其優(yōu)選為擬南芥。
4.一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法，為將GmMYB73蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物； 所述GmMYB73蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述GmMYB73蛋白的編碼基因為序列表中的序列I。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性和/或耐干旱性；所述耐鹽性具體通過提高葉片長度、提高發(fā)芽率和/或降低相對離子滲透率體現(xiàn)； 所述耐干旱性具體通過提高發(fā)芽率和/或降低失水率體現(xiàn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的方法，其特征在于:所述GmMYB73蛋白的編碼基因通過植物表達載體導(dǎo)入所述目的植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一所述的方法，其特征在于:所述植物表達載體為將所述GmMYB73蛋白的編碼基因插入載體pPROKII中，得到表達GmMYB73蛋白的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一所述的方法，其特征在于:所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為雙子葉植物，尤其優(yōu)選為擬南芥。
10.一種表達載體，為將所述GmMYB73蛋白的編碼基因插入載體pPROKII中，得到表達GmMYB73蛋白的載 體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種GmMYB73在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了GmMYB73蛋白或其編碼基因或如下表達載體在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；在上述應(yīng)用中，所述GmMYB73蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2；所述GmMYB73蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從大豆中克隆了一個MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子基因GmMYB73，研究發(fā)現(xiàn)，GmMYB73基因的過量表達提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性，對培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要的理論及實際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定。
文檔編號C12N15/82GK103102401SQ20111035938
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者陳受宜, 張勁松, 劉云峰, 張萬科, 馬彪, 林晴 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所