專利名稱：大豆轉(zhuǎn)錄活性蛋白GmPHD6及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大豆轉(zhuǎn)錄活性蛋白GmPHD6及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)境中物理、化學(xué)因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等脅迫因素對植物的生長發(fā)育具有重要影響，嚴重時會造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，因此培育耐逆性高的作物是種植業(yè)的主要目標之一。目前，應(yīng)用基因工程技術(shù)進行育種已經(jīng)成為提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細胞具有多條途徑應(yīng)答環(huán)境中的各種逆境脅迫，其中轉(zhuǎn)錄因子起著調(diào)控耐逆相關(guān)效應(yīng)基因表達的作用?，F(xiàn)已在植物中發(fā)現(xiàn)了多類與植物耐逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，例如:EREBP/AP2中的DREB類，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)類具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白廣泛存在于動植物以及細菌、病毒蛋白中，比如哺乳動物的CBP類蛋白、人的INGl家族、酵母Yng2p蛋白、病毒MIRl蛋白。PHD類蛋白結(jié)構(gòu)域是C4HC3類的鋅指結(jié)構(gòu)，其功能主要為以下幾類:(I)作為乙酰化或去乙?；竻⑴c染色質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；(2)作為E3泛素連接酶參與蛋白降解；(3)作為PIPs受體感知PIPs信號參與染色質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)了 PHD類蛋白，植物中該類蛋白的功能研究尚少。大豆是我國五大作物之一，弄清其耐非生物脅迫分子機理，進而為提高其耐逆性提供基礎(chǔ)，具有重要的理論及現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆轉(zhuǎn)錄活性蛋白GmPHD6及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供蛋白，名稱為GmPHD6,來源于大豆屬大豆(Glycine max(L.)),是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由248個氨基酸殘基組成。上述蛋白中，一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白GmPHD6的編碼基因GmPHD6也屬于本發(fā)明的保護范圍。該基因可為如下⑴或⑵或⑶的DNA分子:(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;(3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1 % SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5MNaPOJP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC，0.1 % SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5X SSC, 0.1% SDS 中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，0.1 X SSC，0.1% SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0.1 XSSC,0.1% SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1% SDS 和 1 X SSC, 0.1% SDS 各洗膜一次。其中，序列表中的序列1由747個脫氧核苷酸組成，本序列為GmPHD6基因的讀碼框，編碼具有序列表中序列2的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有本發(fā)明基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。上述重組載體具體為將蛋白GmPHD6的編碼基因插入pROK II載體的Xba I和KpnI識別位點間得到的重組載體；本發(fā)明還保護了擴增上述蛋白GmPHD6的編碼基因全長或其任意片段的引物對。上述引物對可為擴增GmPHD6的所有引物對，具體可為如下(I)或(II):(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對；(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對。上述蛋白或其編碼基因或上述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應(yīng)用是本發(fā)明保護的范圍。上述應(yīng)用具體為將上述基因通過上述重組載體導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因毛狀根；所述轉(zhuǎn)基因毛狀根的增長率大于與轉(zhuǎn)空載體毛狀根，轉(zhuǎn)空載體毛狀根為將PROKII轉(zhuǎn)入植物得到的轉(zhuǎn)空載體毛狀根；在上述應(yīng)用中,所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性；在上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；本發(fā)明的實施例中的雙子葉植物具體為大豆。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。將所述基因?qū)肽康闹参?，會使所述蛋白質(zhì)目的植物中合成，進而是目的植物的耐逆性性狀得到改良。所述基因可先進行如下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達到更好的表達效果:1)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達，其中GC含量可為35 %,優(yōu)選為多于45 %,更優(yōu)選為多于50%，最優(yōu)選多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾；
3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進行連接。5)引入增強子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)。在實際操作中，也可以將本發(fā)明基因進行細胞靶向定位。可利用本領(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)實現(xiàn)。例如，將來源于靶向細胞器的靶基因序列與本發(fā)明基因序列融合，再導(dǎo)入植物細胞中，就可定位了。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。本發(fā)明的實驗證明，GmPHD6的表達受高鹽、干旱和低溫誘導(dǎo)，也受植物激素脫落酸ABA的誘導(dǎo)。已知ABA與植物非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)，因此GmPHD6可能與植物對非生物逆境應(yīng)答的調(diào)控相關(guān)。之后將GmPHD6基因經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌的介導(dǎo)，導(dǎo)入大豆科豐一號根中，獲得了轉(zhuǎn)GmPHD6基因的根系，導(dǎo)入GmPHD6的大豆根系與轉(zhuǎn)化空載體大豆根系相比，其耐鹽和耐旱性顯著提高，GmPHD6基因能夠顯著提高植物的耐鹽、耐旱性。說明GmPHD6參與植物對非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控。
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本發(fā)明對于培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要價值，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定，對提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。并且從分子生物學(xué)角度證明了 PDH家族中的一些成員確實參與植物對非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控，其表達與植物的耐非生物脅迫呈正相關(guān)。下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為GmPHD6基因在高鹽、低溫、干旱及ABA (脫落酸)處理時的轉(zhuǎn)錄特征圖2為植物表達載體pROK I1-GmPHD6的部分結(jié)構(gòu)示意3為發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根的建立圖4為GmPHD6基因在轉(zhuǎn)基因毛狀根中的表達量圖5 為 pZH01-GmPHD6_RNAi 載體6為過量表達GmPHD6和RNAi毛狀根的耐鹽性鑒定和相對生長率圖7為過量表達GmPHD6和其RNAi毛狀根經(jīng)4% PEG處理后的耐旱性鑒定圖8為過量表達GmPHD6和其RNAi毛狀根經(jīng)4% PEG處理后相對生長率
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值或平均值土標準差。大 科豐I 號(Glycine max L.Merr.Kefeng I)記載在 I K.Zhang, Y.J.Wang,G.Z.Luo, J.S.Zhang, C.Y.He, X.L.Wu, J.Y.Gai, S.Y.Chen, QTL mapping of tenagronomictraits on the soybean(Glycine max L.Merr.) genetic map and theirassociation withEST markers, Theor.Appl.Genet, 2004,108:1131-1139 中，公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得； 大豆晉豆23 (JD23)及旱敏鹽敏品種灰布支(HBZ)均記載在Wei W，HuangJ, HaoYJ, Zou HF, Wang HW, Zhao JY, Liu XY, Zhang WK, Ma B, Zhang JS and ChenSY (2009)Soybean GmPHD-Type Transcription Regulators Improve Stress ToleranceinTransgenic Arabidopsis Plants.PLoS ONE,4(9), e7209.公眾獲得山西農(nóng)科院經(jīng)濟作物所同意后可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；pROKII 載體(雙兀表達載體)記載在 D.C.Baulcombe, G.R.Saunders,M.ff.Bevan,M.A.Mayo and B.D .Harrison,Expression of biologically active viral satelliteRNAfrom the nuclear genome of transformed plants.Nature 321 (1986), pp.446-449 中，公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；發(fā)根農(nóng)桿菌K599記載在Attila Kereszt, et al., Agrobacteriumrhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology.NatureProtocols,2007,2 (4), 549-552)中，公眾可從 Peter M Gressnon 教授，The Universityof Queensland, StLucia, Queensland 4072, Australia,獲得，或經(jīng) Peter M Gressnon 教授同意(書面同意書)后由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。實施例1、大豆GmPDH6及其編碼基因的篩選及其cDNA的克隆1、大豆GmPDH6及其編碼基因的獲得以大豆抗旱品種晉豆23(JD23)和旱敏感品種灰布織(HBZ，由山西農(nóng)科院經(jīng)作所劉學(xué)義研究員提供)為材料，通過cDNA-AFLP的方法篩選得到60余個差異表達基因，其中有一個296bp片段，該片段經(jīng)BLAST大豆EST數(shù)據(jù)庫表明其為包含PHD結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白，在比對中發(fā)現(xiàn)在多個物種的旱、鹽cDNA庫中有該基因的同源序列。經(jīng)在大豆EST數(shù)據(jù)庫中比對得到6個該家族成員，分別命名為GmPHDl-6。其中基因GmPHD6具有序列表中序列I的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由248個氨基酸殘基組成。根據(jù)GmPHD6基因序列設(shè)計引物:GmPHD6 sense:5 ‘-ATGGACAGTGGAGGACACTA-3 ’(序列 3)，GmPHD6 antisense:5 ‘-TCAAGGCCTTGGTCTCTTATT_3’(序列 4)應(yīng)用RT-PCR方法，從大豆總RNA中擴增GmPHD6基因:取晉豆23 (JD23)葉片，置于液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入無水乙醇進行沉淀，最后將沉淀溶于水中得到總RNA。取5 μ g總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)按試劑盒的方法進行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA片段為模板進行PCR擴增反應(yīng)。20 μ I PCR反應(yīng)體系為:1μ I 一鏈。0嫩(0.05 48)、1“1 引物(20μΜ)、2μ I 10XPCR 緩沖液、0.4 μ IdNTP (IOmM)和IU Taq DNA聚合酶，用超純水補足20 μ 1，液面覆蓋液體石蠟油。反應(yīng)在ΡΕ9600 型 PCR 儀上進行，其程序為 94°C變性 5min ;再 94°C lmin, 56°C lmin, 72°C lmin,共30-32個循環(huán)；然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。得到約750bp的PCR產(chǎn)物，該PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后序列分析，結(jié)果表明該PCR產(chǎn)物為747bp，具有序列表中序列I的核苷酸序列，即為GmPHD6基因，其編碼蛋白命名為GmPHD6。GmPHD6的氨基酸序列為序列表中的序列2。將PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T質(zhì)粒的多克隆位點，得到重組載體pMDGmPHD6，經(jīng)測序，該載體為將序列表中的序列I插入pMD 18-T質(zhì)粒的多克隆位點得到的載體。2、GmPHD6基因在非生物脅迫下的表達特征對大豆耐旱耐鹽品種晉豆23(JD23)及旱敏鹽敏品種灰布支(HBZ)進行干旱、NaCl、ΑΒΑ、冷害處理，用于分析大豆GmPHD6在非生物脅迫和脫落酸(ABA)處理下的轉(zhuǎn)錄特征。將晉豆23和灰布支的種子種在盆中，生長2星期后，對幼苗分別進行下述脅迫處理:干旱處理:將大豆幼苗從土中取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，分別在光照條件下干旱培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時和12小時后取樣。鹽處理:將大丑幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時和12小時后取樣。ABA處理:大豆幼苗的根系置于100 μ M ABA中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時和12小時后取樣。低溫處理:將小麥幼苗置于0°C培養(yǎng)箱中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時和12小時后取樣。
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總RNA的提取同上述I。應(yīng)用Real Time PCR分析GmPHD6基因在上述處理時的轉(zhuǎn)錄特征，所用引物同上述I。以大豆beta-tubulin為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為GmTubRL-1: TGGCCGCTACCTCACTGCCTGmTubRL-2: TCGTCCATGCCTTCCCCGGT 結(jié)果如圖1所示，在高鹽脅迫下，兩種大豆中的GmPHD6基因均受到脅迫的誘導(dǎo)，前期灰布支中轉(zhuǎn)錄較高，而12小時時，晉豆23中的轉(zhuǎn)錄明顯升高。干旱脅迫下，灰布支中GmPHD6轉(zhuǎn)錄在脅迫3小時時上升，至6小時回落，12小時再上升，而在晉豆23中，脅迫I至3小時，下降至6小時時明顯升高，12小時升至最高。在兩種大豆中GmPHD6轉(zhuǎn)錄均不受低溫誘導(dǎo)。ABA處理下的轉(zhuǎn)錄，在灰布支中不受誘導(dǎo)，而在晉豆23中GmPHD6受到強烈誘導(dǎo)。上升結(jié)果表明GmPHD6可能參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。實施例2、GmPHD6蛋白的功能鑒定一、GmPHD6轉(zhuǎn)基因毛狀根和GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根的獲得1、發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因根系方法的建立發(fā)根農(nóng)桿菌侵染法根據(jù)Attila Kereszt 等方法(Attila Kereszt, et al.,Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study ofrootbiology, Nature Protocols，2007，2 (4)，549-552)進行。具體操作如下:I)首先將含有⑶S 基因的 pBI121 (Datla RS，Hammerlindl JK，Panchuk B，PelcherLE.Keller ff, Modified binary plant transformation vectors with thewild-typegene encoding NPTII, Gene.1992Dec 15 ；122 (2):383-4,公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)，通過電擊法導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599中，得到重組農(nóng)桿菌。提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒，用PCR方法鑒定重組農(nóng)桿菌中所含目的基因，所用引物為正向:5‘-ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3，反向:5‘-AGCGGGTAGATATCACACTC-3，擴增的片段為⑶S基因的5‘端800bP區(qū)段，證明該質(zhì)粒為PBI121，含有⑶S基因，含有該質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌為陽性重組農(nóng)桿菌，命名為K599/pBI121。2)大豆科豐I號種子播種 于蛭石中，待長出2片真葉待用。3)在含有50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中劃線活化K599/pBI121，挑單菌落在含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜，得到K599/pBI121發(fā)根農(nóng)桿菌菌液。4)用步驟3)得到的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，用注射器接種6天含兩片真葉的步驟2)獲得的大豆幼苗(見圖3A，6天苗齡，在距離蛭石表面l-2cm處注射。)，保濕生長:光照16小時，溫度25°C，濕度50%。2周后，長出毛狀根(圖3B)，可以用于轉(zhuǎn)基因鑒定和脅迫實驗。當毛狀根長度為5-10厘米時，剪去老根，新的毛狀根即為轉(zhuǎn)化的根，可進一步用于轉(zhuǎn)基因鑒定。將4根新的毛狀根進行⑶S染色，將毛狀根直接放在下列染色液:50mM NaPO4,pH7.2,2mM X_gluc，0.5mM K3Fe (CN)6, and 0.5mMK4Fe (CN) 6 中，37°C過夜，毛狀根經(jīng)系列濃度70、50、30%乙醇洗(脫色)，之后放在重蒸水中，觀察，結(jié)果如圖3C所示，可以看出，經(jīng)⑶S染色表明外源基因基因GUS已經(jīng)在新長出的毛狀根中表達，說明上述方法可將外源基因轉(zhuǎn)化至毛狀根中(含有pBI121)。上述新的毛狀根為轉(zhuǎn)基因毛狀根。因為pBI121載體中帶有⑶S基因，在建立毛狀根的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)時，應(yīng)用⑶S基因的表達有藍色，容易檢測，因此用的是PBI121載體。而在正式試驗中，用NPTII標記較好，因此換成pROK II載體。2、重組表達載體pROK I1-GmPHD6的構(gòu)建提取大豆抗旱品種晉豆23 (JD23)的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以Primer-F+和Primer-R-作為引物進行PCR擴增，得到747bpPCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Kpn I雙酶切得到的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，將該酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切植物表達載體pROKII得到的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，該質(zhì)粒為將序列表中的序列I的核苷酸插入pROK II的BamH I和Kpn I酶切位點之間得到的載體，將該載體命名為pROK II_GmPHD6，且序列表中的序列I位于CaMV 35S啟動子之后。重組表達載體pROK II_GmPHD6部分結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。Primer-F+:GAGGGATCCATGGACAGTGGAGGACACTA (序列 5)Primer-R-:GAGGGTACCTCAAGGCCTTGGTCTCTTATT (序列 6)3、過量表達GmPHD6基因毛狀根的獲得I)重組農(nóng)桿菌的獲得將上述2得到的重組表達載體pROK II_GmPHD6，通過電擊法導(dǎo)入轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599，得到重組農(nóng)桿菌。提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為pROK II_GmPHD6，將含有該質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌命名為K599/pR0K I1-GmPHD6。2)轉(zhuǎn)GmPHD6毛狀根根系的獲得用注射器將重組農(nóng)桿菌K599/pR0K II_GmPHD6接種生長6天含兩片真葉的大豆科豐I號幼苗，具體方法見上述I的步驟4)，保濕生長:光照16小時，溫度25°C，濕度50%。2周后，長出毛狀根即為轉(zhuǎn)化的毛狀根，共獲得80個轉(zhuǎn)GmPHD6毛狀根根系，可進一步作轉(zhuǎn)基因鑒定和耐逆性檢測。以相同的方法將空載體pROK II轉(zhuǎn)入大豆科豐I號幼苗，得到80個轉(zhuǎn)空載體毛狀根根系，以作為實驗對照。3)轉(zhuǎn)GmPHD6毛狀根根系的鑒定分別取80個轉(zhuǎn)GmPHD6毛狀根和80個轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)，提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用Primer-F和Primer-R進行GmPHD6基因表達量分析。Real-Time PCR反應(yīng)使用Τ0Υ0Β0公司的RealTime PCR Master Mix試劑盒，并按照說明進行操作。GmPHD6基因表達量檢測所用引物為Primer-F和Primer-R ;大豆GmTubulin基因為內(nèi)標，所用引物為Primer-TF和Primer-TR。實驗重復(fù)三次。結(jié)果取平均值土標準差。Primer-F:5，-ATGGACAGTGGAGGACACTA-3’ (序列 3)Primer-R:5’ -GGAACTTCTTCAGCAGGCAA-3’ (序列 7)Primer-TF:5，-TGGCCGCTACCTCACTGCCT-3，Primer-TR:5，-TCGTCCATGCCTTCCCCGGT-3，結(jié)果如圖 4B所示，其中，GmPHD6為轉(zhuǎn)GmPHD6毛狀根，對照為轉(zhuǎn)空載體毛狀根，從圖中看出，轉(zhuǎn)GmPHD6毛狀根中GmPHD6的相對表達量為38.5±2 ;轉(zhuǎn)空載體毛狀根中檢測出的GmPHD6的相對表達量是大豆原有的GmWRKY78的表達，為3.0±0.1。在80個轉(zhuǎn)基因毛狀根中有75個的GmPHD6基因的表達高于對照30倍以上，因此將此75個視為轉(zhuǎn)基因毛狀根，5個為非轉(zhuǎn)基因，共得到75個經(jīng)檢測鑒定的轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根，即GmPHD6在轉(zhuǎn)GmPHD6毛狀根中過表達。4、GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根的獲得I)重組載體 pZH01-GmPHD6-RNAi 的獲得以由實施例1得到的載體pMDGmPHD6為模板，根據(jù)序列I的自5’末端第I位至509位核苷酸設(shè)計引物G6RNAi L和G6RNAi R，得到500bp的PCR產(chǎn)物(序列I的自5’末端第I 位至 509 位核苷酸)，然后進行 RNAi 載體 pZHOl (Han Xiao, et al.Functionalanalysisof the rice AP3 homologue OsMADSI6 by RNA interference,PlantMolecular Biology,2003，52，957-966，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)的鏈接。第一鏈用Sac I和Kpn I雙酶切鏈接，然后使用Xba I和Sal I雙酶切將反鏈連接到第一鏈陽性克隆上。獲得反向插入的含GmPHD6-RNAi的植物表達載體pZH01_GmPHD6-RNAi，經(jīng)過測序，pZH0-GmPHD6-RNAi含有序列I的自5’末端第I位至509位核苷酸，具體結(jié)構(gòu)示意圖如圖5所示。)?？寺∫餅?G6RNAi L:GAGTCTAGAGAGCTCATGGACAGTGGAGGACACTA (序列 9)G6RNAi R:GAGGTCGACGGTACCTTTGGGGGTTCAGATCCTCG (序列 10)2)GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根的獲得
與上述3的步驟1)-2)方法相同，將pZH01-GmPHD6-RNAi通過發(fā)根農(nóng)桿菌K599轉(zhuǎn)入大豆科豐I號幼苗中，得到GmPHD6-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根。以相同的方法將K599轉(zhuǎn)入大豆科豐I號幼苗，得到未轉(zhuǎn)基因的毛狀根(對照K599)作為對照。提取GmPHD6-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用G6-RNA1-檢測L和G6-RNA1-檢測R進行PCR擴增，以未轉(zhuǎn)基因的毛狀根作為對照。檢測引物為:G6-RNA1-檢測 L:ATGGACAGTGGAGGACACTAG6-RNA1-檢測 R:AGGCCTTGGTCTCTTATTGC大豆GmTubulin基因為內(nèi)標，所用引物為Primer-TF和Primer_TR。結(jié)果如圖4A所示，為對照K599和GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根中GmPHD6的表達水平，GmPHD6-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根中幾乎檢測不到GmPHD6的表達，而對照中因為有本底的GmPHD6,因此顯示了 GmPHD6基因的表達。此結(jié)果表明GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根中，GmPHD6幾乎不表達。二、轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根的耐鹽和耐旱性鑒定實驗樣本為由上述獲得的轉(zhuǎn)空載體毛狀根、經(jīng)檢測鑒定的轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根(本實驗中簡稱為轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根(GmPHD6))和GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根(G6RNAi)。
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1、耐鹽性鑒定將轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)、轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根(GmPHD6)及GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根(G6RNAi)各取20個經(jīng)IOOmM NaCl水溶液處理3天，即浸入IOOmM NaCl溶液中3天，25°C。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標準差。以水培(水中正常生長)為對照(每種根系各10個)。處理3天后，拍照觀察，結(jié)果如圖6A所示，過量表達GmPHD6和RNAi毛狀根的耐鹽性鑒定，水處理6天(正常條件)轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)和轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根(GmPHD6)、GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根(G6RNAi)無顯著差異，經(jīng)IOOmM NaCl處理3天的轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)和轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根(GmPHD6)的表型，可以看出，在IOOmM NaCl處理下，之間有顯著差異，測量具體如下:測量各組根系，先計算每一根毛狀根的增長率=(處理后根長-處理前根長)/處理前根長，然后取平均值土標準差；將增長率作圖如圖6B所示，為過量表達GmPHD6和RNAi毛狀根的耐鹽的相對生長率，經(jīng)IOOmM NaCl水溶液處理轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根(GmPHD6)的長度增長率為16±8%。而經(jīng)IOOmM NaCl水溶液處理轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)的長度增長率為7±5%，GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根(G6RNAi)的長度增長率為2.5±2.3%，之間均有顯著差異。說明轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根比轉(zhuǎn)空載體毛狀根耐鹽。2、耐旱性鑒定將轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)、轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根(GmPHD6)及GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根(GmPHD6-RNAi)分別浸入4% (體積百分含量)PEG(聚乙二醇6000)處理3天，25°C，以水中正常生長為對照。PEG處理的毛狀根各為8個。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。處理3天后，拍照觀察，結(jié)果如圖7所示，水培時，轉(zhuǎn)空載體毛狀根(對照)、GmPHD6-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根(G6RNAi)和轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根(GmPHD6)的生長無明顯差異，而經(jīng)4% PEG處理后，之間有顯著差異，具體測量和計算毛狀根長度增長率的公式同上述1，結(jié)果如圖8所示。從圖8中看出，過表達GmPHD6毛狀根(轉(zhuǎn)GmPHD6基因毛狀根)的增長率為53±9%，而轉(zhuǎn)空載體毛狀根的增長率約為17±5%，GmPHD6-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根(G6RNAi)增長率僅約為5±3%。GmPHD6的過表達顯著增加了轉(zhuǎn)基因毛狀根的耐旱性。上述過量表達GmPHD6基因的毛狀根，GmPHD6_RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根和轉(zhuǎn)空載體毛狀根的耐逆性鑒定表明，GmPHD6與植物耐非生物脅迫相關(guān)，GmPHD6在大豆中的過量表達增加了轉(zhuǎn)基因大豆的耐鹽和耐旱性狀。GmPHD6基因可作為提高植物耐非生物脅迫基因工程的目
的基因。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入pROK II載體中，得到表達權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
7.如權(quán)利要求6所述的引物對，其特征在于: 所述引物對為如下⑴或(II): (I)、所述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4 ； (II)、所述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列5，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列6。
8.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述雙子葉植物為大豆。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆轉(zhuǎn)錄活性蛋白GmPHD6及其編碼基因與應(yīng)用。該大豆PHD轉(zhuǎn)錄因子，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，該大豆PHD轉(zhuǎn)錄因子GmPHD6及其編碼基因可用于培育耐逆植物品種特別是耐逆大豆品種，如耐鹽、耐旱大豆。
文檔編號C12N15/11GK103102400SQ20111035937
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者陳受宜, 張勁松, 韋偉, 張玉芹, 哈達, 張萬科, 馬彪, 林晴 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所