專利名稱：癌癥細(xì)胞侵入的診斷和預(yù)防的制作方法
癌癥細(xì)胞侵入的診斷和預(yù)防本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2003年7月17日、申請(qǐng)?zhí)枮?3816955. X、發(fā)明名稱為“癌癥細(xì)胞侵入的診斷和預(yù)防”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及惡性病癥(disorder)領(lǐng)域中的診斷和治療方法。特別是，本發(fā)明提供了惡性病癥(disorder)的侵入力的測(cè)定方法和包括預(yù)防和治療癌癥細(xì)胞侵入的降低惡性病癥的侵入力(invasivity)的方法。近年來，顯示出受體酪氨酸激酶(RTK)的過表達(dá)在許多實(shí)例中都與惡性病癥的發(fā)生有關(guān)，尤其是包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的癌癥。例如，受體酪氨酸激酶AXL/UF0(參考文獻(xiàn).l，2;Genbank登陸號(hào).M 76125)的過表達(dá)已經(jīng)被指出與人血液惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。 此外，最近的數(shù)據(jù)顯示出AXL以及其配體GAS6的信號(hào)傳輸與血管發(fā)生，癌癥細(xì)胞的粘連和存活有關(guān)(參考文獻(xiàn) 3,4, 5,6, 7,8)。在 Breast Cancer Research and Treatment (1997 年 10月，Vol. 46，No. 1，pp. 91，Attar，Ε. C.等)中公開了關(guān)于人類乳腺癌中的AXL受體酪氨酸激酶表達(dá)的研究。Dodge Zantek N.等人已經(jīng)提出將MCF-lOA-NeoST作為一種研究乳腺癌中細(xì)胞與ECM間和細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用的新型細(xì)胞系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)34)。其暗示AXL 對(duì)于乳腺癌的侵入力和治療乳腺癌的進(jìn)展因子的潛在作用。然而，還沒有數(shù)據(jù)能夠證明AXL 的過表達(dá)與其他惡性病癥中的侵入力和/或轉(zhuǎn)移形成相關(guān)。本研究的一個(gè)目的是建立特別選自惡性病癥尤其是乳腺癌和腦癌中的蛋白激酶、 磷酸酶和其它信號(hào)基因的基因的表達(dá)特征(profile)，從而能夠鑒別侵入力和/或侵占性的新標(biāo)記。使用一種cDNA雜交陣列分析7種高侵入性、14種弱侵入性乳腺癌細(xì)胞系和三種正常乳腺上皮細(xì)胞系的基因表達(dá)特征。鑒定了高侵入性與弱侵入性乳腺癌細(xì)胞系基因表達(dá)的差別，這可以明確與乳腺癌細(xì)胞系的侵入性相關(guān)的基因簇。通過使用這種基因簇或來自這基因簇的基因的組合，使得將高侵入性乳腺癌細(xì)胞系與弱侵入性乳腺癌細(xì)胞系和普通乳腺上皮細(xì)胞系區(qū)別開來成為可能。此外，為了鑒別參與惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤生物學(xué)相關(guān)的新的受體酪氨酸激酶(RTK)，已經(jīng)通過一種cDNA微陣列技術(shù)確定了人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的RTK表達(dá)特征。除了 EGFR 和PDGFR- α之外，受體UF0/AXL也是最顯著的被表達(dá)的RTK之一。在經(jīng)檢測(cè)的7/9人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，UF0/AXL mRNA的表達(dá)水平高于EGFR的mRNA表達(dá)水平(表4)。與過表達(dá)UF0/AXL野生型的細(xì)胞相比，通過一種UF0/AXL的截短的顯性失活突變體型的過表達(dá)實(shí)現(xiàn)的UF0/AXL信號(hào)傳遞的抑制，抑制了腫瘤的進(jìn)展并延長(zhǎng)了小鼠的存活。為了研究UF0/AXL 信號(hào)機(jī)制以及其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)中的作用，在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)和關(guān)于增殖、聚集和遷移的腫瘤細(xì)胞行為進(jìn)行了評(píng)估。此外，還通過活體內(nèi)多-熒光顯微術(shù)在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞行為、腫瘤血管生成和腫瘤灌注進(jìn)行了分析。該研究表明了 UF0/AXL的一種新作用，即介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵入。UFO/ AXL是第一種被用于介導(dǎo)惡性腦瘤的擴(kuò)散性-滲透性，局部轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的RTK。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種確定惡性病癥的侵入力的方法，其包括確定選自 AXUGenbank M 76125)、GAS 6 (Genbank L 13720)、MMP14 (Genbank NM 004995)、ADAM 12 (Genbank AF023476)、ADAMl7 (Genbank U69611)、MT3MMP (GenbankNM 005961), FGF2 (Genbank NM 002006), FGF5 (Genbank NM 004464), FYN (Genbank M 14333)、LYN (Genbank M 16038)、DDR2 (Genbank X 74764)、TIMPl (Genbank NM 003254)、 HB-EGF (Genbank NMOO1945)、SGK(Genbank Y 10032)、RPS6RB1(Genbank M 60724)、 MAP4K4(Genbank XM 038748)、SIRP α (Genbank Y 10375)禾口 Annexin A2 (Genbank D 00017)中的至少一種基因的表達(dá)。此外，任選除測(cè)定一種或多種上述基因的表達(dá)之外，基因Mat 5b (Acc.NM_012448)或EDG2 (Acc. NM_057159)的表達(dá)也被測(cè)定作為惡性病癥的侵入力的指示。據(jù)發(fā)現(xiàn)，至少一種上述基因的高表達(dá)與高侵入力相關(guān)。此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)高侵入力與至少兩種上述基因的高表達(dá)相關(guān)，尤其是AXL 和一種或多種其它基因。一種或多種其它基因可以選自上面所列基因或選自現(xiàn)已知作為侵入性標(biāo)記的基因。因此，這種方法優(yōu)選包括確定幾種上述基因的表達(dá)，例如確定至少二、三、四、五、 六、七或八種基因的表達(dá)。更優(yōu)選的是，這種方法包括測(cè)定至少AXL/UF0基因(Genbank M 76125)的表達(dá)。此外，這種方法可以包括確定至少一種其它已知作為侵入性標(biāo)記的基因的表達(dá)，例如 CD44 (Genbank X 66733)、vimentin (Genbank X 56134)、CAVl (Genbank Z 18951)、CAV2(Genbank、AF 03572) ,MMP 1(Genbank M 13509) ,MMP 2(Genbank 匪 004530) MMP9(Genbank MM 004994),M-CSF (Genbank M 37435)和 EPHA2 (GenbankM59371)。上述基因簇和尤其是AXL基因的表達(dá)與侵入力之間的相關(guān)性被發(fā)現(xiàn)存在于幾種惡性病癥中，例如乳腺癌(尤其是原發(fā)性乳腺癌)前列腺癌、腎癌和惡性膠質(zhì)瘤或其它上皮來源的癌癥。特別令人關(guān)注的是發(fā)現(xiàn)在一種或更多種上述標(biāo)記基因尤其是AXL基因與惡性膠質(zhì)瘤的侵入力之間存在相關(guān)性。此外，發(fā)現(xiàn)AXL基因的顯性失活突變體的穩(wěn)定的過度表達(dá)能夠強(qiáng)烈地抑制細(xì)胞侵入和遷移，這表明AXL功能的抑制可以阻礙和缺失高侵入性的惡性病癥的轉(zhuǎn)移形成，例如乳腺癌或腦癌，如惡心膠質(zhì)瘤。此外，一種針對(duì)AXL的胞外域部分的多克隆抗體對(duì)于癌癥細(xì)胞如乳腺癌或前列腺細(xì)胞系的侵入和轉(zhuǎn)移具有強(qiáng)抑制活性。而且，野生型AXL在弱侵入性乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞系和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的過表達(dá)顯著提高它們的侵入力。這些數(shù)據(jù)顯示AXL基因和蛋白是用于預(yù)防或治療惡性病癥，尤其是抑制惡性病癥中腫瘤侵入力和/或轉(zhuǎn)移形成的一種具有前景的新靶子。因此，本發(fā)明的另一方面涉及一種減少惡性病癥侵入力的方法，包括抑制AXL基因、AXL配體基因或蛋白、或其配體。該方法的包括⑴抑制AXL蛋白的受體酪氨酸激酶活性，(ii)抑制AXL基因的表達(dá)，(iii)抑制AXL蛋白與其配體尤其是GAS6之間的相互作用和/或(iv)抑制AXL與下游信號(hào)轉(zhuǎn)換因子之間的相互作用。至于AXL蛋白配體，特別是GAS6 (GAS6-LG)的層粘連蛋白G-樣結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)參與與AXL蛋白的相互作用，例如AXL的結(jié)合和激活(參考文獻(xiàn)36)。尤其是，GAS-LG2結(jié)構(gòu)域的殘基，例如Leu62°、Tyr660和Wre487，影響AXL的結(jié)合和/或激活。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案，這種降低惡性病癥的侵入力的方法包括抑制GAS-LG—個(gè)或多個(gè)殘基，優(yōu)選 Leu·、Tyr660 和 / 或 Phe487。本發(fā)明涉及惡性病癥的診斷或預(yù)防和/或治療，尤其是惡性病癥中的腫瘤侵入力和/或轉(zhuǎn)移形成。惡心病癥的優(yōu)選例子是乳腺癌，前列腺癌，腎癌，結(jié)腸癌，肺癌和惡性膠質(zhì)瘤。更優(yōu)選的是，所述惡性病癥是乳腺癌或惡性膠質(zhì)瘤。
本發(fā)明的診斷實(shí)施方案中，定性和/或定量測(cè)定侵入力相關(guān)基因的表達(dá)。確定含有惡性細(xì)胞的樣品(例如來自人腫瘤患者)中的所述表達(dá)。該樣品可以取自組織切片、組織活檢樣品等等，或取自體液。待測(cè)樣品中的基因表達(dá)可以與在對(duì)照樣品中的基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，例如源于“正?！奔?xì)胞或弱侵入力惡性細(xì)胞的陰性對(duì)照樣品和/或例如源于強(qiáng)侵入性惡性細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照樣品?；虮磉_(dá)可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)測(cè)定，例如在mRNA水平或轉(zhuǎn)錄水平和/或蛋白質(zhì)水平上?；虮磉_(dá)在mRNA水平的測(cè)定可以包括反轉(zhuǎn)錄和/或擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR。優(yōu)選的是，在一個(gè)核酸陣列上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，其中源于待測(cè)樣品的待測(cè)核酸如RNA或 cDNA雜交到固定有特異于待測(cè)核酸的探針的陣列上。PCT/EP 02/01073中描述了一種合適的核酸陣列的優(yōu)選例子。另外一種選擇是，基因表達(dá)可以通過其它方法測(cè)定，例如Northern 印跡雜交。在蛋白水平的基因表達(dá)可以通過采用針對(duì)由與侵入力相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體的免疫學(xué)方法進(jìn)行測(cè)定。這些抗體可以用已知標(biāo)記基團(tuán)如放射性、熒光、化學(xué)發(fā)光或酶基團(tuán)例如本領(lǐng)域中已知的酶基團(tuán)直接或間接進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明的一個(gè)治療實(shí)施方案涉及一種包括對(duì)有此需求的受試者以能有效降低惡性病癥的侵入力的量施用AXL基因、AXL配體基因、AXL蛋白質(zhì)或其配體的抑制劑的方法。 所述受試者優(yōu)選是一種哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選是人類。AXL蛋白質(zhì)的配體優(yōu)選GAS6，尤其是如上定義的GASG-LG的殘基。AXL基因、AXL配體基因、AXL蛋白質(zhì)或其配體GAS6的抑制劑如可以是抗體、生物活性核酸或低分子量化合物，例如肽或非肽有機(jī)化合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抑制劑是針對(duì)AXL蛋白質(zhì)或其配體如GAS6的抗體。 術(shù)語(yǔ)“抗體”涉及多克隆抗體和單克隆抗體，特別是嵌合抗體或人源化抗體或人抗體。此外， 該術(shù)語(yǔ)包括抗體片段，例如蛋白水解片段如i^ab、Fab'或F (ab) 2片段或重組片段如單鏈抗體片段，如scFv片段。生產(chǎn)上述抗體或抗體片段的方法是本領(lǐng)域已知的。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抑制劑是生物活性核酸，例如DNA、RNA或合成的核酸類似物。生物活性核酸優(yōu)選的例子是反義核酸、核酶或針對(duì)AXL基因或AXL配體基因或其轉(zhuǎn)錄物的RNA干擾分子。生物活性核酸的進(jìn)一步優(yōu)選的例子是AXL基因的顯性失活突變體。生物活性核酸可以通過公知方法例如使用病毒或非病毒基因轉(zhuǎn)移載體被遞送。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抑制劑是肽化合物，例如具有4-25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽、環(huán)肽、肽衍生物或衍生自這種肽的肽類似物。或者所述低分子量抑制劑可以是一種肽性有機(jī)化合物，例如AXL激酶活性抑制劑。低分子量抑制劑可以通過采用下文將要詳細(xì)描述的方法從合適的化合物文庫(kù)中篩選獲得。本發(fā)明的另一方面涉及一種藥物組合物包含作為活性劑的AXL基因、AXL配體基因、AXL蛋白質(zhì)或其配體(例如GAS6，特別如上文定義的GAS6-LG的殘基)的抑制劑以及藥物活性稀釋劑、載體和/或助劑。該組合物尤其適于降低惡性病癥的侵入力或降低惡性病癥中的轉(zhuǎn)移形成。根據(jù)所使用的作為活性劑的抑制劑的類型的不同，所述藥物組合物可以是液體、固體(例如粉末、片劑等等)、乳劑或懸浮液。該組合物可以通過注射、口服、局部、 直腸、鼻內(nèi)或其它合適的方式施用。該組合物中的活性劑的有效量可以由本領(lǐng)技術(shù)人員無需任何不適當(dāng)負(fù)擔(dān)的情況下，根據(jù)化合物和待治療的疾病的類型確定。
該組合物可以包含至少一種其它活性劑。這種至少一種活性劑可以與AXL抑制劑配制在單一組合物中或配制為與AXL抑制劑組分共同施用的分離組合物。這種其它活性劑可以是細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑例如阿霉素、順鉬、卡鉬、抗腫瘤抗體或它們的任意組合O本發(fā)明的另一方面涉及一種鑒別和/或表征一種惡性病癥侵入力的抑制劑的方法，包括確定是否至少一種測(cè)試化合物能夠抑制AXL基因、AXL配體基因、AXL蛋白質(zhì)或其配體(例如如上文定義的GAS6)或蛋白質(zhì)。更具體地，該方法包括測(cè)定是否一種測(cè)試化合物能夠結(jié)合AXL蛋白質(zhì)和/或減少AXL基因表達(dá)。該測(cè)試化合物可以源于化合物文庫(kù)，例如經(jīng)過AXL抑制活性篩選的肽或非肽文庫(kù)。該篩選方法可以包括使用基于細(xì)胞的測(cè)試系統(tǒng)， 例如一種使用能夠過表達(dá)AXL基因的細(xì)胞的系統(tǒng)。除此之外或作為另一種選擇，該方法可以包括使用無細(xì)胞測(cè)試系統(tǒng)，其中測(cè)試化合物與充分純化的AXL蛋白質(zhì)或其片段接觸以測(cè)定該測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)或其片段的結(jié)合。此外，將通過下文的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。

圖1.在matrigel_matrix(3D生長(zhǎng)暈(outgrowth))上培養(yǎng)時(shí)正常和乳腺癌(EC) 細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)。在Matrigel層上培養(yǎng)細(xì)胞7_14天。A，表示對(duì)于所指的BC細(xì)胞系三個(gè)基本形態(tài)的照片。MDA-MB-231、MDA-MB-4;35S、BT549和MCFlOA的放大率是xlOO。如前所述進(jìn)行生長(zhǎng)在 Matrigel上的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的鑒定(10，11，12)。簡(jiǎn)而言之，重懸于50 μ 1培養(yǎng)基中的細(xì)胞 (96-孔板上5000細(xì)胞/孔)被接種在預(yù)先制備的在RPMA基礎(chǔ)培養(yǎng)基鹽中稀釋至6mg/ml 的70μ1 Matrigel (Becton Dickinson)構(gòu)成的Matrigel涂層上。在頂端的聚合作用后， 加入50 μ 1 Matrigel (1. 0mg/ml)。集落生長(zhǎng)暈在整個(gè)試驗(yàn)過程中被監(jiān)控并在7-14天時(shí)使用裝備有OpenLab⑴K)數(shù)碼相機(jī)的kiss Axiovert 35顯微鏡進(jìn)行拍攝。每一細(xì)胞系的名字被指明。圖2.通過已知激酶和磷酸酶的基因表達(dá)特征對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的分類。一般基因在弱侵入性BC細(xì)胞系中與在強(qiáng)侵入性BC細(xì)胞系的表達(dá)的變化(AXL簇)。如“原料和方法”中所述，通過源于每一指定的細(xì)胞系的RNA(雙份制劑)的cDNA 陣列雜交對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。這22個(gè)選出的基因在至少75%弱侵入性BC細(xì)胞系、強(qiáng)侵入性BC細(xì)胞系(依次為紅、綠條)或二者中以高于2倍的中值倍數(shù)變化差異表達(dá)。相對(duì)于 MCF10A的基因表達(dá)水平通過顏色和指定的位于簇底部的圖解的陰影表示出來。每一種顏色的陰影包括跨越刻度下數(shù)字范圍的所有值。同時(shí)還提供了 GenBank登陸號(hào)(參見表3) 和每一種基因的說明以及在自制陣列膜上的點(diǎn)的位置(分別參見表2和3的基因)。通過 Northern (AXL和GAS6)或采用與陣列中同樣的RNA制劑的RT-PCR(用于HER2表達(dá)和擴(kuò)增的Roche系統(tǒng)，未顯示)分析進(jìn)行證實(shí)研究。除非另有說明，所述陣列與其他已知方法之間的一致性在2倍內(nèi)，與試樣的絕大多數(shù)相關(guān)；通過其它方法得到的與低估倍數(shù)改變的陣列的定性的一致性至少10倍。侵入性和弱侵入性細(xì)胞系的位置通過顏色條依次被指明。圖3A，B.通過已知激酶和磷酸酶的基因表達(dá)特征進(jìn)行對(duì)原發(fā)性乳腺癌以及其細(xì)胞系的分類。如“原料和方法”所述，通過源于每一指定細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤的RNA (雙份制劑) 的cDNA陣列雜交對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。這沈個(gè)選出的基因在至少75%的弱侵入性BC細(xì)
6胞系、強(qiáng)侵入性BC細(xì)胞系(依次為紅、綠條)或二者中以倍數(shù)變化中值高于2倍差異表達(dá)。 相對(duì)于正常乳腺組織(兩種混合)的基因表達(dá)水平通過顏色和位于簇底部的指定的陰影的圖解表示出來。每一種顏色的陰影包括跨越刻度下數(shù)字范圍的所有值。同時(shí)還提供了 GenBank登陸號(hào)(參見表3)和每一種基因的說明以及在自制陣列膜上的點(diǎn)的位置。通過 Northern (AXL和GAS6，未顯示原發(fā)性腫瘤)或采用與陣列中同樣的RNA制劑的RT-PCR (僅用于HER2表達(dá)和擴(kuò)增的Roche系統(tǒng)，未顯示)分析進(jìn)行證實(shí)研究。除非另有說明，所述陣列與其他已知方法之間的一致性在2倍內(nèi)，與試樣的絕大多數(shù)相關(guān)；與通過其它方法低估倍數(shù)的改變的陣列性質(zhì)的一致性至少10倍。A.正常乳腺組織、原發(fā)性腫瘤、正常乳腺和癌癥細(xì)胞系的未受監(jiān)控(supervised) 的陣列分析。AXL簇包括18種基因(表達(dá)的相關(guān)度是0，51或者顯著)，乳腺癌細(xì)胞系中鑒定了大部分基因(參見附圖2)。B.使用單一共有序列(censensus)侵入力的基因進(jìn)行原發(fā)性腫瘤和乳腺癌細(xì)胞系的分類。所有原發(fā)性腫瘤和BC細(xì)胞系被應(yīng)用于采用沈個(gè)基因(屬于AXL簇)的聚類分析。原發(fā)性腫瘤和乳腺癌細(xì)胞系被識(shí)別，并且大多數(shù)強(qiáng)侵入(HI)性BC細(xì)胞系屬于同一家族(除了 DA-MB-231和一種原發(fā)性腫瘤BC151，經(jīng)紅色條標(biāo)出)。圖4.選出的差異表達(dá)的AXL/GAS基因的Northern印跡分析通過與對(duì)應(yīng)于置于cDNA陣列上片段的探針雜交分析分離自各指定細(xì)胞系的 mRNA(15yg/泳道)指定基因的表達(dá)。相對(duì)于Ac745 (正常的乳腺上皮細(xì)胞)的每一 mRNA 表達(dá)水平記錄在每一條帶的下方。對(duì)應(yīng)于主要的特定帶的大小(右側(cè))與現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的每一 mRNA的大小一致。同樣的濾膜被探查和重新探查以做此分析。圖中A-AXL表達(dá)， B-GAS和C- β -肌動(dòng)蛋白mRNA。對(duì)于典型濾膜，β -肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平被表示出來作為等量的樣品載荷的對(duì)照。mRNA由兩組獨(dú)立生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中制備而來，并被測(cè)試指定基因的表達(dá)水平。圖 5A 禾Π B.當(dāng)培養(yǎng)于 Matrigel 中時(shí) BC 細(xì)胞系 MDA-MB_4;35S、BT549 和 MDA-MB-231(模擬(mock))的形態(tài)或穩(wěn)定表達(dá)dnAXL。在Matrigel層上培養(yǎng)細(xì)胞7-14天。A顯示了反映指定的BC細(xì)胞系三個(gè)基本形態(tài)的照片。B，顯示了 MDA-MB-435S模擬和dnAXL突變克隆2的創(chuàng)傷測(cè)試。所處位置和處理都在圖中示出。放大率是xlOO。圖6A，B和C。BC細(xì)胞系MDA_MB_4;35S，模擬，穩(wěn)定表達(dá)dnAXL或用抗-Ex-AL抗體處理之后的3D生長(zhǎng)暈、遷移和侵入行為。A.細(xì)胞被培養(yǎng)在Matrigel層上7_14天(參見附圖1的圖例)。這些細(xì)胞經(jīng)所示抗體處理或不經(jīng)處理。B.根據(jù)“原料和方法”描述的步驟，在Boyden室中通過計(jì)數(shù)在20_36小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)移到包被Matrigel (3-%ig/ml)的濾膜的細(xì)胞的數(shù)量測(cè)試指定BC細(xì)胞系的侵入力。結(jié)果取至少兩個(gè)含有三個(gè)點(diǎn)的獨(dú)立試驗(yàn)的平均值(Error bars).C.在平行transwell室中使用沒有Matrigel的濾膜在與侵入性測(cè)試同樣的條件下進(jìn)行遷移能力測(cè)試。結(jié)果取至少兩個(gè)含有三個(gè)點(diǎn)(error bars)的獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。 同樣，在沒有Matrigel阻礙的Boyden室中對(duì)細(xì)胞遷移進(jìn)行評(píng)估。正如所預(yù)期的，細(xì)胞系MDA23LMDA435S和BT549與弱侵入性細(xì)胞系MCF7 (未顯示)相比具有相當(dāng)強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。圖7. AXL wt的轉(zhuǎn)染對(duì)MCF7乳腺癌細(xì)胞的影響。A. AXL wt的感染和強(qiáng)制過表達(dá)的形態(tài)學(xué)影響。AXL wt在MCF7細(xì)胞中的過表達(dá)導(dǎo)致緊湊的鵝卵石狀細(xì)胞變?yōu)闊o規(guī)則形狀且具有多突出延伸的細(xì)胞。B.如上文所述(參見材料和方法)在Boyden室中對(duì)AXL wt的感染對(duì)細(xì)胞侵入性的影響進(jìn)行測(cè)試。克隆MCF7-AXL wt的侵入力高于空載體感染的細(xì)胞30倍。共有20，000 個(gè)細(xì)胞被接種在Boyden室中36_48個(gè)小時(shí)(具有8 μ m孔的濾膜，其涂布著濃度為3_%ig/ ml的matrigel基質(zhì))。感染AXL wt的細(xì)胞比感染空載體對(duì)照或dnAXL突變型侵入得更快些。圖 8A.表達(dá)對(duì)照載體(SF126-模擬)，UF0/AXL 野生型(SFU6-Ufo_WT)和 UF0/AXL 的截短的顯性失活突變體型(SF126Ufo-DN)的SFU6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆的Wfestern印跡分析。血清耗盡細(xì)胞不經(jīng)處理(_)或經(jīng)200yg/ml Gas6 (+)處理。溶解產(chǎn)物與抗磷酸酪氨酸血清(上圖)或針對(duì)人UF0/AXL(下圖)的細(xì)胞外區(qū)域的抗體印跡。與SF126-模擬細(xì)胞相比，該分析證實(shí)Gas6/UF0/AXL介導(dǎo)的信號(hào)傳輸在SF126-UF0-WT和SF126-UF0-DN細(xì)胞中分別升高(大約30% )和消失。B-D.與SF126-模擬和SF126-UF0-WT細(xì)胞(B和C)相比， UF0/AXL截短的顯性失活突變體型在SFU6細(xì)胞(B)中的表達(dá)改變它們的形態(tài)。圖 9.A. SF126細(xì)胞克隆的腫瘤體積的分析。腫瘤細(xì)胞被皮下植入到裸鼠(n = 4個(gè)動(dòng)物每組)中并持續(xù)14天。顯示了平均值士SEM。*p<0.05vs SF126-模擬細(xì)胞。B.在 SFU6細(xì)胞克隆植入裸鼠的背部皮膚褶腔后的腫瘤面積(左側(cè))和功能性血管的密度(右側(cè))的定量分析，該分析通過活體內(nèi)多-熒光視頻顯微鏡(n = 4個(gè)動(dòng)物每組)測(cè)試。顯示了平均值士SD。通過ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，然后進(jìn)行合適的組間的個(gè)體比較的post hoc 測(cè)試；*P < 0. 05vs. SFU6-Ufo-DN細(xì)胞。C和D.顯示出腫瘤體積的差異的SF126-UF0-WT 腫瘤(C)和SF126-UF0-DN腫瘤⑶的組織形態(tài)學(xué)圖像。條代表1mm。H&E染色。E禾Π F.顯示出腫瘤侵入性的差異的SF126-UF0-WT腫瘤(E)和SF126-UF0-DN腫瘤(F)的組織形態(tài)學(xué)圖像。SFU6-UF0-WT腫瘤大量滲入到鄰近的皮膚肌肉和皮下組織中(E)(箭頭表示被損壞的肌肉層的殘留)，SFU6-UF0-DN腫瘤細(xì)胞侵入性幾乎被完全抑制了(F)。注意(F)中保留的肌肉層結(jié)構(gòu)。條代表ΙΟΟμπι。H&E染色。H和I.僅用熒光顯微鏡(G)與結(jié)合相差(H) 確定沒有SF126-UF0-DN腫瘤細(xì)胞侵入到鄰近的組織層。組織細(xì)胞在植入前被標(biāo)記上Dil。 條代表ΙΟΟμπι。所有樣品是在植入裸鼠背部皮膚褶腔21天后被切離的。t，腫瘤塊;m，小鼠肌肉層；sc，皮下組織。SF126-模擬，對(duì)照；SFU6-Ufo-WT，表達(dá)野生型UF0/AXL的細(xì)胞； SFU6-Ufo-DN，表達(dá)截短的顯性失活突變體型UF0/AXL的細(xì)胞。圖 10.A. SFU6細(xì)胞克隆的MTT增殖測(cè)試。存在feis6 QOOg/ml)或不存在feis6。細(xì)胞經(jīng)200yg/ml Gas6(+Gas6)處理或不經(jīng)處理(_Gas6)。在培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行分析。相對(duì)于未受刺激的SF126-模擬細(xì)胞表示生長(zhǎng)率。平均值被表示出來。B和C. SF126-Ufo-WT和 SF126-Ufo-DN細(xì)胞克隆的多細(xì)胞聚集的形成證實(shí)抑制UF0/AXL功能之后聚集能力未改變的。D.SFU6細(xì)胞在7天的觀察期內(nèi)的遷移。通過圖像分析系統(tǒng)對(duì)遷移的區(qū)域進(jìn)行面積法的分析。顯示了平均值士SD。通過使用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，然后進(jìn)行不成對(duì)Mudent t-檢驗(yàn)。*p < 0. 05vs. SF126-模擬。E和F.通過48小時(shí)將SF126-UF0-WT腫瘤細(xì)胞球(E) 或SF126-UF0-DN腫瘤細(xì)胞球(F)與大鼠胎兒腦細(xì)胞聚集物接觸對(duì)腫瘤細(xì)胞侵入性進(jìn)行分析。SFU6-UF0-DN腫瘤細(xì)胞球與腦細(xì)胞聚集物的清晰的邊緣表明抑制UF0/AXL功能后缺乏侵入性。B，大腦細(xì)胞聚集物；S，腫瘤球。SF126-模擬，對(duì)照；SF1260UF0-WT，表達(dá)野生型 UF0/AXL的細(xì)胞；SFU6-UF0-DN，表達(dá)截短顯性失活型UF0/AXL的細(xì)胞。圖 11.A.將SF126-Ufo-WT細(xì)胞和SFU6_Ufo_DN細(xì)胞定向植入腦(n = 4個(gè)動(dòng)物每組) 后，成年裸鼠的存活曲線。當(dāng)動(dòng)物生長(zhǎng)到神經(jīng)缺陷或損失> 30%它們的原始體重時(shí)處死。 B-E.在植入腦后的SFUe-Ufo-WT腫瘤組織形態(tài)學(xué)顯示腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散滲入到鄰近的腦組織 (B)0腫瘤細(xì)胞經(jīng)由血管周隙(C)，沿著白質(zhì)束(D)，并沿著心室系統(tǒng)壁(E)滲透。H&E染色。 條代表100 μ m。
實(shí)施例Α.乳腺癌和前列腺癌的研究1.材料和方法1. 1.腫瘤樣品和細(xì)胞系為了避免選擇乳腺癌(BC)和其它腫瘤的類型和大小的任何偏見，待測(cè)RNAs由未選擇的樣品制備。原生侵入性乳腺癌樣品取自72名接受手術(shù)的患者。在外科切除后，這些腫瘤被整個(gè)切下取切片用于病理學(xué)家的診斷，鄰近的一塊被迅速冷凍在液氮中以用于 mRNA提取。進(jìn)行診斷時(shí)患者的平均年齡在55歲(范圍在四_81)，并且他們中的大多數(shù)是處于絕經(jīng)期后。根據(jù)乳腺腫瘤的WHO組織學(xué)類型將腫瘤分類導(dǎo)管癌，小葉癌，導(dǎo)管-小葉混合癌和髓樣癌。源自正常乳腺的混合的“正?！眂DNA作為對(duì)照組并用于標(biāo)準(zhǔn)化。上述“正?！?cDNA中的蛋白激酶(PK)和磷酸酶(PP)的表達(dá)特征被分別鑒定。在這項(xiàng)研究中，我們也研究了包括21個(gè)BC和3個(gè)正常乳腺上皮細(xì)胞系。乳腺癌細(xì)胞系的來源是由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville, MD)獲得的 BT-20，BT-474，BT-483，BT-459，Du-4475， MDA-MB-134、-157、-175、-361、-436、-453、-468，SK-BR-3，和 ZR-75-1,T-47D,MDA-MB-231, ZR-75-30。MCF-7 克隆和 BC 細(xì)胞系 DAL 由 SUGEN (Redwood City, CA)提供。HBL-100 細(xì)胞系由ATCC提供。該細(xì)胞系來源于正常的組織但含有串聯(lián)整合的SV-40序列(9)。培養(yǎng)物在補(bǔ)充了 6mM谷氨酰胺，10 μ g/ml 人胰島素和 10%胎牛血清(FCQ (CSL，Parkvi 1 Ie，Australia) 的RPMI 1640培養(yǎng)基中維持在指數(shù)生長(zhǎng)期。正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF10A、MCF10T-24和 MCFlOneo 由 B. Gilles 博士(Arizona Cancer center)提供。Ac745 由 Μ. Stampfer 博士提供，其生長(zhǎng)在補(bǔ)充有Hs578Bst、胰島素、氫化可的松、EGF、霍亂毒素、維生素和抗生素的條件培養(yǎng)基的DMEM Fl2培養(yǎng)基中。細(xì)胞無支原體污染。 1.2. RNA和DNA的分離和分級(jí) 從同樣的細(xì)胞沉淀中通過在異硫氰酸胍溶液(GTS緩沖液4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉PH 7. 0，0.5 ^Sarkosyl和0. IM β-巰基乙醇)中裂解之后進(jìn)行酚-氯仿萃取分離總RNA和基因組DNA。通過經(jīng)修飾的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，[1989])分離完整RNA。用等體積酚氯仿異戊醇05 24 1)收集萃取DNA兩次。在至少三個(gè)不同時(shí)間從各細(xì)胞系中分離RNA和DNA?？俁NA和mRNA的完整性和cDNA的復(fù)雜性由瓊脂糖凝膠電泳和采用特異探針的Northern印跡控制。一些mRNA的提取通過使用OligoTex mRNA分離試劑盒(Quagen， Biotech, Germany)進(jìn)行。細(xì)胞沉淀重懸于溶胞/結(jié)合緩沖液中，短暫渦旋混合，流經(jīng)三次 21G針，并被施用到自旋溶解產(chǎn)物柱(spin lysate column)上并以13，OOOg離心三分鐘。然后溶解產(chǎn)物與Oligo-dT纖維素(Stratagene he.)輕輕混合，并被施用于預(yù)濕的Oligotex 分子生物柱(Quagen Biotech)上。該柱被溶胞/結(jié)合緩沖液沖洗三次，用清洗緩沖液沖洗四次，然后用預(yù)熱(65°C)的洗脫緩沖液洗脫mRNA。使用0D260測(cè)量mRNA的量。1. 3. cDNA陣列的制備通過用放射性靶物質(zhì)(cDNA)于尼龍濾膜陣列上的雜交分析1 和PP基因的表達(dá)。該陣列含有645個(gè)編碼激酶，磷酸酶和其它信號(hào)蛋白配體、連接體、轉(zhuǎn)錄因子、金屬蛋白酶/ADAMs、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和11個(gè)管家基因(所列在http://www.biochem.mpg. de or Ullrich S) bi0Chem.mpg. De上可得)的基因。它們的身份通過對(duì)DNA質(zhì)粒的測(cè)序并與 GenBank序列信息進(jìn)行對(duì)比確證。所有點(diǎn)在尼龍濾膜上的克隆的Hi和PP的特征是一致的或一式兩份。為了標(biāo)準(zhǔn)化的目的，將GFP基因以及基因組DNA和載體DNA點(diǎn)樣兩次。使用質(zhì)粒純化試劑盒toiagen，Germany)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行純化。1. 4. cDNA 陣列雜交起先，濾膜在0. 5% SDS中預(yù)清洗5分鐘，邊清洗邊攪動(dòng)。IOml的預(yù)雜交溶液中含有酵母tRNA。在雜交步驟中使用人Cot-IDNA(BRL/Life technologies)，這一步在65°C下置于滾軸烤箱里的Roller bottle (Hybaid Inc.)中進(jìn)行16小時(shí)。標(biāo)記探針在100°C下變性 10分鐘，然后被立刻置于雜交混合物中，該混合物在65°C下再溫育18小時(shí)。18小時(shí)后，去除所述雜交混合物，然后42°C下在溫育箱中連續(xù)旋轉(zhuǎn)下用2氯化鈉檸檬酸鈉(SSC)緩沖液，0. 2% SDS清洗所述陣列兩遍。第三次清洗是65°C下在水平振動(dòng)的塑料盒中用0. 2xSSC, 0. 1 % SDS清洗15-60分鐘。在第三次清洗后，濾膜被置于一張浸濕的Whatman紙上并蓋上 Saran wrap。然后將所述陣列置于裝備有 Phosphorimager storage screen (Fuji, Japan) 的顯像暗盒中，并被曝光兩天。1.5.圖像獲取和分析經(jīng)曝光的 phospho-imager storage screens 在 Phosphoimager Scanner (Fuji) 中以50微米的分辨率被掃描一次，并通過MacBAS2000(FUji)顯像。圖象被輸入到 ArrayVision V(Canada)中通過軟件分析。采用代表整個(gè)基因組對(duì)照DNA、GFP和載體的總共4項(xiàng)對(duì)照因子通過比對(duì)基于軟件的矩陣上圖像對(duì)不同的元素相對(duì)內(nèi)部參考數(shù)據(jù)庫(kù)作圖。 通過將每一數(shù)據(jù)元素的原始強(qiáng)度乘以一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)因子實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，該標(biāo)準(zhǔn)因子等于所有載體元素的平均原始強(qiáng)度除以100(這個(gè)值是所有因子的原始強(qiáng)度平均數(shù)，其源于大量不同的由陣列進(jìn)行的雜交反應(yīng))。將標(biāo)準(zhǔn)化圖像與由取自源于如上文指出的正常乳腺RNA，永生化 (腫瘤發(fā)生前)乳腺上皮細(xì)胞系的混合“正常”cDNA的經(jīng)標(biāo)記的cDNA的圖像進(jìn)行以軟件為基礎(chǔ)的pair-wise比較。用標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度對(duì)表達(dá)水平的改變進(jìn)行計(jì)算，并得出比值(正比值表示轉(zhuǎn)錄水平的升高，負(fù)比值表示轉(zhuǎn)錄水平的降低)，表達(dá)水平的改變通過katter-blot 制圖法和iTreeView程序(13-16)體現(xiàn)。
1. 6.陣列數(shù)據(jù)分析在分析結(jié)果之前，試驗(yàn)的再現(xiàn)性通過比較雙傳點(diǎn)或與在兩個(gè)獨(dú)立陣列上相同的 cDNA雜交或兩個(gè)獨(dú)立的與由相同RNA制備而來的cDNA雜交反應(yīng)而被證實(shí)。在每一個(gè)例子中，結(jié)果顯示出良好的重現(xiàn)性，其相關(guān)系數(shù)依次為0. 96，0. 98和0. 98 (數(shù)據(jù)未顯示)。這種重現(xiàn)性足以認(rèn)為2倍表達(dá)差異屬于顯著差異。接下來的分析采用Excel和統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成。與腫瘤參數(shù)相關(guān)的基因表達(dá)水平的檢索在幾個(gè)連續(xù)的步驟中完成。首先，通過比較根據(jù)所需參數(shù)不同而不同的腫瘤兩組亞群中的中值表達(dá)水平檢測(cè)基因。我們使用中值而不是平均值因?yàn)樵S多基因的表達(dá)水平的差異性高，這導(dǎo)致接近或高于平均值的標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)水平，并使得無法與平均值進(jìn)行比較。其次，通過制圖法對(duì)這些被檢測(cè)的基因進(jìn)行直觀的檢驗(yàn)。最后，對(duì)那些試圖證實(shí)相關(guān)性的基因應(yīng)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過Marm-Witney檢驗(yàn)證實(shí)HER2的表達(dá)在ER-陽(yáng)性腫瘤與ER-陰性腫瘤之間的比較。相關(guān)系數(shù)被用于比較基因表達(dá)水平與所含腋淋巴結(jié)數(shù)目。1. 7.聚類分析本研究中所得數(shù)據(jù)被分析并被如所述方式(13-16)列出。簡(jiǎn)而言之，一種分等級(jí)的聚類算法產(chǎn)生表格的結(jié)果，其中陣列的元素/cDNAs(代表特定基因)根據(jù)其基因表達(dá)模式的相似性被分到一組。試驗(yàn)樣品(例如細(xì)胞系和腫瘤)應(yīng)用同樣的算法根據(jù)其基因表達(dá)的整個(gè)模式的相似性進(jìn)行分群。這樣排列好的數(shù)據(jù)表格以彩色圖象圖形表示。縱軸方向， 被分析的基因按照聚類算法排列，這樣具有最大表達(dá)模式相似性的基因就可以一個(gè)挨著一個(gè)。沿著橫軸，試驗(yàn)樣品以類似排列，以使得所有基因中具有最大表達(dá)模式相似性的可以彼此相鄰排列。在這個(gè)表圖的每一個(gè)單元格/正方形的顏色代表經(jīng)檢測(cè)每個(gè)所研究基因的表達(dá)的比例。顏色的飽和度也與經(jīng)檢測(cè)基因表達(dá)率成正比，最亮紅色正方形具有最高T/N比 (例如，> 8倍差異)，最亮綠色正方形具有最低T/N比，黑色正方形表示比值大約為1，灰色正方形表明數(shù)據(jù)質(zhì)量不足。1. 8. Northern-印跡進(jìn)行 RNA 分析我們使用Northern-印跡分析標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來檢測(cè)AXL和GAS6在一些乳腺癌和所有乳腺癌細(xì)胞系制劑中的表達(dá)。通過與具有人肌動(dòng)蛋白探針的濾膜的再雜交驗(yàn)證加載的 RNA樣品。1. 9.化學(xué)侵入測(cè)試和遷移測(cè)試以Albini等的方法(10)的修飾方法進(jìn)行化學(xué)侵入測(cè)試。在胰蛋白酶消化后，細(xì)胞 (20. 000)被接禾中在 Boyden 室(Biocoat Matrigel Invasion Chamber, Becton Dickinson, Bedford，MA 或 Nunc IOmm 組織培養(yǎng)插入板，Naperville，IL)中 Matrigel-包被的(4. Omg/ ml, 150 μ 1)的8μπι聚丙烯濾膜插件(insert)上。該底部室含有按Albini等描述方法制備的0. 55ml NIH3T3-條件培養(yǎng)基用于培養(yǎng)一些細(xì)胞系的或正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基。由ATCC獲得的BC細(xì)胞系被胰蛋白酶消化，離心并以4X IO5細(xì)胞/ml重懸于含有 10% FBS的RPMI中。剩下的細(xì)胞系被重懸于一般的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在20-36小時(shí)后，將殘留在該插件上的細(xì)胞用棉簽轉(zhuǎn)移，用不同的方法計(jì)數(shù)過濾 11/ ^Wiffllfi^ :^Diff-quick(American Scientific Products, McGraw Park, IL) ψ 固定，用RNase A(37°C，50yg/ml處理20分鐘)處理，然后在室溫(RT)下用碘化丙錠 (propidium iodine) (10ug/ml的PBS液)染色一分鐘。干燥的濾膜被移除并被置于有
1Cytoseal 60 封片培養(yǎng)基(Stephens Scientific, Kalamazoo, MI)的載玻片上。對(duì)濾膜上各個(gè)碘化丙錠染色的核計(jì)數(shù)。大部分結(jié)果通過胰蛋白酶作用和細(xì)胞計(jì)數(shù)獲得。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中三份樣品被計(jì)數(shù)。從平均侵入力的計(jì)算中刪除無關(guān)(outlying)值。為了進(jìn)行抗體存在時(shí)的侵入性測(cè)試，細(xì)胞被接種在Matrigel上，當(dāng)附著時(shí)，所示抗體被加入到培養(yǎng)基中。該抗體在整個(gè)測(cè)試過程中都在室的上層；在測(cè)試結(jié)束時(shí)，室上層的細(xì)胞的存活力通過臺(tái)盼藍(lán)評(píng)估。根據(jù)用于侵入性測(cè)定的方法進(jìn)行遷移力測(cè)定，除了細(xì)胞被接種于Boyden室中的未包被的8_μ m孔聚丙烯濾膜上。1. 10. Matrigel 生長(zhǎng)暈(outgrouth)用以前描述的方法(10)對(duì)生長(zhǎng)在Matrigel上的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。簡(jiǎn)而言之，重懸于50 μ 1培養(yǎng)基的細(xì)胞(96-孔板上，5000細(xì)胞/孔)被接種于預(yù)定的Matrigel涂層頂部，該涂層含有在RPMI基礎(chǔ)培養(yǎng)基鹽中稀釋至6. 0mg/ml的70 μ 1 Matrigel (Becton Dickinson)。在頂部的聚合反應(yīng)后，添加稀釋的50 μ 1 Matrigel (1. 0mg/ml)。集落生長(zhǎng)暈在整個(gè)試驗(yàn)過程中被監(jiān)控，并在7-14天時(shí)用配備有OpenLab(UK)數(shù)碼相機(jī)的的 ZeissAxioVert 35熒光顯微鏡進(jìn)行拍攝。1. 11 創(chuàng)傷測(cè)試(wound assay)饑餓過夜后，用一塑料尖端對(duì)匯合細(xì)胞的單層制造創(chuàng)辦傷。在拍照(相差) 之前，用培養(yǎng)基(10% FCS)和含GAS6Q00ng/ml)的培養(yǎng)基處理MDA-MB-345S-模擬和 MDA-MB-435-dnAXL,克隆2細(xì)胞12J4和48小時(shí)。為了定量細(xì)胞遷移，以40X的放大率拍攝創(chuàng)傷的三個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域(Imm長(zhǎng))；20μπι平均傷口的寬度，計(jì)算創(chuàng)傷閉合的平均比例。 每個(gè)測(cè)定樣品檢驗(yàn)三個(gè)獨(dú)立的創(chuàng)傷，計(jì)算出創(chuàng)傷閉合的平均比例。1. 12.用抗體處理細(xì)胞用Ex-AXL多克隆抗體Q00 μ g/ml)處理乳腺癌細(xì)胞(5000用于3D生長(zhǎng)暈檢測(cè)， 且20000用于Boyden chamber中的侵入性檢測(cè))，其中使用50 μ 1抗體和500 μ 1細(xì)胞懸液。室溫下將細(xì)胞與抗體一起培養(yǎng)60分鐘，然后在室溫下用PBS清洗。用相同濃度Ex-AXL 抗體進(jìn)行細(xì)胞的接種和隨后M小時(shí)的處理。1. 13.用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染BC細(xì)胞根據(jù)經(jīng)修飾的標(biāo)準(zhǔn)方法(31)獲得病毒的AXLwt和dn-AXL突變型。簡(jiǎn)而言之，依次通過 EcoRI/BamHI 和 Notl/Xbal 位點(diǎn)克隆 pLXSN-AXLwt 和 pLXSN-dnAXL。使用磷酸鈣用這些載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系Wioenix A。收集轉(zhuǎn)染W(wǎng)ioenixA細(xì)胞的上清液，經(jīng)0. 45- μ m的濾膜過濾。為了感染人癌癥細(xì)胞系，細(xì)胞與病毒上清液一起培養(yǎng)M 小時(shí)。48小時(shí)后，培養(yǎng)基被替換為含有400 μ g/mKn48的培養(yǎng)基。為了進(jìn)一步篩選，細(xì)胞與G148 —起培養(yǎng)14天。通過有限稀釋獲得多克隆和單克隆抗體細(xì)胞系。AXL的表達(dá)由 Western印跡和陣列分析測(cè)定。選擇具有類似AXL和dnAXL表達(dá)水平的多克隆和3個(gè)單克隆細(xì)胞系用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。1. 4.抗體用含有氨基酸殘基l-410(AXL_Ex)的重組GST-AXL胞外域融合蛋白免疫兔獲得了 AXL/UF0-特異性抗體。該重組GST-AXL-Ex蛋白質(zhì)是由經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞(載體 pcDNA3-GST)穩(wěn)定分泌的。收集培養(yǎng)基，用標(biāo)準(zhǔn)GST-標(biāo)記方法(Pharmacia，Sweden)純化 GST-AXL-Ex蛋白質(zhì)，AXL-Ex多克隆抗體在GST-瓊脂糖親合柱上被部分純化。
結(jié)果本研究的目的是建立乳腺癌細(xì)胞中的蛋白激酶，磷酸酶和信號(hào)基因的表達(dá)特征， 同時(shí)鑒別乳腺癌侵占性的新標(biāo)記。cDNA雜交陣列被用于分析14個(gè)弱侵入性、7個(gè)強(qiáng)侵入性乳腺癌細(xì)胞系和3個(gè)正常乳腺上皮細(xì)胞系的基因表達(dá)特征(表1，圖1，侵入性BC細(xì)胞系和對(duì)照組的3D生長(zhǎng))。表1用于產(chǎn)生侵入共有序列的乳腺癌細(xì)胞系的表征
權(quán)利要求
1.AXL基因表達(dá)和/或AXL配體基因表達(dá)和/或蛋白質(zhì)功能和/或蛋白質(zhì)配體功能的抑制劑在制備用于降低惡性病癥侵入力的藥物組合物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中AXL蛋白質(zhì)配體是GAS6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述抑制劑抑制AXL蛋白的受體酪氨酸激酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述抑制劑抑制AXL基因的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述抑制劑抑制AXL蛋白與其配體之間的相互作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一個(gè)的用途，其包括以能有效降低惡性病癥的侵入力的量對(duì)有所需要的受試者施用AXL基因、AXL配體基因、AXL蛋白質(zhì)和/或AXL蛋白質(zhì)配體的抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中惡性病癥是癌癥，尤其是選自乳腺癌、前列腺癌、腎癌、 肺癌、結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤和其它癌癥。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述癌癥是惡性膠質(zhì)瘤。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任意一個(gè)的用途，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物，尤其是人類。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任意一個(gè)的用途，其中所述抑制劑是針對(duì)AXL蛋白的抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任意一個(gè)的用途，其中所述抑制劑是反義核酸、核酶或針對(duì) AXL基因或其轉(zhuǎn)錄物的RNA干擾分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任意一個(gè)的用途，其中所述抑制劑是AXL基因顯性失活突變體。
13.鑒定和/或表征惡性病癥侵入力的抑制劑的方法，其包括測(cè)定測(cè)試化合物是否能夠抑制AXL基因、AXL配體基因、AXL蛋白質(zhì)和/或AXL蛋白質(zhì)配體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其包括測(cè)定測(cè)試化合物是否能夠結(jié)合AXL蛋白和/或降低AXL基因表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中使用了一種基于細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中使用了一種無細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及惡性病癥領(lǐng)域中的診斷和治療方法。尤其是，本發(fā)明提供了測(cè)定惡性病癥的侵入力的方法和包括阻止或治療腫瘤細(xì)胞侵入的減小惡性病癥的侵入力的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102349997SQ20111032844
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2003年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月17日
發(fā)明者A·尤爾里奇, P·克尼亞澤夫, P·瓦杰科克基, T·克尼亞澤瓦, Y·切伯金 申請(qǐng)人:馬普科技促進(jìn)協(xié)會(huì)