專利名稱：N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
唾液酸(Sialic acid)是一類神經(jīng)氨酸的衍生物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的天然的唾液酸衍生物達(dá)40多種。其中最主要的是N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid,NeuSAchNeuSAc通常位于細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂的糖鏈非還原末端，在許多與糖和蛋白相互作用有關(guān)的生理過程中起著很重要的作用如細(xì)胞的粘附、信號傳遞、糖蛋白的穩(wěn)定性、細(xì)菌致病性、病毒侵染、炎癥和腫瘤的轉(zhuǎn)移等。N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物學(xué)功能多樣化，在治療流感、神經(jīng)性疾病、炎癥和腫瘤等方面具有重要的醫(yī)藥價值，特別是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的H1N1)的預(yù)防和治療方面有良好的效果。同時，N-乙酰神經(jīng)氨酸可促進(jìn)神經(jīng)突觸的發(fā)育，對嬰幼兒腦部發(fā)育非常重要，因此也被用于嬰幼兒奶粉添加劑。無論是藥用前景還是作為食品添加劑，N-乙酰神經(jīng)氨酸都具有較高的市場價值。N-乙酰神經(jīng)氨酸可從以下幾種途徑獲得天然產(chǎn)物提取、化學(xué)合成、化學(xué)酶法、酶法合成等。N-乙酰神經(jīng)氨酸可從燕窩、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取純化難，產(chǎn)量低(10-20% )，純度低?；瘜W(xué)合成法合成N-乙酰神經(jīng)氨酸，由于產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，需要繁多的保護(hù)和去保護(hù)步驟。使用化學(xué)法合成N-乙酰神經(jīng)氨酸反應(yīng)條件苛刻，需要銦等一些貴重金屬作為催化劑，N-乙酰神經(jīng)氨酸得率低。因此，化學(xué)法常常和酶法結(jié)合使用。N-乙酰神經(jīng)氨酸 可通過酶法合成，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在N-乙酰神經(jīng)氨酸醒縮酶(Neu5Ac aldolase or Neu5Ac lyase,NanA,EC4.1. 3· 3)作用下生成 N_ 乙酰神經(jīng)氨酸。但ManNAc對于工業(yè)生產(chǎn)而言成本較高?；瘜W(xué)酶法是一種更經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，即在堿性條件下，使GlcNAc異構(gòu)化生成ManNAc ;然后采用N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。或用雙酶法合成SP用 GlcNAc 2_ 異構(gòu)酶(GlcNAc 2-epimerase,AGE,EC5.1. 3. 8)催化 GlcNAc 異構(gòu)成 ManNAc,然后ManNAc和丙酮酸在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的作用下縮合產(chǎn)生Neu5Ac。在工業(yè)生產(chǎn)中多以GlcNAc為原料生產(chǎn)Neu5Ac，不論是采用化學(xué)酶法還是雙酶法，都需要N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。雖然N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶在高等動物及一些微生物中有存在，但是生物體中其含量極微，難以分離得到足夠量的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。因此如何獲得性質(zhì)優(yōu)良的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶對N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，名稱為SaNanA，來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),是如下 a)或 b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的編碼基因，為如下I)或2)或3)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列I所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
O.1 % SDS 和 I X SSC, O.1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由882個核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。序列表中序列2由293個氨基酸殘基組成。含有所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在載體6HisT_pRSET的多克隆位點插入所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。所述重組菌為將所述編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌；所述編碼基因是通過所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中的；所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。擴(kuò)增所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。所述N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、所述編碼基因、所述重組表達(dá)載體或所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明以金黃色葡萄球菌總DNA為模板，用PCR擴(kuò)增獲得一個編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的新基因SananA。將SananA基因克隆到原核表達(dá)載體6HisT_pRSET質(zhì)粒上，在大腸桿菌中進(jìn)行N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶蛋白(SaNanA)的高效表達(dá)。獲得的重組N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸，具有較高的酶活性，具有較高的應(yīng)用前景及開發(fā)價值。


圖1為SananA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖2為重組質(zhì)粒pSananA的酶切鑒定結(jié)果。圖3為基因工程菌pSananA/BL21表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。圖4為SaNanA純化后的SDS-PAGE分析。圖5為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的制備及功能驗證一、金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取和SaNanA基因的PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，CGMCC1. 1529)，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根公司)提取金黃色葡萄球菌基因組DNA。以提取金黃色葡萄球菌基因組總DNA作為模板，以Sa-F和Sa-R為引物，用高保真pyrobest酶(Takara公司)PCR擴(kuò)增SaNanA基因。引物序列如下Sa-F :5’ -GCGCGACCATATGAACAAAGATTTAAAAGG-3> (下劃線表示 NdeI 酶切位點)，Sa-R 5，-GCGGGATCCCTATAAATCGTATTTTGCAATG-3，(下劃線表示 BamHI 酶切位點)。PCR 程序為
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì) a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下I)或2)或3)所示 1)其核苷酸序列是序列表中序列I所示DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在載體6HisT-pRSET的多克隆位點插入所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌；所述權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中的。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或其任一片段的引物對，所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4-6中任一所述的重組表達(dá)載體、重組菌、表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明獲得了一個編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的新基因SananA。將SananA基因克隆到原核表達(dá)載體6HisT-pRSET質(zhì)粒上，在大腸桿菌中進(jìn)行N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶蛋白(SaNanA)的高效表達(dá)。本發(fā)明所獲得的重組N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸，具有較高的酶活性，具有較高的應(yīng)用前景及開發(fā)價值。
文檔編號C12N1/19GK103060300SQ20111032202
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者林白雪, 張子娟, 陶勇 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所