專利名稱：白僵菌素合成相關(guān)蛋白質(zhì)系統(tǒng)及其編碼基因簇與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白僵菌素合成相關(guān)蛋白質(zhì)系統(tǒng)及其編碼基因簇與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白僵菌素是一種六元環(huán)狀縮酯肽化合物，由3個(gè)甲基苯丙氨酸和(D)-Ci -羥基異戊酸殘基交替相連而成，分子式為C45H57N3O9，分子量為786，結(jié)構(gòu)如圖1。白僵菌素是真菌的次生代謝產(chǎn)物，最早由Hamil于1969年首次從球孢白僵菌的菌絲體中提取到。至今為止已經(jīng)從球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和幾種其他的真菌中分離得到了白僵菌素。白僵菌素對(duì)蚊子幼蟲(chóng)、鹵蟲(chóng)、綠頭蒼蠅和鞘翅目害蟲(chóng)等有殺傷作用。目前，白僵菌素主要用作殺蟲(chóng)劑和除菌劑等。近年來(lái)，越來(lái)越多的發(fā)現(xiàn)表明白僵菌素除了殺蟲(chóng)之外還具有很多生物活性。2000 年，Nilanonta報(bào)道了其同系物的抗結(jié)核和瘧原蟲(chóng)的活性。2004年，F(xiàn)ukuda從Beauveria sp. FKI-1366中分離得到了白僵菌素及其3個(gè)同系物，并與咪康唑配合進(jìn)行了抗白色念珠菌(Candidaalbicans)活性測(cè)定，結(jié)果表明通過(guò)配合白僵菌素使用咪康唑，不僅能夠抑制普通白假絲酵母，而且能夠有效抑制對(duì)咪康唑有抗藥性的白假絲酵母。2004年，Jow等發(fā)現(xiàn)白僵菌素能夠誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞的凋亡。2005年，Lin等對(duì)白僵菌素誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了研究。然而，白僵菌素對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性較大，可影響動(dòng)物或人類的健康，可引起鼠和人類腫瘤細(xì)胞系顯著的細(xì)胞死亡，并且強(qiáng)效和特異地抑制鼠肝臟微體中膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性。2003年，Dombrink-Kurtzman還發(fā)現(xiàn)白僵菌素能夠誘導(dǎo)火雞外周血液中淋巴細(xì)胞的凋亡，從而影響其免疫系統(tǒng)(Dombrink-Kurtzman MA，2003)。因此，白僵菌素的毒性極大地限制了它的應(yīng)用。然而，2007年的研究發(fā)現(xiàn)低劑量的白僵菌素與酮康唑能夠產(chǎn)生互動(dòng)作用 (Synergy)殺死病原真菌，大大減少用藥量，并降低毒副作用(^iang LX, Yan KZ, Zhang Y, Huang R, Bian J etal. (2007)High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites as combinationagents for the treatment of fungal infections. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 104(11) :4606-4611.)。另外，在白僵菌中，白僵菌素的產(chǎn)量相對(duì)較低，Xu等利用Beauveria bassiana發(fā)酵得到約20mg/L的白僵菌素。如上所述，鐮刀菌屬中的株的白僵菌素的產(chǎn)量比白僵菌屬中的產(chǎn)量高2 3個(gè)數(shù)量級(jí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與白僵菌素合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與白僵菌素合成相關(guān)的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列13所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列13的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與白僵菌素合成相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所提供的與白僵菌素合成相關(guān)蛋白的編碼基因，為如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列1第27，092位到36，504位所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。含有與白僵菌素合成相關(guān)蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種白僵菌素合成相關(guān)蛋白質(zhì)系統(tǒng)及其編碼基因簇。本發(fā)明所提供的白僵菌素合成相關(guān)蛋白質(zhì)系統(tǒng)，是由如下1)至15)中15種蛋白質(zhì)組成的1)其氨基酸序列為序列表中的序列2或在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列2限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；2)其氨基酸序列為序列表中的序列3或在序列表中序列3所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列3限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；3)其氨基酸序列為序列表中的序列4或在序列表中序列4所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列4限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；4)其氨基酸序列為序列表中的序列5或在序列表中序列5所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列5限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；幻其氨基酸序列為序列表中的序列6或在序列表中序列6所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列6限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；6)其氨基酸序列為序列表中的序列7或在序列表中序列7所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列7限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；7)其氨基酸序列為序列表中的序列8或在序列表中序列8所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列8限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；幻其氨基酸序列為序列表中的序列9或在序列表中序列9所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列9限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；9)其氨基酸序列為序列表中的序列10或在序列表中序列10所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列10限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；10)其氨基酸序列為序列表中的序列11或在序列表中序列11所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列11限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；11)其氨基酸序列為序列表中的序列12或在序列表中序列12所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列12 限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；12)其氨基酸序列為序列表中的序列13或在序列表中序列13所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列13 限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；13)其氨基酸序列為序列表中的序列14或在序列表中序列14所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列14 限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；14)其氨基酸序列為序列表中的序列15或在序列表中序列15所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列15 限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；15)其氨基酸序列為序列表中的序列16或在序列表中序列16所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列16 限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的白僵菌素合成相關(guān)蛋白質(zhì)系統(tǒng)的編碼基因簇，為如下1)或2)或 3)的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼白僵菌素合成相關(guān)蛋白系統(tǒng)的DNA分子；3)與1)的基因具有90%以上的同源性，且編碼白僵菌素合成相關(guān)蛋白系統(tǒng)的DNA 分子。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種重組載體。本發(fā)明所提供的重組載體，為將序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列插入到出發(fā)載體上，得到的含有序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列作為上下游同源臂的重組載體。所述出發(fā)載體為pRF-HU2克隆載體；所述pRF_HU2克隆載體攜帶有可以在大腸桿菌中復(fù)制的起始位點(diǎn)oriV元件，同時(shí)含有廣譜宿主性的復(fù)制起始基因TrfA，可保證該載體可在各種真菌宿主中擴(kuò)增(如曲霉、鐮刀菌等)。另外，構(gòu)巢曲霉來(lái)源的色氨酸啟動(dòng)子PTrpC 和色氨酸終止子TtrpC對(duì)篩選標(biāo)記潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hph的功能表達(dá)起到重要的作用，潮霉素抗性篩選在真菌分子生物中是很好的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種制備產(chǎn)白僵菌素能力降低的基因工程菌的方法。本發(fā)明所提供的制備產(chǎn)白僵菌素能力降低的基因工程菌的方法，包括如下步驟將所述重組載體導(dǎo)入能生產(chǎn)白僵菌素的真菌中，即得到產(chǎn)白僵菌素能力降低的基因工程菌；所述能生產(chǎn)白僵菌素的真菌為可育鐮刀菌(Fusarium proliferatum) LF061。根據(jù)所述方法制備得到的基因工程菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的與白僵菌素生物合成相關(guān)蛋白質(zhì)系統(tǒng)及其編碼基因簇可以幫助人們理解羧酸肽家族天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)制，為進(jìn)一步遺傳改造提供了材料和知識(shí)。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來(lái)尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。


圖1為白僵菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2為鐮刀菌LF061基因組文庫(kù)篩選三個(gè)陽(yáng)性克隆子在白僵菌素合成簇上可能的排布方式。3個(gè)交疊的R)smid黏粒代表了可育鐮刀菌LF061基因組431Λ的DNA區(qū)域，★代表篩選所用引物，fpBeasLJl, fpBeas5#和fpBeaS8#為篩選獲得的三個(gè)陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒。圖3為白僵菌素生物合成基因簇的基因組成；每一個(gè)箭頭代表一個(gè)0RF，箭頭方向代表轉(zhuǎn)錄方向；其中，白僵菌素合酶基因fpBeas，kivr和調(diào)節(jié)基因orf 12用黑色箭頭表示。圖4為FpBEAS合酶結(jié)構(gòu)示意與提出的BEA的生物合成途徑；其中，(I)FpBEAS合成酶結(jié)構(gòu)。modulel =L-苯丙氨酸識(shí)別和活化模塊；module〗=D- α -羥異戊酸活化模塊；S 4'-硫酸泛酰巰基乙胺結(jié)合位點(diǎn)；C:縮合結(jié)構(gòu)域；M :Ν-甲基轉(zhuǎn)移酶域。(II)推測(cè)的鐮刀菌中白僵菌素合成機(jī)制。圖5為重組載體pRF-HU2-fpBeaS的構(gòu)建過(guò)程示意圖。圖6為重組載體pRF-HU2_fpBeas的示意圖。圖7為白僵菌素合成基因fpBeas基因的阻斷及分子驗(yàn)證；(I)突變子ml中fpBeas 基因阻斷示意；(II)PCR 鑒定突變子(L)HygU/HygL，(M) geneTl/T2，(R) geneT3/RFl 擴(kuò)增左側(cè)區(qū)域和geneT4-RF2擴(kuò)增右側(cè)區(qū)域。圖8為可育鐮刀菌LF061及突變株發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜(HPLC)分析；(I)野生型可育鐮刀菌LF061 ;(11)突變子ml (fpBeas基因單側(cè)插入阻斷)；(III)突變子m2 (敲除載體異位插入LF061基因組別處位置)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、可育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)LF061白僵菌素合成相關(guān)基因簇的制備一、可育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)LF061白僵菌素合成相關(guān)基因簇的克隆1、白僵菌素產(chǎn)生菌鐮刀菌LF061總DNA的提取將單孢分離純化的可育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)LF061菌株(公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專利文獻(xiàn)是Jhang LX, Yan KZ, Zhang Y, Huang R, Bian J et al. (2007)High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites ascombination agents for the treatment of fungal infections. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 104(11) :4606-4611.)接種于含 IOOmL PDA 液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm 的搖床上培養(yǎng)3天。過(guò)濾出菌絲體，再用無(wú)菌水洗滌1-2次，用滅菌的濾紙包住放置晾干。稱取0. Ig菌絲體，在液氮中研磨成粉，分裝于1. 5mL離心管中，加入600 μ L改良基因組提取液 SDS ；IOOmM Tris-HCl, ρΗ 8. 0 ；IOmM EDTA, ρΗ 8. 0 ；1. 4Μ NaCl) (Moiler et al.， 1992)，混勻，65°C水浴中保溫30min處理。然后將離心管迅速移入冰浴中靜置5-lOmin，加入Tris飽和酚和氯仿各300 μ L，充分混勻，室溫靜置10min，4°C，12，OOOrpm離心10分鐘。 吸取上清，加入等體積的氯仿，混勻，4°C，12，OOOrpm離心lOmin。繼續(xù)吸取上清，加入1/10 體積的3M的NaAC (ρΗ6· 0)和3/5體積的異丙醇，混勻，室溫靜置lOmin，4°C，12，OOOrpm離心5min后用70%乙醇洗滌一次。12000rpm離心^iiin棄上清，晾干后加入100 μ L無(wú)菌去離子水，加入 2 μ L 的 Rnase (10mg/mL)，37°C保溫 20min。2、白僵菌素產(chǎn)生菌鐮刀菌LF061基因組文庫(kù)的構(gòu)建將上述提取的總DNA進(jìn)行脈沖場(chǎng)瓊脂糖凝膠電泳，電洗脫純化回收36-451Λ大片段DNA,用 CopyControlTMFosmid Library Production Kit 的 End-Repair Enzyme Mix進(jìn)行末端補(bǔ)平。以0. 5 X TE進(jìn)行點(diǎn)透析2小時(shí)，換30% PEG8000濃縮DNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定 DNA濃度，按插入片段分子數(shù)pCC2F0S載體分子數(shù)1 10的比例以i^ast-Link DNA Ligase 室溫2小時(shí)進(jìn)行連接。再次以0. 5XTE進(jìn)行點(diǎn)透析2小時(shí)，換30% PEG8000濃縮DNA。取 10 μ L連接后的DNA力口入至IJ25 μ L冰上融化的MaxPlax Lambda Packaging Extracts, 30°C, 90 分鐘溫育后加入另外 25 μ L MaxPlax Lambda Packaging Extracts，30°C，90 分鐘溫育， 加入PDB緩沖液至終體積lmL。取大腸桿菌EPI300-T1K單菌落接入LB液體培養(yǎng)基220rpm， 37°C過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行活化。5ml過(guò)夜培養(yǎng)物加入到50mL新鮮LB培養(yǎng)基(含IOmM MgSO4)， 37°C，220rpm振蕩至OD6tltl = 0.8-1.0。取50 μ L包裝后混合物加入950 μ L上述培養(yǎng)的大腸桿菌，37°C，20分鐘溫育。取部分菌液涂布于含12.5 48/!^氯霉素的1^培養(yǎng)基，371過(guò)夜培養(yǎng)計(jì)算文庫(kù)克隆數(shù)；剩余菌液加入終濃度20%的甘油，儲(chǔ)存于-80°C。三、PCR克隆白僵菌素合酶A-domain合成基因簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)進(jìn)行的菌落PCR篩選法是篩選基因組文庫(kù)最常用的一種方法。文獻(xiàn)調(diào)研表明BEA生產(chǎn)菌Fusarium proliferatum LF061在分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上與F. equiseti 近源，而且后者產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物恩鏈孢菌素(ermiatin)與白僵菌素同屬NRPs —類，結(jié)構(gòu)相近。以F. equiseti中ESYN(CAA79MQ中腺苷酸模塊EA結(jié)構(gòu)域保守區(qū)域氨基酸序列作為探針，在NCBI上blastP比對(duì)搜索，選取近源的NRPk序列，用Genedoc軟件比對(duì)。以恩鐮孢菌素合酶ESYNl中EA模塊中的A-domain的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以Fusarium prolferatum LF061的總DNA為模板，克隆負(fù)責(zé)催化識(shí)別D-Hiv的腺苷?；Y(jié)構(gòu)域基因。PCR體系包括DMSO(8%，v/v), dNTP(2. 5mM), Taq聚合酶緩沖液(10X)，簡(jiǎn)并性引物 (30mM)及適量模板 Fusariumproliferatum LF061 總 DNA。首先 94°C，5min，1 個(gè)循環(huán)；然后 94°C，lmin，50-70°C，lmin，72°C，lmin，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C，lOmin，1 個(gè)循環(huán)。PCR 結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。切膠回收合適大小的片段，PCR產(chǎn)物用BioSpin Gel Extraction Kit (BioFlux, Cat. NO. BSC02M1)純化，與 pMD_18T vector 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有氨芐青霉素，IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和 X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落過(guò)夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，EcoRI酶切鑒定是否含有預(yù)期大小的DNA插入片段，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增獲得的基因片段如序列表中序列1第33，412位33，932位所示，即負(fù)責(zé)催化識(shí)別D-Hiv的腺苷酰化結(jié)構(gòu)域基因。通過(guò)與結(jié)構(gòu)類似的縮酯肽化合物的生物合成基因簇對(duì)比，可以確定該腺苷?；Y(jié)構(gòu)域基因與LF061白僵菌素生物合成相關(guān)。對(duì)FpBEAS合成酶的分析，有兩個(gè)模塊構(gòu)成(modulel和module2)，其構(gòu)成符合 "C1A1T1-C2A2 (M)T2aT2b-C/'特點(diǎn)。與恩鏈孢菌素合成酶作用機(jī)制類似，modulel模塊中A1結(jié)構(gòu)域識(shí)別并活化羥基異戊酸(D-Hiv)基團(tuán)，后轉(zhuǎn)移到相鄰T結(jié)構(gòu)域的磷酸泛酰巰基乙胺 (Ppant)長(zhǎng)臂上，形成氨?；?SeH絲氨酸)-酶中間產(chǎn)物。同樣，modUle2模塊A2結(jié)構(gòu)域活化L-苯丙氨酸(Wie)生成氨?；?L-Phe-酶中間產(chǎn)物，在磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶 (Pptases)的作用下與Ia結(jié)構(gòu)域的Ser殘基相連，最后在C2結(jié)構(gòu)域的作用下生成“二肽” 單體(dip印tidolmonomer)。新合成的肽?；虚g產(chǎn)物被T結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到下游C結(jié)構(gòu)域而合成肽鏈，通過(guò)與恩鏈孢菌素合成機(jī)制類似的三次循環(huán)反應(yīng)，從而環(huán)化生成白僵菌素，見(jiàn)圖 4。四、篩選、克隆和分析白僵菌素的生物合成基因簇利用上述克隆的該腺苷酰化結(jié)構(gòu)域基因片段設(shè)計(jì)篩選引物，用菌落PCR方法從鐮刀菌LF061的Fosmid基因組文庫(kù)篩選獲得fpBeasLJl，fpBeas5#*fpBeas8#H個(gè)質(zhì)粒(圖 2)。其中，fpBeasLJl，fpBeas5#*fpBeas8# 質(zhì)粒的 DNA 序列由華大基因(BGI)用 shotgun 方法測(cè)序，拼接由 Sequencher 4. 9 (Gene Codes)和 Vector NTI suite 10. O (Invitrogen) 完成。用FGENESH和AUGUSTUS在線分析軟件工具對(duì)白僵菌素合成基因編碼基因進(jìn)行了分析，內(nèi)含子/外顯子臨界預(yù)測(cè)用SPLICEVIEW在線工具。使用BLAST程序在GenBank的DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行DNA和氨基酸序列的同源性搜索。用Clustal W(Thompson, 1994)程序進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。NRP^結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)使用UMA運(yùn)算法則，A結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)氨基酸分析運(yùn)用NRPSpredictor預(yù)測(cè)軟件。獲得合成白僵菌素的相關(guān)基因簇(431Λ)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將其命名為bea，GC含量平均49. 16%，包含15個(gè)開(kāi)放閱讀框，如圖3所示。整個(gè)基因簇共包含15個(gè)基因的核苷酸序列或互補(bǔ)序列，其中，1個(gè)與白僵菌素大環(huán)生物合成相關(guān)的非核糖體多肽合酶基因，1個(gè)編碼負(fù)責(zé)從前體物質(zhì)到2-羥異戊酸的轉(zhuǎn)化的還原酶，1個(gè)調(diào)節(jié)基因，1個(gè)ABC-型多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，5個(gè)參與編碼輔助毒力蛋白因子，1個(gè)編碼膜蛋白，1個(gè)胺氧化酶基因，1個(gè)編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，1個(gè)脫氫酶基因，3 個(gè)未知功能的基因。開(kāi)放閱讀框詳細(xì)的分析結(jié)果如表1所示。表Ibea基因簇上參與白僵菌素合成的ORF注釋及比對(duì)
Gene modlesProteinIdentityGene productsE-valueb
(Start-end, bp)Length (aa) /Simiarity (%)
"^/7(5444272)22457 71^^^^^^^^^^
orflc (1396-2088)23068/81COGl670，acetyltransferase，乙酰轉(zhuǎn)移酶 le-85
orfic (2449-4533)65558/71cd01823, SGNH-hydrolases,脂酶lc-161
orf4(5226-7l65)54465/79COG3325, ChiA, Chitmase,幾丁質(zhì)酶 0.0
orf5c (7517-8632)37138/52Zmc-dependent metalloprotease,蛋白酶 6e-59
o//6(10169-13032) 68659/74putative muramidase,唾液酸酶h-91
o//7(15201-16378) 37438/53ND,未知功能蛋Π3e-53
orfic (16467-17272) 23568/80short chain type dehydrogenase,脫氫酶 2e-90
0/^9(18293-18847)18447/61ND2c-21
orflO0 (19172-23623) 1,30157/74ABC-type multidrug transport system,多藥 0.0
^轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
kivrc (24722-25950) 39060/75ICetopantoate reductase,酮異戊酸還原酶 7e-132
pBeas(27092-36504) 3,09266/80cyclic peptide synthetase,白僵菌素合酶0.0
orflf (36749-37828) 34259/72Predicted membrane protein,可能的膜蛋白7e-114
o//i2(39528-40190) 22051/67putative C6 zinc transcription factor,調(diào)節(jié)蛋2c-26
白
o,;/H(42373-443979) 47972/82flavin containing amine oxidase,胺氧化酶0.0
ND，功能未知；。反向互補(bǔ)。1)非核糖體合酶基因fpBeas全長(zhǎng)9，410bp，位于bea基因簇第27，092位-36，504 位堿基處，編碼3，092個(gè)氨基酸的FpBEAS合酶，其氨基酸序列如序列表中序列13所示。它由兩個(gè)外顯子組成，分別位于bea基因簇上第27，092-32，667位和第32，802-36，501位堿基處，中間被134bp內(nèi)含子隔斷。對(duì)FpBEAS合成酶的分析，由兩個(gè)模塊構(gòu)成(modulel和 module2)，其構(gòu)成符合"C1A1T1-C2A2 (M) T2aT2b-C3"特點(diǎn)。2)白僵菌素合成的另外一個(gè)關(guān)鍵基因kivr，位于bea基因簇第M，722位-25，950 位堿基處，編碼NADPH-依賴的2-酮異戊酸還原酶，其氨基酸序列如序列表中序列12所示， 負(fù)責(zé)從前體物質(zhì)丙酮酸L-纈氨酸到2-羥異戊酸的轉(zhuǎn)化。它含有1個(gè)內(nèi)含子。由2個(gè)外顯子組成，分別位于bea基因簇上第24，725-24, 755位和第24，812-25，950位堿基處。3)白僵菌素合成的抗性和調(diào)節(jié)基因，即orflO和orfl2共2個(gè)基因orflO位于bea基因簇第19，172-23，623個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為3，906個(gè)堿基對(duì)，編碼l，301aa的ABC-型多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列11所示，含有10個(gè)內(nèi)含子。它由11個(gè)外顯子組成，分別位于bea基因簇上19，175-19，198，19，263-19，696， 19，749-19，867,19，928-21，582,21，658-22，632,22, 683-23，018, 23，068-23，122, 23，188-23，272，23，335-23，440，23510-23623 堿基處；orf 12位于bea基因簇39，528-40, 190個(gè)堿基處，編碼220aa的類似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其氨基酸序列如序列表中序列15所示，典型特征是含保守的Si (II) 2Cys6鋅簇 DNA結(jié)合域。4)白僵菌素的輔助毒力基因，即orfl，orf3, orf4, orf5和orf6共5個(gè)基因orfl位于bea基因簇M4_l，272個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為672個(gè)堿基對(duì)，編碼2Maa的硫酯酶，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，含有1個(gè)內(nèi)含子。它由2個(gè)外顯子組成，分別位于bea基因簇上544-945，1，000-1, 269堿基處；orf3位于bea基因簇2，449-4, 533個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1，968個(gè)堿基對(duì)，編碼的脂酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示，含有2個(gè)內(nèi)含子。它由3個(gè)外顯子組成，分別位于 bea 基因簇上 2，452-3，054，3，117-3，986，4，042-4，533 堿基處；orf4位于bea基因簇5，226-7, 165個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1，635個(gè)堿基對(duì)，編碼M^a 的幾丁質(zhì)酶，其氨基酸序列如序列表中序列5所示，含有6個(gè)內(nèi)含子。它由7個(gè)外顯子組成，分別位于 bea 基因簇上 5，226-5，470，5，522-6，142，6，195-6，315，6，367-6，454， 6，504-6，653，6，701-6，962，7，018-7，162 堿基處；orf5位于bea基因簇7，517-8，632個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1，116個(gè)堿基對(duì)，編碼371aa 的鋅-依賴的金屬蛋白酶，其氨基酸序列如序列表中序列6所示；orf6位于bea基因簇10，169_13，032個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為2，061個(gè)堿基對(duì)，編碼686aa的胞壁酸酶(可能參與裂解細(xì)胞壁功能)，其氨基酸序列如序列表中序列7所示，含有5個(gè)內(nèi)含子。它由4個(gè)外顯子組成，分別位于bea基因簇上10，169-10, 635， 10，689-11，386，11，962-12，388，12，520-12，943，12，988-13，029 堿基處。5)白僵菌素合成簇上膜蛋白基因orf 11位于bea基因簇36，749-37，擬8個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1,0 個(gè)堿基對(duì)，編碼342aa的膜蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列14所示， 可能參與中間代謝產(chǎn)物或前體物的運(yùn)輸?shù)?，含?個(gè)內(nèi)含子。它由2個(gè)外顯子組成，分別位于 bea 基因簇上 36，752-37，268，37，320-37，828 堿基處。6)白僵菌素合成簇其他功能未知蛋白，即orf2，orf7，orf8，orf9和orfl3共五個(gè)基因orf2位于bea基因簇1，396-2, 088個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為693個(gè)堿基對(duì)，編碼230aa的乙酰轉(zhuǎn)移酶，其氨基酸序列如序列表中序列3所示；orf7位于bea基因簇15，201-16, 378個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1，125個(gè)堿基對(duì)，編碼 374aa的未知功能蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列8所示，含有1個(gè)內(nèi)含子。它由2個(gè)外顯子組成，分別位于bea基因簇上15，201-15，730，15，784-16，375堿基處；orf8位于bea基因簇16，467-17，272個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為708個(gè)堿基對(duì)，編碼的短鏈型還原酶，其氨基酸序列如序列表中序列9所示，含有2個(gè)內(nèi)含子。它由3個(gè)外顯子組成，分別位于 bea 基因簇上 16，470-16，647，16，696-16，978，17，029-17, 272 堿基處；orf9位于bea基因簇18，293-18, 847個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為555個(gè)堿基對(duì)，編碼I^aa 的未知功能蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列10所示；orfl3位于bea基因簇42，373-43, 979個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1，440個(gè)堿基對(duì)，編碼 479aa的胺氧化酶，其氨基酸序列如序列表中序列16所示，含有2個(gè)內(nèi)含子。它由3個(gè)外顯子組成，分別位于 bea 基因簇上 42，373-42，653，42，705-43，328，43，383-43，947 堿基處。二、可育鐮刀菌(Fusarium proliferate)LF061白僵菌素合成相關(guān)基因簇的功能1、白僵菌素產(chǎn)生菌鐮刀菌LF061遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立選定fpBeas基因上1. 5kb A2和部分M2部分序列作為敲除靶區(qū)基因，設(shè)計(jì)敲除靶區(qū)的上下游序列的引物。其中，B-HRSlF 和 B-HRS 1R(B_HRS1F :5，-GGTCTTAAUCGTCGTCTCGT CTCACCT-3，和 B-HRS IR :5，-GGCATTAAUCCGCCTTGTCAATCTCAC-3，)擴(kuò)增敲除靶區(qū)的上游序列；B-HRS2F 和 B-HRS2R(B-HRS2F :5’ -GGACTTAAUGCCACGAAACTCATCTCA-3’ 和 B-HRS2R :5’ -GGGTTTAAUTGCTGTTCCACCTCACTCT-3，)擴(kuò)增敲除靶區(qū)的下游序列。聚合酶使用PfuTurbo CxHotstart DNA polymerase,94 °C 5min,94°C 30s,59°C lmin,72°C 1. 5min,72°C IOmin, ^CyCleS，l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為分別獲得l，46;3bp的敲除靶區(qū)的上游序列，將其命名為B-HRS1，其核苷酸序列如序列表中序列17所示；1，562bp的敲除靶區(qū)的下游序列，將其命名為B-HRS2，其核苷酸序列如序列表中序列18所示。將上述PCR基因片段 B-HRSl和B-HRS2與經(jīng)過(guò)I^acI和Nt. BbvCI限制性內(nèi)切酶雙酶切處理的pRF_HU2克隆載體 (公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專利文獻(xiàn)是=FrandsenRJN, Andersson JA, Kristensen MB, Giese H(2008)Efficient four fragment cloning for theconstruction of vectors for targeted gene replacement in filamentous fungi. BMC MolecularBiology 9 :70.)進(jìn)行 USER 連接反應(yīng)，體系如B_HRS1 5 μ L, B-HRS2 5 μ L, PRF-HU2(Pacl/Nt. BbvCI)7 μ L, USER enzyme mix(NEB)1 μ L，10 X Taq buffer 2 μ L。37°C 反應(yīng)20min，25°C繼續(xù)反應(yīng)20min，建議PCR儀器上進(jìn)行。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-Tl感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)CD501)，分別以B-HRS1F/B-HRS1R和B-HRS2F/B-HRS2R引物，利用菌落PCR方法篩選含有插入片段(B-HRS1和B-HRS2)的fpBeas敲除載體的陽(yáng)性克隆子，fpBeas敲除載體的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖5，并送中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果顯示菌落PCR產(chǎn)物DNA序列與fpBeas基因上
11B-HRSl和B-HRS2序列一致，說(shuō)明敲除載體構(gòu)建正確，將其命名為pRF-HU2-fpBeas，見(jiàn)圖6。將含有fpBeas基因敲除載體pRF-HU2_fpBeas轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌A. tumefaciens AGL (公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專利文獻(xiàn)是=Murata H，Sunagawa M, Yamazaki T, Shishido K, Igasaki T(2006)Expression of the autofluorescent protein,DsRed2,inthe recombinants of the ectomycorrhizal basidiomycete,Suillus grevillei, generated byAgrobacterium-mediated transformation. Mycorrhiza 16(6) 407-412.)。制備農(nóng)桿菌AGL-I的感受態(tài)細(xì)胞，加入1 μ g質(zhì)粒pRF_HU2-fpBeas混勻后，冰浴 30min。后置液氮中速凍5min，37°C熱激5min，冰上放置anin。加入ImL YEB液體搖勻，置 ^°C，150rpm搖床培養(yǎng)池；涂布于含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素的YEB抗性平板上，培養(yǎng)2-3天。同樣，分別以B-HRS1F/B-HRS1R和B-HRS2F/B_HRS^引物，利用菌落 PCR方法篩選含有插入片段(B-HRS1和B-HRS2)的fpBeas敲除載體的農(nóng)桿菌陽(yáng)性克隆子。 將已轉(zhuǎn)入目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL-I的農(nóng)桿菌單克隆接種到4mL YEB液體中(含Kan和利福平分別為50 μ g/mL)，于，250rpm搖床，過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)液12000rpm離心2min，并用 IMAS (2. 5XMM salts，80mL，葡萄糖0. 36g，50%甘油20mL，加水定容到192mL，高壓滅菌后， 加入IM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES，pH5. 3)和乙酰丁香酮(AS)至終濃度40mM和200 μ Μ。 搖床震蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)，最終0D_值在0. 6 0. 8之間。同時(shí)，從培養(yǎng)7-15天左右的PDA 平板上刮去適量的鐮刀菌LF061孢子到ImL無(wú)菌的0. 05%吐溫20溶液中，渦旋分散。收集孢子，用ImL無(wú)菌生理鹽水(w/v 0. 85% NaCl)重懸孢子，重復(fù)洗滌一次。用適量生理鹽水重懸孢子，濃度IO5 IO6個(gè)孢子/mL。將上述農(nóng)桿菌懸液100 μ L和鐮刀菌LF061孢子懸液 100 μ L混勻，涂布于IMAS平板，27°C共培養(yǎng)2天。最后，將共培養(yǎng)物用2_3mL無(wú)菌水洗滌，涂布于含有50 μ g/mL潮霉素和300 μ g/mL噻孢霉素的M-100平板上吹干，27°C培養(yǎng)篩選，待生長(zhǎng)5-6天后挑選生長(zhǎng)比較迅速的菌落轉(zhuǎn)移到M-100平板上進(jìn)行第二次篩選。二次篩選后的M-100平板上能長(zhǎng)出來(lái)的菌落視為疑似轉(zhuǎn)化子，分別挑取少量菌絲或菌塊，于25°C搖床 200rpm培養(yǎng)2-3天后，抽提基因組驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)化成功。用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的引物對(duì)HygU/ HygL (HygU :5，-AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-3，和 HygL :5，-GCGCGTCTGCTGCTCCATACAA-3，)， PCR擴(kuò)增都能獲得588bp的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因片段，說(shuō)明鐮刀菌LF061轉(zhuǎn)化成功。2、基因阻斷突變菌株的獲得與分子鑒定ATMT轉(zhuǎn)化共獲得130個(gè)潮霉素(Hyg)抗性克隆子，經(jīng)過(guò)2次傳代后仍然保持HvgK抗性，隨機(jī)挑取20個(gè)克隆子用潮霉素抗性基因特異引物擴(kuò)增能擴(kuò)增出潮霉素抗性基因，并測(cè)序驗(yàn)證。同時(shí)，發(fā)酵結(jié)果顯示選擇的30個(gè)突變株，40%的突變子發(fā)酵BEA產(chǎn)量比野生株LF061高出5_40倍產(chǎn)量，8株無(wú)白僵菌素產(chǎn)生，其他突變子BEA 產(chǎn)量降低或變化不大。從突變子中挑選ml和m2，PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3_5天提取基因組DNA，野生株LF061(W)基因組作為對(duì)照。四對(duì)PCR引物為分子鑒定用引物，其中 HygU/HygL(序列如上)用于擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，gene-Tl/gene-T〗 (gene-Tl 5，-GCACAGCCCAGGACATCA-3，和 gene_T2 :5，-CGCCGCAGGAACTGTAAG-3，)擴(kuò)增 fpBeas 基因內(nèi)部靴區(qū)序列(敲除的基因序列)。geneT3/RFl (geneT3 5，-GCAGCTTGTTGGCGTTGGTGTCAT-3， 和RFl :5，-AAATTTTGTGCTCACCGCCTGGAC-3，)擴(kuò)增敲除靶區(qū)上游區(qū)，可鑒定敲除質(zhì)粒插入 B-HRSl 區(qū)；geneT4/RF2(geneT4 :5， -TCTCCTTGCATGCACCATTCCTTG-3，和 RF2 5，-CCCGGGACTGAAGAGGAACGAATT-3，)可擴(kuò)增敲除靶區(qū)下游區(qū)，可鑒定敲除質(zhì)粒插入B-HRS2區(qū)，其中RFl和RF2為pRF-HU2質(zhì)粒上設(shè)計(jì)引物。如圖7所示，突變子ml和m2用HygU/HygL引物都能擴(kuò)增出片段，而野生株 LF061 (W)基因組做為模板卻不能擴(kuò)增得到片段；同時(shí)，gene-Tl/gene-T2在W、ml和m2中都能擴(kuò)增出520bp大小的基因片段，說(shuō)明靶區(qū)序列并未被敲除。geneT3/RFl以ml基因組DNA 為模板能擴(kuò)增出1. 91Λ基因片段，與理論擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一致，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步測(cè)序表明1. 91Λ基因片段是質(zhì)粒PRF-HU2部分序列和fpBeas基因部分序列的雜合體，而m2和野生株W均不能擴(kuò)增出任何片段。geneT4/R2引物在突變子ml、m2和LF061中均不能擴(kuò)增出基因片段， 說(shuō)明突變子ml在左側(cè)臂(B-HRSl)同源整合，為單交換。而m2為異位整合，即整合到LF061 基因組上其他位置。3、白僵菌素發(fā)酵、產(chǎn)物分離純化將鐮刀菌突變子ml和m2從M-100平板上接種到PDA平板上生長(zhǎng)5天，同時(shí)接種 LF061野生株(W)。待菌長(zhǎng)滿平板后，取其菌絲，用無(wú)菌去離子水配成濃度為IX IO5的菌懸液，確定突變株(ml和m2)與出發(fā)野生株LF061孢子濃度一致。每個(gè)250mL的三角瓶中放入20g玉米粒，加入12mL蒸餾水，封口，浸泡4小時(shí)。在121°C滅菌30min，冷卻備用。每瓶加入2mL上述菌懸液，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)10天。結(jié)束發(fā)酵后，用15mL的 86%乙腈浸泡過(guò)夜，離心取上清。HPLC分析條件HPLC分析采用Agilent 1100RP-HPLC平臺(tái)，色譜柱為ZORBAX SB C18，4.6謹(jǐn)Χ150_，5μπι;流動(dòng)相為80%甲醇(溶于水)；流速為 lmL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm ；標(biāo)準(zhǔn)品為白僵菌素(beauvericin)(購(gòu)自Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為 B7510)；標(biāo)準(zhǔn)品的的保留時(shí)間為IOjmin ；突變株(m2)與野生株LF061(W)中的白僵菌素的保留時(shí)間為10.5min。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明(見(jiàn)圖8)，ml喪失白僵菌素產(chǎn)生能力，與對(duì)照野生株W相比，m2保留微弱的白僵菌素產(chǎn)生能力，具體分子機(jī)制未知。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列13所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列13的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與白僵菌素合成相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3) 中任一所述的基因1)序列表中序列1第27，092位到36，504位所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
4.一種白僵菌素合成相關(guān)的蛋白質(zhì)系統(tǒng)，是由如下1)至15)中15種蛋白質(zhì)組成的1)其氨基酸序列為序列表中的序列2或在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列2限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；2)其氨基酸序列為序列表中的序列3或在序列表中序列3所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列3限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；3)其氨基酸序列為序列表中的序列4或在序列表中序列4所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列4限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；4)其氨基酸序列為序列表中的序列5或在序列表中序列5所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列5限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；5)其氨基酸序列為序列表中的序列6或在序列表中序列6所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列6限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；6)其氨基酸序列為序列表中的序列7或在序列表中序列7所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列7限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；7)其氨基酸序列為序列表中的序列8或在序列表中序列8所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列8限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；8)其氨基酸序列為序列表中的序列9或在序列表中序列9所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列9限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；9)其氨基酸序列為序列表中的序列10或在序列表中序列10所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列10限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；10)其氨基酸序列為序列表中的序列11或在序列表中序列11所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列11限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；11)其氨基酸序列為序列表中的序列12或在序列表中序列12所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列12限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；12)其氨基酸序列為序列表中的序列13或在序列表中序列13所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列13限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；13)其氨基酸序列為序列表中的序列14或在序列表中序列14所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列14限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；14)其氨基酸序列為序列表中的序列15或在序列表中序列15所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列15限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)；15)其氨基酸序列為序列表中的序列16或在序列表中序列16所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與白僵菌素合成相關(guān)的由序列16限定的蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。
5.編碼權(quán)利要求4所述蛋白系統(tǒng)的基因簇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因簇，其特征在于所述基因簇為如下1)或2)或3)的DNA 分子1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼白僵菌素合成相關(guān)蛋白系統(tǒng)的DNA分子；3)與1)的基因具有90%以上的同源性，且編碼白僵菌素合成相關(guān)蛋白系統(tǒng)的DNA分子。
7.—種重組載體，為將序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列插入到出發(fā)載體上，得到的含有序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列 18所示核苷酸序列作為上下游同源臂的重組載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其特征在于所述出發(fā)載體為PRF-HU2克隆載體。
9.一種制備產(chǎn)白僵菌素能力降低的基因工程菌的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求7或8所述的重組載體導(dǎo)入能生產(chǎn)白僵菌素的真菌中，即得到產(chǎn)白僵菌素能力降低的基因工程菌；所述能生產(chǎn)白僵菌素的真菌為可育鐮刀菌(Fusarium proIiferatum)LFO61。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法制備得到的基因工程菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了白僵菌素合成相關(guān)蛋白質(zhì)系統(tǒng)及其編碼基因簇與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列13所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列13的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與白僵菌素合成相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的與白僵菌素生物合成相關(guān)蛋白質(zhì)系統(tǒng)及其編碼基因簇可以幫助人們理解羧酸肽家族天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)制，為進(jìn)一步遺傳改造提供了材料和知識(shí)。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來(lái)尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/57GK102532286SQ20111032203
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者劉金濤, 張濤, 張立新, 賈曉鵬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所