專利名稱：一種苯酚降解菌及其轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用一種野生型苯酚降解菌轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán)的方法。
背景技術(shù)：
靛藍(lán)是一種廣泛用于食品、醫(yī)藥、印染和化妝品等行業(yè)的古老色素，其化學(xué)合成的合成原料、催化劑、中間產(chǎn)物等均具有一定的毒性，給人和環(huán)境造成危害。1983年Ensley等人開始采用生物法合成靛藍(lán)，1986年Mermod N等將降解甲苯、二甲苯或甲苯其他衍生物的Pseudomonas putida mt_2的TOL質(zhì)粒pffffO克隆到Escherichiacoli K-12，獲得的基因工程菌能催化吲哚直接生成3-羥基吲哚從而生成靛藍(lán)。利用野生菌合成靛藍(lán)的報(bào)道較少，1997年Doukyu等利用假單胞菌ST-200的加氧酶在兩相系統(tǒng)中進(jìn)行生物合成靛藍(lán)，當(dāng)加入體積分?jǐn)?shù)為20%的二苯甲烷時(shí)，假單胞菌對吲哚的最大耐受量為4 mg/mL，靛藍(lán)的生成量僅為5μ8/ιΛ;1997年Allen CCR等發(fā)現(xiàn)Rhodococcus sp. NCIMB 12038也能利用某種酶(可能是單加氧酶)催化卩引哚合成靛藍(lán)，文中主要探討了菌株NCMB12038合成靛藍(lán)的獨(dú)特現(xiàn)象和其可能的靛藍(lán)合成機(jī)制，沒有提到靛藍(lán)的產(chǎn)量產(chǎn)率等問題。現(xiàn)有的關(guān)于制備靛藍(lán)的研究，涉及的酶資源較為單一，主要集中在萘雙加氧酶、甲苯雙加氧酶、苯乙烯單加氧酶和P450酶等，而且實(shí)際應(yīng)用研究有限；大多數(shù)的研究都是利用基因工程技術(shù)調(diào)取相關(guān)合成基因進(jìn)行重組，構(gòu)建工程菌，關(guān)于利用野生型菌株合成靛藍(lán)的研究較少，忽視了自然界原生菌株合成靛藍(lán)的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一種降解苯酚的野生菌，以及采用該苯酚降解菌轉(zhuǎn)化吲哚得到靛藍(lán)類色素物質(zhì)的方法，實(shí)現(xiàn)生物法制備靛藍(lán)，產(chǎn)物濃度較高。本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的。一種能有效催化吲哚合成靛藍(lán)的苯酚降解微生物菌株，它是蒙氏假單胞菌QM(Pseudomonas monteilii QM)，保藏編號為 CGMCC No. 5054。用苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM催化卩引哚合成靛藍(lán)的方法,其特征在于包含以下步驟(I)利用苯酌·誘導(dǎo)Pseudomonas monteilii QM菌在培養(yǎng)基中生長10 14小時(shí)至對數(shù)末期，然后離心分離，經(jīng)PH值為7. O 7. 5、濃度為O.1 O. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌制備菌懸浮；(2)在菌懸液中加入吲哚(吲哚用丙酮溶解)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化以制備靛藍(lán)，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中Pseudomonas monteilii QM菌的細(xì)胞干重濃度為O.1 10g/L,卩引哚濃度為25 200mg/L，在20 40°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速在50 300r/min，振蕩反應(yīng)I 8小時(shí)。
上述生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最佳參數(shù)為Pseudomonas monteilii QM菌的細(xì)胞干重濃度為4. O 8. Og/L,吲哚濃度為25 75mg/L，溫度為25 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，振蕩反應(yīng)時(shí)間為3 5小時(shí)。Pseudomonas monteilii QM菌是用濃度梯度法從大連理工大學(xué)校園土壤樣品中分離篩選獲得的。采集土壤樣品后，在富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)到以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基中馴化。通過逐步減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分直至混合菌液可以以苯酚為唯一的碳源生長，反復(fù)進(jìn)行平板涂布，最終分離得到能以苯酚為唯一碳源生長的蒙氏假單胞菌；在該菌株的菌液中加入吲哚，它能將吲哚轉(zhuǎn)化生成靛藍(lán)。該野生菌適宜在中性及偏堿性(pH 7. O 8.0)的培養(yǎng)介質(zhì)中生長，適合生長溫度為30 35°C，能在多種培養(yǎng)基上生長(如M9培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基)，在固體培養(yǎng)基上呈無色透明的圓形小點(diǎn)，表面光滑，邊緣整齊，易挑起。細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征革蘭氏陰性桿菌，無鞭毛，大小約為(O. 3-0. 5) ymX (1-3) μ m。通過擴(kuò)增該菌株的16S rDNA，得到了長度為1451bp的16S rDNA全序列。應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST進(jìn)行相似性分析，結(jié)果表明該菌株的16S rDNA序列與GenBank中Pseudomonas monteilii的很多菌株序列相似性高達(dá)99%,確定該菌株屬于蒙氏假單胞菌,命名為Pseudomonas monteilii QM,其保藏號為CGMCC NO. 5054。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)前的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)按下述條件進(jìn)行首先將菌株QM接種到固體培養(yǎng)基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂15_20g/L，調(diào)pH至7. O 7. 2)上培養(yǎng)，即平板活化種子，再將其接種到液體M9培養(yǎng)基(Na2HPO4 · 12H20 17. lg/L、KH2PO4 3. 0g/L、NH4Cl1. 0g/L、NaCl 0.5g/L、FeCl3 0. 00075g/L、lg/L 葡萄糖，2mmol/L MgS04)中，在 20 40 °C, 50 300r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 16小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；然后按體積百分比I 2%的接種量接入液體M9培養(yǎng)基中(添加100 200mg/L的苯酚作誘導(dǎo)劑)振蕩培養(yǎng)，待菌體生長10 14小時(shí)進(jìn)入對數(shù)末期，離心收集菌體，經(jīng)pH值為7. O 7. 5、濃度為0.1
0.2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其濃度達(dá)到0.1 10g/L(換算成干重)。其中細(xì)胞干重按離心法測定將待測培養(yǎng)液放入離心管中，反復(fù)作離心、清水洗滌三次后，進(jìn)行105°C干燥12小時(shí),然后稱重。制備種液過程也可以采用富集培養(yǎng)基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，調(diào)pH 至 7. O 7. 2)或無機(jī)鹽培養(yǎng)基((NH4)2SO4 2g/L、KH2PO41. 3g/L，、Na2HPO4 · 12H20 2g/L、苯酌· lOOmg/L)。本發(fā)明的苯酚降解菌對吲哚的轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，且具有廣泛的底物廣譜性，能轉(zhuǎn)化一系列的吲哚衍生物合成相應(yīng)的色素。本發(fā)明的苯酚降解菌生物轉(zhuǎn)化吲哚生成靛藍(lán)的方法反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，產(chǎn)物濃度高，可達(dá)到42. 5mg/L,生產(chǎn)周期短，成本低，提取步驟簡單，生產(chǎn)清潔，適合工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用。


圖1為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)選定其他參數(shù)時(shí),靛藍(lán)濃度隨Pseudomonas monteiliiQM菌的細(xì)胞干重濃度變化的曲線。圖2為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)選定其他參數(shù)時(shí)，靛藍(lán)濃度隨反應(yīng)時(shí)間變化的曲線。
圖3為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)選定其他參數(shù)時(shí)，靛藍(lán)濃度隨吲哚濃度變化的曲線。本發(fā)明涉及的苯酚降解菌的生物保藏信息保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號、中國科學(xué)院微生物研究所，日期為 2011年 7 月 12 日，編號 CGMCC NO. 5054，分類命名為Pseudomonas monteilii。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1,采用苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物轉(zhuǎn)化卩引哚生產(chǎn)靛藍(lán)，并考察部分參數(shù)對靛藍(lán)濃度的影響。苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM的擴(kuò)大培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化卩引哚生產(chǎn)靛藍(lán)的步驟和參數(shù)如下1、將苯酌·降解菌Pseudomonas monteilii QM菌株接種到固體平板LB培養(yǎng)基(酵母粉 5g/L、蛋白胨 10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂 15_20g/L，調(diào) pH 至 7. O 7. 2)上，于 37°C靜置培養(yǎng)2天，4°C冰箱保存，作為平板活化種子；2、用步驟I所得的平板活化種子，接種到液體M9培養(yǎng)基中(Na2HPO4 · 12H20 17.1g/L、KH2PO4 3. 0g/L、NH4Cl1. 0g/L、NaCl 0. 5g/L、FeCl3 0. 00075g/L、lg/L 葡萄糖，2mmol/LMgS04)，在20 40°C，50 300r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 16小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；該步驟也可以采用富集培養(yǎng)基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L)或無機(jī)鹽培養(yǎng)基((NH4)2SO4 2g/L、KH2PO41. 3g/L，、Na2HPO4 · 12H20 2g/L、苯酚 lOOmg/L)制備種子培養(yǎng)液。3、使用步驟2所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比I 2%的接種量接入添加了100 200mg/L苯酚液體的 M9培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長至對數(shù)期末期，即10 14小時(shí)后，離心收集菌體，經(jīng)pH值為7. O 7. 5、濃度為0.1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其干重濃度為6g/L。4、制備吲哚/丙酮溶液(0.1g吲哚溶于ImL丙酮)，然后用濾膜過濾除菌，吲哚/丙酮溶液中吲哚濃度為lX105mg/L ； 5、在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonasmonteilii QM菌，步驟4制備的吲哚/丙酮溶液10 μ L，使反應(yīng)液中吲哚的濃度為50mg/L，在30°C下，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，振蕩反應(yīng)5小時(shí)。高效液相色譜(HPLC)測定靛藍(lán)產(chǎn)量反應(yīng)結(jié)束時(shí)，上清液用三氯甲烷萃取，并用0. 22 μ M的有機(jī)濾膜過濾，利用Prominenece LC-20A高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，流速1.OmL/min,進(jìn)樣量為10 μ L，柱溫為40°C;其中流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為超純水，0_20min用60-75 %的流動(dòng)相A和40-25 %的流動(dòng)相B梯度淋洗，20_25min用60 %的流動(dòng)相A和40 %的流動(dòng)相B清洗，35min時(shí)停止清洗。其中靛藍(lán)檢測波長為289nm，測得靛藍(lán)濃度為42. 50mg/L0生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)不同參數(shù)變化對靛藍(lán)濃度影響的實(shí)驗(yàn)當(dāng)其他參數(shù)采用本實(shí)施例的數(shù)值時(shí),靛藍(lán)濃度隨Pseudomonas monteiliiQM菌細(xì)胞濃度變化、隨反應(yīng)時(shí)間變化、隨吲哚濃度變化的曲線分別如圖1、圖2、圖3所示。實(shí)施例2,苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物轉(zhuǎn)化卩引哚生產(chǎn)靛藍(lán)。
步驟I 4同實(shí)施例1,控制步驟3制得的擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonas monteiliiQM菌干重濃度為4. Og/L。在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonas monteiliiQM菌，步驟4制備的吲哚/丙酮溶液15μ L，使反應(yīng)液中吲哚的濃度為75mg/L，35°C下、300r/min振蕩6小時(shí)。按實(shí)施例1所述的測量方法，測得靛藍(lán)濃度為35. 24mg/L。實(shí)施例3,苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物轉(zhuǎn)化卩引哚生產(chǎn)靛藍(lán)。步驟I 4同實(shí)施例1,控制步驟3制得的擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonas monteiliiQM菌干重濃度為8. 0g/L。在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonas monteiliiQM菌，步驟4制備的吲哚/丙酮溶液20 μ L，使反應(yīng)液中吲哚的濃度為100mg/L，40°C下、250r/min振蕩反應(yīng)8小時(shí)。按實(shí)施例1所述的測量方法，測得靛藍(lán)濃度為31. 20mg/L。實(shí)施例4,苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物轉(zhuǎn)化卩引哚生產(chǎn)靛藍(lán)。步驟I 4同實(shí)施例1,控制步驟3制得的擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonas monteiliiQM菌干重濃度為0. lg/L。在50mL的錐形瓶中 加入20mL步驟3制得的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonasmonteilii QM菌，步驟4制備的吲哚/丙酮溶液5 μ L，使反應(yīng)液中吲哚的濃度為25mg/L，25°C下、50r/min振蕩反應(yīng)2小時(shí)。按實(shí)施例1所述的測量方法，測得靛藍(lán)濃度為0. 24mg/L。實(shí)施例5,苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物轉(zhuǎn)化卩引哚生產(chǎn)靛藍(lán)。步驟I 4同實(shí)施例1,控制步驟3制得的擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonas monteiliiQM菌干重濃度為10. 0g/L。在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的擴(kuò)大培養(yǎng)后的Pseudomonas monteiliiQM菌，步驟4制備的吲哚/丙酮溶液40 μ L，使反應(yīng)液中吲哚的濃度為200mg/L，20°C下、100r/min振蕩反應(yīng)I小時(shí)。按實(shí)施例1所述的測量方法，測得靛藍(lán)濃度為8. 50mg/L。
權(quán)利要求
1.一種能有效催化吲哚合成靛藍(lán)的苯酚降解微生物菌株，它是蒙氏假單胞菌QM(Pseudomonas monteilii QM)，保藏編號為 CGMCC No. 5054。
2.用苯酹降解菌Pseudomonasmonteilii QM催化Π引哚合成靛藍(lán)的方法,其特征在于包含以下步驟 (1)利用苯酌■誘導(dǎo)Pseudomonasmonteilii QM菌在培養(yǎng)基中生長10 14小時(shí)至對數(shù)末期，然后離心分離，經(jīng)PH值為7. O 7. 5、濃度為O.1 O. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌制備菌懸浮； (2)在菌懸液中加入吲哚進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化以制備靛藍(lán)，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中Pseudomonas monteilii QM菌的細(xì)胞干重濃度為O.1 10g/L,卩引哚濃度為25 200mg/L,在20 40°C溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速在50 300r/min，振蕩反應(yīng)I 8小時(shí)。
3.如權(quán)利要求2所述的用苯酹降解菌Pseudomonasmonteilii QM催化卩引哚合成靛藍(lán)的方法，其特征在于，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，Pseudomonas monteilii QM菌的細(xì)胞干重濃度為4.O 8. Og/L，吲哚濃度為25 75mg/L，溫度為25 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min,振蕩反應(yīng)時(shí)間為3 5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用一種野生型苯酚降解菌轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán)的方法。其特征在于，采用一種能有效催化吲哚合成靛藍(lán)的苯酚降解微生物菌株，它是蒙氏假單胞菌QM(Pseudomonas monteilii QM)，保藏編號為CGMCC No.5054；生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)液中Pseudomonas monteilii QM菌的細(xì)胞干重濃度為0.1～10g/L，吲哚濃度為25～200mg/L，在20～40℃溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速在50～300r/min，振蕩反應(yīng)1～8小時(shí)。本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物濃度高，可達(dá)到42.5mg/L，生產(chǎn)周期短，成本低，提取步驟簡單，生產(chǎn)清潔，適合工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用。
文檔編號C12N1/20GK103060218SQ201110317698
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者曲媛媛, 馬橋, 許炳雯, 張旭旺, 李新亮, 周豪, 孔春雷, 曹湘禹, 周集體, 沈娥 申請人:大連理工大學(xué)