專(zhuān)利名稱(chēng)：一株降解烷烴功能菌、其培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株能降解烷烴的功能菌、其培養(yǎng)方法及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，微生物治理廢水的研究和利用越來(lái)越被人們重視。傳統(tǒng)的活性污泥法處理廢水利用的是自然的或是經(jīng)過(guò)一定馴化的微生物菌群，任其自然降解，污染物的降解速率不高，已不能適應(yīng)當(dāng)今越來(lái)越多的工業(yè)廢水種類(lèi)。目前國(guó)際上興起的生物強(qiáng)化(Bioaugmentation)是以提高生物處理過(guò)程的穩(wěn)定性和污染物處理效率為目的的新興技術(shù)，針對(duì)傳統(tǒng)生物處理技術(shù)部能有效降解有毒有害的污染物，利用現(xiàn)代生物技術(shù)選育優(yōu)勢(shì)菌種、構(gòu)建基因工程菌，突破了過(guò)去傳統(tǒng)生物處理反應(yīng)器的微生物菌種靠生活污泥進(jìn)行培養(yǎng)或馴化的低效模式，通過(guò)直接投加高效菌種，有選擇的將有害物質(zhì)去除，使環(huán)境形成一個(gè)有益的良性循環(huán)過(guò)程，所花費(fèi)的成本也會(huì)大大降低。因此，環(huán)境生物菌劑的研制是目前污水環(huán)境生物處理技術(shù)最具發(fā)展?jié)摿Φ姆较蛑弧?br> 國(guó)際上許多環(huán)境生物技術(shù)成果已進(jìn)入商品化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。生物技術(shù)是水污染控制中最成熟也是最富有挑戰(zhàn)性的技術(shù)，在國(guó)外的環(huán)保產(chǎn)業(yè)中——直是市場(chǎng)占有量最大的。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，新污染治理的需要，新技術(shù)、工藝設(shè)備不斷出現(xiàn)并產(chǎn)業(yè)化，美國(guó)在此領(lǐng)域內(nèi)的年市場(chǎng)額達(dá)數(shù)百億美元，數(shù)十項(xiàng)環(huán)境生物技術(shù)產(chǎn)品已獲得有關(guān)國(guó)家政府部門(mén)的許可。并進(jìn)行野外應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。美國(guó)還成立了相當(dāng)數(shù)量的環(huán)境生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)公司，部分產(chǎn)品已占領(lǐng)了國(guó)際市場(chǎng)。而生物強(qiáng)化技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題是微生物生產(chǎn)成本過(guò)高，作為活菌制劑的生產(chǎn)要獲得高收率、高活力的菌液十分不易，難以大批量生產(chǎn)。而用一般發(fā)酵工藝生產(chǎn)，發(fā)酵液中的菌體濃度仍較低，難以獲得理想效果。因而現(xiàn)有技術(shù)極大的限制了該項(xiàng)技術(shù)的推廣和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺點(diǎn)和不足，提供一株降解烷烴的功能菌、其培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。
該菌株為短狀桿菌屬(Brachybacterium Collins)，菌株基本生物學(xué)特性不規(guī)則桿狀，有時(shí)形成球，革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，好氧。菌落成淺黃色，不產(chǎn)芽孢，生長(zhǎng)溫度20-50℃，PH 5-9，從葡萄糖，麥芽糖產(chǎn)酸，還原NO3--NO2-。該菌株已經(jīng)提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC NO1262，保藏日期為2004年12月8日。
本發(fā)明中涉及的菌株是從煉油廠污泥中分離純化得到的，經(jīng)實(shí)踐證明，對(duì)煉油廢水中的烷烴，COD降解能力很強(qiáng)，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基配方的研制和發(fā)酵條件的探索，在不降低該菌的降解性能的條件下，菌液的發(fā)酵密度可達(dá)1013個(gè)/mL.為生產(chǎn)降解石油廢水的微生物菌劑提供了一種高密度發(fā)酵工藝。
本發(fā)明菌株的液體發(fā)酵工藝包括菌種活化、搖瓶種子培養(yǎng)、發(fā)酵和處理石油廢水等步驟(一)菌種活化斜面與搖瓶液體培養(yǎng)基牛肉膏0.1-1％蛋白胨0.1-1％NaCl 0.1-0.5％
水100g固體培養(yǎng)基加0.5-1.5％瓊脂用接種環(huán)從冷凍保藏的菌種斜面培養(yǎng)基上取少許菌種，接種至新配制的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，從而對(duì)冷藏的菌種進(jìn)行活化以利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
(二)搖瓶種子培養(yǎng)從活化的菌種斜面培養(yǎng)基上取少許菌種，接種至裝有已滅菌的液體培養(yǎng)基100mL的三角瓶(250mL)中，在35℃、145r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)18小時(shí)。
(三)發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方玉米粉0.2-0.8％MgSO4.7H2O 0.2-0.8％豆餅粉0.2-1.0％。
煉油廢水 適量豆油 0.1-0.2％調(diào)節(jié)PH值為6-7發(fā)酵罐在接種前和投料前分別滅菌，可用121℃/0.11Mpa滅菌30分鐘，培養(yǎng)基冷卻至35℃時(shí)接種，接種量為1-10％，培養(yǎng)溫度為30-40℃，攪拌轉(zhuǎn)速為＞200r/min，通氣量＞1∶1.2v.v.m(每分鐘單位體積培養(yǎng)基含同體積空氣量)，發(fā)酵至10小時(shí)，可適量的補(bǔ)加碳源和氮源，發(fā)酵時(shí)間為16-20小時(shí)，活菌數(shù)達(dá)1013個(gè)/mL，可停止發(fā)酵。
(四)將菌液在無(wú)菌條件下進(jìn)行灌裝，低溫保存。
制備的產(chǎn)品主要指標(biāo)為活菌數(shù)大于100億個(gè)/g；pH＝6-7
本菌株應(yīng)用方法為在含有長(zhǎng)鏈烷烴(C10-C20)的含油廢水中，廢水COD＝0-3000，pH值＝5-9中，按照10％(菌液活菌數(shù)大于100億個(gè)/mL)比例接種上述培養(yǎng)制得的菌液，采用間歇換水的方式，待掛膜后再在進(jìn)水中逐漸增加含油廢水的比重，直至進(jìn)水全部為含油廢水為止，通過(guò)爆氣水中溶解氧含量3-4mg/L。即可對(duì)含油廢水進(jìn)行處理。
本發(fā)明的優(yōu)越之處(1)工藝簡(jiǎn)單，工藝路線短.
(2)發(fā)酵液光密度高，活菌數(shù)可達(dá)1013個(gè)/mL。
(3)在培養(yǎng)基中加入石油廢水，發(fā)酵后不降低菌株的降解性能。
(4)發(fā)酵所得菌劑對(duì)石油廢水處理效果顯著。
具體實(shí)施例方式測(cè)定廢水的各種理化指標(biāo)，COD值采用重鉻酸鉀法測(cè)定，正十六烷采用氣相色譜法測(cè)定。
1將高溫滅菌處理(121℃、30分鐘)過(guò)的固體培養(yǎng)基定量備用，固體培養(yǎng)基的配方為牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、水100g、瓊脂1.5％。
2預(yù)制菌種并將預(yù)制好的含降解烷烴菌種接種至滅菌固體培養(yǎng)基中活化備用。
3進(jìn)行菌種擴(kuò)增將活化后的菌種接種至液體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、水100g)，中振蕩(35℃，160轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)菌液0.5L。
4在10L種子罐中配制6L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為玉米粉0.8％，MgSO4.7H2O0.8％，豆餅粉1.0％，煉油廢水75％，豆油0.2％。在121℃/0.11Mpa壓力下滅菌30分鐘。
5將擴(kuò)增培養(yǎng)菌液0.5L接種至10L種子罐開(kāi)始發(fā)酵，控制PH在6(10％NaOH調(diào)節(jié))，培養(yǎng)溫度35℃(以冷卻循環(huán)水控制)，攪拌轉(zhuǎn)速在400r/min，通氣量1∶1(v.v.m)條件下培養(yǎng)16-18小時(shí)，既可移種至發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)，此時(shí)種子罐發(fā)酵液菌量達(dá)1011個(gè)/mL，停止發(fā)酵。
6將菌液在無(wú)菌條件下進(jìn)行灌裝，低溫保存。
7使用方法在SBR反應(yīng)器中按10％加入量加入菌液，采用間歇換水的方式，每天換水2次，待掛膜后再在進(jìn)水中逐漸增加煉油廢水的比重，直至進(jìn)水全部為煉油廢水為止，同時(shí)做只加活性污泥和空白(不加活性污泥和菌液)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定后連續(xù)處理5天，每天測(cè)定出水的COD值和正十六烷含量，處理效果如下表所示

由上表可知，處理5天后加入菌液的處理效果最好，COD去除率最高。

由上表可知，加入菌液的煉油廢水中正十六烷含量由進(jìn)水56mg/L降為0.06mg/L。
權(quán)利要求
1.一株降解烷烴功能菌，為短狀桿菌屬(Brachybacterium Collins)，于2004年12月8日提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC NO1262；菌株不規(guī)則桿狀，有時(shí)形成球，革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，好氧。菌落成淺黃色，不產(chǎn)芽孢，生長(zhǎng)溫度20-50℃，PH 5-9，從葡萄糖，麥芽糖產(chǎn)酸，還原NO3--NO2-。。
2.權(quán)利要求1所述的降解烷烴功能菌的放大培養(yǎng)包括采用下述培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化、搖瓶種子培養(yǎng)牛肉膏0.1-1％，蛋白胨0.1-1％，NaCl0.1-0.5％，水100g，優(yōu)選為牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、水100g，搖瓶種子培養(yǎng)條件為35℃、145r/min和18小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)采用培養(yǎng)基玉米粉0.2-0.8％，MgSO4.7H2O0.2-0.8％，豆餅粉0.2-1.0％，煉油廢水適量，豆油0.1-0.2％，調(diào)節(jié)PH值為6-7，優(yōu)選為培養(yǎng)基配方為玉米粉0.8％，MgSO4.7H2O 0.8％，豆餅粉1.0％，煉油廢水75％，豆油0.2％。
3.權(quán)利要求2中所述菌種活化和搖瓶種子培養(yǎng)所用培養(yǎng)基可以加入加0.5-1.5％瓊脂作為固體培養(yǎng)基。
4.權(quán)利要求2中所述發(fā)酵培養(yǎng)方法為培養(yǎng)基冷卻至35℃時(shí)接種，接種量為1-10％，培養(yǎng)溫度為30-40℃，攪拌轉(zhuǎn)速為＞200r/min，通氣量＞1∶1.2v.v.m每分鐘單位體積培養(yǎng)基含同體積空氣量，發(fā)酵至10小時(shí)，可適量的補(bǔ)加碳源和氮源，發(fā)酵時(shí)間為16-20小時(shí)，活菌數(shù)達(dá)1013個(gè)/mL。
5.權(quán)利要求1所述的降解烷烴功能菌的使用方法在含有C10-C20長(zhǎng)鏈烷烴的含油廢水中，廢水COD＝0-3000，pH值＝5-9中，按照10％比例接種菌液，采用間歇換水的方式，待掛膜后再在進(jìn)水中逐漸增加含油廢水的比重，直至進(jìn)水全部為含油廢水為止，通過(guò)爆氣水中溶解氧含量3-4mg/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)保領(lǐng)域。針對(duì)目前石油廢水處理中存在的問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一株降解烷烴的功能菌、其培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。本發(fā)明菌株從煉油廠污泥中分離純化得到，為短狀桿菌屬(Brachybacterium Collins)，采用放大發(fā)酵培養(yǎng)后得到的菌液處理含有C
文檔編號(hào)C02F3/02GK1789408SQ20041008150
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者嚴(yán)平, 李旭東, 楊俊仕, 廖銀章 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所