專利名稱：一種將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過化學(xué)誘導(dǎo)將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
楊樹以其物種豐富、分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、生長迅速、基因組較小、遺傳轉(zhuǎn)化較易等特點(diǎn)，已作為林木中的模式物種(Bradshaw et al. ,2000 ；Brunner et al.，2004)，在生理生化、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域開展廣泛研究。2006年美國能源部完成楊樹全基因組測(cè)序計(jì)劃(Tuskan et al.)，為楊樹甚至林木功能基因組研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，是林木基礎(chǔ)性研究的一大突破，并且對(duì)林木育種和改良產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。目前為止，已有多種基于分子和基因組水平的研究技術(shù)成功運(yùn)用于楊樹，如基因組測(cè)序、EST庫的收集、芯片技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等(Jansson and Douglas 2007)。其中，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法已成為研究楊樹基因功能的最普遍且行之有效的技術(shù)。但是由于轉(zhuǎn)化效率較低、獲得轉(zhuǎn)基因植株周期長等因素，限制該技術(shù)對(duì)楊樹基因功能進(jìn)行大規(guī)模地篩選和分析。因此，我們需要尋找一種簡便、快捷的方法來更高效地研究基因功能。在植物中，原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)分析系統(tǒng)可簡便、高效地分析植物基因的功能 (Sheen2001)。植物原生質(zhì)體已去除細(xì)胞壁，是一個(gè)以細(xì)胞為基礎(chǔ)的，可供廣泛研究的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。另外，通過多種手段可將像DNA、RNA和蛋白質(zhì)等大分子轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中，這些手段包括PEG融合、電穿孔和顯微注射等。這樣，植物中的信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑和轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制可被瞬時(shí)操控，以此來研究植物的自主調(diào)節(jié)和響應(yīng)(Yoo et al. 2007) 0這一系統(tǒng)已在擬南芥、玉米(Sheen 2001)、煙草(Locatelli et al. 2003)、藜科植物(Lung et al. 2010)、胡椒 (Jeon et al. 2007)等植物中應(yīng)用，但是在楊樹中該平臺(tái)還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用PEG-Ca2+將外源基因高效轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，以便于更有效地篩選和分析楊樹基因的功能。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，使用纖維素酶和果膠酶將楊樹葉肉酶解成原生質(zhì)體，所得到的原生質(zhì)體經(jīng)分離、純化和預(yù)處理后，利用PEG-Ca2+將含有外源基因的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體中，經(jīng)培養(yǎng)，使外源基因在原生質(zhì)體中表達(dá)。本發(fā)明中所述的瞬時(shí)表達(dá)載體通常為含有外源目的基因、小于IOlAp的過量表達(dá)載體質(zhì)粒，該質(zhì)粒通常攜帶植物3 啟動(dòng)子和終止子，以便于植物中表達(dá)。利用PEG-Ca2+將含有外源基因的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體中，經(jīng)培養(yǎng)，使外源基因在原生質(zhì)體中表達(dá)。上述方法具體包括如下步驟
(1)酶液的制備將 15-25mM pH 為 5. 7 的 MES、0. 4-0. 8M 甘露醇、18_22mM KCl 和水混合，70°C水浴3-5min ；再加入8_M0U/ml纖維素酶(即每ImL反應(yīng)液中加入10-M0U纖維素酶)和5-20U/ml果膠酶(即每ImL反應(yīng)液中加入5-20U果膠酶)，55°C水浴5-15min ； 用冰降至室溫，然后加入8-12mM CaCl2和0. 05g/100ml-0. lg/100ml BSA，混勻，過濾滅菌，(2)楊樹原生質(zhì)體的制備采用繼代后生長較好的楊樹組培苗，選取上部完全展葉的2-3片較嫩的葉片，切得盡量的細(xì)，用鋒利的刀片切成葉條，并去除中脈，放入步驟(1) 制得的酶液中浸透兩面，28°C黑暗中靜置酶解2- ，靜置前可于黑暗中抽真空半小時(shí)；(3)原生質(zhì)體收集和純化將步驟( 酶解后的物料加入預(yù)冷的等體積的W5溶液，用200目細(xì)胞篩或75 μ m的濾膜過濾到圓底管中，圓底管放入冰中，使其保持低溫狀態(tài)；700-1200rpm 4°C低溫離心3_9min ；吸除上清，沉淀加入l_2ml的W5溶液，輕輕混勻， 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算稀釋成4-10*105/ml時(shí)所需溶液的體積X ；在黑暗條件下冰上放置 0. 5-1. 5h，使原生質(zhì)體基本靜置于管底，吸除上清；加入X體積的MMG溶液，輕輕重懸，若立即使用則置于室溫，若保存則置于3-6°C ；(4)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化在EP管中加入10-20 μ g含有外源基因的質(zhì)粒，質(zhì)粒體積為A ； 再加入步驟(3)得到的約4-10*104個(gè)原生質(zhì)體，體積為B ；最后加入體積為A+B的PEG-Ca2+ 溶液，輕輕混勻，室溫孵育12-18min，孵育結(jié)束后加入4倍體積以上的W5溶液，混勻； 800-1500rpm水平離心2_10min，吸除上清；在圓底管中加入200ul_lml WI溶液，25_28°C弱光培養(yǎng)15-4 1。步驟(3)或(4)中，所述的W5溶液配方為2mM pH為5. 7的MES，154mM NaCl， 125mM CaCl2, 5mM KC1，溶劑為水，2248°C保存。步驟(3)中，所述的MMG溶液配方為4mM pH為5. 7的MES，0. 3-0. 5M甘露醇，15mM MgCl2，溶劑為水，2248°C保存。步驟中，所述的 PEG-Ca2+溶液配方為20_40g/100ml PEG4000,0. 2-0. 4M 甘露醇、IOOmM CaCl2，溶劑為水。PEG-Ca2+溶液一般現(xiàn)配現(xiàn)用，應(yīng)在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)開始前1小時(shí)配好， 使其慢慢溶解，用45 μ m的膜過濾滅菌。步驟中，所述的WI溶液配方為4mM pH為5. 7的MES，0. 4M_0. 8M甘露醇、20mM KCl，溶劑為水，室溫保存。步驟(4)中，所述的含有外源基因的質(zhì)粒為含有外源目的基因，小于IOlAp的過量表達(dá)載體質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶植物啟動(dòng)子和終止子，以便于植物中表達(dá)。在目的基因片段的前段或后端可含有紅色或綠色熒光報(bào)告基因，hyc、HA、GST、His標(biāo)簽等質(zhì)粒載體。常用質(zhì)粒有p2HAGW7. 0，p2GWF7. 0，p2FGW7. 0，p2RGW7. 0，p2GWR7. 0，pFRKl: : Iuc 等。本發(fā)明適用于楊樹組培苗，例如NL895、214、T89、毛果楊等。本發(fā)明不局限于某種基因或者某種質(zhì)?；蛘吣撤N具體的楊樹品種，本發(fā)明方法適用于將所有外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。有益效果本發(fā)明方法構(gòu)建得到楊樹原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，易于操作和實(shí)現(xiàn)，為開展楊樹功能基因研究開辟廣闊天地，該方法的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)70%。


權(quán)利要求
1.一種將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，利用 PEG-Ca2+將含有外源基因的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體中，經(jīng)培養(yǎng)，使外源基因在原生質(zhì)體中表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)酶液的制備將15-25mM pH為5. 7的MES、0. 4-0. 8M甘露醇、18_22mM KCl和水混合，70°C水浴3-5min ；再加入8_M0U/ml纖維素酶和5_20U/ml果膠酶，55°C水浴5_15min ； 用冰降至室溫，然后加入8-12mM CaCl2和0. 05g/100ml-0. lg/100ml BSA，混勻，過濾滅菌，(2)楊樹原生質(zhì)體的制備采用繼代后的楊樹組培苗，選取上部完全展葉的2-3片較嫩的葉片，用鋒利的刀片切成葉條，并去除中脈，放入步驟(1)制得的酶液中浸透兩面，28°C 黑暗中靜置酶解2- ；(3)原生質(zhì)體收集和純化將步驟( 酶解后的物料加入預(yù)冷的等體積的W5溶液， 用200目細(xì)胞篩或75 μ m的濾膜過濾到圓底管中，圓底管放入冰中，使其保持低溫狀態(tài); 700-1200rpm 4°C低溫離心3-9min ；吸除上清，沉淀加入l_2ml的W5溶液，輕輕混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算稀釋成4-10*105/ml時(shí)所需溶液的體積X ；在黑暗條件下冰上放置 0. 5-1. 5h，使原生質(zhì)體基本靜置于管底，吸除上清；加入X體積的MMG溶液，重懸，若立即使用則置于室溫，若保存則置于3-6°C ；(4)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化在EP管中加入10-20μ g含有外源基因的質(zhì)粒，質(zhì)粒體積為A ；再加入步驟⑶得到的約4-10*104個(gè)原生質(zhì)體，體積為B ；最后加入體積為A+B的PEG-Ca2+ 溶液，輕輕混勻，室溫孵育12-18min，孵育結(jié)束后加入4倍體積以上的W5溶液，混勻； 800-1500rpm水平離心2-10min，吸除上清；在圓底管中加入200ul_lml WI溶液，2548°C弱光培養(yǎng)15-4 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，步驟O)中，靜置酶解前，酶液浸透后，置于黑暗中抽真空半小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，步驟⑶或中，所述的W5溶液配方為2mM pH為5. 7的MES，154mM NaCl，125mM CaCl2, 5mM KC1，溶劑為水，2248°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的MMG溶液配方為4mM pH為5. 7的MES，0. 3_0. 5M甘露醇，15mM MgCl2，溶劑為水，2248°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的PEG-Ca2+溶液配方為20-40g/100ml PEG4000，0. 2_0. 4M甘露醇、 IOOmM CaCl2，溶劑為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，步驟中，所述的WI溶液配方為4mM pH為5. 7的MES，0. 4M-0. 8M甘露醇、20mM KCl，溶劑為水，室溫保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，步驟⑷中，所述的含有外源基因的質(zhì)粒為含有外源目的基因，小于IOlAp的過量表達(dá)載體質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶植物3 啟動(dòng)子和終止子，以便于植物中表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于，所述的楊樹原生質(zhì)體為楊樹組培苗的原生質(zhì)體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將外源基因轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的方法，利用PEG-Ca2+將含有外源基因的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入楊樹原生質(zhì)體中，經(jīng)培養(yǎng)，使外源基因在原生質(zhì)體中表達(dá)。本發(fā)明方法構(gòu)建得到楊樹原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，易于操作和實(shí)現(xiàn)，為開展楊樹功能基因研究開辟廣闊天地，該方法的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)70％。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102373235SQ20111031483
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者徐立安, 潘惠新, 王光萍, 王明庥, 胥猛, 譚碧玥, 陳英, 黃敏仁 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)