專利名稱：轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻pcr-dhplc檢測引物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測，特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻品系的PCR-DHPLC檢測弓I物及檢測方法。
背景技術(shù)：
目前對轉(zhuǎn)基因水稻的檢測方法主要采用常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR-基因芯片等檢測方法。傳統(tǒng)的常規(guī)PCR檢測方法在平臺(tái)擴(kuò)展方面具有一定的局限性，隨著待檢目標(biāo)的增加，需要對體系中的每套引物的用量及比例重新進(jìn)行優(yōu)化，并且兼顧擴(kuò)增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常采用的凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，區(qū)分效率不高，檢測結(jié)果不理想。實(shí)時(shí)熒光PCR雖然在檢測靈敏度等方面較多重常規(guī)PCR檢測方法有優(yōu)勢，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時(shí)提供互不干擾的4個(gè)熒光通道，也限制了該技術(shù)在檢測通量擴(kuò)展。常規(guī)的多套PCR-基因芯片檢測方法，操作步驟繁瑣，并不適·合大規(guī)模的高通量檢測。變性高效液相色譜技術(shù)(Denaturing High-performance LiquidChromatography, DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有擴(kuò)展性強(qiáng)、分辨率好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該方法在50°C條件下分析樣品，樣品峰的洗脫只由堿基對的數(shù)量決定洗脫順序，當(dāng)過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會(huì)根據(jù)分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與marker比較確定分子量大小，判定是否含有目標(biāo)檢測基因。目前，尚沒有轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR結(jié)合DHPLC的檢測技術(shù)(PCR-DHPLC)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測的引物。本發(fā)明的另一目的是提供一種基于上述引物的擴(kuò)展性能好、靈敏度和分辨率高的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測的引物，所述引物的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5，-CTTTTCTGGCTGTCTCGGCT-3’Seq ID No. 2 :5’ -AGGCGGTGAAGGGCAATC-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2是與轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的檢測靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對的特異序列，具有很強(qiáng)的特異性識別性。進(jìn)一步的，所述上游引物的5’端還包括Seq ID No. 3所示序列，所述下游引物的5’端還包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4是分別在上游引物和下游引物的5 ’端添加的與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)的一段序列，該序列可以是與檢測靶標(biāo)序列同源性很遠(yuǎn)的其它物種的序列，也可以是一段隨機(jī)生成的序列。該序列可以用于調(diào)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，以便于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的進(jìn)一步分析。本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游引物具有Seq ID No. 5所示序列，下游引物具有SeqID No. 6所示序列；
Seq ID No. 5 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTCTTTTCTGGCTGTCTCGGCT-3’Seq ID No. 6 :5，_CTCAGCGGCGGAGCTACAGAAGGCGGTGAAGGGCAATC_3，。需要說明的是，所述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6序列是由上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2序列分別在其5’端添加調(diào)控序列而成，盡管上述已經(jīng)說明Seq ID No. 3和SeqID No. 4所示調(diào)控序列可以是隨機(jī)生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具體到本發(fā)明中，需要考慮調(diào)控序列與Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示序列的理化性質(zhì)的統(tǒng)一協(xié)調(diào)，并且還需要考慮添加調(diào)控序列后的Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示序列作為檢測引物的整體性能。本發(fā)明還公開了一種用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測方法，所述檢測方法包括采用上述引物，以水稻DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。進(jìn)一步的,所述檢測方法還包括以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對。優(yōu)選的上述檢測方法包括如下步驟(A)采用所述引物，以水稻DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(B)以步驟(A)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為樣品進(jìn)行DHPLC分析，同時(shí)以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DHPLC分析；(C)將步驟⑶中樣品的DHPLC分析結(jié)果與marker的DHPLC分析結(jié)果進(jìn)行比較，確定樣品的分子量大小，從而判斷是否含有檢測的靶標(biāo)序列。由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測引物具有較強(qiáng)的特異性，能夠用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增以及DHPLC分析。本發(fā)明針對傳統(tǒng)的電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果不理想的問題，將PCR與DHPLC相結(jié)合，提供了一種操作簡便、擴(kuò)展性能好、靈敏度和靈敏度高的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測方法。利用DHPLC對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，對不同大小的PCR產(chǎn)物片段區(qū)分率可達(dá)數(shù)個(gè)堿基，甚至能夠區(qū)分出I個(gè)堿基大小差異的片段。本發(fā)明的引物和檢測方法為轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部11使用。


圖為本發(fā)明實(shí)施例中DHPLC分析的部分結(jié)果；圖中自上而下的曲線分別標(biāo)記為M、l-15，M為marker、l為非轉(zhuǎn)基因水稻DNA、2為Bt63DNA、3為轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1DNA、4為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號DNA、5為轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017DNA、6為轉(zhuǎn)基因玉米品系Btl76DNA、7為轉(zhuǎn)基因玉米BtllDNA、8為轉(zhuǎn)基因玉米M0N863DNA、9為大豆品系A(chǔ)2704-12DNA、10為大豆品系A(chǔ)5547_12DNA、11為非轉(zhuǎn)基因油菜DNA、12為轉(zhuǎn)基因棉花LLcotton25DNAU3為非轉(zhuǎn)基因棉花DNA、14為土豆EH92-527-1DNA、15為水對照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公布了用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測的引物，該引物針對轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的特異序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。進(jìn)一步的，還在引物的上游和下游分別添加了一段與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)或者同源性很遠(yuǎn)的調(diào)控序列，用于實(shí)現(xiàn)對擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小的調(diào)控。需要指出的是，所述調(diào)控序列的加入只是為了獲得更優(yōu)異的檢測效果，因此，本發(fā)明優(yōu)選的，用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR結(jié)合DHPLC技術(shù)檢測的引物是加入了調(diào)控序列的引物，分別具有Seq ID No. 5至Seq ID No. 6所示序列。本發(fā)明還公開了一種用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測方法，所述檢測方法包括采用所述引物，以水稻DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。進(jìn)一步的，所述檢測方法還包括以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，從而判斷是否含有檢測的靶標(biāo)序列。本發(fā)明中，所述引物擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC洗脫峰為337bp?！は旅嫱ㄟ^具體實(shí)驗(yàn)例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)驗(yàn)例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例I DNA提取 采用CTAB法提取樣品DNA，具體如下a)稱取樣品5g，在研缽中加入液氮研磨至樣品呈O. 5mm左右大小的粉末；b)稱取300mg磨碎的樣品，迅速轉(zhuǎn)入2mL離心管中，加65°C預(yù)熱的CTAB提取液700 μ L，混勻，放入65°C水浴鍋中水浴30min ；c)力口 5 μ L RNase (10mg/mL)，37°C 水浴 30min ；d)加入等體積Tris飽和酹,充分混勻，12000r/min離心15min ；e)取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇(24 I)混勻，12000r/min離心15min ；f)取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇(24 I)混勻，12000r/min離心15min ；g)加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖晃，置于_20°C冰箱靜置30min，12000r/min離心15min ；h)棄上清,加70%乙醇500 μ L, 12000r/min離心3min,去上清,重復(fù)2次；i)得到DNA沉淀，用冷凍干燥儀進(jìn)行干燥，加入50 μ L 100 μ L TE或無菌去離子水，充分溶解后，測量DNA的純度和濃度后置于_20°C冰箱中保存。實(shí)施例2 DNA濃度測定對提取的樣品DNA進(jìn)行濃度和純度測定；采用紫外分光光度計(jì)測定260nm和280nm處吸收值，分別計(jì)算核酸的純度和濃度，計(jì)算公式如下DNA 純度=0D260/0D280DNA 濃度=50 X 0D260mg/mLDNA的純度比值在I. 7 L 9之間，濃度大于IOng/μ L。實(shí)施例3 PCR擴(kuò)增根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻設(shè)計(jì)特異性檢測引物的結(jié)合位點(diǎn)，并在特異性檢測引物結(jié)合位點(diǎn)的5’端添加調(diào)控序列，合成含有調(diào)控序列的檢測引物(表1)，采用添加調(diào)控序列的上/下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣品設(shè)置包括非轉(zhuǎn)基因水稻DNA、Bt63DNA、轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1DNA、轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號DNA、M0N88017DNA、轉(zhuǎn)基因玉米品系Btl76DNA、轉(zhuǎn)基因玉米BtllDNA、轉(zhuǎn)基因玉米M0N863DNA、大豆品系A(chǔ)2704-12DNA、大豆品系A(chǔ)5547-12DNA、非轉(zhuǎn)基因油菜 DNA、LLcotton2roNA、非轉(zhuǎn)基因棉花 DNA、土豆 EH92-527-1DNA以及水對照。表I轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測引物結(jié)合位點(diǎn)及引物
權(quán)利要求
1.用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻PCR-DHPLC檢測的引物，其特征在于所述引物的上游引物含有Seq ID No. I所示序列,下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5’ -CTTTTCTGGCTGTCTCGGCT-3’Seq ID No.2 :5， -AGGCGGTGAAGGGCAATC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物，其特征在于所述上游引物的5’端還包括SeqID No. 3所示序列，所述下游引物的5’端還包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No.4 :5， -CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于所述上游引物具有SeqID No. 5所示序列，下游引物具有Seq ID No. 6所示序列；Seq ID No.5 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTCTTTTCTGGCTGTCTCGGCT-3’Seq ID No.6 :5’ _CTCAGCGGCGGAGCTACAGAAGGCGGTGAAGGGCAATC_3’。
4.一種用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測方法，其特征在于所述檢測方法包括采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的引物，以水稻DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于所述檢測方法還包括以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法，所述引物具有較強(qiáng)的特異性，能夠用于多重PCR擴(kuò)增以及DHPLC分析。所述檢測方法提供了一種操作簡便、擴(kuò)展性能好、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測方法。利用DHPLC對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，其片段大小區(qū)分率可達(dá)數(shù)個(gè)堿基，分辨率高。本發(fā)明的引物和檢測方法為轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部門使用。
文檔編號C12N15/11GK102952858SQ201110248310
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者章桂明, 向才玉, 凌杏園, 潘廣, 程穎慧, 康林, 李鶴遙 申請人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心