專利名稱：豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒。
背景技術：
豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒CTransmissible gastroenteritis virus,TGEV)是引起仔豬腹瀉的主要腸道病毒， 二者均屬冠狀病毒科、冠狀病毒屬的病毒，單鏈正股RNA病毒，都能造成腸絨毛的萎縮或變短，均有類似的傳染途徑和臨床癥狀，感染豬均表現為水樣腹瀉、嘔吐、脫水及新生仔豬的高死亡率。在全世界范圍內廣泛發(fā)生。由于傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的臨床表現、病理變化、流行病學等方面都非常相似，但兩病原沒有共同的抗原性，不能交互免疫，而又有混合感染，因此給這兩種病的診治和預防帶來了一定困難。診斷這兩種疾病的傳統(tǒng)方法有病毒分離、電鏡檢測、熒光抗體檢測、免疫組織化學法等。雖說上述方法能夠鑒別診斷這兩種病， 但由于實驗方法的限制，導致檢測耗時過長，無法在病毒感染初期進行診斷。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)在PEDV和TGEV檢測方面的應用越來越廣泛，與傳統(tǒng)的方法相比較，RT-PCR方法更加敏感、快速、方便，但步驟繁雜、假陽性較多、缺乏準確定量、靈敏度不夠高等妨礙了 RT-PCR在實際臨床中的應用。1995年美Perkin Elmer公司研制出新的實時熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技術， 從而一舉解決了常規(guī)PCR的諸多不足之外，使PCR技術得到更新和發(fā)展，從而廣泛地應用于臨床以及其它相關核酸的研究。本發(fā)明首次將熒光RT-PCR技術應用于同時檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒檢測領域，提供了針對豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的特異性引物、 探針序列、試劑盒和檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一組特異性強、靈敏度高的同時檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的核苷酸序列，包括引物和探針。本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供快速、準確、使用方便的檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案
本發(fā)明提供了檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的引物和探針，具體如
下
通過序列比較，根據豬傳染性胃腸炎病毒TGEV Miller M6株N基因的序列(GenBank DQ811785)，在其保守區(qū)27832-27938位置設計一對引物及一條探針
1) TGEV 正義引物(TGEV-F) 5，ACAATTCCTTCAGCAGATTAATGC3，(SEQ ID NO 1)；2)TGEV 反義引物(TGEV-R) 5，CCTCTTGCTCTGACCTTTCTG3，(SEQ ID NO 2)；
3)TGEV探針(TGEV-pr。be)5，(J0E)ATGCTCGYCCATCAGAAGTGGCAAA (TAMARA) 3’ (SEQ ID NO :3)，該探針的5，端標記報告熒光基團J0E，3，端標記淬滅熒光基團TAMRA ；
其中，Y代表兼并堿基τ或C ；擴增目的片段為107bp。通過序列比較，根據豬流行性腹瀉病毒PEDV CV777株N基因的序列(GenBank AF353511)，在其保守區(qū)27163-27348位置設計一對引物及一條探針
4)PEDV 正義引物(PEDV-F) 5，AACAAATCCAGGGCCACTT3，(SEQ ID NO 4)；
5)PEDV 反義引物(PEDV-R) 5，TAAACTGGCGATCTGAGCA3，(SEQ ID NO 5)；
6)PEDV 探針(PEDV-probe)
5，(FAM) TCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAAT (TAMARA) 3，(SEQ ID NO :6)，該探針的 5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA ； 擴增目的基因大小為186bp。本發(fā)明還提供了一種豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒，由以下組分組成
1)RNA提取試劑；通?？梢允褂蒙虡I(yè)購買的RNA提取試劑盒或按照常規(guī)方法來提取 RNA，所述的試劑盒例如Qiagen公司的RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini kit, cat. no 52906)；
2)RNA標準品為豬傳染性胃腸炎病毒體外轉錄的RNA片段，其對應的DNA序列為序列表SEQ ID No :9;和豬流行性腹瀉病毒體外轉錄的RNA片段，其對應的DNA序列為序列表 SEQ ID No 12 ；
3)實時定量RT-PCR反應液，其包括含有dNTP的RT-PCR緩沖液，TaqDNA聚合酶，反轉錄酶，熒光定量PCR參比染料；檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，檢測豬流行性腹瀉病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，
優(yōu)選為1X含有dNTP的RT-PCR緩沖液，檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正義引物0. 2μΜ、 反義引物0. 和熒光探針0. 4μΜ，檢測豬流行性腹瀉病毒的正義引物0. 2μΜ、反義引物 0. 2μΜ和熒光探針0. 4μΜ，Taq DNA聚合酶2U，反轉錄酶5U，1 X熒光定量PCR參比染料；
進一步地，所述含有dNTP的RT-PCR緩沖液為One Step RT-PCR Buffer，購自Takra， 貨號 DRR064，其組成為 dNTP，5mM ；MgCL2,5mM ；KCl,80mM ；Tris-HCl，20mM ；0. 2% Triton X-100。所述反轉錄酶為PrimeScriptTMRT Enzyme Mix II購于大連寶生物公司(Takra)，貨號DRR064，所述Taq DNA聚合酶可以是TaKafei Ex TaqTM HS，購自大連寶生物公司(Takra)， 貨號DRR064。所述熒光定量PCR參比染料為ROX Reference Dye所述熒光定量PCR參比染料為ROX Reference Dye購自大連寶生物公司，貨號DR0X01，所述引物和探針均委托大連寶生物公司合成；
4)陰性對照=DEPC水；
5)DEPC水；ImLx2管，自來水兩次蒸餾，經過Millipore純水儀純化，電阻率大于 18. OM Ω · CM。其中，檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正義引物為序列表SEQ ID No 1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No :2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No 3 所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團J0E，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA ；檢測豬流行性腹瀉病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :4所示的核苷酸序列，反義引物為序列表 SEQ ID No :5所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :6所示的核苷酸序列，其5’ 端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA。本發(fā)明還提供了一種豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒的使用方法
1.樣品采集、運送及制備
具有腹瀉癥狀的豬場，用50mL離心管收集腹瀉物，置于4°C保鮮盒中，運送回實驗室。 腹瀉糞便用0. OlM PBS液稀釋成10%的懸液，4000rpm離心20 min，取上清140 μ L。-70°C 凍存?zhèn)溆谩?. RNA 提取
按照QIAGEN Viral RNA Mini試劑盒提供的方法提取病毒RNA，具體方法如下
(1)取560μ 1緩沖液AVL移入到1. 5ml離心管中；
(2)加入140μ 1細胞毒，在漩渦振蕩器上混勻(1 )，室溫(15°C -20°C)放置10分鐘后瞬離；
(3)加入560μ 1無水乙醇，在漩渦振蕩器上混勻(1 ),開蓋前瞬離；
(4)小心取出630μ 1上述混合物，轉移至柱子(事先放進2ml收集管中)，8000rpm離心 lmin，棄去收集管，把柱子放進新的2ml收集管；
(5)重復步驟4)；
(6)小心打開柱子，加入500μ 1緩沖液AWl，8000rpm離心lmin，棄去收集管，把柱子放進新的2ml收集管；
(7)小心打開柱子，加入500μ 1緩沖液AW2，14000rpm離心;3min，棄去收集管，把柱子放進新的2ml收集管，繼續(xù)HOOOrpm離心Imin ；
(8)把柱子放進1.5ml離心管(無RNA酶)中，棄去收集管，小心打開蓋子，加入60μ 1 緩沖液AVE，蓋上蓋子，室溫放置lmin，8000rpm離心lmin，棄去柱子，1. 5ml離心管中即為
病毒RNA。3.實時定量RT-PCR反應
96孔PCR板，第一排12孔作為標準曲線和陰性對照孔，其余為樣品檢測孔。反應體系為20 μ L，見表1 表權利要求
1.一組檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的核苷酸引物和探針，其特征在于，所述核苷酸引物和探針為序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :6，其中序列SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO :2分別為檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO 3為檢測豬傳染性胃腸炎病毒的熒光探針，序列SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5分別為檢測豬流行性腹瀉病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO :6為檢測豬流行性腹瀉病毒的熒光探針。
2.根據權利要求1所述的檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的核苷酸引物和探針，其特征在于所述探針SEQ ID NO 3的5，端標記報告熒光基團J0E，3，端標記淬滅熒光基團TAMRA。
3.根據權利要求1所述的檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的核苷酸引物和探針，其特征在于所述探針SEQ ID NO 6的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA。
4.一種豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒，其特征在于，由以下組分組成1)RNA提取試劑；2)RNA標準品為豬傳染性胃腸炎病毒體外轉錄的RNA片段，其對應的DNA序列為序列表SEQ ID No :9;和豬流行性腹瀉病毒體外轉錄的RNA片段，其對應的DNA序列為序列表 SEQ ID No 12 ；3)實時定量RT-PCR反應液，其包括含有dNTP的RT-PCR緩沖液，檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，檢測豬流行性腹瀉病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，Taq DNA聚合酶，反轉錄酶，熒光定量PCR參比染料；4)陰性對照=DEPC水；5)DEPT/K ；其中，檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :1所示的核苷酸序列， 反義引物為序列表SEQ ID No :2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :3所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團J0E，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA ；檢測豬流行性腹瀉病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :4所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No :5所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :6所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA。
5.根據權利要求4所述的豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述RNA提取試劑為RNA提取試劑盒。
6.根據權利要求4所述的豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述實時定量RT-PCR反應液包括1 X含有dNTP的RT-PCR緩沖液，檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正義引物0. 2μΜ、反義引物0. 和熒光探針0. 4μΜ，檢測豬流行性腹瀉病毒的正義引物0. 2μΜ、反義引物0. 2μΜ和熒光探針0. 4μΜ, Taq DNA聚合酶2U，反轉錄酶5U， IX熒光定量PCR參比染料。
7.根據權利要求6所述的豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述含有dNTP的RT-PCR緩沖液為One Step RT-PCR Buffer，所述熒光定量PCR 參比染料為ROX Reference Dye，所述7 ^ DNA聚合酶為T1^faTfe Ex Tagm HS，所述反轉錄酶為 PrimeScript RT Enzyme Mix II。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒。所述檢測用引物和探針為序列表SEQIDNO1至SEQIDNO6，其中序列SEQIDNO1和SEQIDNO2分別為檢測豬傳染性胃腸炎病毒的正義引物和反義引物，序列SEQIDNO3為檢測豬傳染性胃腸炎病毒的熒光探針，序列SEQIDNO4和SEQIDNO5分別為檢測豬流行性腹瀉病毒的正義引物和反義引物，序列SEQIDNO6為檢測豬流行性腹瀉病毒的熒光探針。本發(fā)明還提供了豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒。本發(fā)明所選引物和探針特異性非常強，在豬腹瀉物中所提取的病毒總RNA不需要先轉錄成cDNA，cDNA第一鏈的合成與雙重PCR一步完成，且一次能檢測兩種病毒，提高效率。
文檔編號C12N15/11GK102277454SQ20111024054
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權日2011年8月22日
發(fā)明者劉鄧, 徐麗華, 李軍星, 王一成, 袁秀芳 申請人:浙江省農業(yè)科學院