專利名稱：鋅指核酸酶定點(diǎn)敲除Myostatin基因特異靶位點(diǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鋅指核酸酶定點(diǎn)敲除Myostatin基因特異靶位點(diǎn)。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)是以Cre/LoxP系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過(guò)同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。目前為止，雖然利用此技術(shù)已成功制備出多種基因敲除動(dòng)物模型，但實(shí)驗(yàn)工作量大、周期時(shí)間長(zhǎng)、成功率低等缺點(diǎn)一直制約著傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)應(yīng)用。傳統(tǒng)基因敲除的效率約為萬(wàn)分之一，甚至更低。鋅指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)是一種由鋅指蛋白和R)kl核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域重組形成的嵌合蛋白，其中鋅指蛋白可特異性結(jié)合目的靶序列，F(xiàn)okI核酸內(nèi)切酶則負(fù)責(zé)對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性剪切。當(dāng)兩個(gè)ZFN分別結(jié)合到位于DNA的雙鏈上間隔5 至7個(gè)堿基的目的靶序列后，可形成二聚體，進(jìn)而激活R)kl核酸內(nèi)切酶的功能，使DNA在特定位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂，再通過(guò)同源重組或非同源末端連接修復(fù)斷裂雙鏈。ZFN能夠?qū)Π谢蜻M(jìn)行定點(diǎn)斷裂，顯著提高同源重組效率，是一種高效的新型基因打靶技術(shù)，已應(yīng)用于多種動(dòng)植物的基因靶向敲除。ZFN技術(shù)不僅在生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，更因其不需向基因組中引入外源序列而在臨床醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響，提供合適靶位點(diǎn)，可合成出作用靶位點(diǎn)的表達(dá)鋅指核酸酶的質(zhì)粒。豬MSTN(Myostatin)基因?qū)趋兰〉纳L(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控作用。因此，對(duì)于定點(diǎn)敲除 MSTN基因的研究成為研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA分子。本發(fā)明提供的DNA分子，為如下(1)或⑵或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能相關(guān)蛋白的 DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列1由32個(gè)核苷酸組成。含有所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述的DNA分子、所述的重組載體在抑制MSTN基因表達(dá)或?qū)е翸STN功能喪失中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。含有所述DNA分子的表達(dá)鋅指核酸酶的質(zhì)粒在抑制MSTN基因表達(dá)或?qū)е翸STN功能喪失中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述MSTN的核苷酸序列為序列表中的序列4。所述抑制MSTN基因表達(dá)或?qū)е翸STN功能喪失通過(guò)改變MSTN的編碼框體現(xiàn)。所述改變MSTN的編碼框體現(xiàn)在MSTN編碼框的定點(diǎn)敲除、突變和/或定點(diǎn)插入。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明定位了 MSTN基因中一段特異的靶序列位點(diǎn)DNA片段， 并針對(duì)此特異位點(diǎn)構(gòu)建ZFN質(zhì)粒，將此質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞可以定點(diǎn)敲除或突變MSTN基因中特異的靶序列，并徹底破壞MSTN基因的表達(dá)。本發(fā)明的顯著優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在針對(duì)MSTN序列中特異的靶序列位點(diǎn)構(gòu)建的ZFN質(zhì)?？梢园凑赵O(shè)計(jì)人員的需求精確定點(diǎn)敲除或突變豬胎兒成纖維細(xì)胞中MSTN基因的靶位點(diǎn)序列，基因敲除效率高，能大大提高研究效率，能為研究MSTN基因的功能、制備定點(diǎn)敲除或突變MSTN轉(zhuǎn)基因豬提供保證。


圖1為ZFN的特異結(jié)合位點(diǎn)和特異敲除靶位點(diǎn)序列圖2為ZFN定點(diǎn)敲除MSTN基因載體3為ZFN定點(diǎn)敲除MSTN特異位點(diǎn)原理4為菌液PCR鑒定5為陽(yáng)性克隆定點(diǎn)敲除、突變和插入測(cè)序結(jié)果圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、針對(duì)豬MSTN基因特異靶位點(diǎn)序列ZFN質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建1、針對(duì)豬MSTN基因特異靶位點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)構(gòu)建定點(diǎn)敲除梅山豬MSTN基因靶序列特異位點(diǎn)的鋅脂核酸酶(ZFN)質(zhì)粒pZFN質(zhì)粒，ZFN由一個(gè)DNA結(jié)合域和DNA切割結(jié)構(gòu)域組成，ZFN對(duì)特異識(shí)別結(jié)合彡編碼區(qū)內(nèi)Mbp堿基，保證ZFN切割MSTN基因的高度精確與高效。鋅脂核酸酶(ZFN)特異敲除靶位點(diǎn)序列位于MSTN基因(MSTN的核苷酸序列為序列4)第二外顯子，特異靶位點(diǎn)序列為CCTTCCCAGGAC cagga GAAGATGGGCTGGTA(人工合成， 序列1，序列1為序列4的自5’末端第3770-3801位核苷酸)，具體見圖1所示，兩端部分序列(CCTTCCCAGGAC與GAAGATGGGCTGGTA)是ZFN的特異結(jié)合位點(diǎn)，中間部分序列(cagga) 是ZFN特異敲除的靶序列位點(diǎn)。2、重組質(zhì)粒pZFN的構(gòu)建pZFN質(zhì)粒購(gòu)自sigma公司(為一對(duì)質(zhì)粒)，質(zhì)粒的示意圖為圖2所示，其中ZFN為含有靶位點(diǎn)序列序列1的片段。原理如圖3所示，在MSTN序列上設(shè)計(jì)打靶效率最高的目的敲除位點(diǎn)，鋅指核酸酶能夠識(shí)別并結(jié)合指定的位點(diǎn)，雙體i^okl高效且精確地切斷靶DNA產(chǎn)生雙鏈DNA的斷裂，隨后細(xì)胞通過(guò)“同源定向修復(fù)”或“非同源末端連接” -DNA天然修復(fù)過(guò)程來(lái)治愈靶的斷裂，從而造成MSTN基因切口處特異片段的敲除或在切口處插入突變的堿基序列進(jìn)而對(duì)基因組進(jìn)行定向編輯，改變動(dòng)物的特異性狀。實(shí)施例2、鋅指核酸酶定點(diǎn)敲除MSTN基因1、豬胎兒成纖維原代細(xì)胞分離培養(yǎng)(1)選取懷孕35天的純種梅山妊娠母豬(太倉(cāng)市種豬場(chǎng))作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)手術(shù)方式取出含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌燒杯中，封口膜封口帶入實(shí)驗(yàn)室；(2)在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)將胚胎周圍的包膜剔除，將胚胎放于無(wú)菌的加有PBS的燒杯中；(3)將胚胎逐個(gè)轉(zhuǎn)移至小的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌的剪刀和鑷子去除胚胎的頭、尾及四肢后，將組織剪成Imm3大小的小塊，并加入少許血清使組織濕潤(rùn)；(4)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距約0. 2cm-0. 5cm,小塊涂布好之后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后向瓶?jī)?nèi)加入適量培養(yǎng)基，蓋好瓶塞，放置于37°C培養(yǎng)箱中；(5)培養(yǎng)約8小時(shí)，待小塊貼壁后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿 80%左右即可凍存或傳代。2、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)從液氮中取出裝有梅山豬胎兒成纖維細(xì)胞的凍存小管，立即投入37°C的溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解；在anin內(nèi)完成復(fù)溫；將細(xì)胞懸液移入無(wú)菌的離心管，加入 5mL培養(yǎng)液，輕輕吹勻；將細(xì)胞懸液lOOOr/min離心5min，棄上清；向含有細(xì)胞沉淀的離心管加入ImL完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入適量的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。3、細(xì)胞培養(yǎng)條件及傳代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基組成成分DMEM (Invitrogen catalog no. 11965-092)10%>20% FBS(Invitrogen catalog no. 8114318)PS (Invitrogen catalog no.15140)IXMEM NEAA (Invitrogen catalog no. 11140—050)IXHT Supplement (Invitrogen catalog no. 11067-030)1X Sodium Pyruvate (Invitrogen catalog no.11360-070)2ng/mL bFGF(Human, Recombinant catalog no. 132560029)傳代培養(yǎng)(1)豬的胎兒成纖維細(xì)胞融合率達(dá)約80%左右；(2)吸去培養(yǎng)基，加入 IOmL 預(yù)熱至 37°C 的 DPBS (Invitrogen REF :C14190500BT) 沖洗一遍，吸除DPBS ；(3)加入 2mL 預(yù)熱至 37°C 的胰酶(Invitrogen catalog no. 25200)溶液，室溫消化約3min ；(4)加入2mL培養(yǎng)基(含10% FBS)終止消化，用移液器反復(fù)吹打數(shù)次，至細(xì)胞全部均勻重懸在培養(yǎng)基中；
(5)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，取部分細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余細(xì)胞IOOOg離心 5min ；(6)棄上清，加入2mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分兩份鋪到加有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；(7)晃動(dòng)平皿使細(xì)胞分布均勻后，至37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、核轉(zhuǎn)染方法^ffi Lonza ^^11^ ^ Amaxa Basic Nucleofector Kit for Primary Mammalian Fibroblasts及核轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體操作(1)將核轉(zhuǎn)染溶液(Nucleofector Solution)與添加物(Supplement)(試劑盒中含有)按體積比4.5 1的比例配制核轉(zhuǎn)染溶液室溫預(yù)熱，單個(gè)樣品轉(zhuǎn)染可取82uL核轉(zhuǎn)染溶液加入ISuL添加物配制成IOOuL核轉(zhuǎn)染溶液；(2)六孔板中每孔加入1. 5mL培養(yǎng)基(含20% FBS)，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)執(zhí).
y 、人 (3)純種梅山豬原代成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后傳代2次，至細(xì)胞融合率90% ；(4)吸去培養(yǎng)基，加入IOmL預(yù)熱至37°C的DPBS沖洗一遍，吸除DPBS ；(5)加入2mL預(yù)熱至37°C的1 %胰酶溶液，室溫消化約^iin ；(6)加入2mL含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用移液器反復(fù)吹打數(shù)次，至細(xì)胞全部均勻重懸在培養(yǎng)基中；(7)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，取部分進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余細(xì)胞IOOOg離心 5min ；(8)棄上清液，用微量加樣器出去殘留培養(yǎng)基，加入提前室溫預(yù)熱的核轉(zhuǎn)染溶液， 重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度在ι χ IOfVlOOuL ；(9)向細(xì)胞懸液中加入pZFN質(zhì)粒，使質(zhì)粒濃度為5ug/100uL，輕輕吹吸混勻；(10)打開核轉(zhuǎn)染儀，選擇進(jìn)入已優(yōu)化好的程序(T-016)；(11)將細(xì)胞與質(zhì)粒DNA的混合懸液轉(zhuǎn)移到電擊杯中，注意樣品必須能夠覆蓋電擊杯底部且避免生成氣泡；(12)將電擊杯放入電擊槽中，按enter鍵開始電擊；(13)程序結(jié)束后取出電擊杯，沿電擊杯內(nèi)壁緩緩加入500uL預(yù)熱的培養(yǎng)基，迅速將樣品轉(zhuǎn)移到加有培養(yǎng)基的6孔板中(步驟0))。37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)及篩選工作。5、細(xì)胞總DNA提取按照SIGMA哺乳動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)G1N70)操作說(shuō)明，提取步驟4 得到的培養(yǎng)48小時(shí)的各組細(xì)胞總DNA，具體操作如下(1)將上述細(xì)胞培養(yǎng)液中含有約5X IO6個(gè)細(xì)胞收集于1. 5ml離心管中，300Xg離心5分鐘，完全去除培養(yǎng)液；(2)加200 μ L的重懸液(Resuspension Solution)將沉積的細(xì)胞重新懸浮起來(lái)， 并在其中加入20 μ L去RNA酶液(RNase A Solution)，常溫下溫育2分鐘；(3)加入20 μ L的蛋白酶K和200 μ L的裂解液(Lysis Solution C)，充分渦旋， 70°C條件下溫育10分鐘，使細(xì)胞充分裂解；(4)將吸附柱連接到收集管中，并在吸附柱中加入500μ L吸附柱準(zhǔn)備液，12000 Xg離心1分鐘，丟棄收集管中的液體；(5)細(xì)胞充分裂解后，加入200 μ L乙醇(純度為100% )，充分渦旋10分鐘；(6)將渦旋后1.5ml離心管中所有的樣品轉(zhuǎn)移到吸附柱中，用寬槍頭吸取， 12000 Xg離心1分鐘，丟棄收集管中的液體；(7)加入500 μ L的漂洗液12000 Xg離心1分鐘，丟棄收集管中的液體；(8)加入500 μ L的漂洗液13000 Xg離心3分鐘，丟棄收集管中的液體，并重新連接新的收集管，室溫(25°C )晾干幾分鐘至乙醇完全揮發(fā)；(9)在吸附柱中心加入200 μ L的洗脫液，室溫溫育5分鐘，12000 Xg離心1分鐘得到細(xì)胞基因組DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?、目的片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)以上述步驟5得到的單克隆細(xì)胞基因組DNA為模板，以下表1所列的引物進(jìn)行目的片段 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為 50 μ 1，10 μ L 5 XBufferU μ L IOmM dNTPU μ L 25 μ M 弓I物 Sence primerU 1 μ L 25 μ M 弓丨物 Anti-sence primerUO. 5 μ L Roche Expand High Fidelity 5 Polymerase、200ng 基因組 DNA，加超純水至 50 μ L。PCR 擴(kuò)增程序95°C 5min ； 94°C 20、退火溫度581(見表1)，72°C 30s，循環(huán)30次，最后72°C延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。表1擴(kuò)增MSTN-基因組DNA目的片段引物表
擴(kuò)增MSTN-基因組DNA目的片段引物目的片段Tm
Sence primerl5' TACAAGGTATACTGGAATCCGATCT 3' (序列2)397bp58 °CAnti-sence5，GCAAAGTAAAAGTATCAAGAGGGTA 3'primerl(序列3)7、PCR產(chǎn)物回收純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下僅含目的片段的凝膠，放入1. 5mL Ependorff管中，然后用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒OiIAGEN)純化目的片段，按照試劑盒說(shuō)明書操作。具體步驟為向Ependorff管中加入相當(dāng)于膠塊3倍體積的溶膠液PN，50°C水浴IOmin至膠完全溶解；將所得溶液轉(zhuǎn)入一個(gè)吸附柱中，12 OOOr/m離心30s，棄廢液；吸附柱放回收集管并加入700uL漂洗液PW，12 000r/m離心30s，棄廢液，再次向吸附柱中加入500uL漂洗液PW， 12 000r/m離心30s，棄廢液；將吸附柱放入收集管中，12 000r/m離心^iin后，將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中并在室溫放置數(shù)分鐘使吸附柱中的酒精完全揮發(fā)，向吸附柱膜中央加入洗脫緩沖液EB，室溫放置anin后，12 000r/m離心lmin，收集DNA溶液。8、純化產(chǎn)物的連接使用TakaRa D101A試劑盒，連接反應(yīng)體系總體積是10yL。分別將IyL的 PMDR18-T Vector，3 μ L純化的 PCR 產(chǎn)物，1 μ L dH20,5y L Solution I 無(wú)菌離心管中，輕輕混勻，于4°C過(guò)夜。9、轉(zhuǎn)化
取出DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；將10 μ L連接產(chǎn)物加入100 μ L感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，在冰上放置30min ；將離心管放置42°C水浴，熱擊90s，注意勿搖動(dòng)離心管；快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，放置anin ；每管加500 μ L LB培養(yǎng)基，在37°C搖床溫和搖動(dòng)溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇；取適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化細(xì)菌均勻涂布于適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基平板上；倒置培養(yǎng)皿，于37°C培養(yǎng)16h，得到重組菌。采用相同的方法將pMDR18-T Vector轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，得到對(duì)照重組菌。10、菌液PCR鑒定隨機(jī)挑取幾個(gè)重組菌的單菌落接種于ImL含100mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中， 370C 300r/min搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜；吸取1 μ L過(guò)夜培養(yǎng)的菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系和程序與步驟6—致。以對(duì)照重組菌為對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下拍照，結(jié)果如圖4所示，可以看出，對(duì)照重組菌沒有397bp目的片段，而得到397bp目的片段條帶的為陽(yáng)性重組菌。11、測(cè)序與鑒定隨意挑取800個(gè)重組菌單菌落接種于ImL含100mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中并送公司分別測(cè)序，測(cè)序成功的約為700個(gè)克隆。將測(cè)序所得的序列結(jié)果與MSTN基因中的靶位點(diǎn)序列(序列1)進(jìn)行同源性比較分析，以鑒定轉(zhuǎn)染ZFN質(zhì)粒豬胎兒成纖維細(xì)胞基因組DNA 中靶位點(diǎn)是否被定點(diǎn)敲除。測(cè)序結(jié)果如圖5所示，與靶位點(diǎn)序列(對(duì)照，序列1，序列表中序列4的第 3770-3801位核苷酸)相比，共獲得7個(gè)定點(diǎn)敲除、突變或定點(diǎn)插入的陽(yáng)性克隆，具體如下 3號(hào)陽(yáng)性克隆定點(diǎn)敲除CAGG堿基，并將AGAAG突變?yōu)镃AGGA ；967號(hào)陽(yáng)性克隆定點(diǎn)敲除A堿基；455號(hào)陽(yáng)性克隆特異敲除A堿基，并將G突變?yōu)門 ；495號(hào)陽(yáng)性克隆定點(diǎn)敲除CAG堿基； 939號(hào)陽(yáng)性克隆定點(diǎn)敲除CAGG和A堿基，并將AGAAG突變?yōu)镚AAGA ；781號(hào)陽(yáng)性克隆，在特異靶位點(diǎn)定點(diǎn)插入C堿基；779號(hào)陽(yáng)性克隆，在特異靶位點(diǎn)定點(diǎn)插入CAGGA堿基。因此，此靶位點(diǎn)序列可被定點(diǎn)敲除、突變或定點(diǎn)插入的效率約為1%，極大的提高了特異敲除的效率。陽(yáng)性克隆菌落中特異靶位點(diǎn)的定點(diǎn)敲除、突變和定點(diǎn)插入都導(dǎo)致了豬MSTN基因讀碼框的變化，從而導(dǎo)致MSTN基因功能的突變或喪失。測(cè)序結(jié)果顯示，MSTN靶位點(diǎn)序列確實(shí)可被定點(diǎn)敲除、突變和定點(diǎn)插入，從而突變 MSTN基因的功能，為制備定點(diǎn)敲除、插入和突變MSTN基因轉(zhuǎn)基因克隆豬做好準(zhǔn)備。
權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其為如下(1)或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能相關(guān)蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能相關(guān)蛋白的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.權(quán)利要求1所述的DNA分子作為靶點(diǎn)、權(quán)利要求2所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在抑制MSTN基因表達(dá)或?qū)е翸STN功能喪失中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述MSTN的核苷酸序列為序列表中的序列4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制MSTN基因表達(dá)或?qū)е翸STN 功能喪失通過(guò)改變MSTN的編碼框體現(xiàn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述改變MSTN的編碼框體現(xiàn)在 MSTN編碼框的定點(diǎn)敲除、突變和/或定點(diǎn)插入。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鋅指核酸酶定點(diǎn)敲除Myostatin基因特異靶位點(diǎn)。本發(fā)明提供一種DNA分子，其為如下(1)或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能相關(guān)蛋白的DNA分子；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明定位了MSTN基因中一段特異的靶序列位點(diǎn)DNA片段，并針對(duì)此特異位點(diǎn)構(gòu)建ZFN質(zhì)粒，將此質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞可以定點(diǎn)敲除或突變MSTN基因中特異的靶序列，并徹底破壞MSTN基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102296073SQ201110229828
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者崔文濤, 李奎, 湯茂學(xué), 錢麗麗 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所