專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低溫酯酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種低溫酯酶、其編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酯酶(esterase，EC 3. 1)是一種水解酶，可在水分子的參與下，經(jīng)由水解作用，將酯類(lèi)切割成酸類(lèi)與醇類(lèi)。酯酶存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中。根據(jù)氨基酸序列差異，目前細(xì)菌酯酶可分為8個(gè)家族(I-VIII)。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，一些新的酯酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，例如篩選至韓國(guó)海域的LipG、南中國(guó)海水體和沉積物環(huán)境的htA和htF，植物根部土壤的htD2、以及羊瘤胃的EstGKl和等。宏基因組，又稱(chēng)元基因組，源于20世紀(jì)70年代土壤微生物基因組DNA直接提取技術(shù)，由Handelsman等人于1998年首次提出并完善了該名詞。宏基因組是指生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)總和。宏基因組技術(shù)可從環(huán)境樣品中直接提取微生物基因組DNA，克隆于不同載體，再將重組載體轉(zhuǎn)移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫(kù)，結(jié)合不同篩選技術(shù)，從基因文庫(kù)中篩選獲得新基因或新的生物活性物質(zhì)。應(yīng)用這種免培養(yǎng)的新技術(shù)，可繞過(guò)微生物菌種分離培養(yǎng)技術(shù)難點(diǎn)，直接在基因水平上研究、開(kāi)發(fā)和利用未培養(yǎng)的微生物資源，為工業(yè)、 農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展提供微生物基因資源。中國(guó)專(zhuān)利200710143545. 8提供了種編碼β -葡萄糖苷酶的基因，它通過(guò)構(gòu)建土壤未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA文庫(kù)和文庫(kù)克隆的葡萄糖苷酶活性檢測(cè)篩選法獲得。目前授權(quán)的細(xì)菌酯酶及其基因?qū)＠鄶?shù)直接來(lái)源于分離培養(yǎng)的菌株。中國(guó)專(zhuān)利 98811110. 1提供了一種耐熱堿性磷酸酯酶的氨基酸序列、編碼基因序列，以及生產(chǎn)重組酶的方法。中國(guó)專(zhuān)利200410091990. 0提供了一種假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因及其克隆方法。中國(guó)專(zhuān)利20081022^71. 7提供了一種酯酶及其編碼基因與應(yīng)用，發(fā)明的酯酶適用于化工、食品、生物轉(zhuǎn)化、醫(yī)藥工業(yè)和其它相關(guān)工業(yè)。中國(guó)專(zhuān)利200910144213.0提供了一種從中溫鏈霉菌中獲取的熱穩(wěn)定性羧酸酯酶基因、編碼蛋白及其應(yīng)用。然而，細(xì)菌酯酶及其基因?qū)＠灿型ㄟ^(guò)未培養(yǎng)技術(shù)篩選于宏基因文庫(kù)。中國(guó)專(zhuān)利200810226942. 6提供了一種酯酶新基因ht pi及其重組表達(dá)體系，該基因克隆自中國(guó)南海海底IOOm深海洋底泥宏基因組文庫(kù)。中國(guó)專(zhuān)利20081022^71. 7提供了一種酯酶及其編碼基因與應(yīng)用，該基因克隆自中國(guó)南海778. 5m深海沉積物宏基因組文庫(kù)，發(fā)明的酯酶適用于化工、食品、生物轉(zhuǎn)化、醫(yī)藥工業(yè)和其它相關(guān)工業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的低溫酯酶、編碼基因及其制備方法，該酯酶用于脂類(lèi)降解及其他油脂類(lèi)化合物的生物催化和轉(zhuǎn)化。本發(fā)明從中太平洋深海沉積物(水深5886m)宏基因組文庫(kù)中，通過(guò)特異性底物 (三丁酸甘油酯)篩選獲得一種新的酯酶基因Est6，包含該基因的表達(dá)重組菌已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所(100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.5084，保藏日期為2011年7月 18日，拉丁分類(lèi)命名為hcherichia coli.經(jīng)PCR克隆測(cè)序，酯酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。Est6 大小為 909bp，堿基組成為148Α(16·)、3^C(36. 19% )、 292G(32. 12% )和140T(15. 40% )，編碼蛋白大小為302個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示。將該基因序列在GenBank中進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)一個(gè)與之相似性最高為 61%的蛋白來(lái)源于一株未培養(yǎng)細(xì)菌的酯酶(其在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)為ACL67845)。 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，酯酶具有甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸組成的催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸位置為142至146)，構(gòu)成酯酶催化中心；還具有組氨酸、甘氨酸、甘氨酸和甘氨酸組成的氧陰離子洞(氨基酸位置為74至77)。綜上所述，Est6應(yīng)為酯酶家族一名新成員O在不影響&丨6蛋白活性前提下，可對(duì)SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有酯酶活性的衍生蛋白質(zhì)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)的公知常識(shí)，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性是和其功能結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)的。一般來(lái)說(shuō)，只有發(fā)生在功能結(jié)構(gòu)域的位點(diǎn)突變可能對(duì)蛋白質(zhì)的二維和三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響其生物學(xué)活性。而對(duì)于發(fā)生在遠(yuǎn)離功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸位點(diǎn)，由于這一區(qū)域不參與蛋白功能構(gòu)象，因而氨基酸的個(gè)別點(diǎn)突變不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響，從而能夠基本保留原蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。因而，在已知74-77和142-146位氨基酸為酯酶的活性結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，根據(jù)公知常識(shí)和邏輯推理，通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)安排可以得到對(duì)&16蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從而獲得基本保留酯酶生物學(xué)活性的蛋白突變體，優(yōu)選的為對(duì)^^6蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變從而獲得基本保留Est6酯酶生物學(xué)活性的蛋白突變體。相應(yīng)地，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響基因表達(dá)的條件下，可對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還保護(hù)對(duì)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學(xué)活性的DNA分子。例如對(duì)基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學(xué)活性的DNA分子，優(yōu)選的為對(duì)基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學(xué)活性的DNA分子。利用基因克隆技術(shù)，可將上述獲得的酯酶基因連接到合適載體上，并轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核或真核生物宿主表達(dá)制備重組酯酶。合適的原核生物宿主包括各種細(xì)菌如E. COli 等，合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞) 等，優(yōu)選采用原核表達(dá)系統(tǒng)E. coli。一個(gè)優(yōu)選的例子是將本發(fā)明篩選到的酯酶基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體 pET28b (Novagen)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出高活性的重組酯酶。本發(fā)明還提供所述在催化水解酯、酯交換或合成、以及蛋白運(yùn)輸保藏中的應(yīng)用。通過(guò)酯酶活力測(cè)定表明，酯酶或上述能表達(dá)酯酶的宿主菌可用于水解短鏈脂肪酸脂。優(yōu)選的短鏈脂肪酸脂為具有C2-C10短碳鏈的對(duì)硝基苯酚酯，例如對(duì)硝基苯乙酸酯、對(duì)硝基苯丁酸酯、對(duì)硝基苯己酸酯、對(duì)硝基苯辛酸酯和對(duì)硝基苯癸酸酯等，其中底物為對(duì)硝基苯酚丁酸酯(C4)時(shí)催化活性最高。Este酯酶為一種低溫酯酶，催化水解溫度范圍為10 50°C，優(yōu)選為20 30°C ； 所述水解的PH值為6. 0 9. 0，優(yōu)選為7. 5 8. 0。在0 20°C條件下，酶蛋白可保持良好的穩(wěn)定性，在添加二價(jià)離子Mg2+、Mn2+或有機(jī)溶劑吐溫20和80條件下，酶學(xué)活性增大。本發(fā)明從中太平洋深海沉積物宏基因組文庫(kù)中篩選獲得新的酯酶基因，發(fā)現(xiàn)了該基因編碼蛋白具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，可應(yīng)用于催化解酯和酶法合成酯產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中。獲得的酯酶基因可克隆到合適的宿主中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)酯酶，為后續(xù)的工業(yè)應(yīng)用提供成本低廉的酯酶起始材料。該酶的生產(chǎn)，將會(huì)在洗滌劑、印染助劑和生物柴油制備等工藝中顯示出重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。


圖1為純化酯酶的聚乙酰胺凝膠電泳分析圖。圖2為酯酶的底物特異性圖。C2 對(duì)硝基苯乙酸酯；C4 對(duì)硝基苯丁酸酯、 C6 對(duì)硝基苯己酸酯；C8 對(duì)硝基苯辛酸酯；ClO 對(duì)硝基苯癸酸酯；C12 對(duì)硝基苯十二酸酯；C14 對(duì)硝基苯十四酸酯；C16 對(duì)硝基苯十六酸酯；定義底物為C4時(shí)測(cè)定值為100%。圖3為酯酶最適反應(yīng)溫度圖。圖4為酯酶最適反應(yīng)pH圖。圖5為酯酶熱穩(wěn)定性圖。圖6為二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)酯酶活性影響圖。圖7為有機(jī)溶劑和去垢劑對(duì)酯酶活性影響圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 酯酶基因的獲取深海沉積物樣品于2008年8月采用多管取樣器采集自中太平洋，水深5886m。宏
CopyControlTM HTP fosmid library production kit (Epicentre, 美國(guó))，克隆載體為 pCC2 FOS fosmid vector (Epicentre，美國(guó))，宿主為 EPI300-T1R Ε. coli (Epicentre，美國(guó))。經(jīng)脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)，插入片段大小為36 48kb0采用氯霉素酯酶篩選平板[1% (w/v)三丁酸甘油酯，12. 5yg ml—1氯霉素，LB培養(yǎng)基(IOg胰蛋白胨，5g酵母抽提物，IOg氯化鈉，pH 7.0)]篩選具有酯酶基因的克隆子。取 10 μ 1文庫(kù)菌液稀釋至100 μ 1，涂布于酯酶篩選平板，30°C培養(yǎng)2天，菌落周?chē)霈F(xiàn)明顯透明圈即為陽(yáng)性克隆。將篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆挑出，在氯霉素酯酶篩選平板上劃線重復(fù)驗(yàn)證。 經(jīng)篩選和重復(fù)驗(yàn)證獲得酯酶陽(yáng)性克隆E6。經(jīng)重復(fù)驗(yàn)證的酯酶陽(yáng)性克隆E6接入:3ml LB液體培養(yǎng)基(含12. 5 μ g ml—1氯霉素禾口 6μ 1 500 X CopyControl Fosmid Autoinduction Solution), 37°C 震蕩培養(yǎng) 18h,震蕩速率為250rpm。采用質(zhì)粒抽提試劑盒(Axygen，美國(guó))抽提fosmid質(zhì)粒。攜帶酯酶基因的 fosmid質(zhì)粒采用限制性?xún)?nèi)切酶Sau3AI進(jìn)行不完全酶切，割膠回收1. 5 41Λ大小的DNA片段，將其克隆至PUC19質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化E.coli DH5a菌株，最后涂布氨芐青霉素酯酶篩選平板 [1% (w/v)三丁酸甘油酯，IOOyg ml—1氨芐青霉素，LB培養(yǎng)基]篩選陽(yáng)性亞克隆。30°C培養(yǎng)2天后挑選產(chǎn)生透明圈的亞克隆，經(jīng)劃線重復(fù)驗(yàn)證后測(cè)序，獲得插入片段DNA序列。經(jīng)陽(yáng)性亞克隆測(cè)序獲得1748bp插入片段。針對(duì)插入片段的序列，基于 NCBI/ORF Finder (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/ gorf/gorf. html)的ORF分析，獲得插入片段中開(kāi)放閱讀框序列信息，通過(guò)Blastx (http:// blast, ncbi. nlm. nih. gov/)比對(duì)序列與已知酯酶基因序列的同源性。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析獲得 Est6 基因，大小為 909bp，堿基組成為:148A(16. 28% ) ,329C(36. 19% ) ,2926(32. 12% ) 和140T(15.40% )，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。編碼蛋白大小為302個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。將該基因序列在GenBank中進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)一個(gè)與之相似性最高為61%的蛋白來(lái)源于一株未培養(yǎng)細(xì)菌的酯酶，其在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)為ACL67845。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，酯酶具有甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸組成的催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸位置為142至146)，構(gòu)成酯酶催化中心；還具有組氨酸、甘氨酸、 甘氨酸和甘氨酸組成的氧陰離子洞(氨基酸位置為74至77)，其在催化過(guò)程中可向過(guò)渡狀態(tài)中帶負(fù)電荷的氧原子提供氫鍵。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，酯酶屬于酯酶家族中的IV 家族。綜上所述，Est6應(yīng)為酯酶家族中的一名新成員。實(shí)施例2 酯酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建將本發(fā)明獲得的酯酶基因克隆到表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)菌株。基于 NCBI/ORF Finder的ORF分析獲得的酯酶基因的開(kāi)放閱讀框序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增酯酶全基因的上游引物 Est6F (5’-CGCACATATGGCCAGTCCACAGCTCC-3’，NdeI)和下游引物 ht6R(5，_AATTA AGCTTCTAGCGTGCGGCGGCG-3 ’，Hindi 11), PCR擴(kuò)增確認(rèn)基因全長(zhǎng)序列。采用酶切克隆的方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，即用NdeI和HindIII雙酶切PCR產(chǎn)物，割膠回收酶切后的片段與經(jīng)NdeI和 HindIII雙酶切的質(zhì)粒pET28b連接，采用CaC12轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α中，卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。采用質(zhì)粒抽提試劑盒(Axygen，美國(guó))提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)NdeI 和HindIII雙酶切鑒定，獲得909bp的DNA片段，經(jīng)測(cè)序鑒定為酯酶基因ht6。表明已成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒，將此重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta表達(dá)菌株中，構(gòu)建了表達(dá)重組菌株。包含該基因的表達(dá)重組菌已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所(100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5084，保藏日期為2011年7月18日，拉丁分類(lèi)命名為Escherichia coli。實(shí)施例3 利用重組表達(dá)菌株表達(dá)重組酯酶基因?qū)?gòu)建好的3ml重組表達(dá)菌株轉(zhuǎn)接到100ml含有20 μ g/ml卡那霉素和34 μ g/ ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)到0. 6，此時(shí)加入終濃度為0. 5mM的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)入25°C以150r/min振蕩培養(yǎng)幾。低溫離心收集菌體，重懸于Buffer A(500mM氯化鈉，IOmM咪唑，20mM Tris鹽酸，pH 8.0)中，在冰上進(jìn)行超聲波破碎處理。低溫離心收集上清，然后進(jìn)行NTA-Ni2+親和柱層析，所表達(dá)的重組蛋白含有N端的6XHis tag, 能親和吸附到層吸柱中，經(jīng)過(guò)不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫后，收集洗脫液。經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)，得到電泳純的重組酯酶蛋白Est6，分子量32kd，與預(yù)測(cè)值一致(圖1)。用Bradford 方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，得到約2. 28mg/100ml發(fā)酵液的表達(dá)量。實(shí)施例4 重組酯酶基因的活性檢測(cè)
利用對(duì)硝基苯丁酸酯法測(cè)定純化的重組酯酶活性。具體操作在Iml的反應(yīng)體系中包括ImM對(duì)硝基苯丁酸酯，IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH 7. 5)和0. 57 μ g純酶蛋白 (為10 μ 1經(jīng)稀釋的純化酶液)，采用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Beckman DU800型，美國(guó))于 20°C條件下連續(xù)測(cè)定吸光值A(chǔ)4tl5 3min，使用失活的酶液作為對(duì)照用于調(diào)零。測(cè)得的酯酶活性為104.41U/mg。另外，將純化的酶液直接滴于(w/v)三丁酸甘油酯平板上，可觀察到明顯的透明圈。表明這個(gè)重組表達(dá)的酯酶具有酯酶水解活性，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了材料。實(shí)施例5 酯酶底物特異性分析酯酶的底物特異性分析采用體系100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7. 5)，ImM底物，加入0. 57μ g純酶蛋白，在20°C下連續(xù)測(cè)定吸光值A(chǔ)4(153min。測(cè)定采用的底物為對(duì)硝基苯酚乙酸酯(C2)，對(duì)硝基苯酚丁酸酯(C4)，對(duì)硝基苯酚己酸酯(C6)，對(duì)硝基苯酚辛酸酯 (C8)，對(duì)硝基苯酚癸酸酯(ClO)，對(duì)硝基苯酚十二酸酯(C12)，對(duì)硝基苯酚十四酸酯(C14)， 對(duì)硝基苯酚十六酸酯(C16)。經(jīng)測(cè)定表明，能特異性水解化合物對(duì)硝基苯酚丁酸酯的酯鍵。酯酶對(duì)酰基碳鏈較短的對(duì)硝基苯酚酯(C2、C4、C6、C8和C10)具有催化活性， 其中底物為對(duì)硝基苯酚丁酸酯(C4)時(shí)催化活性最高，較難水解對(duì)硝基苯酚十四酸酯(C14) 和對(duì)硝基苯酚十六酸酯((16)(圖幻。結(jié)果表明，酯對(duì)?；兼溳^短脂類(lèi)物質(zhì)具有催化活性，對(duì)于短鏈脂類(lèi)的水解活力優(yōu)于長(zhǎng)鏈脂類(lèi)。實(shí)施例6 酯酶最適反應(yīng)條件分析酯酶最適反應(yīng)溫度在10 50°C范圍內(nèi)測(cè)定。具體操作采用體系100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7. 5)，ImM對(duì)硝基苯酚丁酸酯，加入0.57 μ g純酶蛋白，分別在10、 15、20、25、30、35、40、45和50°C條件下連續(xù)測(cè)定吸光值A(chǔ)4(15;3min。測(cè)定結(jié)果表明為低溫酶，在10°C條件下仍具有催化活性，最適反應(yīng)溫度為20°C (圖3)。酯酶最適反應(yīng)pH在3.0 10.0范圍內(nèi)測(cè)定。具體操作為在不同pH緩沖液中加入ImM對(duì)硝基苯酚丁酸酯和0. 57 μ g純酶蛋白，在20°C下連續(xù)測(cè)定吸光值A(chǔ)348 3min。 測(cè)定使用的緩沖液為=IOOmM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0 6. 5)，100mM磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液(pH 6. 5 7. 5)，IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH 7. 5 9. 0)和50mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0 10.0)。測(cè)定結(jié)果表明，最適pH為 pH 7. 5，在pH 6.0 9.0范圍內(nèi)具有活性(圖4)。實(shí)施例7 酯酶酶學(xué)穩(wěn)定性分析酯酶熱穩(wěn)定性分析在0 60°C范圍內(nèi)測(cè)定。具體操作為將純化后酶液分別保溫在0、10、20、30、40、50和601下301^11，然后測(cè)定酶活性。測(cè)酶活體系為=IOOmM Tris 鹽酸緩沖液(pH 7. 5)，ImM對(duì)硝基苯酚丁酸酯，加入0. 57 μ g純酶蛋白，于20°C連續(xù)測(cè)定吸光值A(chǔ)4c^miru測(cè)定結(jié)果表明，Est6在0 20°C時(shí)保持良好的穩(wěn)定性，在40 60°C保存時(shí)失去活性(圖5)。二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)酯酶活性影響的測(cè)定具體操作為在反應(yīng)體系中分別加入 IOmM C02+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、ai2+、Sr2+、Mn2+、Ni2+、Ba2+和乙二胺四乙酸，測(cè)定酶活性。測(cè)酶活體系為100mM Tris鹽酸緩沖液(pH 7. 5)，ImM對(duì)硝基苯酚丁酸酯，0. 57 μ g純酶蛋白，于20°C 下連續(xù)測(cè)定吸光值A(chǔ)4tl5 3min。測(cè)定結(jié)果表明，酯酶活性會(huì)被ai2+、Cu2+和Ni2+抑制，在 Co2+、Ca2+、Sr2+和Ba2+存在下仍能保持較強(qiáng)的活性，在Mg2+和Mn2+存在下活性增大(圖6)。
有機(jī)溶劑和去垢劑對(duì)酯酶活性影響的測(cè)定具體操作為在反應(yīng)體系中分別加入15% (ν/ν)有機(jī)溶劑(異丙醇、乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亞砜和二甲基甲酰胺) 和去垢劑(w/v或v/v)(十二烷基硫酸鈉、吐溫20、吐溫80和Triton X-100)然后測(cè)定酶的活性。測(cè)活體系為100mM Tris鹽酸緩沖液(ρΗ 7.幻，ImM對(duì)硝基苯酚丁酸酯，0. 57 μ g 純酶蛋白，于20°C下連續(xù)測(cè)定吸光值A(chǔ)4tl5 3min。測(cè)定結(jié)果表明，酯酶活性會(huì)被十二烷基硫酸鈉抑制，但吐溫20和80可增強(qiáng)其活性(圖7)。
權(quán)利要求
1.一種酯酶蛋白，是具有如下(1)或( 特征的蛋白質(zhì)(1)、其氨基酸序列與ID NO. 2所示序列一致；O)、將kq ID NO. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失和/ 或添加且具有酯酶活性的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酯酶蛋白，其特征在于所述的衍生蛋白質(zhì)為對(duì)^^6蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從而獲得基本保留酯酶生物學(xué)活性的蛋白突變體。
3.根據(jù)權(quán)利2所述的酯酶蛋白，其特征在于所述的衍生蛋白質(zhì)為對(duì)^^6蛋白 1-73、78-141或147-302位氨基酸殘基進(jìn)行點(diǎn)突變從而獲得基本保留酯酶生物學(xué)活性的蛋白突變體。
4.編碼權(quán)利要求1所述Est6酯酶蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；或?yàn)閷?duì)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列進(jìn)行替換、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學(xué)活性的DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于其為對(duì)SEQID NO. 1所示基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學(xué)活性的DNA分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于其為對(duì)SEQID NO. 1所示基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學(xué)活性的DNA分子。
7.攜帶有權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述DNA分子的載體。
8.一種宿主系統(tǒng)，其由權(quán)利要求7所述的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染原核生物或真核生物宿主得到。
9.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的的酯酶在催化水解酯、酯交換或合成、以及蛋白運(yùn)輸保藏中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的酯酶可用于水解短鏈脂肪酸脂。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種低溫酯酶、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明從太平洋深海沉積物宏基因組文庫(kù)中篩選獲得新的酯酶基因，發(fā)現(xiàn)了該基因編碼蛋白具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，催化水解溫度范圍為10～50℃，水解的pH值為6.0～9.0。在0～20℃條件下，酶蛋白可保持良好的穩(wěn)定性，在添加二價(jià)離子Mg2+、Mn2+或有機(jī)溶劑吐溫20和80條件下，酶學(xué)活性增大。獲得的酯酶基因可克隆到合適的宿主中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)酯酶，可應(yīng)用于催化水解酯和酶法合成酯產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中，將會(huì)在洗滌劑、印染助劑和生物柴油制備等工藝中顯示出重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/18GK102286441SQ20111020821
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月24日
發(fā)明者劉鎮(zhèn)盛, 吳敏, 楊俊毅, 江夏薇, 王春生, 許學(xué)偉 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第二海洋研究所